CN113330120A - 利用源自干酪乳杆菌的两种启动子共表达两种靶蛋白的表面表达载体以及使用其在微生物表面上表达蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种使用源自乳杆菌的两种启动子能够在微生物表面上共表达两种不同的靶蛋白的载体和使用该载体在微生物表面上表达靶蛋白的方法。将包含***其中的外源基因的载体转化到微生物中，并使不同的外源蛋白在该微生物的表面上稳定地表达。此外，本发明涉及一种包含编码聚‑γ‑谷氨酸合成酶复合物的基因pgsA的表面表达载体以及使用该载体在微生物表面上表达靶蛋白的方法。将包含***其中的外源基因的载体转化到微生物中，并使外源蛋白在该微生物的表面上稳定地表达。

Description

利用源自干酪乳杆菌的两种启动子共表达两种靶蛋白的表面 表达载体以及使用其在微生物表面上表达蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及一种使用源自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的醛缩酶启动子和半乳糖变旋酶启动子在微生物表面上共表达两种不同基因的载体，以及用该载体转化的微生物。
此外，本发明涉及一种新载体，该载体使用源自芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株并参与聚γ-谷氨酸合成的外膜蛋白(pgsA)在微生物表面上有效地表达外源蛋白。此外，本发明涉及一种通过使用源自芽孢杆菌菌株并参与聚γ-谷氨酸合成的外膜蛋白(pgsA)在微生物表面上表达外源蛋白来制备蛋白质的方法。
背景技术
细胞表面展示或细胞表面表达是指一种将蛋白质或肽与适当的表面锚定基序融合并且表达在革兰氏阴性或***、真菌、酵母或动物细胞的表面上的技术(LeeS.Y.，等人，Trends Biotechnol.，21：4552，2003)。首次细胞表面展示技术是使用具有相对简单的表面的噬菌体于20世纪80年代开发的，并且是一种将肽或小蛋白质与丝状噬菌体的pIII融合并表达的技术。因此，首次细胞表面展示技术被称为表面表达***。使用噬菌体的细胞表面展示已经用于筛选抗体、表位和高亲和力配体，但是由于能够在噬菌体表面上展示的蛋白质的大小相对有限而具有局限性。因此，作为其替代，已经开发了使用细菌的细胞表面表达。这种细胞表面展示是通过使用诸如细菌或酵母的微生物的表面蛋白质作为表面锚定基序而在微生物表面上稳定地表达外源蛋白质的技术。
为了利用特定生物体的外膜蛋白在细胞表面上表达外源蛋白，应当在基因水平上将合适的表面蛋白和外源蛋白相互连接以形成融合蛋白，并且该融合蛋白应当稳定地穿过细胞内膜，并且应当附着和保持在细胞表面上。为此，优选使用具有以下特性的蛋白质作为表面锚定基序。即，(1)该蛋白质在N末端具有能够穿过细胞内膜的分泌信号；(2)该蛋白质应当具有能够稳定地附着到细胞外膜上的靶向信号；(3)该蛋白质能够在不负面影响细胞生长的范围内大量表达在细胞表面上，以使该蛋白质能够表现出高活性；(4)该蛋白质应当能够能稳定地表达而与其大小无关，以便可以用于各种反应中(Georgiou等人，TIBTECH，11：6，1993)。此外，也需要对这种表面锚定基序进行基因工程，以便将其***宿主细胞表面上的外膜蛋白的N末端、C末端或中央部分中(Lee等人，TIBTECH，21：45-52，2003)。
为了在细菌表面上表达蛋白质，该蛋白质应当在其一级序列中具有能够使在细胞中生物合成的蛋白质穿过细胞膜的分泌信号。此外，在革兰氏阴性细菌的情况下，蛋白质应当穿过细胞内膜和细胞膜间隙，应当***并附着到细胞外膜上，并且应当锚定到膜上，以便伸出膜外。
在细菌情况下，用于将蛋白质锚定到细胞表面上的具有这种分泌信号和靶向信号的蛋白质的实例包括表面蛋白质、特定酶和毒素蛋白质。事实上，如果将这些蛋白质的分泌信号和靶向信号与适当的启动子一起使用，这些蛋白质就可以成功地表达在细菌表面上。
同时，在乳酸菌中产生有用的外源蛋白的尝试主要通过使用可诱导的启动子作为诱导剂或通过确保高效率的启动子来进行。尽管对表达如上所述的靶蛋白的乳酸菌积极地进行了各种应用的开发和学术研究，但是仍然存在的问题在于靶蛋白的表达水平不足，以及当使用可诱导的表达启动子获得的蛋白质在体内施用时，可能该蛋白质不能持续表达。
近年来，在美国和欧洲，对使用乳酸菌开发活疫苗、用于将有用的激素药物递送至肠道内并为此建立有效的遗传资源的载体、以及开发用于乳酸菌的***载体进行了研究。特别地，由于在乳酸菌中含有大量的未甲基化的CpG DNA、脂磷壁酸、肽聚糖等已知作为免疫佐剂，因此乳酸菌被认为是非常有用的疫苗载体。此外，由于对胆酸和胃酸具有抗性而可以将抗原递送至肠道中，并因此在肠道内诱导粘膜免疫，因此乳酸菌具有很多优势。
然而，为了使用乳酸菌作为疫苗载体，需要开发一种通过将产生预防疾病的抗体的抗原蛋白呈递至细胞内部或外部来促进抗原-抗体反应的技术。
同时，已知半乳糖变旋酶在作为D-半乳糖分解代谢的代谢途径Leloir途径中通过将β-D-半乳糖催化转化为α-D-半乳糖而在正常的半乳糖代谢中发挥重要作用。然而，对在乳酸菌中这种半乳糖变旋酶的分子生物学特性的研究仍然是不足的。
因此，本发明人利用在其细胞表面上表达HPV E7蛋白的菌株开发了在微生物表面上有效表达两种不同外源蛋白质的表面表达载体，以及在微生物表面上稳定地表达大量的两种不同外源蛋白质的方法。此外，本发明人对使用参与聚γ-谷氨酸合成的基因(pgsA)作为新的表面锚定基序进行了广泛的研究，并因此开发了一种使用pgsA基因在微生物表面上有效地表达外源蛋白质的新载体，以及开发了一种在微生物表面上表达大量外源蛋白质的方法，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明旨在提供一种表面表达载体，该表面表达载体使用源自枯草芽孢杆菌变种Chungkookjang(Bacillus subtilis var.Chungkookjang)菌株的聚-γ-谷氨酸合成酶(poly-gamma-glutamate synthetase)复合物基因作为能够在微生物表面上表达大量的两种外源蛋白质的表面锚定基序，并且使用源自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的醛缩酶启动子和半乳糖变旋酶启动子，在微生物表面上共表达两种靶蛋白，并且提供一种在用所述表面表达载体转化获得的转化体的表面上高效表达两种不同的外源蛋白质的方法。
本发明还旨在提供一种方法，包括：选择源自芽孢杆菌菌株并参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白质作为能够在微生物表面上表达大量外源蛋白质的表面锚定基序；利用所选择的外膜蛋白质构建能够在微生物表面上表达外源蛋白质或肽的表面表达载体；以及在用所述表面表达载体转化获得的转化体的表面上高效表达外源蛋白质。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供一种用于表达靶蛋白的表面表达载体，该表面表达载体包括：第一启动子、编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因和编码靶蛋白的基因；以及第二启动子、编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因和编码靶蛋白的基因。
在本发明中，第一启动子可以由SEQ ID NO：1表示。
在本发明中，第二启动子可以由SEQ ID NO：2表示。
在本发明中，编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因可以源自产生γ-谷氨酸合成酶复合物的芽孢杆菌菌株。
在本发明中，可以在编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因的末端***接头，并且编码靶蛋白的基因可以***已***的接头中。
在本发明中，靶蛋白可以是其中该靶蛋白的一部分氨基酸序列已经被移除或者以定点方式突变以便有利于表面表达的一种蛋白质。
在本发明中，第一启动子可以是源自乳酸菌的醛缩酶启动子(Pald)。
在本发明中，第二启动子可以是源自乳酸菌的半乳糖变旋酶启动子(Pgm)。
在本发明中，所述载体可以应用于革兰氏阴性或***。
本发明还提供一种用所述表面表达载体转化的微生物。在本发明中，用于转化的微生物可以是经修饰使其不产生参与所表达的靶蛋白降解的胞内或胞外蛋白酶，以便有利于靶蛋白的细胞表面表达的微生物。
在本发明中，用作宿主的微生物可以是乳酸菌。在本发明中，乳酸菌的实例包括乳杆菌(Lactobacillus sp.)、链球菌(Streptococcus sp.)和双歧杆菌(Bifidobacteriumsp.)。通常，作为宿主，乳杆菌可以选自嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、干酪乳杆菌(L.casei)、植物乳杆菌(L.plantarum)、发酵乳杆菌(L.ferementum)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、约氏乳杆菌(L.johnsonii LJI)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)和保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)；链球菌可以为嗜热链球菌(S.thermophilus)；双歧杆菌可以选自婴儿双歧杆菌(B.infantis)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.bifidum)、伪长双歧杆菌(B.psuedolongum)、短双歧杆菌(B.breve)、动物双歧杆菌Bb-12(B.lactis Bb-12)和青春双歧杆菌(B.adolescentis)。更优选地，所述微生物为乳杆菌。
本发明还提供了一种用于靶蛋白的细胞表面表达的方法，该方法包括以下步骤：通过培养转化的微生物在细胞表面上表达靶蛋白；以及回收在其表面表达有靶蛋白的细胞。
在本发明中，靶蛋白可以是选自激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号蛋白或其片段、抗体或其片段、单链抗体、结合蛋白、结合域、肽、抗原、粘附蛋白、结构蛋白、调节蛋白、毒素蛋白、细胞因子、转录调节因子、凝血因子和植物生物防御诱导蛋白中的任意一种。
本发明还提供了一种在革兰氏阴性或革兰氏阳性细胞的表面上表达靶蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(a)通过将编码靶蛋白的基因***所述表面表达载体中构建重组载体；(b)用所述重组载体转化革兰氏阴性或革兰氏阳性宿主细胞；和(c)通过培养转化的宿主细胞在转化的宿主细胞的表面上表达靶蛋白。
本发明还提供了一种用于表达靶蛋白的表面表达载体，该表面表达载体包括：编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因pgsA；和编码靶蛋白的基因。
在本发明中，pgsA可以源自产生聚-γ-谷氨酸的芽孢杆菌菌株。
在本发明中，编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因pgsA可以具有SEQ ID NO：21至25和32至34中的任意一种核苷酸序列。优选地，编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因pgsA可以具有SEQ ID NO：21至24和32至34中的任意一种核苷酸序列。
在本发明中，可以将接头***编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因的末端，并且可以将编码靶蛋白的基因***已***的接头中。
在本发明中，靶蛋白可以是其中所述靶蛋白的一部分氨基酸序列已经被移除或以定点方式突变以便有利于表面表达的一种蛋白质。
在本发明中，所述启动子可以是源自乳酸菌的醛缩酶启动子。
本发明还提供了一种用所述表面表达载体转化的微生物。在本发明中，用于转化的微生物可以是经修饰以使其不产生参与所表达的靶蛋白降解的细胞内或细胞外蛋白酶，以便有利于靶蛋白的细胞表面表达的微生物。
本发明还提供了一种用于靶蛋白的细胞表面表达的方法，该方法包括以下步骤：通过培养转化的微生物在细胞表面上表达靶蛋白；以及回收在其表面上表达有靶蛋白的细胞。
在本发明中，靶蛋白可以是选自激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号蛋白或其片段、抗体或其片段、单链抗体、结合蛋白、结合域、肽、抗原、粘附蛋白、结构蛋白、调节蛋白、毒素蛋白、细胞因子、转录调节因子、凝血因子和植物生物防御诱导蛋白中的任意一种。
本发明还提供了一种通过向除人类以外的脊椎动物施用通过上述方法制备并在其表面上表达有抗原的细胞来诱导体液免疫或细胞免疫的方法。
本发明还提供一种在除人类以外的脊椎动物中产生抗体的方法，该方法包括：通过向脊椎动物施用由上述方法制备并在其表面上表达有抗原的细胞来诱导免疫应答；以及回收由免疫应答产生的抗体。
本发明还提供一种用于表达靶蛋白的表面表达载体，其中所述载体应用于革兰氏阴性或***。
本发明还提供一种在革兰氏阴性或革兰氏阳性宿主细胞的表面上表达靶蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(a)通过将编码靶蛋白的基因***所述表面表达载体中构建重组载体；(b)用所述重组载体转化革兰氏阴性或革兰氏阳性宿主细胞；和(c)通过培养转化的宿主细胞在该转化的宿主细胞的表面上表达靶蛋白。
有益效果
根据本发明的表面表达载体是一种单一载体，包括：两个不同的启动子；编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因；以及连接到编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因上的编码靶蛋白的基因。因此，根据本发明的表面表达载体比现有技术发明具有的优势在于：可以共表达两种不同的靶蛋白，并且，由于使用经所述表面表达载体转化的微生物，因此可以使在两个转化过程中可能发生的细胞转化的可能性最小化。此外，由于所述表面表达载体是包含两个不同启动子的单一载体，因此它可以在比常规技术发明更短的时间内高效表达靶蛋白，并且通过快速选择具有高药物潜力的物质并通过所述单表面表达载体表达两种不同的靶蛋白而具有显著降低药物开发成本的优异的效果。而且，根据本发明的用于表达靶蛋白的表面表达载体可以稳定地表达靶蛋白。此外，根据本发明的表面表达载体可以在重组微生物的表面上组成性地表达靶蛋白。因此，所述表面表达载体可以有利地用于生产抗原来制备所需的疫苗。
附图说明
图1示出构建能够在微生物表面上表达两种靶蛋白的表面表达载体的方法。
图2示出根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA-HPV16E7_Pgm-pgsA-EGFP的遗传图谱。
图3示出进行蛋白质印迹法(Western blotting)以测量用本发明的表面表达载体转化的微生物上表达HPV16 E7和EGFP蛋白的结果。
图4示出共焦荧光显微镜观察的结果，表明通过本发明的表面表达载体在乳酸菌的表面上稳定地共表达两种不同的抗原。
图5示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-PgsA-EGFP的遗传图谱。
图6示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA1(pgsA基序1-60氨基酸)-EGFP的遗传图谱。
图7示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA2(pgsA基序1-70氨基酸)-EGFP的遗传图谱。
图8示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA3(pgsA基序1-80氨基酸)-EGFP的遗传图谱。
图9示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA4(pgsA基序1-100氨基酸)-EGFP的遗传图谱。
图10示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA5(pKV-pgsA 1-188氨基酸)-EGFP的遗传图谱。
图11示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA6(pgsA基序25-60氨基酸)-EGFP的遗传图谱。
图12示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA7(pgsA基序25-70氨基酸)-EGFP的遗传图谱。
图13示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA8(pgsA基序25-100氨基酸)-EGFP的遗传图谱。
图14描绘了显示用本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA1至pKV-Pald-pgsA8中的每一个转化的干酪乳杆菌中EGFP蛋白的表面表达的蛋白质印迹图像。
具体实施方式
实施例1：构建用于共表达两种抗原的表面表达载体pKV-Pald-pgsA-HPV16E7_Pgm-pgsA-EGFP
为了构建用于共表达两种抗原的表面表达载体，使用表面表达载体pKV-Pald-pgsA-E7(pKV-Pald-pgsA380L-HPV16E7，见韩国专利No.10-1471043)，将编码Pgm-pgsA-EGFP的基因***Pald-pgsA-HPV16E7的C端以获得能够在乳酸菌的表面上共表达两种不同靶蛋白的载体pKV-Pald-pgsA-HPV16E7_Pgm-pgsA-EGFP。
首先，为了构建EGFP表达载体，移除pKV-Pald-pgsA-E7中融合有pgsA的HPV16 E7基因(参见韩国专利No.10-1471043)，将编码EGFP的基因***载体中。
使用合成的EGFP基因片段，利用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4进行PCR。
Figure BPA0000305142090000081
作为结果，得到755-bp的EGFP基因片段，在其5′端含有BamHI限制酶位点，并且在其3′端含有XbaI限制酶位点。将获得的DNA片段用BamHI和XbaI限制酶处理，用BamHI和XbaI切割载体pKV-Pald-pgsA-E7以移除HPV16 E7基因区，然后将EGFP基因与切割后的载体相互连接以得到pKV-Pald-pgsA-EGFP。
此外，为了用半乳糖变旋酶启动子替代pKV-Pald-pgsA-EGFP载体中的醛缩酶启动子，使用引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6对干酪乳杆菌基因组进行PCR以获得在其5′端包含SphI限制酶位点和在其3′端包含XbaI限制酶位点的半乳糖变旋酶启动子片段。用SphI和XbaI限制酶处理获得的DNA片段，并且也用相同的限制酶切割载体pKV-Pald-pgsA-EGFP以移除醛缩酶启动子区，然后将半乳糖变旋酶启动子和切割后的启动子相互连接以得到pKV-Pgm-pgsA-EGFP。
Figure BPA0000305142090000082
最后，为了将Pgm-pgsA-EGFP***pKV-Pald-pgsA-E7载体的E7区的C端，使用pKV-Pgm-pgsA-EGFP载体作为模板并使用引物SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8进行PCR。
Figure BPA0000305142090000091
作为结果，获得了包含Pgm-pgsA-EGFP基因的2608-bp片段，在其5′端包含EcoRI限制酶位点并且在其3′端包含FspI限制酶位点。使用EcoRI和FspI限制酶位点将获得的作为编码Pgm-pgsA-EGFP的基因的DNA片段***表面表达载体pKV-Pald-pgsA-HPV16E7中以获得1，1171-bp片段的pKV-Pald-pgsA-HPV16E7_Pgm-pgsA-EGFP(图1和图2)。
实施方式
本发明提供一种表面表达载体，该表面表达载体使用源自枯草芽孢杆菌变种Chungkookjang(Bacillus subtilis var.Chungkookjang)菌株的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物基因作为能够在微生物表面上表达大量的两种外源蛋白质的表面锚定基序，并且使用源自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的醛缩酶启动子和半乳糖变旋酶启动子，在微生物表面上共表达两种靶蛋白，并且提供一种在用所述表面表达载体转化获得的转化体的表面上高效表达两种不同的外源蛋白质的方法。
在下文中，将更详细地描述本发明。
本发明提供一种用于表达靶蛋白的表面表达载体，该表面表达载体包括：第一启动子、编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因、和编码靶蛋白的基因；以及第二启动子、编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因、和编码靶蛋白的基因。
在本发明中，术语“启动子”是指足以指导转录的最小序列。
本发明的醛缩酶启动子和半乳糖变旋酶启动子是在干酪乳杆菌中分别诱导醛缩酶基因和半乳糖变旋酶基因表达的启动子。通常，启动子包含RNA聚合酶与其结合来诱导转录起始的区域，并且RNA合成的程度根据启动子的核苷酸序列来确定。因此，基因的表达水平可以根据启动子的类型而变化。在本发明中，为了获得醛缩酶启动子和半乳糖变旋酶启动子，通过PCR扩增干酪乳杆菌的基因组，并且使用基因克隆技术分离源自干酪乳杆菌的406-bp启动子(SEQ ID NO：1)和607-bp启动子(SEQ ID NO：2)。
在本发明中，术语“载体”是指包含可操作地连接到适当的调控序列上的基因的核苷酸序列以便能够在适当的宿主中表达靶基因的基因构建体。所述调控序列可以包含能够起始转录的启动子、用于调控这种转录的任何操纵子序列以及调控转录和翻译终止的序列。
对本发明的载体没有特别地限制，只要它能够在细胞中复制即可，并且在本发明中可以使用本领域已知的任何载体。例如，载体可以是质粒、粘粒、噬菌体粒子或病毒载体。载体还可以包含另外的启动子等。具体地，载体还可以包含可以有助于靶蛋白表面表达而不干扰以下组分操作的任何要素：第一启动子、编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因、以及编码靶蛋白的基因；和第二启动子、编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因、和编码靶蛋白的基因。
在本发明中，当编码要表达的靶蛋白的基因可操作地连接到表面表达载体上时，表面表达载体可以用作能够高效表达靶蛋白的靶蛋白表达载体。所述表面表达载体可以在宿主细胞中表达靶蛋白。
在本发明中，术语“可操作地连接”是指核酸表达调控序列和编码靶蛋白的核酸序列在功能上彼此连接以执行总的功能。例如，启动子和编码蛋白质的核酸序列或RNA可以可操作地彼此连接以影响编码序列的表达。与表面表达载体可操作的连接可以使用本领域熟知的基因重组技术制备，并且可以使用本领域公知的酶进行位点特异的DNA切割和连接。
在本发明中，第一启动子可以由SEQ ID NO：1表示，但是不限于此。
在本发明中，第二启动子可以由SEQ ID NO：2表示，但是不限于此。
由SEQ ID NO：1或2表示的核苷酸序列的变异体也包括在本发明的范围内。在本发明中，第一启动子醛缩酶启动子核酸分子和第二启动子半乳糖变旋酶启动子核酸分子意指包括所述核酸分子的功能等同物，例如，由第一启动子醛缩酶启动子和第二启动子半乳糖变旋酶启动子中的各自一部分核苷酸序列的删除、替换或***而产生的，但是能够具有与第一启动子醛缩酶启动子和第二启动子半乳糖变旋酶启动子的核酸分子相同的功能的变异体。具体地，第一启动子醛缩酶启动子和第二启动子半乳糖变旋酶启动子各自可以包含与SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列具有至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％的序列同源性的核苷酸序列。与多核苷酸的“％的序列同源性”通过对比较区域的两个最佳对齐的序列进行比较来确定，并且对于最佳对齐的这两个序列，比较区域中的一部分多核苷酸序列与参照序列(无添加或缺失)相比，可以包括添加或缺失(即空位)。
在本发明中，第一启动子、编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因、和编码靶蛋白的基因；以及第二启动子、编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因、和编码靶蛋白的基因相继排列，使得位于“单一载体”中的两个不同的启动子相互独立地驱动靶蛋白的表达。由于相互独立地操纵的启动子存在于单一载体中，因此与现有技术的发明相比，通过有效地减少表面表达载体构建步骤的数目，可以更有效地在细胞表面表达靶蛋白。此外，本发明的优点在于，由于这两个不同的启动子存在于单一载体中，因此可以使在常规技术中为在细胞表面上表达两种靶蛋白进行的两个转化过程中可能发生的细胞转化的可能性最小化。此外，根据本发明的细胞表面表达的优点在于，两个基因的表达由各自的启动子彼此独立地驱动，因此可以独立地确定不同靶蛋白的表达。
在另一方面中，本发明提供用所述表面表达载体转化的微生物。优选地，所述微生物可以是乳酸菌，更优选益生革兰氏阳性乳酸菌。益生微生物的通用选择标准包括以下方面：(i)源自人类的微生物；(ii)对胆汁、酸、酶和氧稳定；(iii)粘附肠粘膜的能力；(iv)在人胃肠道中的定植潜力；(v)抗微生物物质的产生；以及(vi)明显的疗效和安全性。基于这些标准，显然乳酸菌是生物相容的且对人体无害。因此，当将使用乳酸菌作为宿主的转化体应用于人体以递送用于预防或治疗疾病的基因或蛋白质时，与使用细菌菌株制备疫苗的常规方法不同，不需要对细菌菌株进行解毒的步骤。
在本发明中，乳酸菌的实例包括乳杆菌(Lactobacillus sp.)、链球菌(Streptococcus sp.)和双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)。通常，作为宿主，乳杆菌可以选自嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、干酪乳杆菌(L.casei)、植物乳杆菌(L.plantarum)、发酵乳杆菌(L.ferementum)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、约氏乳杆菌(L.johnsonii LJI)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)和保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)；链球菌可以为嗜热链球菌(S.thermophilus)；双歧杆菌可以选自婴儿双歧杆菌(B.infantis)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.bifidum)、伪长双歧杆菌(B.psuedolongum)、短双歧杆菌(B.breve)、动物双歧杆菌Bb-12(B.lactis Bb-12)和青春双歧杆菌(B.adolescentis)。更优选地，所述乳酸菌为乳杆菌。
此外，用于转化的微生物可以包括经修饰以使其不产生参与所表达的靶蛋白降解的胞内或胞外蛋白酶，从而有利于靶蛋白的细胞表面表达的转化微生物。
在另一方面，本发明提供一种用于靶蛋白的细胞表面表达的方法，该方法包括以下步骤：通过培养用所述表面表达载体转化的微生物在细胞表面表达靶蛋白；以及回收在其表面表达有靶蛋白的细胞。具体地，本发明提供一种制备外源靶蛋白的方法，该方法通过使用本发明的表面表达载体在微生物表面表达外源靶蛋白，在没有细胞破坏或蛋白质分离/纯化过程的情况下有效地使用靶蛋白。
在本发明中，术语“靶蛋白”或“外源蛋白”是指在表达该蛋白质的转化宿主细胞中不能正常存在的蛋白质。例如，当操纵源自病毒或源自肿瘤的蛋白质在乳酸菌中人工表达时，该蛋白质将称为“外源蛋白”或“靶蛋白”。
优选地，靶蛋白的实例包括，但不限于，传染性微生物、源自免疫疾病的抗原或源自肿瘤的抗原，例如，真菌病原体、细菌、寄生虫、蠕虫、病毒或致敏物质。更优选地，抗原的实例包括破伤风类毒素、流感病毒血凝素或核蛋白、白喉类毒素、HIV gp120或其片段、HIVgag蛋白、IgA蛋白酶、胰岛素肽B、马铃薯粉痂菌(Spongospora subterranea)抗原、弧菌病(Vibriose)抗原、沙门氏菌(almonella)抗原、肺炎球菌(Pneumococcus)抗原、RSV(呼吸道合胞病毒)抗原、流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza)外膜蛋白、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)菌毛、淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)菌毛、黑色素瘤相关抗原(TRP2、MAGE-1、MAGE-3、gp100、酪氨酸酶、MART-1、HSP-70、β-HCG)、人***瘤病毒抗原(包括源自HPV-16、-18、-31、-35或45的E1、E2、E6和E7)、CEA肿瘤抗原、正常或突变ras蛋白、正常或突变的p53、Muc1和pSA，以及来源于以下的本领域熟知的抗原：霍乱、白喉、嗜血杆菌、甲型肝炎、乙型肝炎、流感、麻疹、脑膜炎、腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌性肺炎、小儿麻痹症、狂犬病、风疹、破伤风、结核病、阿狄森氏病、免疫原、过敏原、包括实体瘤和血源性肿瘤的癌症、获得性免疫缺陷综合征，以及参与移植排斥如肾脏、心脏、胰腺、肺、骨骼和肝移植排斥的因素；以及抗原诱导自身免疫。
因此，通过本发明的表面表达方法制备的靶蛋白可以用于各种应用中。这些应用包括有效制备抗体和酶，以及制备用于筛选抗原、粘附或吸附蛋白质和新的生理活性物质的肽库。
在另一方面，本发明提供一种在革兰氏阴性或革兰氏阳性宿主细胞的表面上表达靶蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(a)通过将编码靶蛋白的基因***所述表面表达载体中构建重组载体；(b)用所述重组载体转化所述革兰氏阴性或革兰氏阳性宿主细胞；和(c)通过培养转化的宿主细胞在该转化的宿主细胞的表面上表达靶蛋白。
具体地，本发明提供表面表达载体pKV-Pald-pgsA-HPV16E7_Pgm-pgsA-EGFP，该表面表达载体使用源自干酪乳杆菌的醛缩酶启动子和半乳糖变旋酶启动子在微生物表面上共表达两种不同的靶蛋白。
具体地，在一个实施例中使用源自干酪乳杆菌的醛缩酶启动子和半乳糖变旋酶启动子，但是，在本发明的范围内也包括：或者使用与源自干酪乳杆菌的醛缩酶启动子和半乳糖变旋糖酶启动子的核苷酸序列具有至少80％的序列同源性的源自另一菌株的醛缩酶启动子和半乳糖变旋酶启动子构建载体，或者使用所构建的载体在微生物表面表达外源蛋白。
在本发明的一个实施例中，使用HPV蛋白E7和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为模型蛋白来检测乳酸菌表面上是否有效表达了蛋白质。
“HPV16E7”是一种引起癌症的致癌HPV 16型基因，E7蛋白质全部参与HPV介导的细胞永生化和细胞转化。E7蛋白通过直接结合其上诱导Rb蛋白过度磷酸化，并且这种源自HPV的E7蛋白是一种能够仅杀死HPV感染的癌细胞的特异靶点，并且用作治疗HPV诱导的癌症的药物靶点。此外，“增强型绿色荧光蛋白(EGFP)”是一种在体内发射绿光使得能容易观察表达相应蛋白的细胞的基因，并且具有能够在荧光显微镜下观察的优点。GFP是一种来源于水母(Aeqorea-victoria)的绿色荧光蛋白，并且已在各种研究领域中用作基因表达的重要标记物。EGFP是GFP的突变体，由亮氨酸取代了GFP的氨基酸序列中第64位的苯丙氨酸并且苏氨酸取代了第65位的丝氨酸产生的，并且具有比原始GFP显示出更强烈的荧光信号的优点。
本发明人通过将HPV16E7和EGFP基因***载体中来构建表面表达载体，用该表面表达载体转化干酪乳杆菌，然后培养转化的干酪乳杆菌以诱导蛋白质表达，并且通过收集一定量的培养物获得蛋白质。获得的蛋白质通过SDS-PAGE进行分析，并且使用抗EGFP和抗HPV16E7抗体进行蛋白质印迹，作为结果，证实HPV16E7和EGFP蛋白成功***构建的表面表达载体pKV-Pald-pgsA-HPV16E7_Pgm-pgsA-EGFP中，并且在细胞表面上共表达。
在上述实施例中，将HPV16E7和EGFP蛋白质用作外源蛋白，但是也可以使用任何其它的蛋白质，例如酶、抗原、抗体、粘附蛋白或吸附蛋白作为外源蛋白。
另外，通过本发明的表面表达载体在细胞表面上表达两种不同的靶蛋白，因此本发明的转化的微生物可以用作疫苗。
在另一方面，本发明提供一种通过使用经所述表面表达载体转化的乳酸菌来制备微生物疫苗的方法。
疫苗是为了预防疾病的目的使用活的生物体用于刺激免疫***的药物。免疫激活是指在生物体中通过产生抗体、刺激T淋巴细胞或刺激其它免疫细胞(如巨噬细胞)来有效去除抗原的过程。与这些细节相关的免疫学的详细概述将容易被本领域技术人员理解(Barrett，J.T.，Textbook of Immunology，1983)。
表达靶蛋白的转化的微生物疫苗作为抗原可以给予哺乳动物，优选人类。
可以使用标准技术进行疫苗组合物的制备。适合向对象给药的剂量根据基因产物的抗原性变化，并且可以是疫苗可以充分诱导典型免疫应答的量。剂量可以通过常规实验程序容易确定。疫苗的典型初始剂量为0.001mg至1mg抗原/kg体重。如有必要，可以增加剂量以提供优选的保护水平，或者以多次剂量使用疫苗。剂量可以由本领域技术人员确定，并且还可以根据各种因素例如配制方法、给药方式、对象的年龄、体重和性别、病理状况、饮食、给药持续时间、给药途径、***率和响应敏感性而变化。
为了使疫苗有效地产生抗体，应在体内释放抗原性物质，以便在接种的对象体内实现抗体产生机制。因此，必须优先在体内引入用于基因产物的微生物载体用于免疫应答。为了刺激由本发明的转化体呈递的抗原的优先应答，虽然如静脉注射、肌肉注射或皮下注射的给药方法也是可以的，但疫苗优选通过口服、胃肠道插管或以气雾剂形式直接向肠或肺给药。
对于将疫苗组合物口服给予对象，优选以亲液形式，例如胶囊形式，提供疫苗组合物。胶囊作为包含Eudragate S、Eudragate L、乙酸纤维素、邻苯二甲酸纤维素或羟丙甲基纤维素的肠溶性包衣来提供。胶囊可以按原样使用，或者可以在将其重构为亲液材料如悬浮液后给予。优选地在具有适合转化的微生物存活的pH值的缓冲液中进行重构。为了保护转化的微生物和疫苗免受胃酸的破坏，优选在每次给予疫苗前优先给予碳酸氢钠制剂。可以选择性地该疫苗制备为肠胃外给药、鼻内给药或***内给药。
包含本发明的启动子并且包含编码能够作为抗原的靶蛋白的基因的转化的乳酸菌可以在消化道粘膜中形成菌落的同时表现出期望的功效，从而可以获得所期望的功效。此外，上述乳酸菌可以在保持需要的转化特性的同时共同给予载体中选择的抗生素以便顺利地形成菌落，并且可以控制在转化体的细胞***过程中可以发育的不需要的没有载体的乳酸菌的发育。使用本领域已知的任意常规技术可以容易地进行抗生素的筛选过程，并且可以在上述过程中使用的选择的抗生素可以根据表达载体中包含的抗生素基因而变化。
此外，在本发明中，在下面实施例4中构建的表面表达载体(pKV-Pald PgsA-EGFP)的改进可以使用PgsA基因片段进行，以便它能够在乳酸菌宿主中更稳定地显示高的基因表达水平。
首先，在PgsA片段中，通过使用表面表达载体(pKV-Pald-PgsA-EGFP)作为模板并使用引物SEQ-ID NOs：11至20进行PCR，获得了分别含有1-60a.a、1-70a.a、1-80a.a、1-100a.a和1-188a.a的PgsA片段。
结果，获得了包含醛缩酶启动子和各个PgsA基序片段的DNA片段。每个DNA片段在其5′端包含SphI限制酶位点并且在其3′端包含BamHI限制酶位点。将获得的每个DNA片段用SphI和BamHI处理以获得片段。此外，证实PgsA1至A5基序片段分别具有SEQ ID NOs：21至25的核苷酸序列。
同时，在PgsA片段中，通过使用表面表达载体作为模板并使用引物SEQ ID NOs：26至31进行PCR，获得了分别含有25-60a.a、25-70a.a、25-100a.a的PgsA片段。
结果，获得了含有各个PgsA基序片段的DNA片段。每个片段在其5′端含有EcoRV限制酶位点并且在其3′端含有BamHI限制酶位点。将获得的DNA片段用EcoRV和BamHI处理以获得片段。此外，证实PgsA基序片段分别具有SEQ ID NOs：32至34的核苷酸序列。
本发明的一个目的是提供一种方法，包括：选择源自芽孢杆菌菌株并参与合成聚-γ-谷氨酸的外膜蛋白作为能够在微生物表面上表达大量外源蛋白的新的表面锚定基序；利用选择的外膜蛋白构建能够在微生物表面上表达外源蛋白或肽的表面表达载体；以及在使用所述表面表达载体获得的转化体的表面上高效表达外源蛋白。
为实现上述目的，本发明提供一种包含编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因pgsA的微生物表面表达载体，以及使用该载体转化的菌株。
为了实现上述目的，本发明还提供一种在使用所述微生物表面表达载体转化的菌株的表面上表达外源蛋白的方法。
由基因pgsA编码的蛋白质是存在于芽孢杆菌中的外膜蛋白质，并且是参与合成聚-γ-谷氨酸的蛋白质，聚-γ-谷氨酸是由枯草芽孢杆菌IFO3336(Bacillus subtilisIFO3336)(Natto；Biochem.Biophy.Research Comm.，263，6-12，1999)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC9945(Biotech.Bioeng.57(4)，430-437，1998)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(J.Bacteriology，171，722-730，1989)等产生的可食用的、水溶性的、阴离子型的可生物降解的聚合物。
从枯草芽孢杆菌IFO3336(Bacillus subtilis IFO3336)分离的外膜蛋白质由总共922个氨基酸组成，并由pgsB、pgsC和pgsA组成。pgsB由393个氨基酸组成，pgsC由149个氨基酸组成，pgsA由380个氨基酸组成。Ashiuchi等人克隆了源自枯草芽孢杆菌的聚-γ-谷氨酸合成酶基因，将该基因转化到大肠杆菌(E.coli)中，并且观察到该基因在大肠杆菌中合成[Ashiuchi等人，Biochem.Biophy.Res.Communications 263：6-12(1999)]。
然而，所述聚-γ-谷氨酸合成酶复合物中的pgsA蛋白的具体作用和功能尚未被发现。但是，在该复合物的蛋白质中，pgsB是酰胺连接酶***，pgsB的N末端的特定氨基酸与细胞膜或细胞壁相互作用，pgsA在其N末端和C末端具有亲水性的特定氨基酸序列。因此，推测这些氨基酸具有可以在pgsB的帮助下穿过细胞内膜的分泌信号、和靶向和粘附信号。
由本发明人进行的研究揭示，参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白由于其一级氨基酸序列的结构和特性，具有作为在细胞表面上表达外源蛋白的表面锚定基序的许多优点。这些优点如下。首先，参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白可以大量表达在细胞表面上，用于聚-γ-谷氨酸的合成和细胞外分泌。第二，表达的参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白即使在细胞周期的静止期也能稳定地保持。第三，结构上，pgsA从细胞表面突出出来。第四，参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白来源于***的表面，并且可以不仅在多种***而且在革兰氏阴性细菌的表面上稳定地表达。
本发明的一个目的是提供一种有用的载体，该载体利用参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白的特性能够在细菌表面上表达外源蛋白。具体地，根据本发明的用于表达靶蛋白的表面表达载体包含分泌信号和靶向信号，它们包含在参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白的一级序列中。
本发明的另一个目的是提供一种利用表面表达载体在微生物表面上表达外源蛋白的方法，该表面表达载体利用参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白的特性。具体地，本发明提供一种制备外源蛋白的方法，该方法通过使用参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白在微生物表面上表达外源蛋白，能使外源蛋白在没有细胞破坏或蛋白质分离/纯化过程的情况下被高效使用。
本发明的范围包括包含参与聚-γ-谷氨酸合成的全部种类的基因的所有表面表达载体，包括编码源自芽孢杆菌菌株并参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白的基因。
此外，根据本发明的包含聚-γ-谷氨酸合成酶基因的表面表达载体可以应用于所有类型的菌株以在微生物表面上表达外源蛋白。优选地，所述表面表达载体可以应用于革兰氏阴性细菌，更优选大肠杆菌(E.coli)、伤寒杆菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)和志贺氏菌(Shigella)，以及应用于***，优选芽孢杆菌(Bacillus)、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、产单核细胞李氏杆菌(Lysteria monocytogenes)和链球菌(Streptococcus)。使用上述菌株制备所有类型的外源蛋白的方法包括在本发明的范围内。
根据需要，可以将限制酶识别位点***聚-γ-谷氨酸合成酶基因的N末端或C末端，并且其内***有这些限制酶位点的表面表达载体全部包括在本发明的范围内。
具体地，本发明提供表面表达载体pKV-Pald-pgsA1至pKV-Pald-pgsA8，它们包含源自芽孢杆菌菌株的聚-γ-谷氨酸合成酶基因pgsA，并且可以使用***pgsA的C末端的限制酶识别位点容易地将各种外源基因克隆到其中。
本发明提供表面表达载体pKV-Pald-pgsA1至pKV-Pald-pgsA8，它们包含参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白复合物中的外膜复合物pgsA，并且可以在***的表面上，以通过将EGFP蛋白的N末端与pgsA的C末端连接得到的融合的蛋白形式表达EGFP蛋白。
具体地，在本发明的一个实施例中，参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白基因pgsA从枯草芽孢杆菌变种Chungkookjang(KCTC 0697BP)获得，但是，使用从产生聚-γ-谷氨酸的芽孢杆菌株获得的pgsA构建载体，或者使用该载体在微生物表面上表达外源蛋白也包括在本发明的范围内。例如，使用源自与枯草芽孢杆菌变种Chungkookjang中存在的pgsA基因的核苷酸序列具有至少80％的序列同源性的任何菌株的pgsA基因构建载体，或者使用该载体在微生物表面上表达外源蛋白也包括在本发明的范围内。
在本发明的另一个实施例中，使用选做模型蛋白的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)来检测是否在大肠杆菌细胞表面上高效表达蛋白质。“增强型绿色荧光蛋白(EGFP)”是一种在体内发射绿光使得能够容易观察表达相应蛋白的细胞的基因，并且具有能够在荧光显微镜下观察到的优点。GFP是一种来源于水母(Aeqourea victoria)的绿色荧光蛋白，并且已在许多研究领域中用作基因表达的重要标记物。EGFP是GFP的突变体，是由亮氨酸取代了GFP的氨基酸序列中第64位的苯丙氨酸并且苏氨酸取代了第65位的丝氨酸产生的，并且具有比原始GFP显示出更强荧光信号的优点。
本发明人通过将EGFP基因***上述构建的重组载体pKV-Pald-pgsA1至pKV-Pald-pgsA8中构建表面表达载体，用每一个表面表达载体转化干酪乳杆菌，然后培养转化的干酪乳杆菌以诱导蛋白质表达，并且通过收集一定量的培养物获得蛋白质。将得到的蛋白质用SDS-PAGE分析，并使用抗EGFP抗体进行蛋白质印迹，作为结果，证实EGFP蛋白成功***构建的重组载体pKV-Pald-pgsA1至pKV-Pald-pgsA8中，并在细胞表面上表达。
在下文中，将参照实施例更详细地描述本发明。对于本领域技术人员显而易见的是这些实施例仅用于更详细地描述本发明，并且根据本发明的主题的本发明的范围不受这些实施例的限制。
此外，在下面的实施例中，将EGFP蛋白用作外源蛋白质，但是任何其它蛋白质例如酶、抗原、抗体、粘附蛋白或吸附蛋白也可以用作外源蛋白。
此外，在下面的实施例中，构建应用于***的表面表达载体，并使用干酪乳杆菌作为宿主细胞，但是对于本领域技术人员显而易见是，除干酪乳杆菌之外的任何***可以用作宿主细胞，并且革兰氏阴性细菌和除***以外的其它细菌可以用所述表面表达载体转化。
实施例1：构建用于共表达两种抗原的表面表达载体pKV-Pald-pgsA-HPV16E7_Pgm-pgsA-EGFP
为了构建用于共表达两种抗原的表面表达载体，使用表面表达载体pKV-Pald-pgsA-E7(pKV-Pald-pgsA380L-HPV16E7；参见韩国专利No.10-1471043)，将编码Pgm-pgsA-EGFP的基因***Pald-pgsA-HPV16E7的C末端以获得能在乳酸菌的表面上共表达两种不同靶蛋白的载体pKV-Pald-pgsA-HPV16E7_Pgm-pgsA-EGFP。
首先，为了构建EGFP表达载体，移除pKV-Pald-pgsA-E7中与pgsA融合的HPV16 E7基因(参见韩国专利No.10-1471043)，并将编码EGFP的基因***该载体中。
使用合成的EGFP基因片段，使用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4进行PCR。
Figure BPA0000305142090000191
结果，获得了755-bp EGFP基因片段，该片段在其5′端包含BamHI限制酶位点并且在其3′端包含XbaI限制酶位点。将获得的DNA片段用BamHI和XbaI限制酶处理，用BamHI和XbaI切割载体pKV-Pald-pgsA-E7以移除HPV16 E7基因区，然后将EGFP基因与切割后的载体彼此连接以获得pKV-Pald-pgsA-EGFP。
此外，为了用半乳糖变旋酶启动子取代pKV-Pald-pgsA-EGFP载体中的醛缩酶启动子，使用引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6对干酪乳杆菌基因组进行PCR，获得在其5′端包含SphI限制酶位点并且在其3′端包含XbaI限制酶位点的半乳糖变旋酶启动子片段。将得到的DNA片段用SphI和XbaI限制酶处理，并且用相同的限制酶同样切割载体pKV-Pald-pgsA-EGFP以移除醛缩酶启动子区，然后将半乳糖变旋酶启动子和切割后的启动子相互连接以获得pKV-Pgm-pgsA-EGFP。
Figure BPA0000305142090000201
最后，为了将Pgm-pgsA-EGFP***pKV-Pald-pgsA-E7载体的E7区的C末端，使用pKV-Pgm-pgsA-EGFP载体作为模板并使用引物SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8进行PCR。
Figure BPA0000305142090000203
作为结果，获得了包含Pgm-pgsA-EGFP基因的2608-bp片段，该片段在其5′端包含EcoRI限制酶位点并且在其3′端包含FspI限制酶位点。将获得的编码Pgm-pgsA-EGFP的基因的DNA片段使用EcoRI和FspI限制酶位点***表面表达载体pKV-Pald-pgsA-HPV16E7中以获得1，1171-bp片段的pKV-Pald-pgsA-HPV16E7_Pgm-pgsA-EGFP(图1和图2)。
实施例2：通过蛋白质印迹法分析两种靶蛋白的表达
在本实施例中，用实施例1中构建的表面表达载体pKV-Pald-pgsA-HPV16E7_Pgm-pgsA-EGFP转化干酪乳杆菌。培养转化的重组干酪乳杆菌，分析HPV16E7和EGFP蛋白在其表面上的表达。通过蛋白质印迹法检测HPV16E7和EGFP蛋白是否在转化的重组干酪乳杆菌上表达。
将用本发明的表面表达载体转化的重组干酪乳杆菌在30℃下在MRS培养基(乳杆菌MRS，Becton Dickinson and Company Sparks，USA)中静置培养以诱导HPV16E7和EGFP蛋白的表达。
通过对培养的干酪乳杆菌全细胞进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并且使用针对pgsA、HPV16E7和EGFP的各自特异性抗体进行蛋白质印迹来分析融合蛋白质的表达。
具体地，用在相同细胞浓度下获得的蛋白质使其上诱导了蛋白质表达的重组干酪乳杆菌全细胞变性以制备样品。所述样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，然后将分离的蛋白质转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜(Bio-Rad)上。在封闭缓冲液(50mM Tris-HCl，5％脱脂奶，pH 8.0)中封闭其上转移有蛋白质的PVDF膜1小时，然后用在封闭缓冲液中以1∶1000稀释的针对pgsA、HPV16E7和EGFP的各自抗兔多克隆一级抗体孵育1小时。孵育完成后，用缓冲液清洗膜，并用在封闭溶液中以1∶10000稀释的HRP(辣根过氧化物酶)缀合的抗兔二级抗体孵育1小时。孵育完成后，用缓冲液清洗膜，将清洗过的膜用底物(Lumigen PS-3acridan，H2O2)显色约2分钟。然后，通过CCD相机观察针对pgsA、HPV16E7和EGFP的各自特异性抗体与融合蛋白之间的特异性结合(图3)。
图3示出了进行蛋白质印迹来分析用本发明的表面表达载体转化的重组干酪乳杆菌全细胞中pgsA、HPV16 E7和EGFP的表达水平的结果。在图3中，SM泳道表示蛋白质大小标记，泳道1表示干酪乳杆菌(空载体)，泳道2表示干酪乳杆菌(pKV-Pald-pgsA)上的表达，泳道3表示干酪乳杆菌(pKV-Pald-pgsA-HPV16E7)上的表达，泳道4表示干酪乳杆菌(pKV-Pgm-pgsA-EGFP)上的表达，泳道5表示干酪乳杆菌(pKV-Pald-pgsA-HPV16E7_Pgm-pgsA-EGFP)上的表达。
证实表面表达载体pKV-Pald-pgsA-HPV16E7_Pgm-pgsA-EGFP(泳道5)共表达了两种不同的蛋白质，不同于表达单个靶蛋白的表面表达载体pKV-Pald-pgsA-HPV16E7(泳道3)和pKV-Pgm-pgsA-EGFP(泳道4)。这表明，在所述表面表达载体中两个不同的启动子在相互不干扰的情况下能够稳定地共表达各自的靶蛋白。
实施例3：通过共聚焦荧光显微镜观察两种靶蛋白在微生物表面上的表达
为了检测本发明的表面表达载体的表达水平，通过共聚焦显微镜(Carl ZeissLSM800)观察荧光图像。
将用本发明的表面表达载体(pKV-Pald-pgsA-HPV16E7_Pgm-pgsA-EGFP)转化的重组干酪乳杆菌在30℃下在MRS培养基(乳杆菌MRS，Becton Dickinson and CompanySparks，USA)中静置培养以诱导HPV16E7和EGFP蛋白质在细胞表面上表达。接着，使每个蛋白质与各自的特异性抗体结合，然后用Alexa594(红色)免疫染色HPV16E7，并用Alexa488(绿色)免疫染色EGFP。然后，通过共聚焦显微镜观察每个抗原在细胞表面上的表达。
作为结果，如图4所示，可以确认，在用本发明的表面表达载体转化的重组干酪乳杆菌中稳定地共表达两种荧光颜色。
因此，预测本发明的表面表达载体可以转化到乳酸菌中，并且可以用作在短时间内高效共表达两种不同靶蛋白的方法，该方法与传统疫苗制备方法不同，不需要菌株解毒步骤。
实施例4：表面表达载体pKV-Pald-pgsA-EGFP的构建
为了构建用于EGFP表达的载体，使用表面表达载体pKV-Pald-PgsA-E7(参见韩国专利No.10-1471043)，将编码EGFP蛋白的基因***所述表面表达载体的PgsA的C末端以获得能够在乳酸菌的表面上表达EGFP蛋白的载体pKV-Pald-PgsA-EGFP。
首先，移除在pKV-Pald-PgsA-E7载体中与pgsA融合的HPV16E7基因，并将编码EGFP的基因***载体中。使用合成的EGFP基因片段作为模板，使用引物SEQ ID NOs：9和10进行PCR。
Figure BPA0000305142090000221
作为结果，获得了包含EGFP基因的755-bp片段，该片段在其5′端包含BamHI限制酶位点并且在其3′端包含XbaI限制酶位点。通过用BamHI和XbaI限制酶处理来切割获得的DNA片段以获得741-bp片段。
用BamHI和XbaI切割pKV-Pald-PgsA-E7以移除HPV16 E7基因区并获得载体区。
将用BamHI和XbaI切割的含E7基因的DNA片段与用相同限制酶切割的载体连接，从而构建pKV-Pald-PgsA-EGFP(图5)。
实施例5：表面表达载体中PgsA基序的改进
在这个实施例中，对实施例4中构建的表面表达载体(pKV-Pald-PgsA-EGFP)中的PgsA基因片段进行改进，使得该载体可以在乳酸菌宿主中表现出高表达水平。
首先，在PgsA片段中，通过使用表面表达载体pKV-Pald-PgsA-EGFP作为模板并使用下面的引物进行PCR，获得分别含有1-60a.a、1-70a.a、1-80a.a、1-100a.a和1-188a.a的PgsA片段。
PgsA基序1-60a.a
Figure BPA0000305142090000231
PgsA基序1-70a.a
Figure BPA0000305142090000232
PgsA基序1-80a.a
Figure BPA0000305142090000233
PgsA基序1-100a.a
Figure BPA0000305142090000234
PgsA基序1-188a.a
Figure BPA0000305142090000241
作为结果，获得了包含醛缩酶启动子和各个PgsA基序片段的DNA片段。每个DNA片段在其5′端包含SphI限制酶位点并在其3′末端包含BamHI限制酶位点。将获得的每个DNA片段用SphI和BamHI处理以获得片段。此外，证实PgsA1至PgsA5基序片段分别具有以下核苷酸序列。
PgsA 1-60a.a片段序列(PgsA1)
Figure BPA0000305142090000242
PgsA 1-70a.a片段序列(PgsA2)
Figure BPA0000305142090000243
PgsA 1-80a.a片段序列(PgsA3)
Figure BPA0000305142090000244
PgsA 1-100a.a片段序列(PgsA4)
Figure BPA0000305142090000251
PgsA 1-188a.a片段序列(PgsA5)
Figure BPA0000305142090000252
将pKV-Pald-PgsA-EGFP用SphI和BamHI切割以移除醛缩酶启动子和PgsA基因区并获得载体区。
将用SphI和BamHI切割并含有醛缩酶启动子和各个PgsA基序片段基因的每个DNA片段与用相同限制酶切割的载体连接，从而构建改进的载体(图6至图10)。
同时，在PgsA片段中，通过使用表面表达载体(pKV-Pald-PgsA-EGFP)作为模板并使用下面引物进行PCR，获得了分别包含25-60a.a、25-70a.a和25-100a.a的PgsA片段。
PgsA基序25-60a.a
Figure BPA0000305142090000261
PgsA基序25-70a.a
Figure BPA0000305142090000262
PgsA基序25-100a.a
Figure BPA0000305142090000263
作为结果，获得了包含各个PgsA基序片段的DNA片段。每个片段在其5′端包含EcoRV限制酶位点并在其3′端包含BamHI限制酶位点。将获得的每个DNA片段用EcoRV和BamHI处理以获得片段。此外，证实PgsA基序片段分别具有以下核苷酸序列。
PgsA 25-60a.a片段序列(PgsA6)
Figure BPA0000305142090000264
PgsA 25-70a.a片段序列(PgsA7)
Figure BPA0000305142090000265
Figure BPA0000305142090000271
PgsA 25-100a.a片段序列(PgsA8)
Figure BPA0000305142090000272
用EcoRV和BamHI切割pKV-Pald-PgsA-EGFP以移除PgsA基因区并获得载体区。
将用EcoRV和BamHI切割并包含各个PgsA基序片段基因的每个DNA片段与用相同限制酶切割的载体连接，从而构建改进的载体(图11至图13)。
实施例6：通过用PgsA基序改进的表面表达载体转化而获得的转化体上的表达的分析
在这个实施例中，用在实施例2中构建的每个PgsA基序改进的表面表达载体转化干酪乳杆菌，并培养转化的重组干酪乳杆菌并分析其上EGFP蛋白的表达。对于在转化的重组干酪乳杆菌上是否表达了与任一改进的片段pgsA1至pgsA8融合的EGFP蛋白进行检查。
将用包含每个PgsA基序片段的每个表面表达载体转化的重组干酪乳杆菌在30℃下在MRS培养基(乳杆菌MRS，Becton Dickinson and Company Sparks，美国)中静置培养，以诱导与参与聚-γ-谷氨酸合成的任一基因片段pgsA1至pgsA8的C末端融合的EGFP蛋白的表面表达。
通过对培养的干酪乳杆菌全细胞进行SDS-聚酰胺凝胶电泳并使用抗EGFP的特异性抗体进行蛋白质印迹来分析融合蛋白的表达。
具体地，用在相同细胞浓度下获得的蛋白质使在其上诱导了蛋白质表达的重组干酪乳杆菌全细胞变性以制备样品。该样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，然后将分离的蛋白质转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜(Bio-Rad)上。将其上转移有蛋白质的PVDF膜在封闭缓冲液(50mM Tris-HCl，5％脱脂奶，pH 8.0)中震摇封闭1小时，然后用在封闭缓冲液中以1∶1000稀释的抗EGFP的抗兔多克隆一级抗体孵育1小时。孵育完成后，用缓冲液清洗膜，并用在封闭溶液中以1∶10000稀释的HRP(辣根过氧化物酶)缀合的抗兔二级抗体孵育1小时。孵育完成后，用缓冲液清洗膜，将清洗过的膜用底物(Lumigen PS-3 acridan，H2O2)显色约2分钟。然后，通过CCD相机观察抗EGFP的特异性抗体与融合蛋白之间的特异性结合(图14)。
图14示出用于与本发明进行比较的作为对照的基于包含未改进的pgsA的重组表达载体pKV-Pald-pgsA的干酪乳杆菌的表达图案(泳道6和11)，和基于包含根据本发明的改进的pgsA1至pgsA8的重组表达载体pKV-Pald-pgsA1至pgsA8的干酪乳杆菌的表达图案(泳道1至5和泳道7至10)。
具体地，在图14中，泳道1表示用与PgsA基序1-60a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道2表示用与PgsA基序1-70a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道3表示用与PgsA基序1-80a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道4表示用与PgsA基序1-100a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道5表示用与PgsA基序1-188a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道6表示用pKV-Pald-PgsA-EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达。
另外，在图14中，泳道7表示用与PgsA基序26-50a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道8表示用与PgsA基序25-70a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道9表示用与PgsA基序25-100a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道10表示用与PgsA基序1-188a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道11表示用pKV-Pald-PgsA-EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达。
证实包含改进的PgsA基序片段的EGFP融合蛋白的表达比未改进的表面表达载体pKV-Pald-pgsA-EGFP的EGFP融合蛋白的表达更强。
工业实用性
本发明涉及一种使用源自干酪乳杆菌的缩醛酶启动子和半乳糖变旋酶启动子在微生物表面上共表达两种不同的靶蛋白的载体，使用该载体转化的微生物，以及一种新型载体，该新型载体使用源自芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株并参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白(pgsA)在微生物表面上高效地表达外源蛋白。根据本发明的表面表达载体是单一载体，包括：两个不同的启动子；编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因；以及连接到编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因上的编码靶蛋白的基因。因此，根据本发明的表面表达载体比现有技术发明具有如下优势：它可以共表达两种不同的靶蛋白，并且由于使用经所述表面表达载体转化的微生物，因此可以使在两个转化过程中可能发生的细胞转化的可能性最小化。此外，由于所述表面表达载体是包含两个不同启动子的单一载体，因此它可以在比常规技术发明更短的时间内高效表达靶蛋白，并且通过快速选择具有高药物潜力的物质并通过所述单一表面表达载体表达两种不同的靶蛋白而具有显著降低药物开发成本的优异效果。因此，本发明有工业实用性。
【序列表文本】
Figure BPA0000305142090000291
Figure BPA0000305142090000301
Figure BPA0000305142090000311
Figure BPA0000305142090000321
Figure BPA0000305142090000331
Figure IPA0000305142010000011
Figure IPA0000305142010000021
Figure IPA0000305142010000031
Figure IPA0000305142010000041
Figure IPA0000305142010000051
Figure IPA0000305142010000061
Figure IPA0000305142010000071
Figure IPA0000305142010000081
Figure IPA0000305142010000091
Figure IPA0000305142010000101
Figure IPA0000305142010000111
Figure IPA0000305142010000121
Figure IPA0000305142010000131

Claims (27)

1.一种用于表达靶蛋白的表面表达载体，该表面表达载体包括：第一启动子、编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因、和编码靶蛋白的基因；以及第二启动子、编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因、和编码靶蛋白的基因。
2.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述第一启动子由SEQ ID NO：1表示。
3.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述第二启动子由SEQ ID NO：2表示。
4.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因源自芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株。
5.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中，在所述编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因的末端***接头，并且所述编码靶蛋白的基因***已***的接头中。
6.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述靶蛋白是其中该靶蛋白的一部分氨基酸序列已经被移除或者以定点方式突变以便有利于表面表达的一种蛋白质。
7.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述第一启动子是源自乳酸菌的醛缩酶启动子(Pald)。
8.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述第二启动子是源自乳酸菌的半乳糖变旋酶启动子(Pgm)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的表面表达载体，其中，所述载体应用于革兰氏阴性或***。
10.一种用权利要求1至8中任一项所述的表面表达载体转化的微生物。
11.根据权利要求10所述的微生物，其中，用于转化的微生物是经修饰使其不产生参与所表达的靶蛋白降解的胞内或胞外蛋白酶，以便有利于所述靶蛋白的细胞表面表达的微生物。
12.根据权利要求10所述的微生物，其中，该微生物是乳酸菌。
13.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因是pgsA并具有SEQ ID NOs：21至24和32至34中的任意一种核苷酸序列。
14.根据权利要求13所述的表面表达载体，其中，所述基因pgsA源自产生聚-γ-谷氨酸的芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株。
15.根据权利要求13所述的表面表达载体，其中，所述编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因pgsA具有SEQ ID NO：25的核苷酸序列。
16.根据权利要求13所述的表面表达载体，其中，在所述基因pgsA的末端***接头，并且所述编码靶蛋白的基因***已***的接头中。
17.根据权利要求13所述的表面表达载体，其中，所述靶蛋白是其中该靶蛋白的一部分氨基酸序列已经被移除或者以定点方式突变以便有利于表面表达的一种蛋白质。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的表面表达载体，其中，该载体应用于革兰氏阴性或***。
19.一种使用权利要求13至17中任一项所述的表面表达载体转化的微生物。
20.根据权利要求19所述的微生物，其中，用于转化的微生物是经修饰使其不产生参与所表达的靶蛋白降解的胞内或胞外蛋白酶，以便有利于所述靶蛋白的细胞表面表达的微生物。
21.根据权利要求19所述的微生物，其中，该微生物是乳酸菌。
22.一种用于靶蛋白的细胞表面表达的方法，该方法包括以下步骤：通过培养权利要求10所述的转化的微生物在细胞表面上表达所述靶蛋白；以及回收在其表面上表达有所述靶蛋白的细胞。
23.一种在革兰氏阴性或革兰氏阳性宿主细胞的表面上表达靶蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
(a)通过将编码所述靶蛋白的基因***权利要求9所述的表面表达载体中构建重组载体；
(b)用所述重组载体转化所述革兰氏阴性或革兰氏阳性宿主细胞；和
(c)通过培养转化的宿主细胞在该转化的宿主细胞的表面上表达所述靶蛋白。
24.一种用于靶蛋白的细胞表面表达的方法，该方法包括以下步骤：通过培养权利要求19所述的转化的微生物在细胞表面上表达所述靶蛋白；以及回收在其表面上表达有所述靶蛋白的细胞。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述靶蛋白是选自激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号蛋白或其片段、抗体或其片段、单链抗体、结合蛋白、结合域、肽、抗原、粘附蛋白、结构蛋白、调节蛋白、毒素蛋白、细胞因子、转录调节因子、凝血因子和植物生物防御诱导蛋白中的任意一种。
26.一种通过将细胞施用于人以外的脊椎动物来诱导体液免疫或者细胞免疫的方法，所述细胞通过权利要求25所述的方法制备，并且其表面上具有表达的抗原。
27.一种在革兰氏阴性或革兰氏阳性宿主细胞的表面上表达靶蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过将编码所述靶蛋白的基因***权利要求18所述的表面表达载体中构建重组载体；
(b)用所述重组载体转化所述革兰氏阴性或革兰氏阳性宿主细胞；和
(c)通过培养转化的宿主细胞在所述革兰氏阴性或革兰氏阳性宿主细胞的表面上表达所述靶蛋白。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110066758A (zh) * 2019-06-06 2019-07-30 武汉骏安生物科技有限公司 一种高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌及其构建方法和应用
CN113330119A (zh) * 2018-10-10 2021-08-31 生物领先公司 使用源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子用于组成型高表达的表面表达载体及其用途
CN114702559A (zh) * 2022-04-02 2022-07-05 江西师范大学 枯草芽孢杆菌蛋白PgsA及其在表面展示***中的应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102401860B1 (ko) * 2021-10-21 2022-05-24 을지대학교 산학협력단 신규 항암 백신 조성물 및 그를 이용한 백신화 방법
KR102421307B1 (ko) * 2021-11-19 2022-07-14 을지대학교 산학협력단 암 발생 및 성장 억제를 위한 신규 항암 백신 조성물 및 그를 이용한 백신화 방법

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1539018A (zh) * 2001-08-10 2004-10-20 具有编码多聚-γ-谷氨酸合成酶的基因pgsBCA的表面表达载体以及利用该载体在微生物表面表达目的蛋白的方法
US6846481B1 (en) * 1999-02-04 2005-01-25 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Recombinant expression of heterologous nucleic acids in protozoa
US20050191720A1 (en) * 2004-02-27 2005-09-01 Bioleaders Corporation Surface expression method of peptides P5 and ANAL3 using the gene encoding poly-gamma-glutamate synthetase
CN1798844A (zh) * 2003-06-04 2006-07-05 生物领先公司 Sars病毒抗原的细胞表面表达载体和用该载体转化的微生物
KR20080086161A (ko) * 2007-03-22 2008-09-25 주식회사 바이오리더스 신규 항시적 고발현 프로모터 및 그 용도
CN101848997A (zh) * 2007-10-15 2010-09-29 生物领先公司 用于Myo-2肽多聚体和肌生成抑制素的融合蛋白表面表达载体以及由其转化的微生物
JP2012514469A (ja) * 2009-01-08 2012-06-28 バイオリーダーズ コーポレーション 安定的な構成的高発現子宮頸癌治療ワクチン用ベクター及びそれによって形質転換された組換え乳酸菌
US20140045235A1 (en) * 2012-08-12 2014-02-13 Wisconsin Alumi Research Foundation Construction of a lactobacillus casei ethanologen
CN104011212A (zh) * 2011-12-27 2014-08-27 东洋大学产学协力团 利用大肠杆菌yiat蛋白质的靶蛋白的表面表达方法
CN107446872A (zh) * 2017-08-29 2017-12-08 东北农业大学 一种组成型表达兔病毒性出血症病毒vp60蛋白的重组乳酸菌疫苗株及其制备方法和用途
CN112334580A (zh) * 2018-06-26 2021-02-05 生物领先公司 利用源自芽孢杆菌菌株的聚γ-谷氨酸合成基因的表面表达载体以及使用该载体在微生物表面表达蛋白的方法
CN113330119A (zh) * 2018-10-10 2021-08-31 生物领先公司 使用源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子用于组成型高表达的表面表达载体及其用途

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5990091A (en) * 1997-03-12 1999-11-23 Virogenetics Corporation Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof
KR100525759B1 (ko) * 2002-10-17 2005-11-03 한국생명공학연구원 바실러스 속 균주 유래의 폴리 감마 글루탐산합성유전자를 이용한 펩타이드 항생물질 Ｐ5와Ａｎａｌ3의 표면 발현 방법 및 그의 용도
KR100690948B1 (ko) * 2004-06-17 2007-03-09 한국과학기술원 대장균의 외막 단백질을 이용한 목적 단백질의 미생물표면발현 방법
KR100784261B1 (ko) * 2006-01-02 2007-12-11 한국과학기술원 탄저균의 포자외막 단백질을 이용한 목적단백질의 미생물표면발현방법
JP2010088332A (ja) 2008-10-07 2010-04-22 Japan Health Science Foundation 複数の遺伝子発現を行うための発現ベクター
US20110091493A1 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Northwestern University Vaccine compositions and uses thereof

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6846481B1 (en) * 1999-02-04 2005-01-25 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Recombinant expression of heterologous nucleic acids in protozoa
CN1539018A (zh) * 2001-08-10 2004-10-20 具有编码多聚-γ-谷氨酸合成酶的基因pgsBCA的表面表达载体以及利用该载体在微生物表面表达目的蛋白的方法
CN1798844A (zh) * 2003-06-04 2006-07-05 生物领先公司 Sars病毒抗原的细胞表面表达载体和用该载体转化的微生物
US20050191720A1 (en) * 2004-02-27 2005-09-01 Bioleaders Corporation Surface expression method of peptides P5 and ANAL3 using the gene encoding poly-gamma-glutamate synthetase
KR20080086161A (ko) * 2007-03-22 2008-09-25 주식회사 바이오리더스 신규 항시적 고발현 프로모터 및 그 용도
CN101848997A (zh) * 2007-10-15 2010-09-29 生物领先公司 用于Myo-2肽多聚体和肌生成抑制素的融合蛋白表面表达载体以及由其转化的微生物
JP2012514469A (ja) * 2009-01-08 2012-06-28 バイオリーダーズ コーポレーション 安定的な構成的高発現子宮頸癌治療ワクチン用ベクター及びそれによって形質転換された組換え乳酸菌
CN104011212A (zh) * 2011-12-27 2014-08-27 东洋大学产学协力团 利用大肠杆菌yiat蛋白质的靶蛋白的表面表达方法
US20140045235A1 (en) * 2012-08-12 2014-02-13 Wisconsin Alumi Research Foundation Construction of a lactobacillus casei ethanologen
CN107446872A (zh) * 2017-08-29 2017-12-08 东北农业大学 一种组成型表达兔病毒性出血症病毒vp60蛋白的重组乳酸菌疫苗株及其制备方法和用途
CN112334580A (zh) * 2018-06-26 2021-02-05 生物领先公司 利用源自芽孢杆菌菌株的聚γ-谷氨酸合成基因的表面表达载体以及使用该载体在微生物表面表达蛋白的方法
CN113330119A (zh) * 2018-10-10 2021-08-31 生物领先公司 使用源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子用于组成型高表达的表面表达载体及其用途

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABIDA ZAHIROVIĆ等: "Dual functionalized Lactococcus lactis shows tumor antigen targeting and Cytokine binding in Vitro", FRONT BIOENG BIOTECHNOL, vol. 10, 26 January 2022 (2022-01-26), pages 1 - 17 *
ALEŠ BERLEC等: "Single plasmid systems for inducible dual protein expression and for CRISPR-Cas9/CRISPRi gene regulation in lactic acid bacterium Lactococcus lactis", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 08, 17 January 2018 (2018-01-17), pages 1 - 11 *
ATSUSHI SHIMIZU等: "Dual promoter expression system with insulator ensures a stringent tissue-specific regulation of two reporter genes in the transgenic fish", TRANSGENIC RES, vol. 22, 16 September 2012 (2012-09-16), pages 435 - 444 *
FAN ZHANG等: "Dual promoter strategy enhances co-expression of α-L-rhamnosidase and enhanced fluorescent protein for whole-cell catalysis and bioresource valorization", SCIENCE OF THE TOTAL ENVIRONMENT, vol. 722, 11 March 2020 (2020-03-11), pages 1 - 10, XP086143696, DOI: 10.1016/j.scitotenv.2020.137865 *
KYUNG-JIN KIM等: "Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes", PROTEIN SCIENCE, vol. 13, 30 June 2004 (2004-06-30), pages 1698, XP008045869, DOI: 10.1110/ps.04644504 *
MAZE, A.等: "Lactobacillus casei BL23 complete genome, strain BL23", GENBANK, 27 February 2015 (2015-02-27), pages 177140 *
PARK, Y.C.等: "KR 1020210046811-A/1: SURFACE EXPRESSION VECTOR USING TWO KINDS OFPROMOTERS DERIVED FROM LACTOBACILLUS CASEI FOR CONCURRENTLY EXPRESSINGTWO TARGET PROTEINS AND METHOD FOR EXPRESSING PROTEINS ON MICROBIALSURFACE BY USING SAME", GENBANK, 16 December 2021 (2021-12-16), pages 278457 *
PARK, Y.C等: "KR 1020210046811-A/2: SURFACE EXPRESSION VECTOR USING TWO KINDS OFPROMOTERS DERIVED FROM LACTOBACILLUS CASEI FOR CONCURRENTLY EXPRESSINGTWO TARGET PROTEINS AND METHOD FOR EXPRESSING PROTEINS ON MICROBIALSURFACE BY USING SAME", GENBANK, 16 December 2021 (2021-12-16), pages 278458 *
RAMU S. VEMANNA等: "A modified multiste gateway cloning strategy for consolidation of genes in plants", MOL BIOTECHNOL, vol. 53, 25 January 2012 (2012-01-25), pages 129 - 138, XP035153586, DOI: 10.1007/s12033-012-9499-6 *
刘峰涛等: "催乳素和外源基因乳腺共表达载体可提高外源基因在哺乳细胞的表达", 遗传, no. 05, 28 September 2004 (2004-09-28), pages 567 - 573 *
周红等: "不同启动子及锚定蛋白对酿酒酵母表面展示β-葡萄糖苷酶活性的影响", 农业生物技术学报, vol. 28, 19 October 2020 (2020-10-19), pages 1849 - 1861 *
王文骞: "表达IBDV-VP2新型重组乳酸菌的构建及其免疫效果的评价", 中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑, no. 09, 15 September 2019 (2019-09-15), pages 1 - 53 *
鞠珑株: "组成型乳酸菌表达载体的构建及表达效果的比较", 中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）基础科学辑, no. 01, 15 January 2015 (2015-01-15), pages 1 - 75 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113330119A (zh) * 2018-10-10 2021-08-31 生物领先公司 使用源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子用于组成型高表达的表面表达载体及其用途
CN113330119B (zh) * 2018-10-10 2024-07-12 生物领先公司 使用源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子用于组成型高表达的表面表达载体及其用途
CN110066758A (zh) * 2019-06-06 2019-07-30 武汉骏安生物科技有限公司 一种高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌及其构建方法和应用
CN114702559A (zh) * 2022-04-02 2022-07-05 江西师范大学 枯草芽孢杆菌蛋白PgsA及其在表面展示***中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
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