CN113325183A - 一种用于鉴别诊断em/fem的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及鉴别卵巢子宫内膜异位症/卵巢其他良性肿瘤试剂及其应用。本发明提供检测受试者样本中生物标志物含量的试剂在制备用于卵巢子宫内膜异位症/卵巢其他良性肿瘤鉴的鉴别诊断产品中的应用,所述生物标志物包括CA125、SELL、LILRA3、IGKC和/或DSC2。本发明提供了一种用于卵巢子宫内膜异位症/卵巢其他良性肿瘤鉴别诊断的标志物,CA125、SELL、LILRA3、IGKC和/或DSC2,可用于制备鉴别诊断EM/FEM的检测试剂盒等,其鉴别特异性好,灵敏度高。采用该试剂盒可以提高临床EM/FEM鉴别诊断的准确性,从而使患者获得更加准确的治疗措施,获得更佳的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及用于鉴别诊断卵巢子宫内膜异位症/卵巢其他良性肿瘤的试剂盒。
背景技术
子宫内膜异位症(内异症)是一种常见的妇科良性疾病,其特征是功能性子宫内膜腺体和间质生长于子宫腔外。大约每10位育龄期女性中就会有一位子宫内膜异位症患者。然而,在寻求***症评估的女性中,其发病率约50%,且更容易出现疾病进展;在疼痛患者中的发病率则高达70%。子宫内膜异位症在组织形态学上为良性病变,但在生物行为上可呈现出肿瘤样特征,如侵袭、种植和远处转移等。子宫内膜异位症临床表现纷繁复杂,干扰患者的正常生活,严重者可造成沉重的心理压力。早期发现对于及时有效的治疗起着至关重要的作用,但子宫内膜异位症的诊断金标准为腹腔镜手术,这对门诊普通患者的精确诊断带来了极大的困难。因此,通过影像学检查或者易获取的生物学标本(如血液、尿液和唾液等)进行无创性子宫内膜异位症诊断的价值不容忽视。
卵巢子宫内膜异位症(EM)又称卵巢巧克力样囊肿,因子宫内膜样组织种植于卵巢表面反复出血形成囊肿,是子宫内膜异位症最常见类型之一。部分EM患者出现痛经、***、慢性盆腔痛等症状,影响患者生活质量,部分患者仅因发现卵巢肿物而就诊。据统计,大约有5%至10%的女性在一生中的某个时期因可疑性的卵巢肿瘤而接受手术治疗。EM治疗方式包括药物治疗和手术治疗,有研究者指出,EM相关的手术治疗会导致***丢失以及卵巢组织不同程度的破坏,还可能造成抗苗勒管激素水平的下降,因此手术的实施应当认真考虑患者的整体情况,准确的术前诊断有助于对患者进行个体化治疗。多数研究仅纳入内异症患者及健康人群作为实验组及对照组,尚缺乏针对EM鉴别诊断的相关标志物研究。
盆腔超声检查,尤其是经***超声(TVUS),是初步诊断EM的有效方法,但其诊断依赖于超声科医生的主观判断和仪器的精密程度,因此该准确率并不稳定。一项Meta分析比较了术前鉴别良恶性卵巢肿物的19种方法,发现不同方法准确率差别较大,最有效者灵敏度为93%,特异度为81%,如需区分EM和其他良性肿瘤,卵巢肿物鉴别难度将进一步增加。血清癌抗原125(CA125)是临床工作中常用的EM鉴别诊断标志物,但其准确性及稳定性仍然存在争议。随着高通量技术的不断发展,蛋白质组学技术成为查找标志物的重要手段,数据非依赖性的扫描模式(DIA)是一种较新的靶向定量蛋白质组学质谱数据采集方式。目前,高灵敏度、高特异性和高临床相关性的EM鉴别诊断生物标志物尚有待发现。
发明内容
针对上述问题,本发明的目的在于提供一种用于卵巢子宫内膜异位症(EM)/卵巢其他良性肿瘤(FEM)鉴别诊断的生物标志物CA125、SELL、LILRA3、IGKC和/或DSC2及其在制备产品中的应用。
为实现上述目的,本发明具体技术方案如下:
第一方面,本发明提供了检测受试者样本中生物标志物含量的试剂在制备用于卵巢子宫内膜异位症/卵巢其他良性肿瘤的鉴别诊断产品中的应用,所述生物标志物包括CA125、SELL、LILRA3、IGKC和/或DSC2。
在一些实施方式中,与对照样本相比,所述CA125、DSC2和IGKC在卵巢子宫内膜异位症患者样本中表达水平升高;所述SELL和LILRA3在卵巢子宫内膜异位症患者样本中表达水平降低。
在一些实施方式中,所述对照样本为卵巢其他良性肿瘤样本。
在一些实施方式中,所述检测受试者样本中生物标志物含量的试剂包括质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中,所述产品包括试剂盒、芯片或试纸条。
在一些实施方式中,所述试剂包括质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段、引物和探针。
第二方面,本发明提供了一种用于鉴别诊断卵巢子宫内膜异位症/卵巢其他良性肿瘤的检测试剂盒,所述试剂盒包括检测受试者样本中CA125、SELL、LILRA3、IGKC和/或DSC2表达水平的试剂。
在一些实施方式中,所述试剂盒包括检测受试者样本中CA125和/或IGKC表达水平的试剂。
在一种优选实施方式中,所述试剂盒包括检测受试者样本中CA125和IGKC表达水平的试剂。所述试剂盒鉴别诊断EM/FEM的AUC为0.786,当CA125>0.1ng/ml且IGKC>504.52ng/ml设定为阳性(即诊断为EM),诊断的敏感性为85.23%、特异性为62.22%。
在一些实施方式中,所述试剂包括质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中,所述试剂通过Elisa、Western Blot、质谱法检测。
第三方面,本发明提供了一种针对年龄<45岁且肿瘤直径<5cm的子宫内膜异位症和卵巢其他良性肿瘤患者的鉴别诊断试剂盒,所述试剂盒包括检测待测者样本中CA125和IGKC的含量的试剂。
基于上述技术方案,本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种用于EM/FEM鉴别诊断的标志物,CA125、SELL、LILRA3、IGKC和/或DSC2,可用于制备EM/FEM的鉴别诊断试剂盒等,其鉴别特异性好,灵敏度高。采用该试剂盒可以提高临床EM/FEM鉴别诊断的准确性,从而使患者获得更加准确的治疗措施,获得更佳的治疗效果。
附图说明
图1DIA方法流程图。
图2各组韦恩图,(A)以EM为对照的差异蛋白分析;(B)以OC为对照的差异蛋白分析;(C)以FEM为对照的差异蛋白分析。
图3GO富集分析EM与FEM组差异蛋白;纵坐标为GO条目,横坐标表示差异蛋白在对应的功能条目中的富集情况,-Log10 P-Value的值越大,差异蛋白和该功能越相关,可以重点对该功能的差异蛋白展开分析。
图4不同蛋白标志物在EM/FEM/OC组患者血清中的浓度差异。
图5CA125的ROC曲线图。
图6IGKC的ROC曲线图。
图7DSC2的ROC曲线图
图8SELL的ROC曲线图。
图9LILRA3的ROC曲线图。
图10CA125+SELL+LILRA3+IGKC+DSC2,5个蛋白标志物联合ROC曲线图。
图11CA125+IGKC+DSC2,3个蛋白标志物联合ROC曲线图。
图12CA125+IGKC,2个蛋白标志物联合ROC曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所有的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
本发明利用蛋白质组学技术探索用于内异症患者鉴别的诊断性生物标志物。在蛋白质标志物的筛选阶段,发明人采用DIA技术对于所收集的EM组、FEM组及OC组患者的血清样本进行蛋白质检测,对于检测结果进行差异蛋白分析,从中查找到4个具有潜在鉴别诊断价值的蛋白标志物(SELL、LILRA3、IGKC和DSC2)。EM与FEM两组差异蛋白功能分析显示,主要集中于代谢通路(如各种氨基酸代谢通路)以及PPAR信号通路、AMPK信号通路和细胞粘附分子(CAMs)通路。
在蛋白标志物验证阶段,发明人共选取5种蛋白,分别为CA125、SELL、LILRA3、IGKC和DSC2。经过分析发现,对于EM和FEM的诊断,就单一标志物来说,IGKC和CA125诊断能力较强;总的来说,5种蛋白质标志物组合诊断能力最强。CA125+IGKC组合更适合临床应用。
目前国际上尚缺乏妇科及影像学统一的精确测量标准划定,Muzii等研究者建议以内异症囊肿最大直径为5cm为界划分大或者小,对于肿瘤大小5cm以内且有生育需求的年轻女性,建议限制手术的实施以减少医源性卵巢储备功能降低的风险。
基于以上理论,发明人先以45岁为界将患者进行分组,对于年龄<45岁的亚组,仅就EM和FEM患者进行分析,发现CA125的AUC更大。患者≥45岁时,IGKC对EM和FEM患者鉴别能力强。同样发明人就肿瘤大小进行了分层分析,对于EM和FEM,无论肿瘤直径<5cm或者肿瘤直径≥5cm的患者群体,CA125诊断能力都更强,AUC分别是0.854和0.751。最后,发明人对年龄小于45岁肿瘤小于5cm的患者分析,发现CA125+IGKC能够更好地在该群体中鉴别出异位症患者。分层分析为异位症患者的个体化管理提供参考,协助医生做出灵活的处理。
实施例1筛选与EM/OC/FEM相关的蛋白质标志物
一、实验材料
1.研究样本
收集并纳入2019年1月至2020年1月于北京协和医院妇产科就诊并接受手术治疗的三组疾病类型患者共计30例,患者的基本情况见表1。
(1)卵巢子宫内膜异位症组(EM组)10例:纳入患者术前半年未进行子宫内膜异位症相关药物的治疗。
(2)卵巢恶性肿瘤组(OC组)10例:病理符合上皮性卵巢癌。
(3)卵巢其他良性肿瘤组(FEM组)10例:病理除外合并子宫内膜异位症。
表1蛋白标志物筛选患者群体的基本信息
IQR:四分位差距;
#:子宫内膜异位症分期参照美国生育协会修正分期法(r-AFS);
*:参照卵巢癌的FIGO分期原则
2.样本采集与存储
(1)所有患者均于入院后手术之前,通过真空促凝采血管采集静脉血5ml,置于干净的实验台试管架上,室温(25℃左右)竖直静置30min。
(2)4℃条件下,以1600G离心10min,取上清至EP管中。
(3)血清样本保存于-80℃冰箱待后续使用。
3.主要实验试剂与耗材
色谱级乙腈:美国,ABI公司;
尿素、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、CHAPS:美国,Bio-Rad公司;
Tris:美国,USB公司;
氨水、甲酸(FA):美国,Sigma-Aldrich公司;
质谱级胰蛋白酶:美国,Promega公司;
硫脲:美国,Sigma-Aldrich;
Protease Inhibitor Cocktail:美国,Roche公司;
10KD超滤管、Ziptip C18萃取柱:美国,Milipore公司。
4.主要实验仪器
酶标仪(Synogen4):美国,Thermo公司;
RIGOL L-3000高效液相色谱:北京普源精电科技有限公司;
Orbitrap Fusion质谱仪:美国,Thermo公司;
真空干燥仪:美国,Thermo公司;
5.试剂配制
1)裂解液
称取7M尿素,2M硫脲,0.1%CHAPS,取1片Protease Inhibitor Cocktail,加去离子水在50mL离心管中混合定容至50mL。
2)1M DTT
称取0.154g DTT,加入1mL 25mM NH4HCO3,振荡使其充分溶解,保存于-20℃条件下。
3)1M IAA
称取0.185g IAA,加1mL 25mM NH4HCO3,振荡使其充分溶解,现用现配,注意避光。
二、实验方法
1.样本蛋白的提取
使用去高丰度柱子(Thermo,货号:A36370)对血清蛋白进行去高丰度,过程如下:血清样本13000r/min,离心10min,取上清;将色谱柱平衡到室温;加入10μL血清样本;颠倒混匀,使树脂均匀的分布在血清中;室温下,在旋转混匀器上孵育10min;将柱子放入2mL收集管中,1000g/min,离心2min;丢弃含有树脂的色谱柱,得到血清低丰度蛋白。
2.Bradford方法测定蛋白浓度
将试剂盒中2μg/μL的BSA,用裂解液配成0μg/μL,0.025μg/μL,0.125μg/μL,0.25μg/μL,0.5μg/μL,0.75μg/μL,1μg/μL,1.5μg/μL浓度梯度的BSA标准品溶液;向96孔板每个孔中分别加入10μL不同的浓度的标准品溶液或蛋白样品,相同样品做3个平行复孔;再向分别向每个孔中加入300μL的Bradford工作液,避光条件下反应5-10min;用酶标仪测定样本波长在595nm处的吸光度;根据标准品的浓度及相应的吸光度绘制浓度/吸光度标准曲线,并得到根据吸光度计算蛋白浓度的公式,计算各样品蛋白浓度。
3.膜辅助溶液内蛋白酶切
1)蛋白质的还原:
每个样品分别取等量蛋白加入10KD的超滤管中,按溶液总体积与1MDTT体积比为40:1加入1MDTT(使DTT的终浓度为25mM),涡旋混匀,放入水浴锅中以37℃水浴1h,取出放至室温待冷却
2)蛋白质的烷基化:
将还原后的样品按溶液总体积与1M IAA体积比为20:1加入1MIAA(使IAA的终浓度为50mM),涡旋混匀,避光条件下于室温放置30min。
3)清洗样品:
加入5倍稀释的TEAB 300μL,12,000rpm(13,400g)离心10min,弃掉收集管底部溶液,重复3次,再加入2倍稀释的TEAB 300μL,12,000rpm(13,400g)离心10min。
4)膜辅助溶液内酶切蛋白:
更换新的收集管,在超滤管中加入胰蛋白酶,总量与蛋白质量比设置为1:50,体积50μL,37℃条件下反应过夜。
5)多肽的收集:
次日,加入2倍稀释的TEAB 100μL,12,000rpm(13,400g)离心10min,重复3次,酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部。
4.高pH反相C18色谱分离
1)将多肽样品重溶于A液(98%ddH2O,2%乙腈,氨水调pH至10.0)中,每组取等量混合。
2)经离线peptide BEH C18高效液相色谱柱(3.5μm,4.6mm×15mm)分离,洗脱缓冲液B1液为98.0%乙腈,2.0%去离子水(pH10.0),分离梯度见表2。流速1mL/min,分离46min。
3)每隔1min收集一管组分,共收集40个分离组分。按照1、11、21、31;2、12、22、32;3、13、23、33;4、14、24、34;……的梯度顺序将样品合并为10管组分。
4)将收集的组分置于旋转真空干燥仪中,真空干燥,-20℃冻存备用。
表2高pH反相色谱梯度
5.Ziptip C18固相萃取
1)C18固相萃取柱活化:吸取100μL 100%ACN,吹打干净,重复两次。
2)C18固相萃取柱平衡:吸取10μL 2%ACN 0.1%FA,清洗萃取柱中残留的ACN,吹打干净,重复两次。
3)上样:反复吸取和吹打酶切好的多肽溶液,重复10次以上。
4)清洗脱盐:吸取10μL 2%ACN 0.1%FA,清洗样品中的盐,重复五次。
5)洗脱:吸取10μL 50%ACN 0.1%FA,反复吹打10次,用EP管收集洗脱液。再重复一遍,合并洗脱液。
6)将收集的洗脱液置于旋转真空干燥仪中,在不加热的条件下,真空抽干后,置于-80℃冰箱保存备用。
6.DDA进行信号采集
6.1LC-MS/MS扫描
1)将多肽组分重溶于20μL 0.1%FA溶液中,在每个馏分中分别加入2μL iRT试剂。
2)经过EASY-nLC液相,低pH反相C18毛细管色谱(150μm×150mm,1.9μm)分离,A相为99.9%H2O和0.1%FA,B相为99.9%ACN,0.1%FA,有效洗脱梯度为3%-35%,总洗脱时间设置为90min,流速0.5μL/min。液相条件如表3。
3)使用Orbitrap Fusion质谱仪分析鉴定多肽混合物。使用高灵敏度模式,仪器参数设置为:每个全扫描为高速信号依赖扫描,扫描时间共计为90min。一级全扫描分辨率为60000,扫描范围为设置为300-1400m/z,AGC5e5,最大注射时间为50ms,碰撞能量为32%,二级扫描分辨率为15000,电荷状态筛选(包含+2至+6电荷的前体),AGC 5e4,最大注射时间为45ms。
表3低pH反相色谱梯度
6.2数据分析
1)收集所得质谱数据,经过Proteome Discoverer(version 2.3.0.523)软件进行检索,数据库为:uniprot_human_75778_20201211_iRT.fasta(序列总数73940个)。
2)检索参数为:相应物种的蛋白数据库,胰蛋白酶酶切,最多2个漏切位点,母离子和碎片离子质量误差分别为10ppm和0.02Da,固定修饰为Carbamidomethyl(C),可变修饰为Oxidation(M),Acetyl(N-terminal)。多肽和蛋白假阳性率设置为(FDR)<1.0%,每个蛋白至少鉴定到1个特异性多肽。
3)统计分析窗口大小,窗口设置如下:
表4DIA窗口设置
7.DIA进行信号采集
LC-MS/MS扫描
1)取定量后的多肽10μg/样,重溶于20μL 0.1%FA溶液中,并混入2μLiRT试剂。
2)经过EASY-nLC液相,低pH反相C18毛细管色谱(150μm×150mm,1.9μm)分离,液相条件如“低pH反相色谱梯度”所述。
3)修改质谱可变窗口,扫描时间为90min,碰撞能量:32%;一级扫描分辨率设置为60000,二级分辨率为30000;母离子最大注入时间50ms;母离子扫描范围:300-1300m/z;子离子扫描范围:从300m/z开始;设置35个扫描窗口;窗口大小根据一级母离子数目确定,平均分布。
8.搜库与建库
1)基于质谱检测得到的Raw文件,利用Spectronaut Pulsar软件进行搜库,导入PD搜库结果,建立谱图库。
2)导入DIA数据,与谱图库中数据进行匹配,q value<1.0%,通过iRT试剂校正保留时间。DIA方法整体流程如图1所示:
9.数据质控分析
色谱质谱联用仪器构造精密,在使用过程中有很多因素会造成样品采集的***误差,比如:温度、湿度、仪器的清洁程度等。通过两种方式进行质量控制:样本平行性质控和变异系数(CV)值区间统计。
10.生物信息学分析
10.1差异蛋白筛选
差异候选蛋白的选取需要根据变化倍数、统计学显著性共同判断。在数据分析中,选取2组样本间ratio≤(1-2*SD)或ratio≥(1+2*SD),并且P value<0.05的蛋白作为候选差异蛋白。
10.2差异蛋白分析
1)Venn分析:对组别间的差异蛋白进行韦恩图分析,通过比较,直观展示差异性蛋白。
以上差异蛋白分析均由Perseus(版本:1.5.5.1)软件完成。
2)功能分析:
利用OmicsBox(版本:1.3.11)软件的Blast2GO功能注释模块对差异表达蛋白进行GO分析,从蛋白质的生物过程(BP)、分子功能(MF)、细胞组分(CC)进行基因富集分析。
利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)公共数据库,对差异蛋白进行通路分析。
三、结果
1.差异蛋白的筛选
筛选标准为:Fold Change≥1.4,校正后P<0.05,三组之间进行互相比较,各组差异蛋白统计结果如表5所示。
表5差异蛋白统计结果
本研究中,每组差异蛋白质不仅数量不同,而且不同的蛋白质存在于不同的组别或同一蛋白质同时存在于不同组别中。发明人对组别间的差异蛋白进行韦恩图分析,图2A、图2B和图2C分别从EM、OC和FEM的角度分析差异蛋白。
其中,发明人以EM组为对照进行对比后,发现4个重叠差异性蛋白,即蛋白ID分别为P14151、A0A0G2JMY9、P01834和A0A3B3ISU0的蛋白质,其对应蛋白名称分别为SELL(L-selectin,选择素L)、LILRA3(Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily Amember 3,白细胞免疫球蛋白样受体A亚家族成员3)、IGKC(Immunoglobulin kappaconstant,免疫球蛋白轻链kappa)和DSC2(Desmocollin-2,桥粒芯胶蛋白2)。
2.差异蛋白的功能分析
2.1差异蛋白GO分析
EM与FEM差异蛋白进行GO富集分析后,结果如图3所示。
可以看出,在BP方面主要集中于positive regulation of anion transmembranetransport、response to organophosphorus和regulation of anion transmembranetransport等,在CC方面主要集中于extrinsic component of organelle membrane、extrinsic component of Golgi membrane和lumenal side of Golgi membrane等,在MF方面主要集中于carboxylic ester hydrolase activity、lipase activity和glycolipidbinding等。
2.2差异蛋白KEGG分析
EM与FEM两组差异蛋白分别进行KEGG富集分析,主要集中于代谢通路(如各种氨基酸代谢通路)以及PPAR信号通路、AMPK信号通路和细胞粘附分子(CAMs)通路等。
实施例2蛋白质标志物验证
一、实验材料
1.研究样本
收集2019年1月至2020年1月于北京协和医院妇产科就诊的住院203例患者的血清样本进行蛋白质标志物的验证,其中EM组患者88例、FEM组患者90例、OC组患者25例,所有纳入患者的基本信息见表6。
样本的纳入标准:
纳入标准:a.超声结果发现附件肿物或盆腔包块,可疑EM或OC或意义不明者;b.确定于北京协和医院行手术治疗。
排除标准:a.合并其他妇科良恶性肿瘤;b.临床可疑恶性肿瘤;c.其他***恶性肿瘤或恶性肿瘤病史;d.怀孕者。
表6蛋白标志物筛选患者群体的基本信息
IQR:四分位间距;
#:子宫内膜异位症分期参照美国生育协会修正分期法(r-AFS);
*:参照卵巢癌的FIGO分期原则
2.样本采集与存储
同实施例1中的方法相同。
3.实验试剂
人卵巢癌抗原CA125试剂盒(产品编号:SEKH-0527),人L选择素试剂盒(L-Selectin,产品编号:SEKH-0231),人白细胞免疫球蛋白样受体A3试剂盒(LILRA3,产品编号:SEKH-0528)购自北京,Solarbio(北京索莱宝科技有限公司);
人免疫球蛋白轻链kappa试剂盒(κ-IgKC)购自上海信裕生物科技有限公司;
人桥粒芯胶蛋白-2试剂盒(Desmocollin-2,产品编号:ELH-DSC2)购自美国,RayBiotech公司。
4.主要仪器设备及耗材
自动洗板机(PW-960),深圳市汇松(HEALES)科技发展有限公司;
酶标仪(Multiskan GO):美国,Thermo公司;
化学发光成像***(Fusion):法国,Vilber。
二、ELISA实验方法
1.准备步骤
(1)试剂回温:首先在实验前30min将试剂盒、待测样本放置于室温下(18℃-25℃),浓缩洗涤液如出现结晶则放入水浴锅中37℃进行溶解。
(2)配制洗涤液:预先计算好稀释后的洗涤液使用体积,用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成1倍应用液,未用完的浓缩洗涤液放入4℃冰箱保存。
(3)标准品梯度稀释:加入标准品/样本稀释液(SR1)0.5ml至冻干标准品中,静置15分钟,待其完全溶解后轻轻混匀(浓度为20ng/ml),然后按照以下浓度进行2倍稀释:10、5、2.5、1.25、0.625、3.125、0ng/ml进行稀释,20ng/ml为标准曲线最高点浓度,标准品/样本稀释液(SR1)作为标准曲线的零点(0pg/ml)。复溶过的标准品原液(20ng/ml)按照一次用量分装,并储存于-20℃~-80℃冰箱。
(4)生物素化抗体工作液:预先计算好试验所需用量,用检测稀释液(SR2)将100倍抗体浓缩液稀释成1倍应用工作液(稀释前充分混匀),并于30分钟内加入到反应孔中。
(5)酶结合物工作液:按照每次试验所需用量进行配制,用酶结合物稀释液(SR3)将100倍浓缩酶结合物稀释成1倍应用工作液(稀释前进行离心),于30min之内使用。
(6)洗涤:甩尽酶标板孔中的液体,在厚吸水纸上拍干,用洗瓶加入洗涤液300μl/孔,静止30秒后甩净酶标板孔中的液体,在厚吸水纸上拍干,洗板5次。
2.实验步骤
(1)加样:分别将100μl标准品及检测样本加至反应孔中,封板膜进行封板,在室温条件下(25±2℃)震荡孵育120分钟。拍板及洗板4次。
(2)加抗体:各反应孔中加入100μl生物素化抗体工作液,封板膜进行封板,在室温条件下(25±2℃)震荡孵育60分钟。拍板及洗板4次。
(3)加酶:各反应孔中加入100μl酶结合物工作液,封板膜进行封板,在室温条件下(25±2℃)震荡孵育30分钟。拍板及洗板5次。
(4)显色:各反应孔中加入100μl显色底物,封板膜进行封板,在室温条件下(25±2℃)震荡孵育10-20分钟。
(5)终止:各反应孔中加入50μl终止液终止反应。
(6)检测:在加入终止液的5分钟内,用酶标仪在450nm波长下测量吸光度值(OD值)。
3.鉴别诊断效率的判定
检索并记录验证组患者的术后组织学病理结果,对比三组患者不同蛋白质标志物的表达情况。通过MedCalc软件(19.4.1版本)绘制受试者工作特征曲线(receiveroperating characteristic curve,简称ROC曲线),计算曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异度,将联合检测的数据进行二元logistic回归分析,得到联合检测的概率预测值,利用预测值绘制ROC曲线。AUC值在1.0和0.5之间。AUC越接近于1,说明诊断效果越好。AUC在0.5-0.7时有较低准确性,AUC在0.7-0.9时有一定的准确性,AUC在0.9以上时有较高的准确性。AUC=0.5时,说明诊断方法完全不起作用,无诊断价值。P<0.05记为有统计学差异。
三、结果
1.Elisa检测结果分析
Elisa实验所检测的目标蛋白,来源于上一部分蛋白质标志物的筛选结果。以EM组为对照得出的4个重叠差异蛋白(SELL、LILRA3、IGKC和DSC2)和临床常用标志物CA125。本研究检测的蛋白质为CA125、SELL、LILRA3、IGKC和DSC2。
EM、FEM和OC三组样本之间CA125、SELL、LILRA3、IGKC和DSC2表达浓度的对比如图4显示。对于CA125,OC组浓度明显高于EM组(P<0.001),而EM组浓度则明显高于FEM组(P=0.002);类似地,对于DSC2,OC组浓度明显高于EM组(P<0.001),而EM组浓度亦明显高于FEM组(P=0.010);对于IGKC,EM和OC两组浓度差异显著(P=0.044);对于LILRA3,三组之间浓度差异并不明显(EM组vs.OC组:P=0.704;EM组vs.FEM组:P=0.335;OC组vs.FEM组:P=0.620);对于SELL,三组之间浓度差异亦并不明显(EM组vs.OC组:P=0.216;EM组vs.FEM组:P=0.643;OC组vs.FEM组:P=0.293)。
2.整体诊断能力分析
5种不同蛋白标志物及其组合对于鉴别EM/FEM的表现,如表7和图5-12所示。
表7不同蛋白标志物及其组合的诊断能力
2.1单个蛋白标志物的ROC曲线分析
对于EM和FEM组,发明人对于5个蛋白标志物的进行ROC曲线分析,结果如图5-9所示。CA125鉴别诊断EM和FEM的AUC最大,其次是IGKC,两者诊断能力差别不显著(P=0.785)。LILRA3诊断能力最弱。
2.2蛋白标志物组合的ROC曲线分析
对于EM和FEM组,发明人将CA125+SELL+LILRA3+IGKC+DSC2、CA125+IGKC+DSC2、CA125+IGKC蛋白标志物组合方式进行ROC曲线分析。结果如图10-12所示,5种蛋白组合鉴别诊断EM和FEM的AUC最大,其次是CA125+IGKC组合,两者诊断能力差别不显著(P=0.158)。CA125+IGKC+DSC2组合的诊断能力最弱。
2.3分层分析
2.3.1以患者年龄进行分层分析
发明人以45岁为界分别将患者人群组各划分为2组。
对于EM和FEM组,单个蛋白以及蛋白组合的诊断能力如表2所示。当患者<45岁时,CA125的AUC相对更大(0.733),灵敏度70.51%,特异度70.97%,而蛋白标志物的组合对于诊断无明显改善;
当患者≥45岁时,IGKC的AUC为0.900,敏感度100%,特异度82.14%;CA125+IGKC组合AUC更大(0.932),但特异度下降。对于EM和OC组中≥45岁患者,CA125+IGKC组合AUC更大(0.980),且灵敏度(100%)及特异度高(90%)(表8)。
表8不同年龄组,EM和FEM组间不同蛋白质标志物的表现
2.3.2以肿瘤大小进行分层分析
根据临床处理经验,发明人以肿瘤最大直径5cm为界进行分组,OC组各亚分组例数较少,未行诊断分析。对于EM和FEM组患者,单个蛋白以及蛋白组合的诊断能力如表9所示。当肿瘤直径<5cm时,CA125的AUC0.854,灵敏度71.43%,特异度85.00%,蛋白标志物的组合未见明显改善;当肿瘤直径≥5cm,CA125的表现相对最佳,AUC 0.751,灵敏度73.33%,特异度72.86%。
表9按照肿瘤大小进行分层,不同蛋白质标志物的表现
2.3.3限制条件后进行诊断能力分析
进一步选择年龄<45岁且肿瘤直径<5cm的EM和FEM组患者进行分析,单个蛋白以及蛋白组合的诊断能力如表10所示,CA125+IGKC组合AUC更大(0.834),灵敏度最高,但特异度相对较低。
表10年龄<45岁且肿瘤<5cm组,EM和FEM组间不同蛋白质标志物的表现
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.检测受试者样本中生物标志物含量的试剂在制备用于鉴别诊断卵巢子宫内膜异位症/卵巢其他良性肿瘤的产品中的应用,所述生物标志物包括CA125、SELL、LILRA3、IGKC和/或DSC2。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述产品包括试剂盒、芯片或试纸条。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,与对照样本相比,所述CA125、DSC2和IGKC在卵巢子宫内膜异位症患者样本中表达水平升高;所述SELL和LILRA3在卵巢子宫内膜异位症患者样本中表达水平降低。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述对照样本为卵巢其他良性肿瘤样本。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述试剂包括质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段、引物和探针。
6.一种用于鉴别诊断卵巢子宫内膜异位症/卵巢其他良性肿瘤的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括检测受试者样本中CA125、SELL、LILRA3、IGKC和/或DSC2表达水平的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括检测受试者样本中CA125和/或IGKC表达水平的试剂。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂包括质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂通过Elisa、Western Blot、质谱法检测。
10.一种针对年龄<45岁且肿瘤直径<5cm的子宫内膜异位症和卵巢其他良性肿瘤患者的鉴别诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括检测待测者样本中CA125和IGKC的含量的试剂。
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