CN113318222A - 超氧化物歧化酶在制备治疗银屑病药物中的应用及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酶制剂的应用技术领域，具体涉及超氧化物歧化酶在制备治疗银屑病药物中的应用及应用方法。本发明所述的超氧化物歧化酶是从嗜热脂肪地芽孢杆菌中克隆的超氧化物歧化酶的蛋白质氨基酸序列，将第20位天冬氨酸突变为甘氨酸，并将141位的亮氨酸突变为天冬酰胺；将HIV‑1肽段上的CPP序列YGRKKRRQRRR与超氧化物歧化酶偶联表达，赋予其越膜能力；CPP序列为Trans‑activating transcriptional activator序列。本发明的有益效果在于：（1）本发明所采用的关键原料超氧化物歧化酶，其本质是一种蛋白，安全性高，对人体无副作用；（2）本发明的产品使用效果优异，喷涂半个月左右，即可治愈顽固的银屑病；（3）相对于昂贵的治疗银屑病的药物，本发明的产品成本低。

Description

超氧化物歧化酶在制备治疗银屑病药物中的应用及方法
技术领域
本发明属于酶制剂的应用技术领域，具体涉及一种超氧化物歧化酶在制备治疗银屑病药物中的应用，还涉及上述的应用方法。
背景技术
银屑病（牛皮癣）是一种慢性、难治且极易复发的免疫性皮肤病，具有一定的遗传性，主要表现为皮肤红斑和斑块，上覆银白色鳞屑，可累及全身皮肤，常见部位包括躯干、四肢伸面和头皮。目前并没有能根治的药物，仅能够通过有效控制病情发展，缓解病情。
临床上多使用的药物一般有：
焦油类、蒽林、皮质类固醇激素；氨甲蝶蛉、羟脲、乙亚胺、乙双吗啉；
近年来广泛应用于银屑病患者的阿维A，其副作用也是较大的。除最常见的***干燥外，对肝脏也有影响，容易引起血脂和胆固醇增高，儿童服用还会影响骨骼生长和发育，孕妇服用还有致畸作用。
上述的药物中，或效果不甚理想，或副作用大。
本发明人通过检索，专利文献中披露的多为中药、西药来作为治疗银屑病的药物。
CN111643669A披露的是谷氨酰胺酶抑制剂在制备治疗银屑病的药物中的应用；CN111265529A公开了蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂在制备治疗银屑病药物中的应用；CN110787162A甲基黄连碱用作JNK2激酶抑制剂和治疗银屑病的用途；上述的文献都是酶的抑制剂应用于银屑病的治疗中；CN108653736A 公开的是M2型丙酮酸激酶作为药物靶点在制备防治银屑病的药物中的应用。
关于超氧化物歧化酶应用于银屑病的治疗中，并未见相关的文献披露。超氧化物歧化酶作为一种抗氧化功效的蛋白，根据本领域技术人员的预测，也难以将其应用于银屑病的治疗中，并且本发明人经过实验，发现普通的超氧化物歧化酶在治疗银屑病中，并未有显著的功效。
因此，针对于上述的病症，需要开发一种安全性高、治疗效果好的药物。
发明内容
鉴于背景技术中所提及的银屑病，目前并无特效药物，很多病人使用激素类药物，虽然使用后在一定时间内症状暂时有所减轻，但是副作用大，因此急需开发一种非激素类的、无毒的、并且还能能快速缓解上述症状的特效药物。本发明所提供的超氧化物歧化酶，与其它的药用辅料相结合后，所形成的药物是一种治疗效果十分理想、并且还能有效避免激素类药物对人体产生副作用的药物。
本发明所述及的超氧化物歧化酶并非是普通的超氧化物歧化酶，而是通过改性的特定的超氧化物歧化酶，获得上述特定的超氧化物歧化酶的方法具体见本申请人所申请的申请号为“2021107192568”名称为“具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法”的发明专利申请；
本发明所要着重保护的是超氧化物歧化酶在制备治疗银屑病药物中的应用，关于这一应用，是上述超氧化物歧化酶所能达到的一个意想不到的功效，也是普通超氧化物歧化酶所并不能达到的。
本发明所涉及的超氧化物歧化酶，其特点是：超氧化物歧化酶是从嗜热脂肪地芽孢杆菌中克隆的超氧化物歧化酶的蛋白质氨基酸序列，将第20位天冬氨酸突变为甘氨酸，并将141位的亮氨酸突变为天冬酰胺；将HIV-1肽段上具有越膜能力的CPP序列YGRKKRRQRRR与超氧化物歧化酶偶联表达，赋予其越膜能力；所述的CPP序列为Trans-activatingtranscriptional activator序列。
含有上述的超氧化物歧化酶的治疗银屑病药物，也是本发明所要保护的范围。即，一切含有上述超氧化物歧化酶的且能用于治疗银屑病的药物，也在本发明的的保护范围之内。
超氧化物歧化酶与辅料相配合，共同应用于治疗银屑病药物中，辅料为稳定剂、防腐剂、保湿剂中的至少一种，当然还可以是其它的常规的药用辅料，并不仅限于上述的几种。
治疗银屑病药物中，各原料的配比如下：
超氧化物歧化酶溶液20000U/ml 60-300U/ml
甘油 0.5-2%
丙二醇 0.2-1.0%
透明质酸钠 0.05-1.0%
海藻糖 0.1-1.0%
肉豆蔻酰六肽 2~20μg/ml
山梨酸钾 0.06%-0.2%
余量为无菌去离子水。
优选的，上述的治疗银屑病药物中，各原料的配比如下：
超氧化物歧化酶溶液20000U/ml 60-300U/ml
甘油 1%
丙二醇 0.5%
透明质酸钠 0.25%
海藻糖 0.3%
肉豆蔻酰六肽 7.5μg/ml
山梨酸钾 0.1%
余量为无菌去离子水。
治疗银屑病药物的制备方法如下：
（1）配制2×的水相基质组分：在经115~125℃、12~20分钟灭菌的去离子水中，添加甘油、丙二醇使二者的浓度分别为2.0%和1.0%，记作“A”；
（2）配制10×透明质酸钠组分：在经115~125℃、12~20分钟灭菌的去离子水中，溶解透明质酸钠，使透明质酸钠的浓度为2.5%，用0.45uM的微孔滤膜进行过滤，记作“B”；
（3）配制100×的山梨酸钾组分：在经115~125℃、12~20分钟灭菌的去离子水中溶解山梨酸钾，使其终浓度为10%，用0.45uM的微孔滤膜进行过滤，记作“C”；
（4）配制200×的肉豆蔻酰六肽组分：在经115~125℃、12~20分钟灭菌的去离子水中溶解肉豆蔻酰六肽，使其终浓度为1mg/ml，记作“D”；
（5）用0.22 uM的微孔滤膜进行过滤后的高稳定型超氧化物歧化酶溶液10000U/ml母液，此组分记作“组分E”；
（6）在无菌环境中，以配制1L为例，按照下列体积混合各组分：
A 500 ml
B 100 ml
C 10 ml
D 7.5 ml
E 10 ml
无菌去离子水 372.5 ml；
将混合后的液体，在ATS高压均质机中于200~500ba的压力下，充分混合, 无菌灌装，常温保存。
经检测，治疗银屑病药物的密度约为1.02g/ml。
治疗银屑病药物的使用方法如下：将治疗银屑病药物喷于患处，喷后轻轻涂抹使其吸收，每日2-3次。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明所提供的超氧化物歧化酶，其本质是一种蛋白类，安全性高，对人体无副作用；
（2）本发明的产品使用效果优异，喷涂半个月左右，即可治愈顽固的银屑病；并且本发明人通过上述超氧化物歧化酶抑制皮肤角质形成细胞Hacat的过度增殖、抑制角质形成细胞的细胞周期、降低皮肤角质化程度等实验，验证了其作用于银屑病的机理，证实了其有效性；
（3）本发明的产品，相对于昂贵的治疗银屑病的药物，其成本低。
附图说明
图1为临床应用中患者治疗前一天的所拍摄的腿部银屑病发病区域的状态图；
图2为图1中患者治疗第一天（喷涂12小时后）所拍摄的腿部银屑病发病区域的状态图；
图3为图1中患者治疗第六天所拍摄的腿部银屑病发病区域的状态图；
图4为治疗第十六天所拍摄的腿部银屑病发病区域的状态图；
图5为本发明抑制皮肤角质形成细胞Hacat的过度增殖的对比图；
图6为本发明抑制皮肤角质形成细胞Hacat的细胞周期的对比图；
图7为本发明降低皮肤角质化的对比较图；
图8为普通的超氧化物歧化酶对银屑病治疗的效果图片。
具体实施方式
为了对本发明进行更进一步的说明，本发明将以具体实施例来详细的阐述本发明，但并不以此限制本发明。
实施例1
治疗银屑病药物的制备方法，具体步骤如下：
（1）配制2×的水相基质组分：在经121℃、15分钟灭菌的去离子水中，添加甘油、丙二醇使二者的浓度分别为2.0%和1.0%，记作“A”；
（2）配制10×透明质酸钠组分：在经121℃、15分钟灭菌的去离子水中，溶解透明质酸钠，使透明质酸钠的浓度为2.5%，用0.45uM的微孔滤膜进行过滤，记作“B”；
（3）配制100×的山梨酸钾组分：在经121℃、15分钟灭菌的去离子水中溶解山梨酸钾，使其终浓度为10%，用0.45uM的微孔滤膜进行过滤，记作“C”；
（4）配制200×的肉豆蔻酰六肽组分：在经121℃、15分钟灭菌的去离子水中溶解肉豆蔻酰六肽，使其终浓度为1mg/ml，记作“D”；
（5）用0.22 uM的微孔滤膜进行过滤后的高稳定型超氧化物歧化酶溶液10000U/ml母液，记作“E”；
（6）在无菌环境中，以配制1L为例，按照下列体积混合各组分：
A 500 ml
B 100 ml
C 10 ml
D 7.5 ml
E 10 ml
无菌去离子水 372.5 ml；
将混合后的液体在ATS高压均质机中于200~500ba的压力下，充分混合, 无菌灌装，常温保存、使用。
经检测，通过上述方法制备获得的治疗银屑病药物的密度：1.02g/ml左右。
实施例1中的高稳定型超氧化物歧化酶的获得方法具体见本申请人所申请的申请号为“2021107192568”名称为“具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法”的发明专利申请；
大致方法如下：
（1）利用RNA提取试剂盒（购自天根生化）提取了嗜热脂肪地芽孢杆菌的RNA，然后利用反转录试剂盒（购自天根生化）合成了该微生物的cDNA，然后设计并根据限制性内切酶位点优化特异性引物（引物序列如下），钓取其编码超氧化物歧化酶的序列。
超氧化物歧化酶钓取上游引物序列：
5’-CATATGCCCTTTGAACTACCAGCAT-3’
超氧化物歧化酶钓取下游引物序列：
5’- AAGCTTCTTCGCTTTCGCCTCGCTG -3’；
（2）选取pET30a载体（购自优宝生物）为表达载体，扩增的序列与载体经过HindIII与NdeI（购自ABclonal）双酶切后，用DNA凝胶回收试剂盒（购自天根生化）回收酶切产物，回收后的双酶切产物，按照DNA片段：质粒=2:1（摩尔比）的优化比例，用DNA连接酶16℃连接12小时（优化连接条件），连接后的连接子采用42℃热击法转化至感受态大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)，转化之后的工程菌涂布于含有50ug/ml卡那霉素的LB抗性平板，37°C培养18-26小时。待单克隆形成后，采用菌落PCR的方式（菌落PCR引物见下列序列），对克隆进行验证；
（3）选取验证正确的单克隆，进行表达验证，表达条件为：接种单克隆菌落至5mlLB液体培养基（培养基含卡那霉素50ug/ml），待OD600值达到0.7时，加入IPTG至终浓度0.5mM，在多种温度下（16℃、37℃为优选代表）进行诱导。诱导后收集菌体，进行超声裂解（超声体积为1mL，超声条件为超2秒停3秒，总超声时间为10分钟）。
（4）提高超氧化物歧化酶的稳定性
将第20位天冬氨酸突变为甘氨酸，并将141位的亮氨酸突变为天冬酰胺后，以提高该酶的热稳定性。
实施例2
治疗银屑病药物的制备方法如下：
（1）配制2×的水相基质组分：在经115℃、20分钟灭菌的去离子水中，添加甘油、丙二醇使二者的浓度分别为2.0%和1.0%，记作“A”；
（2）配制10×透明质酸钠组分：在经115℃、20分钟灭菌的去离子水中，溶解透明质酸钠，使透明质酸钠的浓度为2.5%，用0.45uM的微孔滤膜进行过滤，记作“B”；
（3）配制100×的山梨酸钾组分：在经115℃、20分钟灭菌的去离子水中溶解山梨酸钾，使其终浓度为10%，用0.45uM的微孔滤膜进行过滤，记作“C”；
（4）配制200×的肉豆蔻酰六肽组分：在经115℃、20分钟灭菌的去离子水中溶解肉豆蔻酰六肽，使其终浓度为1mg/ml，记作“D”；
（5）用0.22 uM的微孔滤膜进行过滤后的高稳定型超氧化物歧化酶溶液10000U/ml母液，记作“E”；
（6）在无菌环境中，以配制1L为例，按照下列体积混合各组分：
A 500 ml
B 100 ml
C 10 ml
D 7.5 ml
E 10 ml
无菌去离子水 372.5 ml；
将混合后的液体，在ATS高压均质机中于200~500ba的压力下，充分混合, 无菌灌装，常温保存、使用。
实施例3
治疗银屑病药物的制备方法如下：
（1）配制2×的水相基质组分：在经125℃、12分钟灭菌的去离子水中，添加甘油、丙二醇使二者的浓度分别为2.0%和1.0%，此组分记作“组分A”；
（2）配制10×透明质酸钠组分：在经125℃、12分钟灭菌的去离子水中，溶解透明质酸钠，使透明质酸钠的浓度为2.5%，用0.45uM的微孔滤膜进行过滤，此组分记作“组分B”；
（3）配制100×的山梨酸钾组分：在经125℃、12分钟灭菌的去离子水中溶解山梨酸钾，使其终浓度为10%，用0.45uM的微孔滤膜进行过滤，此组分记作“组分C”；
（4）配制200×的肉豆蔻酰六肽组分：在经125℃、12分钟灭菌的去离子水中溶解肉豆蔻酰六肽，使其终浓度为1mg/ml，此组分记作“组分D”；
（5）用0.22 uM的微孔滤膜进行过滤后的高稳定型超氧化物歧化酶溶液10000U/ml母液，此组分记作“组分E”；
（6）在无菌环境中，以配制1L为例，按照下列体积混合各组分：
A 500 ml
B 100 ml
C 10 ml
D 7.5 ml
E 10 ml
无菌去离子水 372.5 ml；
将混合后的液体，在ATS高压均质机中于200~500ba的压力下，充分混合, 无菌灌装，常温保存、使用。
实施例4
使用方法：将实施例1中治疗银屑病药物喷于患处，喷后轻轻涂抹使其吸收，每日2-3次。
患者（广州人）患有银屑病2年，多种治疗方法无效。使用品发明期间停止其他药物。患者按说明使用该发明后6天有明显改善，半个月后几乎痊愈。如附图1-4所示，从图1中可以看出，在治疗前，患者腿部的红斑严重；
用药12小时后，红斑处部分部位开始有结痂现象，红斑处的伤口在逐渐愈合。
用药6天后，患者腿部的皮肤明显好转，红斑颜色变淡，多处呈现出即将愈合状态；
用药16天后，患者腿部皮肤红斑淡化，逐渐向正常皮肤转化。可视为基本治愈。
实施例5
附图5为银屑病患者的表皮形成细胞常出现过度增殖的现象。本发明人利用皮肤角质形成细胞作为细胞模型，研究本发明药物的作用。从附图5中可以看出：
细胞实验中，本发明药物的加入，可以有效的抑制皮肤角质形成细胞Hacat的过度增殖。
对照组是以相同剂量的纯水，作为安慰剂。以对比和判断发明物的作用。在图5、图6、图7中，对照组均是相同剂量的纯水作为安慰剂。
附图5中左图为本发明与对照组处理细胞72小时后的细胞形态图。Hacat细胞系购自武汉普洛赛公司。附图5中右图为本发明与对照组处理72小时后，细胞活力相对值。细胞活力定量检测采用CCK8法（CCk8试剂盒购自日本东仁）。
从附图6中可以看出：细胞模型中，本发明可以抑制皮肤角质形成细胞Hacat的细胞周期。右图为经本发明药物处理细胞72小时后的细胞周期检测结果。与对照组对比发现，本发明的药物能够下调S期与G2期，说明本发明具有抑制角质形成细胞的细胞周期的作用，这对于阻断银屑病的发病以及防治银屑病进一步加重具有重要的作用。
附图7为银屑病患者的表皮形成细胞常出现过度角质化的现象，其中Keratin 6是皮肤角质化的Marker。图7显示，本发明的药物可以显著降低皮肤角质形成细胞中Keratin6的表达，即本发明可以降低皮肤角质化程度，从而抑制银屑病。本发明人分析，银屑病所产生的其中一个原因就是皮肤角质化程度增加从而导致的病情加重、病程延长。
图8为本发明人进行的对比实验，主要是比较普通的超氧化物歧化酶是否也具有治疗银屑病的作用；
将普通的超氧化物歧化酶按相同于实施例1的配方配制后，按每天3次的频次使用，使用量同实施例1。
结果表明：以普通超氧化物歧化酶作为主原料所获得的产品对于银屑病的治疗效果，远不及本发明，从图中可以看出，患者在使用6天后无明显改善，而本发明中的在使用6天后效果已经比较显著，因此，无须再进行更长时间下的比较。这说明本发明的药物，由于将第20位天冬氨酸突变为甘氨酸，并将141位的亮氨酸突变为天冬酰胺；将HIV-1肽段上具有越膜能力的CPP序列YGRKKRRQRRR与超氧化物歧化酶偶联表达，赋予了它具有对银屑病的治疗效果，这是普通的超氧化物歧化酶所并不能达到的效果。
通过上述的比较，可以看出，本发明的配方达到了意料不到的技术效果，将其应用于治疗银屑病的药物中，为该病的防治提供了一种更加温和、安全、有效的方式。

Claims (8)

1.超氧化物歧化酶在制备治疗银屑病药物中的应用，其特征在于，所述的超氧化物歧化酶是从嗜热脂肪地芽孢杆菌中克隆的超氧化物歧化酶的蛋白质氨基酸序列，将第20位天冬氨酸突变为甘氨酸，并将141位的亮氨酸突变为天冬酰胺；将HIV-1肽段上的CPP序列YGRKKRRQRRR与超氧化物歧化酶偶联表达，获得超氧化物歧化酶。
2.含有权利要求1所述的超氧化物歧化酶的治疗银屑病药物。
3.如权利要求1所述的超氧化物歧化酶在制备治疗银屑病药物中的应用，其特征在于，所述的超氧化物歧化酶与辅料相配合，共同应用于治疗银屑病药物中，所述的辅料为稳定剂、增香剂、防腐剂、保湿剂、抗菌剂中的至少一种。
4.如权利要求1所述的超氧化物歧酶在制备治疗银屑病药物中的应用，其特征在于，治疗银屑病药物中，各原料的配比如下：
超氧化物歧化酶溶液20000U/ml 60-300U/ml
甘油 0.5-2%
丙二醇 0.2-1.0%
透明质酸钠 0.05-1.0%
海藻糖 0.1-1.0%
肉豆蔻酰六肽 2-20μg/ml
山梨酸钾 0.06%-0.2%
余量为无菌去离子水。
5.如权利要求1所述的超氧化物歧酶在制备治疗银屑病药物中的应用，其特征在于，治疗银屑病药物中，各原料的配比如下：
超氧化物歧化酶溶液20000U/ml 60-300U/ml
甘油 1%
丙二醇 0.5%
透明质酸钠 0.25%
海藻糖 0.3%
肉豆蔻酰六肽 7.5μg/ml
山梨酸钾 0.1%
余量为无菌去离子水。
6.如权利要求1所述的超氧化物歧酶在制备治疗银屑病药物中的应用，其特征在于，治疗银屑病药物的制备方法如下：
（1）配制2×的水相基质组分：在经115~125℃、12~20分钟灭菌的去离子水中，添加甘油、丙二醇使二者的浓度分别为2.0%和1.0%，记作“A”；
（2）配制10×透明质酸钠组分：在经115~125℃、12~20分钟灭菌的去离子水中，溶解透明质酸钠，使透明质酸钠的浓度为2.5%，用0.45uM的微孔滤膜进行过滤，记作“B”；
（3）配制100×的山梨酸钾组分：在经115~125℃、12~20分钟灭菌的去离子水中溶解山梨酸钾，使其终浓度为10%，用0.45uM的微孔滤膜进行过滤，记作“C”；
（4）配制200×的肉豆蔻酰六肽组分：在经115~125℃、12~20分钟灭菌的去离子水中溶解肉豆蔻酰六肽，使其终浓度为1mg/ml，记作“D”；
（5）用0.22 uM的微孔滤膜过滤的高稳定型超氧化物歧化酶溶液10000U/ml母液，记作“E”；
（6）在无菌环境中，以配制1L为例，按照下列体积混合各组分：
A 500 ml
B 100 ml
C 10 ml
D 7.5 ml
E 10 ml
无菌去离子水 372.5 ml；
将混合后的液体，在ATS高压均质机中于200~500ba的压力下充分混合, 无菌灌装，常温保存。
7.如权利要求6所述的超氧化物歧酶在制备治疗银屑病药物中的应用，其特征在于，治疗银屑病药物的密度为1.02g/ml。
8.如权利要求6所述的超氧化物歧酶在制备治疗银屑病药物中的应用，其特征在于，治疗银屑病药物的使用方法如下：将治疗银屑病药物喷于患处，喷后轻轻涂抹使其吸收，每日2-3次。
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