CN113308551A - 一种绵羊per2基因***/缺失多态性的检测方法、试剂盒和应用 - Google Patents
一种绵羊per2基因***/缺失多态性的检测方法、试剂盒和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113308551A CN113308551A CN202110566106.8A CN202110566106A CN113308551A CN 113308551 A CN113308551 A CN 113308551A CN 202110566106 A CN202110566106 A CN 202110566106A CN 113308551 A CN113308551 A CN 113308551A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sheep
- deletion
- per2 gene
- per2
- polymorphic site
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种绵羊PER2基因***/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：以待测绵羊基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含绵羊PER2基因外显子区***/缺失多态性位点，将扩增产物进行电泳分型，根据电泳结果鉴定对应***/缺失多态性位点的基因型；所述***/缺失多态性位点选自绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558‑2899563位6‑bpindel多态性位点。本发明方法根据绵羊PER2基因外显子区***/缺失多态性位点设计引物，以绵羊基因组DNA为模板，通过序列扩增、电泳鉴定，能够简便、精确、低成本地检测所述***/缺失多态性位点的基因型。
Description
技术领域
本发明属于生物技术与家畜育种技术领域，尤其是一种绵羊PER2基因***/缺失(indel)多态性的检测方法、试剂盒和应用。
背景技术
绵羊作为最早被人类驯化的动物之一，在畜牧产业中具有重要的经济价值，可以为人们提供羊肉、羊奶、羊绒、羊皮等一系列动物副产品。我国是绵羊饲养量、出栏量及羊肉产出量最多的国家，绵羊的繁殖性状直接影响养殖企业的生产效益。现代绵羊育种旨在提高其生产和繁殖性能从而大大提高其经济价值。随着生物科学技术的发展以及遗传学研究的深入，传统的选择方法逐渐暴露出周期长、难度大等弊端，已不能满足我国绵羊育种能力快速提高的需要。近年来，分子标记辅助选择(Marker-assisted Selection，MAS)在动物育种中广为应用，可以显著提高选择的准确性和选择效率。分子标记辅助选择可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。
目前，常见的基因组变异包括***/缺失(indel)、单核苷酸多态性(SNPs)和结构变异(SVs)等。Indel突变是作为一种重要的分子遗传标记具有分布广、密度高、数量多、检测方便等优点。且与其它变异相比，indel更容易通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳技术直接被鉴定。随着比较基因组学的深入研究，indel为理论研究和遗传育种应用研究提供了大量的生物信息，其作为遗传学鉴定标记，多集中在人类基因组研究中，对反刍家畜的功能性基因，尤其是可应用于反刍动物繁殖性状的选育方面的indel标记的研究和应用甚少。最近的研究显示，孙等人的研究发现绵羊BMPR-IB基因编码区存在一个597位点与绵羊产羔数有关(孙渭博,2020)；Chen等在绵羊PPARGC1A基因上检测到一个17bp的indel与绵羊生长性状显著相关(Chen Pingbo，2020)；Akhatayeva等利用indel分子标记在绵羊GHR和PRL基因上发现3个与产羔数有关的indel位点(Akhatayeva et al.，2020)，从而加快绵羊分子选育。这些研究都表明indels对动物分子育种具有重要的意义和参考价值。
周期2(period 2,PER2)是编码生物钟的特殊成分，其主要功能是调节昼夜节律，该基因是周期基因家族的成员，在视交叉上核中以昼夜节律模式表达，视交叉上核是哺乳动物大脑中主要的昼夜节律起搏器。这个家族中的基因编码运动活动、代谢和行为的昼夜节律的组成部分，从而调节生物的许多生化、生理和行为过程。该基因由CLOCK/ARNTL异二聚体上调，但随后在使用PER/CRY异二聚体与CLOCK/ARNTL相互作用的反馈回路中抑制这种上调。这种基因的多态性可能会增加患某些癌症的风险，并与睡眠障碍有关。近年来，相关研究表明，PER2的表达与绵羊繁殖激素的分泌有关，如***、***等。据报道，动物繁殖激素分泌情况会影响动物的发情周期，从而影响动物的生殖能力。然而，目前还没有相关研究证实PER2基因通过影响绵羊发情周期来调节生殖相关功能。因此，PER2基因多态性影响绵羊产羔数的机制有待进一步研究。基于此，本发明PER2基因可以作为改善绵羊繁殖性能的候选基因，研究其关键变异位点与绵羊性状的关系，加速培育繁殖性能优良的绵羊品种。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种绵羊PER2基因***/缺失(indel)多态性的检测方法、试剂盒和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种绵羊PER2基因***/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：
以待测绵羊基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含绵羊PER2基因外显子区***/缺失多态性位点，将扩增产物进行电泳分型，根据电泳结果鉴定对应***/缺失多态性位点的基因型；所述***/缺失多态性位点选自绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位6-bp indel多态性位点。
进一步地，所述***/缺失多态性位点PER2采用的PCR扩增引物对为：
上游引物：SEQ NO.1 5’-GTCTTAAAGGCAGCAGCGAC-3’(20nt)，
下游引物：SEQ NO.2 5’-TGTCGGCCATCAGCAGC-3’(17nt)。
进一步地，所述PCR采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸20s，25个循环；72℃延伸10min；所述电泳采用质量浓度为3.5％的琼脂糖凝胶。
进一步地，根据电泳结果，***/缺失多态性位点有两个基因型II和ID，其中***/***基因型II表现为162bp一条带纹，***/缺失基因型ID表现为162bp和大于162bp的两条带纹。
进一步地，所述绵羊为澳洲白绵羊或兰州大尾羊。
如上所述的检测方法在绵羊育种的分子标记辅助方面中的应用。
绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位6-bp***/缺失多态性位点在绵羊育种的分子标记辅助方面中的应用。
一种绵羊PER2基因***/缺失多态性的检测试剂盒，所述试剂盒包含用于PCR扩增绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位6-bp***/缺失多态性位点的引物对。
进一步地，所述引物对为：
上游引物：SEQ NO.1 5’-GTCTTAAAGGCAGCAGCGAC-3’(20nt)，
下游引物：SEQ NO.2 5’-TGTCGGCCATCAGCAGC-3’(17nt)。
如上所述的检测试剂盒在绵羊育种的分子标记辅助方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明方法根据绵羊PER2基因外显子区***/缺失多态性位点(参考序列NC_040252.1:g.2899558-2899563)设计引物，以绵羊基因组DNA为模板，通过序列扩增、电泳鉴定，能够简便、精确、低成本地检测所述***/缺失多态性位点的基因型。
2、本发明方法对澳洲白绵羊和兰州大尾羊PER2基因6-bp***/缺失多态性位点(参考序列NC_040252.1:g.2899558-2899563)进行基因型和基因频率分析，对该***/缺失多态性位点与澳洲白绵羊繁殖性状进行独立卡方检验，结果表明本发明检测的***/缺失多态性位点即PER2基因6-bp indel位点能够作为绵羊产羔数的分子标记位点，从而加快建立繁殖性状优良的绵羊种群，提高良种选育速度。
3、本发明方法以待测绵羊全基因组DNA为模板，通过PCR扩增绵羊PER2基因部分片段，再进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位6-bp***/缺失多态性位点的基因型。PER2基因6-bp indel多态性对产羔数有显著影响，存在提高绵羊繁殖性状的DNA标记。本发明提供的检测绵羊PER2基因***/缺失多态性的方法，可应用于绵羊分子标记辅助选择育种中，加快建立优良绵羊遗传资源群体。
4、本发明方法能够简单、快速、低成本、精确地检测所述***/缺失多态性位点的基因型，以快速建立优良繁殖性状的澳洲白绵羊和兰州大尾羊遗传资源群体。
附图说明
图1为本发明中引物对扩增绵羊PER2基因的产物琼脂糖凝胶电泳结果图；其中，M表示Marker；
图2为本发明中绵羊PER2基因PCR扩增产物测序图；其中，方框标出的部分表示6-bp***序列(NC_040252.1:g.2899558-2899563del GGCGAA)。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一种绵羊PER2基因***/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：
以待测绵羊基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含绵羊PER2基因外显子区***/缺失多态性位点，将扩增产物进行电泳分型，根据电泳结果鉴定对应***/缺失多态性位点的基因型；所述***/缺失多态性位点选自绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位6-bp indel多态性位点。
较优地，所述***/缺失多态性位点PER2采用的PCR扩增引物对为：
上游引物：SEQ NO.1 5’-GTCTTAAAGGCAGCAGCGAC-3’(20nt)，
下游引物：SEQ NO.2 5’-TGTCGGCCATCAGCAGC-3’(17nt)。
较优地，所述PCR采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸20s，25个循环；72℃延伸10min；所述电泳采用质量浓度为3.5％的琼脂糖凝胶。
较优地，根据电泳结果，***/缺失多态性位点有两个基因型II和ID，其中***/***基因型II表现为162bp一条带纹，***/缺失基因型ID表现为162bp和大于162bp的两条带纹。
较优地，所述绵羊为澳洲白绵羊或兰州大尾羊。
如上所述的检测方法在绵羊育种的分子标记辅助方面中的应用。
绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位6-bp***/缺失多态性位点在绵羊育种的分子标记辅助方面中的应用。
一种绵羊PER2基因***/缺失多态性的检测试剂盒，所述试剂盒包含用于PCR扩增绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位6-bp***/缺失多态性位点的引物对。
较优地，所述引物对为：
上游引物：SEQ NO.1 5’-GTCTTAAAGGCAGCAGCGAC-3’(20nt)，
下游引物：SEQ NO.2 5’-TGTCGGCCATCAGCAGC-3’(17nt)。
如上所述的检测试剂盒在绵羊育种的分子标记辅助方面中的应用。
更为具体地，相关制备及检测如下：
本发明利用PCR方法对绵羊PER2基因g.2899558-2899563位点(参考序列：NC_040252.1)突变在澳洲白绵羊和兰州大尾羊群体中可能产生的***/缺失多态性进行检测，并将其基因型与澳洲白绵羊繁殖性状进行独立卡方检验，验证其是否可以作为绵羊分子育种中辅助选择的分子标记。
1.实验药品与试剂
1.1生化试剂与生物学试剂：①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；②；蛋白酶K(购自华美生物工程公司)③Marker I(购自天根生化科技(北京)有限公司)。
1.2普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。
1.3溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×105Pa)、25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。
1)提取组织样DNA所用溶液：
除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配制以下试剂：①2mol/LNaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌。②组织DNA提取液(100mL)：l mol/LTris-HCl(pH 8.0)l mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)20mL，2mol/LNaCl 5mL，定容至100mL。
2)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液
①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE 50mL定容至1000mL。②上样缓冲液：含质量终浓度0.25％溴酚蓝以及质量终浓度0.25％二甲苯青FF，溶剂为40.0％(w/v)蔗糖水溶液。
2.设计绵羊PER2基因indel位点引物
根据绵羊PER2参考基因序列(NC_040252.1)，利用NCBI设计能够扩增目的片段的引物，合成扩增绵羊PER2基因6-bp indel(NC_040252.1:g.2899558-2899563del)位点DNA片段的引物(引物设计完成时间2020年12月17日)。引物对序列如下：
上游引物：SEQ NO.1 5’-GTCTTAAAGGCAGCAGCGAC-3’(20nt)，
下游引物：SEQ NO.2 5’-TGTCGGCCATCAGCAGC-3’(17nt)。
以上述引物对绵羊基因组进行扩增，其中包含绵羊PER2基因(NC_040252.1)第21外显子6-bp indel变异区域；扩增后片段的电泳检测如图1所示，第3泳道为Marker I(由大到小依次为600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)。1～2泳道为目的片段检测，其中6-bp indel有II和ID两个基因型。II为***/***基因型，表现为162bp一条带纹；ID为***/缺失基因型，表现为162bp和大于162bp的两条带纹,对扩增的片段进行测序鉴定后，发现在NC_040252.1序列的第2899558-2899563位之间存在6-bp indel变异，测序峰图如图2所示。
3.PCR扩增澳洲白绵羊PER2基因目的片段
3.1绵羊耳组织样品的采集与繁殖性状数据收集
实验所用的动物共计955个样本，具体信息见表1。随机选择饲养环境、管理条件一致的成年绵羊，采集每个个体的耳组织样，在70％乙醇中保存，冰盒低温收集后置于-80℃冻存。采样信息如下：澳洲白绵羊耳组织样在天津奥群牧业有限公司采用群体随机抽样方式收集，采集时间为2019年8月，采集人为张清峰和蓝贤勇；共采集894个澳洲白绵羊个体耳组织样。绵羊头胎繁殖性状数据由育种场或养殖场工作人员测量，包括泌乳打分、母性打分、***炎打分、产羔数、活羔数、死胎数、畸形数、92日龄成活数及92日龄成活率共9个繁殖相关性状。兰州大尾羊耳组织样在甘肃永靖县瑞霖科技养殖公司采用群体随机抽样方式收集，采集时间为2016年9月，共采集61个兰州大尾羊个体耳组织样，采集人为徐红伟和蓝贤勇。
表1采样信息
3.2组织样品基因组DNA的提取与分离
参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)和参考以下文献：蓝贤勇.山羊重要功能基因遗传变异及其与经济性状的关系[D.]西北农林科技大学博士学位论文，2007，陕西杨凌。
3.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA
参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。
3.4 DNA的纯化
参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。
3.5分光光度法检测DNA
用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值。如OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。
DNA浓度(ng/μL)＝50×OD260值×稀释倍数。
DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至20ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。
3.6 PCR扩增
PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL EppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系包括2×Taq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2×)6.5μL；上游引物0.4μL；下游引物0.4μL(上下游引物浓度为10pmol/μL)；基因组DNA(浓度为20ng/μL绵羊基因组DNA0.5μL；去离子水5.2μL；共13μL体积的PCR扩增体系。
3.7 PCR反应的程序
1)95.0℃预变性5min，然后进入步骤2)；
2)94.0℃变性30s，68.0℃复性30s(每个循环减1℃)，72.0℃延伸20s，共18个循环，然后进入步骤3)；
3)94.0℃变性30s，50.0℃复性30s，72.0℃延伸20s，共25个循环；
4)经过步骤3)后，72.0℃延伸10min。
4.琼脂糖凝胶电泳检测
琼脂糖凝胶电泳检测分3步：1)制作3.5％的琼脂糖凝胶，使用核酸染料染色，点样4.0μL，点样后120V电压电泳50-60min；2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RADGel Doc 2000凝胶成像***成像；3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析indel多态性；
用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像***照相分析，判断indel的多态性(参见图1)：
对于绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位存在的6-bp***/缺失多态性，II为***/***基因型，表现为162bp一条带纹；ID为***/缺失基因型，表现为162bp和大于162bp的两条带纹。
5.绵羊PER2基因indel位点的频率统计分析
1)基因型和基因频率
基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。PYY＝NYY/N，其中PYY代表某一位点的YY基因型频率；NYY表示群体中具有YY基因型的个体数；N为检测群体的总数量。
基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：PY＝(2NYY+NYa1+NYa2+NYa3+NYa4+……+NYan)/2N
式中，PY表示等位基因Y频率，NYY表示群体中具有YY基因型的个体数量，NYai表示群体中具有Yai基因型个体数量，a1－an为等位基因Y的n个互不相同的复等位基因。
绵羊PER2基因6-bp indel突变位点的基因型频率、等位基因频率及遗传多态性指数如表2所示。
表2.绵羊PER2基因6-bp indel位点的遗传参数分析
6.绵羊PER2基因indel位点基因效应的独立卡方检验
基因型数据：PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳识别的基因型；
繁殖数据：澳洲白绵羊的产羔数数据。
分析方法：利用独立卡方检验分析基因型的效应。
由表3可以看出，在对894只绵羊的生产性状研究中，PER2基因6-bp indel多态性对产羔数有显著影响(χ2(Pvalue)<0.05)。因此，绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位一个新的6-bp***/缺失多态性位点可作为绵羊产羔数的DNA分子标记。
表3澳洲白绵羊后代品种澳洲白的产羔数的独立卡方检验
利用独立卡方检验，对后代品种为澳洲白和杜泊的绵羊个体进行基因型与繁殖性状的相关性分析，结果表明后代品种为澳洲白的绵羊个体，其6-bp indel变异与头胎产羔数显著相关(P<0.05)；因此，绵羊PER2基因6-bp***/缺失多态性位点(NC_040252.1:g.2899558-2899563del)的II和ID基因型可作为绵羊繁殖性状的DNA分子标记。
总之，本发明利用PCR扩增方法检测到绵羊PER2基因一个新的6-bp***/缺失多态性位点(NC_040252.1:g.2899558-2899563del)并将其与澳洲白绵羊的繁殖性状进行独立卡方检验，发现其与澳洲白绵羊产羔数显著相关，可以作为绵羊分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。本发明所建立的绵羊PER2基因***/缺失(indel)多态性位点作为繁殖性状早期选择的应用方法，有利于快速建立繁殖性状优良的绵羊种群，加快良种选育速度。
上游引物：SEQ NO.1 5’-GTCTTAAAGGCAGCAGCGAC-3’(20nt)，
下游引物：SEQ NO.2 5’-TGTCGGCCATCAGCAGC-3’(17nt)。
本发明相关序列如下：
1、人工合成SEQ NO.1
GTCTTAAAGGCAGCAGCGAC 20
2、人工合成SEQ NO.2
TGTCGGCCATCAGCAGC 17
3、NC_040252.1:g.2899558-2899563位***序列
GGCGAA 6
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津奥群牧业有限公司
<120> 一种绵羊PER2基因***/缺失多态性的检测方法、试剂盒和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 上游引物(Unknown)
<400> 1
gtcttaaagg cagcagcgac 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA/RNA
<213> 下游引物(Unknown)
<400> 2
tgtcggccat cagcagc 17
<210> 3
<211> 6
<212> DNA/RNA
<213> NC_040252.1:g.2899558-2899563位***序列(Unknown)
<400> 3
ggcgaa 6
Claims (10)
1.一种绵羊PER2基因***/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
以待测绵羊基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含绵羊PER2基因外显子区***/缺失多态性位点，将扩增产物进行电泳分型，根据电泳结果鉴定对应***/缺失多态性位点的基因型；所述***/缺失多态性位点选自绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位6-bpindel多态性位点。
2.根据权利要求1所述的绵羊PER2基因***/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述***/缺失多态性位点PER2采用的PCR扩增引物对为：
上游引物：SEQ NO.1；
下游引物：SEQ NO.2。
3.根据权利要求1所述的绵羊PER2基因***/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸20s，25个循环；72℃延伸10min；所述电泳采用质量浓度为3.5％的琼脂糖凝胶。
4.根据权利要求1至3任一项所述的绵羊PER2基因***/缺失多态性的检测方法，其特征在于：根据电泳结果，***/缺失多态性位点有两个基因型II和ID，其中***/***基因型II表现为162bp一条带纹，***/缺失基因型ID表现为162bp和大于162bp的两条带纹。
5.根据权利要求1至4任一项所述的绵羊PER2基因***/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述绵羊为澳洲白绵羊或兰州大尾羊。
6.如权利要求1至4任一项所述的检测方法在绵羊育种的分子标记辅助方面中的应用。
7.绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位6-bp***/缺失多态性位点在绵羊育种的分子标记辅助方面中的应用。
8.一种绵羊PER2基因***/缺失多态性的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含用于PCR扩增绵羊PER2基因NC_040252.1:g.2899558-2899563位6-bp***/缺失多态性位点的引物对。
9.根据权利要求8所述的绵羊PER2基因***/缺失多态性的检测试剂盒，其特征在于：所述引物对为：
上游引物：SEQ NO.1；
下游引物：SEQ NO.2。
10.如权利要求8或9所述的检测试剂盒在绵羊育种的分子标记辅助方面中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110566106.8A CN113308551A (zh) | 2021-05-24 | 2021-05-24 | 一种绵羊per2基因***/缺失多态性的检测方法、试剂盒和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110566106.8A CN113308551A (zh) | 2021-05-24 | 2021-05-24 | 一种绵羊per2基因***/缺失多态性的检测方法、试剂盒和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113308551A true CN113308551A (zh) | 2021-08-27 |
Family
ID=77374454
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110566106.8A Withdrawn CN113308551A (zh) | 2021-05-24 | 2021-05-24 | 一种绵羊per2基因***/缺失多态性的检测方法、试剂盒和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113308551A (zh) |
-
2021
- 2021-05-24 CN CN202110566106.8A patent/CN113308551A/zh not_active Withdrawn
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110468218B (zh) | 一种山羊igf2bp1基因***/缺失标记的检测方法 | |
| CN109880890B (zh) | 一种山羊hiat1基因***/缺失多态性的检测方法及其应用 | |
| CN109957614B (zh) | 一种山羊cmtm2基因***/缺失多态性的检测方法及其应用 | |
| CN110468185B (zh) | 一种山羊dnmt3b基因***/缺失多态性的检测方法及其应用 | |
| CN109182539B (zh) | 一种黄牛igf1r基因***/缺失的检测方法及其应用 | |
| CN112795667B (zh) | 一种牛fras1基因***/缺失突变的检测方法及其应用 | |
| CN111088369B (zh) | 一种绵羊rora基因***/缺失多态性的检测方法、引物对和应用 | |
| CN111154892B (zh) | 绵羊bmpr1b基因***/缺失多态性检测用引物对、试剂盒、方法和应用 | |
| CN110607373B (zh) | 一种山羊dnah1基因***/缺失多态性的检测方法及其应用 | |
| CN112941202B (zh) | 一种牛sept7基因***/缺失突变的检测方法及其应用 | |
| CN112553345B (zh) | 一种绵羊prnp基因***/缺失在繁殖性状早期选择方面中的应用 | |
| CN112795668B (zh) | 一种山羊cfap43基因***/缺失标记在性状早期选择中的应用 | |
| CN111088373B (zh) | 绵羊prl基因***/缺失多态性的检测引物对、试剂盒、方法和应用 | |
| CN111118179B (zh) | 一种检测鲁西黑公羊胸深性状的dna检测方法及其应用 | |
| CN111154891B (zh) | 绵羊igf2bp1基因***/缺失多态性的检测引物对、试剂盒、方法和应用 | |
| CN113308551A (zh) | 一种绵羊per2基因***/缺失多态性的检测方法、试剂盒和应用 | |
| CN112852974B (zh) | 一种绵羊ahr基因***/缺失作为繁殖性状早期选择的应用方法 | |
| CN113308550A (zh) | 一种绵羊cry2基因***/缺失多态性的检测方法、试剂盒和应用 | |
| CN110904247B (zh) | 一种山羊Sox9基因InDel标记的检测方法及其应用 | |
| CN112609007B (zh) | 一种绵羊kdm3b基因***/缺失作为繁殖性状早期选择的应用及方法 | |
| CN112941203A (zh) | 一种牛ITGβ5基因***/缺失突变的检测方法及其应用 | |
| CN111154895B (zh) | 绵羊ghr基因***/缺失多态性的检测引物对、试剂盒、方法和应用 | |
| CN113278708A (zh) | 一种绵羊pdgfd基因***/缺失多态性的检测方法、试剂盒和应用 | |
| CN111154894B (zh) | 一种检测鲁西黑头羊体重性状的dna检测方法及其应用 | |
| CN117568487A (zh) | 绵羊mast4基因***/缺失标记的繁殖性状早期选择的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20210827 |
|
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |