CN113303342A

CN113303342A - 银杏内生球黑孢菌生物农药及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113303342A
Application number: CN202110548524.4A
Authority: CN
Inventors: 沈玉平; 袁志辉; 齐成媚; 刘小文; 何福林; 张祖姣
Original assignee: Hunan University of Science and Engineering
Current assignee: Hunan University of Science and Engineering
Priority date: 2021-05-19
Filing date: 2021-05-19
Publication date: 2021-08-27

Abstract

本发明公开了一种银杏内生球黑孢菌生物农药及其制备方法与应用。该生物农药包括银杏内生球黑孢菌发酵液和葡萄糖、玉米浆。抑菌实验显示，该生物农药能有效的抑制姜青枯菌的生长和繁殖，与阳性对照农用硫酸链霉素效果相当；田间试验显示，该生物农药对姜青枯病的防治达到80％以上，与农用硫酸链霉素效果相当。本发明采用银杏内生球黑孢菌发酵液制备生物农药，绿色安全无污染，且不易产生抗药性，能对姜青枯病进行有效防控。

Description

银杏内生球黑孢菌生物农药及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种银杏内生球黑孢菌生物农药及其制备方法与应用。

背景技术

姜青枯病，俗称姜瘟病，是由姜青枯菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种重大病害，严重影响着我国生姜的产量和品质，据调查，生姜主产区常年由于姜青枯病的危害而损失20％～30％，重者可达80％以上，且一旦大面积发病，很难采取补救措施，给姜农带来巨额损失。腐烂的生姜中还含有对人体有害的黄樟素，影响人类的健康。

银杏(Ginkgo biloba)是我国有大量栽培的世界珍稀树种，在其生长过程中几不会或很少感染病虫害。一方面是由于银杏自身在代谢过程中产生的抑菌活性物质，比如银杏黄酮、内酯、银杏酸等；另一方面，与银杏共生的内生菌代谢长生的抑菌抗菌次级代谢物，二者协同对病虫害进行防御。因此，银杏提取物或银杏内生菌均可开发作为生物农药使用。但是，受限于气候、土地资源和生长周期，银杏提取物作为生物农药开发具有一定的局限性；而银杏内生菌生长繁殖速度快，不受气候、土地和生长周期限制，更具有应用开发价值。发明人在前期工作中筛选到一株银杏内生真菌，具有抗青枯菌的活性，经鉴定为球黑孢菌(Nigrospora sphaerica，保藏编号为CCTCCM 2018755)，已申请专利保护菌株(ZL201811382974.5)。实验室试验显示，该菌株对姜青枯菌具有明显的拮抗作用，是一种应用开发潜力巨大的生防菌。

发明内容

本发明的目的在于提供一种银杏内生球黑孢菌生物农药及其制备方法与应用。

一种银杏内生球黑孢菌生物农药，包括银杏球黑孢菌发酵液、葡萄糖和玉米浆。

所述葡萄糖的终浓度为5-15g/L。

所述葡萄糖的终浓度为0.5-2g/L。

所述银杏内生球黑孢菌生物农药的制备方法，按照如下步骤进行：

(1)银杏球黑孢菌的活化：取-80℃保藏的菌株，用接种环挑取孢子，在PDA斜面培养基上划线，在28℃恒温培养箱中培养5-7天，直至试管中长满菌丝；

(2)种子液的制备：用接种环取活化的菌丝，接种到装有100mL PDB液体培养基的500mL规格的摇瓶中，培养20-30h；

(3)发酵：采用发酵罐进行发酵，发酵培养基为PDB培养基，装液量为60％，发酵温度28-32℃，溶氧全程控制在25-35％，溶氧与转速进行关联控制，通过调节转速来控制和调节溶氧，转速设置最低600rpm，最高1200rpm；发酵120h后，待发酵液变为深红色，每隔12h取样用HPLC检测9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素(9α-hydroxydihydrodesoxybostrycin)浓度，当其浓度在1.0g/L以上，终止发酵，制成发酵液；

(4)按照葡萄糖终浓度10g/L，玉米浆终浓度1g/L添加相应重量的葡萄糖和玉米浆，溶解混匀，即为制备的生物农药。

所述发酵罐采用5L发酵罐。

所述发酵罐的通气量为5L/min，pH 7.0，分别用20％NaOH和20％磷酸溶液调节pH。

所述银杏内生球黑孢菌生物农药防治姜青枯菌的用途。

本发明的有益效果：本发明以专利菌株银杏内生球黑孢菌(保藏编号为CCTCCM2018755)发酵液为基础，添加辅料葡萄糖和玉米浆，制备银杏生物农药。实验室试验显示，该生物农药对姜青枯病病原菌-姜青枯菌显示出良好的拮抗效果；田间试验显示，该生物农药对姜青枯病的防治达到80％以上，与农用硫酸链霉素效果相当。因而，该生物农药对姜青枯病具有较好的防治作用。

附图说明

图1为银杏生物农药对姜青枯菌的抑制作用；

图中，A、B：100倍稀释生物农药；C：阳性对照25μg/L农用硫酸链霉素；D：阴性对照无菌水。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

实施例1银杏生物农药的制备

1、银杏球黑孢菌发酵液的制备

(1)银杏球黑孢菌的活化：取-80℃保藏的菌株，用接种环挑取少许孢子，在PDA斜面培养基上划线，在28℃恒温培养箱中培养5-7天，直至试管中长满菌丝。

(2)种子液的制备：用接种环在“(1)”中活化的菌丝少许，接种到装有100mL PDB液体培养基的500mL规格的摇瓶中，培养24h。

(3)发酵：发酵采用5L发酵罐进行发酵(Sartorius Biostat A，德国贝朗)，发酵培养基为PDB培养基，装液量为60％，接种量为10％，发酵温度30℃，通气量为5L/min，pH 7.0，分别用20％NaOH和20％磷酸溶液调节pH；溶氧全程控制在30％，溶氧与转速进行关联控制，通过调节转速来控制和调节溶氧，转速设置最低600rpm，最高1200rpm。发酵120h后，待发酵液变为深红色，每隔12h取样用HPLC检测9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素(9α-hydroxydihydrodesoxybostrycin)浓度，当其浓度在1.0g/L以上，即可终止发酵。纱布过滤去除菌丝体和固体颗粒，备用。

9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素HPLC分析方法：

A、样品的制备：取发酵液1mL，离心后将上清液转移至2mL离心管中，然后加入1mL乙酸乙酯，振荡混匀萃取10-15min，分层后取上层液体，0.22μm滤膜过滤，即为分析样品。

B、分析方法：

色谱柱为Symmetry-C₁₈色谱柱。流动相：A相为0.1M的pH 6.50乙酸钠溶液，预先配制0.1M的乙酸钠溶液，用乙酸调节pH至6.5，0.22μm滤膜过滤后超声脱气备用；B相为乙腈：水＝4：1溶液，按照体积比配制乙腈：水＝4:1的溶液，用0.22μm滤膜过滤，流动相超声脱气备用。柱温为36℃，流速为1mL/min，进样体积：10μL，检测波长为400nm。采用等度洗脱的方法，B相浓度维持在60％进行分析，在5.432min处即可出现9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素峰。

2、辅料的添加

根据发酵液的体积，按照葡萄糖终浓度10g/L，玉米浆终浓度1g/L添加相应重量的葡萄糖和玉米浆，溶解混匀，即为制备的生物农药。

实施例2银杏生物农药对姜青枯菌的抑制作用

在实验室条件下，以农用硫酸链霉素为对照，考察本发明银杏生物农药对姜青枯菌的抑制效果。

1、银杏生物农药的制备，按照实施例1中所述方法制备银杏生物农药备用。

2、姜青枯菌的活化：从保藏好的姜青枯菌斜面上用接种环刮取一小环菌体，接种到装有50mL CPG液体培养基(配方：酸水解酪蛋1g，蛋白胨10g，葡萄糖5g，蒸馏水1000mL，自然pH，121℃灭菌15分钟)的250mL摇瓶中，30℃震荡培养12-16h，活化，所得姜青枯菌悬液即为活化后的姜青枯菌。

3、抑菌实验

A、取活化后的姜青枯菌培养液稀释100倍后，取100μL涂布于CPC固体培养基平板。并在平板上分别标记样品、阳性对照(25μg/L农用硫酸链霉素)、阴性对照(无菌蒸馏水)，并将灭菌后的牛津杯(6mm)摆放至相应的区域。

B、用无菌移液器吸取100倍稀释的银杏生物农药150μL，缓慢加至标记为样品的区域摆放的牛津杯中；同时，吸取150μL无菌蒸馏水缓慢加至阴性对照区域摆放的牛津杯中，吸取150μL农用硫酸链霉素溶液(25μg/L)缓慢加至阳性对照摆放的牛津杯中。

C、将上述平板在30℃恒温培养箱培养24h，观察，并测量抑菌圈直径，详细结果见表1和图1。

表1银杏生物农药对姜青枯菌的抑制作用

从图1和表2中的结果可以看出，本发明银杏生物农药的100倍稀释液对姜青枯菌的抑制作用与25μg/L相当。

实施例3银杏生物农药对姜青枯病的防治作用

试验地位于湖南省永州市双牌县麻江乡生姜种植基地，已发生姜青枯病，试验前3天及试验过程中未喷洒任何农药。试验地土质为沙壤，pH6.7，密度1.31g/cm³，肥水管理充足，试验过程中试验地管理方式保持一致。

本次试验设五个处理，100倍液，500倍液，1000倍液，阳性对照组(72％农用硫酸链霉素1000倍液)，阴性对照组(清水)，实验组(实施例1制备的银杏生物农药)。试验区选择长势基本一致，发病程度基本相同的初发病田块作为试验区，使用喷雾器喷药，药量为35kg/亩，喷洒时保证茎叶及行间土壤均受药均匀。第一次喷药后，间隔7日后实施第二次喷药，共连续喷药3次。每次喷药后的第7天下午观察发病情况，计算发病指数和防治效率，评价防治效果。检查时，每个处理取固定取5个点，每个点9株，共计45株。

生物防治效果评价：

发病指数和防治效果按照以下公式1和2计算。

生姜青枯病发病情况按照以下标准分级：0级：整个植株无病斑；1级：20％以下的茎叶有病斑或枯死；2级：20％～40％以下的茎叶有病斑或枯死；3级：40％～60％以下的茎叶有病斑或枯死；4级：60％～80％以下的茎叶有病斑或枯死；5级：全株枯死或90％以上茎叶有病斑或枯死。结果如表2所示。

病情指数：

防治效率：

表2不同处理对姜青枯病的防治效果

田间试验表明，随着本发明银杏生物农药施药次数的增加，三个稀释度对姜青枯病的防治效率均呈现上升趋势，连续三次施药后，100倍和500稀释液银杏农药的防治效率均在80％以上，与生姜青枯病常用防治药物农用硫酸链霉素的防治效率相当，而1000倍稀释液的防治效率仅为67.78，较对照低，可能是稀释倍数过高，导致有效药物成分浓度降低，使防治效果下降。总的来说，说明本发明银杏生物农药对生姜青枯病具有较高的防治效率，较好的防治效果，在100～500倍稀释范围内对生姜青枯病有较好的防治效果，与农用硫酸链霉素效果相当。

为防止抗生素的滥用，加强环境保护，早在2011年5月，第八届全国农药登记评审委员会第九次会议即决定：停止受理和批准硫酸链霉素的新增田间试验、农药登记，已批准含有硫酸链霉素的产品，其登记证件到期后不再办理续展登记。因而，农用硫酸链霉素将逐步退出退出历史舞台。本发明银杏生物农药对姜青枯病的防治效果与农用硫酸链霉素相当，而且绿色安全无污染，可以用于替代农用硫酸链霉素防治姜青枯病。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种银杏内生球黑孢菌生物农药，其特征在于，包括银杏球黑孢菌发酵液、葡萄糖和玉米浆。

2.根据权利要求1所述银杏内生球黑孢菌生物农药，其特征在于，所述葡萄糖的终浓度为5-15g/L。

3.根据权利要求1所述银杏内生球黑孢菌生物农药，其特征在于，所述葡萄糖的终浓度为0.5-2g/L。

4.权利要求1所述银杏内生球黑孢菌生物农药的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

(3)发酵：采用发酵罐进行发酵，发酵培养基为PDB培养基，装液量为60％，发酵温度28-32℃，溶氧全程控制在25-35％，溶氧与转速进行关联控制，通过调节转速来控制和调节溶氧，转速设置最低600rpm，最高1200rpm；发酵120h后，待发酵液变为深红色，每隔12h取样用HPLC检测9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素浓度，当其浓度在1.0g/L以上，终止发酵，制成发酵液；

5.根据权利要求4所述银杏内生球黑孢菌生物农药的制备方法，其特征在于，所述发酵罐采用5L发酵罐。

6.根据权利要求4所述银杏内生球黑孢菌生物农药的制备方法，其特征在于，所述发酵罐的通气量为5L/min，pH 7.0，分别用20％NaOH和20％磷酸溶液调节pH。

7.权利要求1所述银杏内生球黑孢菌生物农药防治姜青枯菌的用途。