CN113302306A - 用于代谢工程的嵌合启动子 - Google Patents

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Abstract

本发明包括嵌合启动子，其根据不同条件(诸如碳源)启动基因的转录。本发明还涉及包含该嵌合启动子的重组DNA片段、包含该重组DNA片段的表达质粒和用该重组DNA片段转化的宿主细胞。

Description

用于代谢工程的嵌合启动子
技术领域
本发明包括嵌合启动子，其可以在各种条件(诸如不同碳源)下启动基因的转录。本发明还涉及包含该嵌合启动子的重组DNA片段、包含该重组DNA片段的表达质粒和用该重组DNA片段转化的宿主细胞。
背景技术
数千年以来，酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)和S.sensu stricto物种被用于生产面包和酒精饮料(如清酒、红酒或啤酒)。通过该长期工业使用，使酵母适应于工艺条件，并且可以耐受生物反应器中的机械力、抑制物和发酵产物。此外，它们对于温度的波动是稳定的，并且可以在低pH值下发酵糖，使污染风险最小化。除此之外，酿酒酵母是关键的实验室模型***，并且可以容易地被遗传修饰，并且一般被认为符合安全-GRAS标准。广泛的遗传工具组可用于酿酒酵母，且许多细胞内过程(如代谢、分泌、转运、信号传导)和其他途径被充分研究，这有助于成功地工程化酵母以用于广泛的多种应用。
尤其是多酶途径的引入需要根据不同条件(诸如不同的碳源，包括不同比例的碳源，其中酶是异源的或天然的)调节和控制基因表达，以优化底物利用和/或产物形成。因此，转录控制发生在位于基因上游区——启动子的寡核苷酸序列处。因此，启动子强度和调节是代谢工程的关键点。
代谢工程和启动子选择中的一个重要因素是遗传稳定性。由于相同序列的序列段之间的同源重组，相同启动子的多次使用通常导致工程化菌株的遗传不稳定。
不同类型的启动子是本领域已知的。本发明涉及嵌合启动子，其中组合了不同的启动子或不同启动子的部分，即具有启动子活性的寡核苷酸或其部分。
在下文中，将更详细地描述本发明的元素。这些元素是以特定实施方案列出的，但是，应当理解的是，它们可以任何方式和以任何数量组合以产生其他的实施方案。各种描述的实施例和实施方案不应当被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。该描述应当被理解为支持和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的公开的元素组合的实施方案。此外，本申请中的所有描述的元素的任何排列和组合应当被认为是本申请说明书所公开的，除非上下文另有说明。
在整个说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和诸如“包含”和“含有”的变型将被理解为表示，包括所述的成员、整数或步骤，或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其它成员、整数或步骤，或者成员、整数或步骤的组。除非在本文中另有说明或者与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是权利要求书的上下文中)使用的术语“一个”和“一种”和“该”以及类似的引用应被解释为涵盖单数和复数。本文中对数值范围的叙述仅用作单独地提及落入该范围内的每个单独的数值的简略写法。除非本文另有说明，否则每个单独的数值均被引入说明书中，如同其在本文中被单独地引用。本文所描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另有说明或者与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”、“例如”)的使用仅为更好地阐释本发明，而不对另外要求保护的本发明的范围施加限制。说明书中的语言不应被解释为表示对本发明的实践所必需的任何未要求保护的元素。
对于分别调节依赖于特定条件(诸如不同碳源，包括例如不同比例的碳源)的一种或多种基因的转录和任选地表达的启动子和启动子组合存在较高的需求。该条件是例如细胞内和/或细胞外条件，并且需要使得细胞的基因转录对一种或多种条件的优化适应的启动子。这样的启动子应当允许优化细胞的转录，使得基因的转录在需要时被活化或增加，且在不再需要时被停止或减少/降低以优化细胞资源的利用。因此，对于足以在特定条件(诸如碳源)下控制的以优化细胞中的基因转录且由此的基因表达的启动子，存在较高的需求。
发明简述
本发明涉及嵌合启动子，其特征在于，其包含两个或更多寡核苷酸序列或其部分，所述寡核苷酸序列或其部分调节合成代谢和/或分解代谢途径(诸如糖酵解和糖异生)的基因的转录，并增加被分型为编码蛋白的信使RNA片段、调节RNA片段、酶活性RNA片段或转移RNA片段的RNA转录水平，所述蛋白选自下组：酶(例如碳水化合物修饰酶)、结构蛋白、辅酶、转运子、抗体、激素和调节子，所述嵌合启动子与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3具有至少80％或至少85％的序列同一性。碳水化合物修饰酶例如选自下组：EC 5.1.3、EC5.3.1、EC 2.7.1、EC 2.2.1和EC 1.1.1。转运子例如选自下组：TC 2.A.1.1和2.A.1.2。
本发明的嵌合启动子使得，例如当在例如选自下组的碳源上生长用至少一种包含该嵌合启动子的重组DNA片段转化的宿主细胞时，酵母宿主细胞中的RNA片段的转录水平增加：葡萄糖、木糖、乙醇及其组合。本发明的嵌合启动子包含例如数目增加的转录结合因子，例如选自下组：REB1、GCR1、GCR2、PHD1、TYE7、PHO2、PHO4、AZF1及其组合。
SEQ ID NO.1(pCHI3)的嵌合启动子包含例如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.6，SEQID NO.2(pCHI4)的嵌合启动子包含例如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.11，以及SEQ ID NO.3(pCHI5)的嵌合启动子包含例如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.9。
本发明进一步涉及包含本发明嵌合启动子的重组DNA片段，包含至少一种重组DNA片段的表达质粒，和用至少一种重组DNA片段转化的或用至少一种表达质粒转化的宿主细胞。
发明详述
因此，本发明的发明人已将其自身的任务确定为开发新的和改进的嵌合启动子，其能够响应于不同的细胞内和/或细胞外条件(诸如不同的碳源，包括不同比例的碳源)，实现细胞的一种或多种基因的高度特异性、可靠的转录控制，其中该嵌合启动子对于工业应用是高度可行的。
此外，本发明的嵌合启动子扩展了用于在诸如酵母的微生物(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))中基因工程化的启动子集合，包括例如增加的表达水平的多样性。本发明的启动子包含形成异源启动子的异源寡核苷酸或由其组成。由于表达了许多基因，有利的是可具有几个异源启动子，即使它们可以分别产生相似的转录水平和可以具有相似的表达速率，以增加工程化微生物的基因稳定性，所述工程化微生物的特征在于通过同源重组不丢失或很少丢失引入的基因元件。
本发明的发明人令人惊讶地发现，该任务可通过嵌合启动子来解决，该嵌合启动子包含调节合成代谢途径和/或分解代谢途径的基因转录的两个或更多寡核苷酸序列或其部分，其中分解代谢途径对应于合成代谢途径，诸如分别为糖酵解和糖异生的基因，其例如增加RNA的转录水平(基于RNA的转录速率和稳定性)，所述RNA诸如为编码选自下组的蛋白的信使RNA片段：酶、结构蛋白、辅酶、转运子、抗体、激素和调节子，诸如为调节性RNA片段，诸如为酶活性RNA片段或转移RNA片段，所述嵌合启动子与SEQ ID NO.1(pCHI3)、SEQ IDNO.2(pCHI4)或SEQ ID NO.3(pCHI5)具有至少80％的序列同一性。
本申请中氨基酸、肽、核苷酸和核酸的命名遵循IUPAC的建议。通常，在本文中氨基酸根据单字母代码命名。
“嵌合启动子”是具有启动子活性的寡核苷酸。根据本发明的“寡核苷酸”应理解为包含2-1000个核酸、优选10-900个核酸、更优选50-850个核酸、最优选100-820个核酸的单链或双链DNA或RNA分子。
术语“DNA”和“RNA”是本领域技术人员熟知的。DNA含有脱氧核糖，而RNA含有核糖(在脱氧核糖中，在2’位置上戊糖环上没有连接羟基)。腺嘌呤的互补碱基不是胸腺嘧啶(在DNA中是)，而是尿嘧啶，尿嘧啶是胸腺嘧啶的非甲基化形式。
本发明的嵌合启动子包含两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)寡核苷酸序列或其部分(例如启动子或其部分)或由其组成，所述寡核苷酸序列或其部分调节合成代谢和分解代谢途径的一种或多种基因(即相反代谢途径的基因，例如糖酵解(葡萄糖降解)和糖异生(葡萄糖合成)(例如图1))的转录。这些基因不是根据它们所属的途径分类的，而是根据它们在该途径的特定条件下的活化分类的，例如高或低葡萄糖水平的存在(例如在酿酒酵母中)。根据该分类，糖酵解的基因是例如PGK1、ENO1或PFK2，糖异生的基因是例如PGI1、TPI1或FBA1。
嵌合启动子pCHI3、pCHI4和pCHI5具有如下序列：
Figure BDA0003168824630000051
Figure BDA0003168824630000061
本发明的嵌合启动子包含选自下组的寡核苷酸(例如，启动子的部分)或由其组成：pK1a(SEQ ID NO.4)、pK2a(SEQ ID NO.5)、pK2b(SEQ ID NO.6)、pK3b(SEQ ID NO.7)、pK4a(SEQ ID NO.8)、pK4c(SEQ ID NO.9)、pK5a(SEQ ID NO.10)、pK5b(SEQ ID NO.11)、pK6a(SEQ ID NO.12)及其组合。
这些部分的序列如下所示：
Figure BDA0003168824630000062
Figure BDA0003168824630000071
嵌合启动子pCH13(SEQ ID NO.1)包含寡核苷酸(例如启动子的部分)pK5a(SEQ IDNO.10)和pK2b(SEQ ID NO.6)或由其组成。嵌合启动子pCH14(SEQ ID NO.2)包含寡核苷酸(例如启动子的部分)pK4a(SEQ ID NO.8)、pK3b(SEQ ID NO.7)和pK5b(SEQ ID NO.11)或由其组成。嵌合启动子pCH15(SEQ ID NO.3)包含寡核苷酸(例如启动子的部分)pK6a(SEQ IDNO.12)、pK1a(SEQ ID NO.4)、pK2a(SEQ ID NO.5)和pK4c(SEQ ID NO.9)或由其组成。嵌合启动子和它们的部分(寡核苷酸)示于图1中。
此外，在本发明的嵌合启动子中，转录因子结合位点被改进，其例如选自下组：REB1(例如具有序列RTTACCCK)、GCR1(例如具有序列CTTCC)、GCR2(例如具有序列GCTTCCA)、PHD1(例如具有序列SMTGCA)、TYE7(例如具有序列CACGTGA)、PHO2(例如具有序列ATAWTW)、PHO4(例如具有序列GCRCGYG)、AZF1(例如具有序列AAAMRGMAA)及其组合(图2和3)，其中R、K、W、M、Y等根据IUPAC确定，例如R＝A或G，K＝G或T，W＝A或T，M＝A或C及Y＝C或T。本发明的嵌合启动子包含“核心区”，该核心区在接近翻译的起点且未修饰的嵌合启动子的5’-端包含至少210bp，即该核心区对应于天然寡核苷酸的序列。根据本发明的天然寡核苷酸是与其起源的微生物中发现的序列相同的核酸序列。例如，源自乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，被转移至宿主微生物(诸如酿酒酵母)的寡核苷酸包含对应于乳酸克鲁维酵母序列的核心区或由其组成。形成本发明的嵌合启动子的寡核苷酸或其部分，例如与其所源自的寡核苷酸定向在相同的方向上，且位于相同的位置。
本发明的嵌合启动子，即具有启动子活性的寡核苷酸，被转移到宿主细胞中，该宿主细胞是与启动子的寡核苷酸所源自的微生物不同的微生物，或是与启动子的寡核苷酸所源自的微生物相同的微生物。
根据本发明的嵌合启动子包含与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3具有80％-100％序列同一性、81％-99％序列同一性、82％-98％序列同一性、85％-97％序列同一性、88％-96％序列同一性、90％-95％序列同一性，或至少80％序列同一性，优选至少82％，更优选至少85％，特别优选至少90％，甚至更优选至少92％，还优选至少95％，进一步优选至少98％和最优选至少99％序列同一性的核酸序列。
在另一个实例中，核酸序列选自下组：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3。
根据本发明的嵌合启动子提高某些RNA片段的转录水平，所述RNA片段例如功能性连接于嵌合启动子，即受嵌合启动子控制，例如依赖于变化的条件，诸如不同的碳源，包括不同比例的碳源。本发明的嵌合启动子具有特定的功能特征，即，例如与由现有技术的启动子产生的各自转录水平相比，当宿主生长于且启动子分别暴露于特定碳源时，其使得某些RNA的转录水平提高，以及当宿主生长于且启动子分别暴露于另一特定碳源时，其使得某些RNA的转录水平不变或降低。选择和组合形成嵌合启动子的寡核苷酸以(特异性地)调节转录水平。单独的嵌合启动子的寡核苷酸可显示与形成嵌合启动子的寡核苷酸组合不同的转录水平。本发明的极大优点是寡核苷酸的组合，其使得嵌合启动子例如根据碳源，特异性地调节一种或多种转录水平。
因此，术语“增加”或“转录水平的降低”应理解为，例如与现有技术的寡核苷酸(其为现有技术中已知的存在于微生物中的天然的或重组的寡核苷酸)引起的转录水平相比的增加或降低。例如，如果具有启动子活性的寡核苷酸源自乳酸克鲁维酵母(K.lactis)并被转移到酿酒酵母，则确定转录水平的增加或降低的参照是在乳酸克鲁维酵母或酿酒酵母中具有启动子活性的寡核苷酸，其例如天然地或重组地存在于该微生物中。例如，与酿酒酵母的天然启动子(例如，pPKG1_Sce，在该情况下其代表现有技术的寡核苷酸)相比，确定基于本发明的嵌合启动子(诸如pCH13、pCH14或pCH15)活性的RNA的转录水平。“转录水平的增加或降低”通常如下确定：
Figure BDA0003168824630000091
RTLI-由根据本发明的嵌合启动子控制的报告***(例如XylA，SEQ ID NO.13)的相对转录水平
RTLS-由根据现有技术的寡核苷酸控制的报告***(例如XylA，SEQ ID NO.13)的相对转录水平
因此，相对转录水平被测量为细胞提取物中报告***的RNA浓度相对于相同细胞提取物中管家基因(例如ACT1)的RNA浓度。
其中RTLI和RTLS通过使用相同类型的宿主细胞来确定，而宿主细胞用至少一种包含相应嵌合启动子的重组DNA片段转化，且宿主细胞在相同的现有技术条件下生长，且在指数生长期内收获。
在优选实施方案中，当在碳源(包括不同比例的碳源)上生长用至少一种根据本发明的包含嵌合启动子的重组DNA片段转化的酵母宿主细胞(优选酿酒酵母)时，特异基因的转录水平增加，该碳源例如选自下组：葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、木糖、***糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、甘油、乙醇、乙酸酯(acetate)和乳酸酯(lactate)，特别是葡萄糖、木糖和/或乙醇。所述增加如下确定：
Figure BDA0003168824630000101
RTLIe-由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3嵌合启动子或例如与SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3具有至少80％序列同一性的衍生物控制的编码SEQ IDNO.15的信使RNA的相对转录水平
RTLSe-由寡核苷酸SEQ ID NO.14控制的编码SEQ ID NO.15的信使RNA的相对转录水平
因此，相对转录水平被测量为酵母(酿酒酵母)细胞提取物中编码SEQ ID NO.15的信使RNA的浓度相对于与同一酵母细胞提取物中编码肌动蛋白的管家基因的信使RNA的浓度。
其中RTLIe和RTLSe通过使用相同类型的酵母宿主细胞(酿酒酵母)来确定，其中酵母宿主细胞用至少一种包含相应嵌合启动子的重组DNA片段转化，且酵母宿主细胞在相同的现有技术条件下生长，其中酵母宿主细胞在指数生长期内收获。
在本发明特别优选的实施方案中，取决于不同的条件(诸如不同的碳源，包括不同比例的碳源)，用至少一种包含根据本发明的嵌合启动子的重组DNA片段转化的酵母宿主细胞中的基因的转录水平增加，例如当在选自下组的碳源上生长宿主细胞(诸如酵母)时：葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、木糖、***糖、蔗糖、海藻糖、棉籽糖、甘油、乙醇、乙酸酯、乳酸酯及其组合；或在选自下组的碳源上生长宿主细胞(诸如酵母)时：葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖、蔗糖、甘油、乙醇及其组合；或在选自下组的碳源上生长宿主细胞(诸如酵母)时：葡萄糖、甘露糖、甘油、乙醇、木糖及其组合；或在选自下组的碳源上生长宿主细胞(诸如酵母)时：葡萄糖、木糖、乙醇及其组合，转录水平增加1.1倍-10倍、1.2倍-9倍、1.3倍-8倍、1.4倍-7倍、1.5倍-6倍、1.4倍-5倍、1.5倍-4倍、1.6倍-3倍、1.7倍-2.5倍、1.8倍-2.4倍、1.9倍-2.3倍，或至少增加1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍-至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍或更多，或增加1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍。
任选地，另外，取决于不同的条件(诸如不同的碳源，包括不同比例的碳源)，根据本发明的嵌合启动子增加由寡核苷酸控制的RNA编码的酶活性。术语“x-倍酶活性”因此应理解为，与具有现有技术的启动子活性的寡核苷酸的酶活性相比，酶活性的增加或减少。“x-倍酶活性”通常如下确定：
Figure BDA0003168824630000111
EAI-由根据本发明的嵌合启动子控制的报告***(例如XI，SEQ ID NO.15)的酶活性
EAS-由根据现有技术的寡核苷酸控制的报告***(例如XI，SEQ ID NO.15)的酶活性
因此，酶活性被测量为每分钟通过限定量的细胞提取物转化的底物量，不包括报告***的背景活性。
其中EAI和EAS通过使用相同类型的宿主细胞来确定，其中宿主细胞用至少一种包含相应嵌合启动子的重组DNA片段转化，且该宿主细胞在相同的现有技术条件下生长，其中该宿主细胞在指数生长期内收获。
在优选实施方案中，取决于不同条件(诸如不同碳源，包括不同比例的碳源)，酶活性增加，例如当在选自下组的碳源上生长用至少一种包含根据本发明的嵌合启动子的重组DNA片段转化的宿主细胞(诸如酵母，例如酿酒酵母)时：葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、木糖、***糖、蔗糖、海藻糖、棉籽糖、甘油、乙醇、乙酸盐、乳酸盐及其组合；或在选自下组的碳源上生长用至少一种包含根据本发明的嵌合启动子的重组DNA片段转化的宿主细胞(诸如酵母，例如酿酒酵母)时：葡萄糖、木糖、乙醇及其组合，酶活性增加1.1倍-10倍、1.2倍-9倍、1.3倍-8倍、1.4倍-7倍、1.5倍-6倍、1.4倍-5倍、1.5倍-4倍、1.6倍-3倍、1.7倍-2.5倍、1.8倍-2.4倍、1.9倍-2.3倍，或至少1.5倍或至少2倍或1.1倍-5倍、1.2倍-4倍、1.3倍-3.5倍、1.4倍-3倍、1.5倍-2.9倍、1.6倍-2.8倍、1.7倍-2.7倍、1.8倍-2.6倍、1.9倍-2.5倍或2倍。
增加量如下确定：
Figure BDA0003168824630000121
EAIe-由嵌合启动子SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或例如与SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3具有至少80％序列同一性的衍生物控制的蛋白质SEQ IDNO.15的酶活性。
EASe-由寡核苷酸SEQ ID NO.14控制的蛋白质SEQ ID NO.15的酶活性。
因此，酶活性被测量为每分钟通过限定量的细胞提取物转化的木糖量，不包括报告***的背景活性。
其中EAIe和EASe通过使用相同类型的宿主细胞(酿酒酵母)来确定，其中宿主细胞用至少一种包含各自相应启动子的重组DNA片段转化，且该宿主细胞在相同的现有技术条件下生长，其中该宿主细胞在指数生长期内收获。
在本发明的实施方案中，取决于不同条件(诸如不同碳源，包括不同比例的碳源)，用至少一种包含根据本发明的嵌合启动子的重组DNA片段转化的酵母宿主细胞中的一种或多种酶活性增加且一种或多种其他酶活性保持不变或降低。例如，当在选自下组的碳源上生长宿主细胞(诸如酵母)时：葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、木糖、***糖、蔗糖、海藻糖、棉籽糖、甘油、乙醇、乙酸酯、乳酸酯及其组合；或在选自下组的碳源上生长宿主细胞(诸如酵母)时：葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖、蔗糖、甘油、乙醇及其组合；或在选自下组的碳源上生长宿主细胞(诸如酵母)时：葡萄糖、甘露糖、甘油、乙醇、木糖及其组合；或在选自下组的碳源上生长宿主细胞(诸如酵母)时：葡萄糖、木糖、乙醇及其组合，转录水平的增加或减少范围为1.1倍-10倍、1.2倍-9倍、1.3倍-8倍、1.4倍-7倍、1.5倍-6倍、1.4倍-5倍、1.5倍-4倍、1.6倍-3倍、1.7倍-2.5倍、1.8倍-2.4倍、1.9倍-2.3倍，或至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍或更多，或1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍。
在本发明中，术语“调节RNA片段”应理解为能够通过与基因的mRNA或DNA的一部分互补来下调基因表达的RNA链。“调节RNA片段”的实例为通过RNA干扰(RNAi)作用的微小RNA(miRNA)，其中miRNA和酶的效应复合物可切割互补的mRNA，阻断mRNA被翻译，或加速其降解。mRNA可在5’非翻译区或3’非翻译区含有调节元件本身，诸如核糖开关；这些顺式调节元件调节该mRNA的活性。非翻译区还可含有调节其它基因的元件。
在本发明中，术语“酶活性RNA片段”应理解为是可催化细胞内的酶促反应的蛋白质复合物的一部分的RNA，如核糖体RNA或本身形成催化活性复合物(诸如核酶(核糖核酸酶))的RNA。
在本发明中，术语“酶活性RNA片段”应理解为是可催化细胞内的酶促反应的蛋白质复合物的一部分的RNA，如核糖体RNA或本身形成催化活性复合物(诸如核酶(核糖核酸酶))的RNA。
在本发明中，术语“转移RNA片段”(tRNA片段)应理解为约80个核苷酸的小RNA链，其能够在翻译过程中将特定氨基酸转移到蛋白质合成的核糖***点处的生长多肽链中。其具有用于氨基酸附着的位点和用于密码子识别的反密码子区，该反密码子区通过氢键结合到信使RNA链上的特定序列。
在本发明中，术语“信使RNA片段”(mRNA片段)应理解为能够将关于蛋白序列的信息携带至核糖体的小RNA链。每三个核苷酸(一个密码子)对应于一个氨基酸。在真核细胞中，一旦前体mRNA(pre-mRNA)从DNA转录，则其被加工成成熟的mRNA。这去除了其内含子——pre-mRNA的非编码部分。然后，mRNA从细胞核运输出至细胞质，在那里其结合至核糖体且在tRNA的帮助下翻译成其相应的蛋白质形式。在不具有细胞核和细胞质区室的原核细胞中，mRNA可在其从DNA转录时结合至核糖体。在一定时间后，信使RNA在核糖核酸酶的帮助下降解成其组分核苷酸。
在本发明中，术语“结构蛋白”是指赋予其它流体生物学组分刚度和硬度的蛋白。优选的结构蛋白选自下组：纤维蛋白(诸如胶原、弹性蛋白和角蛋白)和球状蛋白(诸如肌动蛋白和微管蛋白)。其它具有结构功能并被理解为本发明中“结构蛋白”的蛋白质是运动蛋白(诸如肌球蛋白、驱动蛋白和动力蛋白)，它们能够产生机械力。
优选的编码结构蛋白的RNA片段选自下组：肌动蛋白、弹性蛋白、丝胺、胶原、肌球蛋白、lamine。
优选的编码辅酶的RNA片段选自编码多肽的RNA片段，该多肽在翻译后被修饰。实例是色氨酸色氨酰醌(TTQ)和4-亚甲基-咪唑-5-酮(MIO)。
优选的编码抗体的RNA片段选自编码IgA、IgD、IgE、EgG、IgM、IgY和IgW的RNA片段。
优选的编码激素的RNA片段选自编码小肽激素(诸如TRH和血管加压素)的RNA片段；胰岛素；生长激素；糖蛋白激素(诸如促黄体激素、促卵泡激素和促甲状腺激素)的RNA片段。
优选的编码调节子的RNA片段选自编码受体、转录因子、代谢传感器、光传感器、电传感器、机械传感器和信号转导器的RNA片段。
优选的编码酶的RNA片段选自编码碳水化合物修饰酶的RNA片段。在本发明中，术语“碳水化合物修饰酶”应理解为包括能够修饰任何类型碳水化合物的任何酶，诸如(但不限于)碳水化合物切割酶、碳水化合物氧化酶、碳水化合物还原酶、碳水化合物脱羧酶、碳水化合物脱乙酰酶、碳水化合物乙酰化酶、碳水化合物甲基化酶、碳水化合物脱甲基化酶、碳水化合物胺化酶、碳水化合物磷酸化酶、碳水化合物脱磷酸化酶、碳水化合物异构酶、碳水化合物差向异构酶和碳水化合物脱氨酶。
在本发明特别优选的实施方案中，碳水化合物修饰酶选自下组：EC 5.1.3、EC5.3.1、EC 2.7.1、EC 2.2.1和EC 1.1.1类，优选选自下组：EC 5.1.3.3、EC 5.3.1.5、EC2.7.1.17、EC 2.2.1.2、EC 2.2.1.1、EC 1.1.1.1、EC 5.3.1.4、EC 2.7.1.16和EC 5.1.3.4以及突变酶(例如包含取代、缺失和/或***)或其片段。
根据本发明，例如本发明寡核苷酸的1-80个核苷酸是“突变的”。在本发明中，术语“突变的”应理解为“被取代的”、“缺失的”或“***的”。术语“突变”应理解为“取代”、“缺失”或“***”。取代被分类为转换，其中嘌呤被替换为嘌呤(A<->G)或嘧啶被替换为嘧啶(C<->T)；颠换，其中嘌呤被替换为吡啶，反之亦然(C/T<->A/G)。***将一个或多个其他的核苷酸(A、C、T或G)添加至寡核苷酸中。从DNA中去除一个或多个核苷酸称为缺失。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含根据本发明的寡核苷酸的重组DNA片段。
特别优选的根据本发明的重组DNA片段包含选自下组的嵌合启动子：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的衍生物，以及编码选自下组的蛋白的DNA片段：酶、结构蛋白、辅酶、转运子、抗体、激素和调节子。还特别优选的是，该蛋白是酶，且该酶选自下组：EC 5.1.3、EC5.3.1、EC 2.7.1、EC 2.2.1和EC 1.1.1类，优选选自下组：EC 5.1.3.3、EC 5.3.1.5、EC2.7.1.17、EC 2.2.1.2、EC 2.2.1.1、EC 1.1.1.1、EC 5.3.1.4、EC 2.7.1.16和EC 5.1.3.4。在另一个特别优选的实施方案中，该蛋白选自下组：SEQ ID NO 22-138。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含至少一种根据本发明的重组DNA片段的表达质粒。
本发明进一步提供了用至少一种包含根据本发明的嵌合启动子的重组DNA片段转化的宿主细胞。根据本发明的宿主细胞优选地用于代谢工程或用于将包含底物的木糖的代谢转化为优选代谢物。
根据本发明的重组宿主细胞，优选选自细菌、酵母或真菌细胞。在特别优选的实施方案中，宿主细胞选自下组：埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)；酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、耶氏酵母属(Yarrowia)、Komagataella、毕赤酵母属(Pichia)、汉森酵母属(Hansenula)、青霉属(Penicillium)、木霉属(Trichoderma)、肉座菌属(Hypocrea)、曲霉属(Aspergillus)、鸡油菌属(Cantharellu)、伞菌属(Agraicus)、牛肝菌属(Boletos)、侧耳属(Pleurotus)、栓菌属(Trametes)、毛平革菌属(Phanerochaete)、毁丝霉属(Myceliophthora)、毛壳属(Chaetomium)、腐质霉属(Humicola)、金孢子菌属(Chrysosporium)、篮状菌属(Talaromyces)和链孢霉属(Neurospora)。
特别优选的是，宿主细胞选自下组：乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescence)、植物克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)、大肠杆菌(Escherichia coli)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uravum)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、库德里阿兹威酵母(Saccharomyceskudriavzevii)、米卡塔酵母(Saccharomyces mikatae)、卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、解脂耶氏酵母(Yarrowina lipolytica)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、Komagataella pastoris、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)。
根据本发明的重组宿主细胞可包含一种或多种根据本发明的质粒。另外或可选地，编码嵌合启动子的重组DNA片段被整合至宿主细胞的基因组中。
具体实施方式
实施例和附图
下面通过实施例和附图描述本发明。实施例和附图仅用于说明目的，并不在任何方面限制本发明和权利要求的范围。
实施例1：质粒的克隆
在酿酒酵母中通过重组克隆构建质粒：用已经被限制性内切酶NotI线性化的载体，以及彼此之间和与载体具有45bp同源重叠的PCR产物转化酵母细胞。载体由酵母标记(pUG6 87-1559bp)、大肠杆菌标记及来源(pUG19 754-2534bp)和酵母来源(酿酒酵母S288C染色体IV 44978-449831和酿酒酵母S288C染色体II 63156-63454bp)组成。这些部分的侧翼分别为限制性位点SapI、SbfI、StuI和NotI。PCR片段含有功能部分(分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20或SEQ ID NO.21；SEQ ID NO.13和酿酒酵母S288C染色体XI326407-326108bp)。
所述片段通过在酵母细胞中同源重组，组装形成环状质粒。
然后，从酵母细胞分离DNA并将其转化到大肠杆菌中，从而将质粒单一化并以较高的量生产质粒。在验证质粒后，根据Gietz和Schiestl(High-Efficiency yeasttransformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.Nat Protocols 2(1),2007:31-34)以高效LiAc方法用再次分离的质粒转化酵母菌株Simi WhiteTM(Lot：02905340230601V,Lallemand,Canada)。
实施例2：含有不同寡核苷酸的不同质粒的转录水平比较
将携带不同质粒的酵母菌株在30℃和250rpm下，在100ml摇瓶中，20ml含葡萄糖、乙醇或木糖的底物(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L碳源，200mg/L G418)中培养。通过以大约OD600 2的培养密度离心并用水洗涤两次，收获细胞。之后，将细胞在水中重悬并且将OD600设置为6。将600μL细胞悬浮液的等分试样离心并将细胞沉淀在-80℃储存。
根据生产者手册，通过使用RNeasy Mini KitTM(Qiagen Germany)从细胞沉淀中提取总RNA。然后，根据生产者手册，使用用于RT-qPCR的iScript Reverse TranscriptionSupermix(BIORAD Germany)在逆转录反应中使用500ng RNA以得到cDNA。依据生产者信息，使用iQTM
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Green Supermix和iQTM iCycler(BIORAD Germany)测定转录水平。ACT1用作计算XylA mRNA水平的参考基因。在qPCR中，分别从ACT1和XylA mRNA扩增225和236bp长的PCR产物。通过使用2(-ΔΔCt)方法，相对于酿酒酵母pPGK1启动子控制下的XylA转录水平，计算不同启动子控制下的XylA转录水平。
测定pCHI3、pCHI4和pCHI5的转录水平且显示于图4A-4C中。如果酿酒酵母在木糖上生长，则pCHI3导致XylA转录的增加；当在葡萄糖或乙醇上生长时，可以较低量检测到XylA的转录。如果酿酒酵母在木糖上生长，则pCHI4同样导致XylA转录的增加；当在葡萄糖或乙醇上生长时，可以较低量检测到XylA的转录。如果酿酒酵母在葡萄糖上生长，则pCHI5展现了XylA转录的增加；当在木糖或乙醇上生长时，XylA转录较低(图4A-4C)。
在图5中，比较了根据嵌合启动子pCHI3、pCHI4和pCHI5的XylA的转录水平，证实了经由pCHI3和pCHI4在木糖上生长的XylA的转录水平增加，以及经由pCHI5在葡萄糖上生长的XylA的转录水平增加。
实施例3：含有不同寡核苷酸的不同质粒的酶活性比较
如实施例2中所述，将携带不同质粒的酵母菌株在250ml摇瓶中，50ml体积培养基中培养，并以大约OD600 2收获。然后，将培养物沉淀在-80℃储存。
将解冻的沉淀悬浮于400μl缓冲液(100mM Tris pH 7.5，10mM MgCl2)中并均质。在细胞裂解后，将粗提取物稀释至总蛋白质浓度为2μg/μl(通过Bradford测定法测量)。木糖异构酶活性测定在100μl的10％的稀释粗提取物、0.25mM NADH、3U/ml山梨糖醇脱氢酶和500mM木糖中进行。在340nm处以光度计跟踪反应动力学。
对在葡萄糖、木糖或乙醇上生长的微生物(如酿酒酵母)，测定由XylA编码且在pCHI3、pCHI4或pCHI5的控制下表达的木糖异构酶(XI)的活性，并示于图6A-6C中。
图7显示了转录水平vs酶活性的比较。其显示了当经由pCH13和pCH14在木糖上生长时，以及当经由pCH15在葡萄糖上生长时，转录水平增加。图7显示当微生物在木糖上生长时，与当微生物在葡萄糖或乙醇上生长时相比，pCH13和pCH14的相关酶活性最强。当微生物在葡萄糖上生长时，与当微生物在木糖或乙醇上生长时相比，pCH15相关酶活性最强。这证实了本发明的嵌合启动子通过启动子的选择使得实现选择性地增加或减少的转录以及相关酶活性，从而使两者适应于特定条件(诸如碳源)。
附图简要说明
图1显示了形成本发明嵌合启动子的寡核苷酸及其部分，诸如SEQ ID NO.1(pCHI3)、SEQ ID NO.2(pCHI4)或SEQ ID NO.3(pCHI5)的嵌合启动子，以及调节天然的(即源自乳酸克鲁维酵母)糖酵解和糖异生的基因的寡核苷酸(例如其启动子及其部分)。
图2A-2C显示了与各自的天然(野生型)启动子中的转录因子结合位点相比，本发明的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3嵌合启动子中的转录因子结合位点的改进。
图3A-3C更详细地描述了转录因子结合位点，即，基于SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的嵌合启动子的序列，示出了转录结合位点的位置和序列。
图4A-4C描述了根据生长的碳源和控制XylA转录的启动子，微生物(例如酿酒酵母)中XylA的转录水平。该图分别显示了与天然启动子(其中部分(寡核苷酸)形成各自的嵌合启动子)，以及现有技术的启动子(例如酿酒酵母PGK1的天然启动子)的XylA转录水平相比，pCHI3、pCHI4和pCHI5的XylA转录水平。
图5显示在葡萄糖、木糖或乙醇上生长的细胞中XylA的转录水平的比较，其中当细胞在木糖上生长时，由pCHI3和pCHI4控制的转录展示出增加，且当细胞在葡萄糖上生长时，由pCHI5控制的转录显示出增加。
图6A-6C描述了在微生物(如酿酒酵母)中，根据生长的碳源和控制XylA转录的启动子，木糖异构酶(XI)的活性水平。该图分别显示了与天然启动子(其中部分形成各自的嵌合启动子)的XI活性水平以及现有技术的启动子(例如酿酒酵母PGK1的天然启动子)的XI活性水平相比，pCHI3、pCHI4和pCHI5的XI活性水平。
图7描述了细胞分别在葡萄糖、木糖或乙醇上生长，pCHI3、pCHI4和pCHI5的转录水平和酶活性的相关性比较。
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Claims (12)

1.嵌合启动子，其特征在于，其包含两个或多个寡核苷酸序列或其部分，所述寡核苷酸序列或其部分调节合成代谢和/或分解代谢途径的基因的转录，并增加被分型为编码蛋白的信使RNA片段、调节RNA片段、酶活性RNA片段或转移RNA片段的RNA转录水平，所述蛋白选自下组：酶、结构蛋白、辅酶、转运子、抗体、激素和调节子，所述嵌合启动子与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.1具有至少80％的序列同一性。
2.根据权利要求1所述的嵌合启动子，其中所述嵌合启动子与SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.1具有至少85％的序列同一性。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合启动子，其中当在选自下组的碳源上生长用至少一种包含所述嵌合启动子的重组DNA片段转化的酵母宿主细胞时，酵母宿主细胞中RNA片段的转录水平增加：葡萄糖、木糖、乙醇及其组合。
4.根据前述权利要求任一项所述的嵌合启动子，其中所述酶是碳水化合物修饰酶或转运子。
5.根据前述权利要求任一项所述的嵌合启动子，其中所述酶是选自下组的碳水化合物修饰酶：EC 5.1.3、EC 5.3.1、EC 2.7.1、EC 2.2.1、EC 1.1.1、EC 5.3.1.4、EC 2.7.1.16、EC5.1.3.4及其组合，或选自下组的转运子：TC 2.A.1.1、TC 2.A.1.2及其组合。
6.根据前述权利要求任一项所述的嵌合启动子，其中所述启动子包含选自下组的转录结合因子：REB1、GCR1、GCR2、PHD1、TYE7、PHO2、PHO4、AZF1及其组合。
7.根据前述权利要求任一项所述的嵌合启动子，其中SEQ ID NO.2包含(SEQ IDNO.8)、(SEQ ID NO.7)和(SEQ ID NO.11)。
8.根据权利要求1-6任一项所述的嵌合启动子，其中SEQ ID NO.3包含(SEQ IDNO.12)、(SEQ ID NO.4)、(SEQ ID NO.5)和(SEQ ID NO.9)。
9.根据权利要求1-6任一项所述的嵌合启动子，其中SEQ ID NO.1包含(SEQ ID NO.10)和(SEQ ID NO.6)。
10.重组DNA片段，其包含根据权利要求1-9任一项所述的嵌合启动子。
11.表达质粒，其包含至少一种根据权利要求10所述的重组DNA片段。
12.宿主细胞，其用至少一种根据权利要求10所述的重组DNA片段转化，或用至少一种根据权利要求11所述的表达质粒转化。
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