CN113293185A - 一种壳寡糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备壳寡糖的方法。本发明的制备方法为将壳聚糖溶解后配制成壳聚糖溶液，调节pH值后加入壳聚糖进行酶解；酶解得到的酶解液依次通过微滤除杂、超滤除杂、浓缩除盐后收集浓缩液，最后将浓缩液冷冻干燥，得到壳寡糖。本发明的制备方法以60％以上的收率制备出分子量集中在1‑3kDa的壳寡糖，制备的壳寡糖水溶性好、生物活性高，本发明的制备方法收率高，生产成本低，适于规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种壳寡糖的制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
壳聚糖(chitosan)，是由D-氨基葡萄糖(GlcN)通过β-1,4-糖苷键连接组成的碱性多糖。壳寡糖是由几丁质或者壳聚糖通过物理法、化学法、酶水解等方法得到的产物。
壳寡糖聚合度一般为2～20，是自然界唯一带正电荷的碱性阳离子低聚糖。壳寡糖易溶于水，粘性低，具有较好的生物相容性，无毒害，致敏性低，细胞转导性良好，易于肠胃吸收。大量研究证实：壳寡糖具有多种生物学活性，包括抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗高血压、抗糖尿病、抗阿尔兹海默症、抗病毒等，因此，壳寡糖及其衍生物被广泛应用于生物医药、营养保健品和药妆产品中。
在壳寡糖的生产方法中，酶法是用专一性酶或非专一性酶对壳聚糖进行水解得到壳寡糖的方法。该方法具有反应条件温和、污染小等优点，是目前公认的绿色环保的壳寡糖制备方法。
研究表明，壳寡糖的分子量在1-3kDa之间时，生物活性较高。然而，目前常用的壳寡糖制备方法存在着产物不均一，分子量分布指数大等缺点，导致壳寡糖的应用受到了限制。例如，专利CN 104726519采用壳聚糖酶酶解，然后除杂浓缩再经超滤以及电渗析精制，最终得到窄分布的壳寡糖。但是根据图谱观察，壳寡糖分子量主要在1kDa以下，分子量范围1-3kDa的具有高生物活性的壳寡糖占比不高。因此，高效制备分子量范围1-3kDa占比较高的壳寡糖，并且降低成本、减少污染，是目前壳寡糖制备中亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：如何低成本、少污染并高效制备分子量范围1-3kDa占比较高的壳寡糖的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种壳寡糖的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将壳聚糖分散于水中，加入酸溶解，配制成壳聚糖溶液，调节pH值后加入壳聚糖酶进行酶解，酶解结束后升温灭酶，得到酶解液；
步骤2：将步骤1得到的酶解液依次经过微滤除杂、超滤除杂、浓缩除盐后得到浓缩液；
步骤3：将步骤2所得浓缩液经过冷冻干燥得到壳寡糖。
优选地，所述步骤1中的酸为盐酸、乙酸和磷酸中的至少一种。
优选地，所述步骤1中的壳聚糖与水的质量比为1:40～120，所述壳聚糖溶液中酸的含量为0.1～3wt％。
优选地，所述步骤1中的调节pH值具体为采用碱性溶液将pH值调节至5～6.5。
优选地，所述的碱性溶液为1～20wt％的氢氧化钠溶液。
优选地，所述步骤1中的壳聚糖酶为内切型壳聚糖酶，其CAS号为51570-20-8；所述壳聚糖酶加入的量为100～1000U/g壳聚糖。
优选地，所述步骤1中酶解的工艺条件为:转速100～250rpm，温度30～70℃，酶解时间2～15h；所述升温灭酶的条件为：温度85℃，时间10～30min。
所述步骤2中的微滤具体为将步骤1得到的酶解液依次通过0.45μm和0.22μm的水相微滤膜除杂质；所述的超滤除杂具体为将微滤除杂后的酶解液依次通过5.0×104Da、1.0×104Da和3.0×103Da滤膜后，收集滤液；所述的浓缩除盐具体为将超滤除杂所得的液滤通过1×103Da滤膜浓缩以及除去盐分；其中，所述的超滤除杂和浓缩除盐均采用板式超滤仪，所述板式超滤仪的压力设为0.3～0.6MPa。
更优选地，所述的超滤除杂过程中，板式超滤仪的压力设为0.4～0.5MPa；所述的浓缩除盐过程中，板式超滤仪的压力设为0.3～0.4MPa。
优选地，所述步骤3中的冷冻干燥具体为：将步骤2所得的浓缩液冷冻后置于冷冻干燥机中，冻干48h。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明通过酶解法以60％以上的收率制备出分子量集中在1-3kDa的壳寡糖，分子量在1-3KDa的壳聚糖占比高达96％，制备的壳寡糖水溶性好、生物活性高；
2.本发明采用板式超滤仪除杂和浓缩一步完成，简化了工艺流程，降低了制备成本；本发明的制备方法收率高，成本低，适于规模化生产。
附图说明
图1为右旋糖苷的校正曲线图；
图2为实施例2制备的壳寡糖冻干粉的凝胶色谱图；
图3实施例3制备壳寡糖冻干粉外观图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
以下实施例中，采用如下方法测定壳寡糖的分子量和收率：
(1)配制浓度为3mg/mL的右旋糖苷标准品，用凝胶色谱仪(GPC)测定其出峰时间，用empower软件根据RT值与流速的关系拟合校正曲线，如图1所示；
(2)将酶解液用GPC测定其分子量，根据RT值，代入拟合校正曲线中计算分子量以及分子量分布。
(3)以制备的壳寡糖冻干粉与原料壳聚糖的质量比计算壳寡糖的收率。
实施例1
一种壳寡糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)壳聚糖溶液的配制：称取1g壳聚糖，溶于50mL水充分搅拌使壳聚糖均匀分散在水中，加入盐酸使盐酸含量为0.5wt％，用2wt％的氢氧化钠调节pH至5.0，搅拌至壳聚糖完全溶解。
(2)酶解：向上述壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶，酶的添加量为400U，酶解转速为200rpm，温度45℃，时间8-10h。反应结束后，升温至85℃灭酶，时间10-30min。
(3)分离纯化：将上述酶解液用微滤装置过水系0.45μm、0.22μm滤膜，再将上述酶解液依次通过5.0×104Da、1.0×104Da、3.0×103Da板式超滤仪，调整压力为0.5MPa，收集滤液。再将滤液过1×103Da滤膜浓缩以及除去盐分，收集浓缩液，其中板式超滤仪的压力为0.3MPa。
(4)冷冻干燥：将上述浓缩后获得的壳寡糖溶液冷冻后置于冷冻干燥机中，冻干48h，获得白色粉末即为壳寡糖成品。壳寡糖的总收率为62.6％，灰分含量为0.5wt％，蛋白含量为0.2wt％。
实施例2
一种壳寡糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)壳聚糖溶液的配制：称取1g壳聚糖，溶于60mL水充分搅拌使壳聚糖均匀分散在水中，加入乙酸使乙酸含量为1wt％，用10wt％的氢氧化钠调节pH至5.5，搅拌至壳聚糖完全溶解。
(2)酶解：向上述壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶，酶的添加量为600U，酶解转速为150rpm，温度55℃，时间4-6h。反应结束后，升温至85℃灭酶，时间10-30min。
(3)分离纯化：将上述酶解液用微滤装置过水系0.45μm、0.22μm滤膜，再将上述酶解液依次通过5.0×104Da、1.0×104Da、3.0×103Da板式超滤仪，调整压力为0.6MPa，收集滤液。再将滤液过1×103Da滤膜浓缩以及除去盐分，收集浓缩液，其中板式超滤仪的压力为0.3MPa。
(4)冷冻干燥：将上述浓缩后获得的壳寡糖溶液冷冻后置于冷冻干燥机中，冻干48h，获得白色粉末即为壳寡糖成品。壳寡糖的总收率为76.4％，灰分含量为0.2wt％，蛋白含量为0.2wt％；GPC测定壳寡糖分子量分布如图2所示，由图2可知，壳寡糖分子量集中在1～3KDa，占比为96.36％。
实施例3
一种壳寡糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)壳聚糖溶液的配制：称取1g壳聚糖，溶于70mL水充分搅拌使壳聚糖均匀分散在水中，加入磷酸使磷酸含量为2wt％，用5wt％的氢氧化钠调节pH至6，搅拌至壳聚糖完全溶解。
(2)酶解：向上述壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶，酶的添加量为700U，酶解转速为200rpm，温度55℃，时间3-5h。反应结束后，升温至85℃灭酶，时间10-30min。
(3)分离纯化：将上述酶解液用微滤装置过水系0.45μm、0.22μm滤膜，再将上述酶解液依次通过5.0×104Da、1.0×104Da、3.0×103Da板式超滤仪，调整压力为0.6MPa，收集滤液。再将滤液过1×103Da滤膜浓缩以及除去盐分，收集浓缩液，其中板式超滤仪的压力为0.3MPa。
(4)冷冻干燥：将上述浓缩后获得的壳寡糖溶液冷冻后置于冷冻干燥机中，冻干48h，获得白色粉末即为壳寡糖成品，如图3所示。壳寡糖的总收率为72.4％，灰分含量为0.4wt％，蛋白含量为0.3wt％。
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种壳寡糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将壳聚糖分散于水中，加入酸溶解，配制成壳聚糖溶液，调节pH值后加入壳聚糖酶进行酶解，酶解结束后升温灭酶，得到酶解液；
步骤2：将步骤1得到的酶解液依次经过微滤除杂、超滤除杂、浓缩除盐后得到浓缩液；
步骤3：将步骤2所得浓缩液进行冷冻干燥得到壳寡糖。
2.如权利要求1所述的壳寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的酸为盐酸、乙酸和磷酸中的至少一种。
3.如权利要求1所述的壳寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的壳聚糖与水的质量比为1:40～120，所述壳聚糖溶液中酸的含量为0.1～3wt％。
4.如权利要求1所述的壳寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的调节pH值具体为采用碱性溶液将pH值调节至5～6.5。
5.如权利要求4所述的壳寡糖的制备方法，其特征在于，所述的碱性溶液为1～20wt％的氢氧化钠溶液。
6.如权利要求1所述的壳寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的壳聚糖酶为内切型壳聚糖酶，其CAS号为51570-20-8；所述壳聚糖酶加入的量为100～1000U/g壳聚糖。
7.如权利要求1所述的壳寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤1中酶解的工艺条件为:转速100～250rpm，温度30～70℃，酶解时间2～15h；所述升温灭酶的条件为：温度85℃，时间10～30min。
8.如权利要求1所述的壳寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的微滤具体为将步骤1得到的酶解液依次通过0.45μm和0.22μm的水相微滤膜除杂质；所述的超滤除杂具体为将微滤除杂后的酶解液依次通过5.0×104Da、1.0×104Da和3.0×103Da滤膜后，收集滤液；所述的浓缩除盐具体为将超滤除杂所得的滤液通过1×103Da滤膜浓缩以及除去盐分；其中，所述的超滤除杂和浓缩除盐均采用板式超滤仪，所述板式超滤仪的压力设为0.3～0.6MPa。
9.如权利要求8所述的壳寡糖的制备方法，其特征在于，所述的超滤除杂过程中，板式超滤仪的压力设为0.4～0.5MPa；所述的浓缩除盐过程中，板式超滤仪的压力设为0.3～0.4MPa。
10.如权利要求1所述的壳寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的冷冻干燥具体为：将步骤2所得的浓缩液冷冻后置于冷冻干燥机中，冻干48h。
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