CN113292362B - 一种大环内酯类抗生素菌渣的厌氧酸化发酵脱抗方法 - Google Patents
一种大环内酯类抗生素菌渣的厌氧酸化发酵脱抗方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于环保工程领域，公开了一种大环内酯类抗生素菌渣的厌氧酸化脱抗的方法，步骤如下：(1)取新鲜或干燥的菌渣，按照一定比例与秸秆和/或糟渣等富含碳水化合物的生物质原料混合，并调节水分含量；(2)根据秸秆和/或糟渣中可溶性糖和乳酸菌含量，确定是否补充糖和乳酸菌，密封厌氧酸化发酵。通过微生物和低pH的共同作用，降解菌渣中的大环内酯类抗生素，实现菌渣的无害化与原料化利用。本发明充分利用我国秸秆或槽渣资源丰富和大环内酯类抗生素酸性条件下不稳定的特性，通过酸化发酵的方法，有效降解菌渣中残留大环内酯类抗生素，不需要添加外源化学试剂，处理后的发酵产物可以用来提取有机酸或堆肥，是一种经济、环保的处理方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种大环内酯类抗生素菌渣的厌氧酸化发酵脱抗方法，属于环保工程领域。
背景技术
抗生素生产过程中，在提取主要抗生素后，不可避免产生大量废弃菌渣。菌渣中水分含量高达90％以上，同时还含有大量蛋白、菌丝体、多糖、矿物质元素及少量抗生素。由于菌渣水分含量高、营养丰富，处理不当极易滋生细菌，腐败变质，并产生恶臭，严重影响环境卫生。此外，在残留抗生素的选择压力下，抗生素耐药细菌不断生长，抗性基因迅速富集，成为超级细菌进化的温床，对生态环境和全球公共卫生安全造成严重威胁。随着对细菌耐药性和超级细菌认识的增加，国家抗生素菌渣的处置受到越来越严格的限制。国家先后出台系列政策，管控抗生素菌渣的处置方法，鼓励开发抗生素菌渣无害化处理与资源化利用技术。
红霉素菌渣是指红霉素发酵生产过程中产生的菌渣。由于该废弃物中氮、磷、钾等营养元素含量丰富，是生产高品质有机肥或其它产品的优质原料，在工、农业领域有广阔的应用前景。但是，由于红霉素独特的内酯结构，常规抗生素菌渣处理方法很难将其彻底降解。因此，有必要开发新的红霉素菌渣处理方法。
微生物厌氧酸化发酵是指在厌氧环境下，微生物生长繁殖，并代谢利用基质中的糖、蛋白等营养物质产生酸性物质，降低环境中的pH值的过程。目前，有关红霉素菌渣厌氧发酵的报道主要集中在沼气生产领域，由于发酵条件、辅料、微生物菌群等方面的差异，该条件下很难将红霉素有效降解。本专利充分利用红霉素理化特性和厌氧酸化发酵特点，通过调节原料组成和微生物群落结构，促进红霉素在发酵过程中的降解效率，并削减其中抗性基因的含量。目前尚未见相关报道或专利。
目前报道的红霉素菌渣处理方法有三种：一是160℃以上高温降解红霉素后，干燥，制备有机肥；二是添加无机酸在酸性条件下降解红霉素，然后添加强碱进行中和，再制备有机肥(申请号：201310162405.0；201510406489.7)；第三种方法是用酵母菌等真菌进行发酵，制备酵母膏(申请号：201610097783.9)。然而，上述方法均存在一定局限性，第一种方法需要高温、高压的环境，对能源和设备要求极高，存在较大安全隐患，而且脱抗并不彻底；第二种方法需要添加强碱进行中和，无机盐的大量产生会限制菌渣的用途和用量，可能会诱发土壤盐渍化等环境污染；第三种方法对红霉素消纳量有限，且需要较为复杂的工艺。因此急需开发一种操作简单、经济环保的红霉素菌渣无害化与原料化处理方法。
发明内容
本发明目的在于为了克服上述现有技术中的缺陷，提出一种大环内酯类抗生素菌渣的厌氧酸化发酵脱抗方法，经厌氧酸化发酵后，大环内酯类抗生素被有效脱除，抗性基因显著下降，发酵原料可被用作生产肥料或有机酸的高价值原料，不存在无机盐残留的环境风险。
为了实现本发明目的，所采用的技术方案为：
一种大环内酯类抗生素菌渣的厌氧酸化发酵脱抗方法，包括如下步骤：
(1)取大环内酯类抗生素菌渣原液或喷干菌渣与秸秆和/或糟渣混合，控制大环内酯类抗生素菌渣干物质与秸秆和/或糟渣的质量比为1:2-1:9，并调节水分的质量含量至55-75％；
(2)根据秸秆和/或糟渣中可溶性糖和乳酸菌含量，确定是否补充可溶性糖和乳酸菌，确保可溶性糖的质量含量为3-8％，乳酸菌的质量含量在105cfu/g以上，并充分混匀密封；所述可溶性糖为可被乳酸菌直接利用的单糖或双糖；
(3)在室温条件下，进行7-56天的厌氧酸化发酵。7-56天后培养基pH可下降到4.5以下，通过微生物和低pH的共同作用，降解菌渣中的红霉素和抗性基因，实现菌渣的无害化的目的。本步骤中发酵结束后pH降低到4.5以下，微生物大量死亡，并释放胞内基因，在核酸酶作用下，抗性基因被有效削减。
优选地，步骤(1)中所述秸秆和/或槽渣的可溶性碳水化合物含量在2％以上，其中秸秆可以为玉米、水稻等的植物秸秆，所述槽渣甘蔗渣、啤酒糟等有机固体废弃物，用于调节发酵基质中营养物质和微生物种群的组成，确保后续培养基能够有效酸化。
作为优选，步骤(1)中所述水分含量为60-70％，步骤(2)中可溶性糖含量为5-7％。
作为优选，步骤(2)中所述可溶性糖为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖中的一种或几种。
优选地，步骤(2)中所述乳酸菌为乳球菌属、乳杆菌属、肠球菌属、明串珠氏菌属和魏斯氏菌属等不含有抗性基因的厌氧或兼性厌氧微生物；
优选地，步骤(2)中所述乳酸菌添加量在106–108cfu/g；
优选地，步骤(3)中所述密封包括压实和/或抽真空等方式确保发酵基质达到厌氧条件。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明利用我国生物质资源丰富，碳水化合物含量高的特点，将其与大环内酯类抗生素菌渣混合进行严格厌氧发酵，通过微生物及其发酵导致的低pH降解大环内酯类抗生素，从而实现对菌渣的脱抗；
(2)本发明为严格厌氧发酵，厌氧酸化发酵过程中，微生物大量死亡，并释放胞内的抗性基因，在核苷酸酶等微生物胞外酶的作用下，抗性基因会进一步降解为磷酸、脱氧核糖、嘌呤或嘧啶等物质，从而削减菌渣中存在的抗性基因，发酵后品质好，可以用来做沼气或者生产有机酸的原料；
(3)本发明利用能耐受低pH的乳酸菌，密封进行厌氧酸化发酵7～56天，该过程乳酸菌利用可溶性碳水化合物进行发酵，产生乳酸等有机酸，pH下降到4.5以下，对有机固体废物进行厌氧酸化发酵，利用大环内酯类抗生素在酸性条件下不稳定的特性，使其快速降解。同时，厌氧酸性条件下，微生物大量死亡，释放抗性基因，同时抗性基因被微生物胞外核苷酸酶降解。所述厌氧酸化发酵不仅可以快速降解抗生素和抗性基因(ARGs)，还可以改变堆体中整个微生物群落结构，杀灭90％的携带ARGs的微生物，减少ARGs发生基因转移的风险，从源头上控制其扩散，保证了ARGs不会出现反弹。不仅实现有机固体废物的处理，同时能高效去除抗生素残留以及抗性基因污染的双重功效。本发明方法无需外源加酸，仅依靠乳酸菌自身代谢产将pH降低到4.5以下，能耗低，环境友好。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
以下实施例以红霉素菌渣为例，但并不表示本申请方法仅适用于红霉素菌渣脱抗，本申请方法适用于大环内酯类抗生素菌渣脱抗。
实施例1
取新鲜红霉素菌渣1kg，水分含量为90％(具体含水量可以为55-75％，但本实施例作为优选控制含水量为90％)，向其中添加1kg的玉米秸秆，可溶性碳水化合物含量为7.6％，表面附着乳酸菌2.1×105cfu/g，充分混匀密封作为处理组，处理组在室温条件下发酵，于发酵56天取样(发酵时间可以为7-56天，本实施例作为优选控制发酵时间为56天)，用于后续分析；取处理后的样品，用甲醇萃取其中的红霉素，固相萃取纯化后，用装有C18的液相色谱测定其中红霉素的含量，进而评价红霉素的降解效果；取发酵后样品经1:9的蒸馏水浸提后，测定发酵样品pH；取剩余样品提取其中DNA后，用荧光定量PCR仪测定ereA、ermF、mphA、msrA等抗性基因含量。
表1厌氧酸化发酵前后菌渣的pH、红霉素及抗性基因的含量
注：FM，鲜物质；*，P<0.05；**，P<0.01
将菌渣与玉米秸秆混合后，厌氧酸化发酵前后的pH、红霉素及主要抗性基因的含量如表1所示。发酵前基质的pH为7.23，红霉素含量为78.5mg/kg FM，编码红霉素酯酶基因(ereA)、编码核糖体修饰基因(ermF)、编码磷酸转移酶基因(mphA)、编码外排泵基因(mefA)的绝对含量均在较高水平。经过56天发酵后，pH下降到4.72，红霉素降解95％以上，ereA、ermF、mphA和mefA四种不同类型抗性基因分别下降74.9％、96.1％、99.7％、99.2％。综合上述结果发现，该工艺可有效酸化培养基pH，降解菌渣中的红霉素和抗性基因，能够有效实现红霉素菌渣脱抗的目的。
实施例2
取喷雾干燥的红霉素菌渣原料和粉碎水稻秸秆，将红霉素菌渣原料和秸秆按照1:7的质量比混合，水稻秸秆可溶性碳水化合物含量为4.3％，表面附着乳酸菌1.8×104cfu/g混匀后密封作为对照组。取喷雾干燥的红霉素菌渣和粉碎水稻秸秆，将菌渣和秸秆按照1:7的质量比混合，添加千分之一的乳酸菌菌粉和2％的葡萄糖(即乳酸菌菌粉占菌渣与秸秆总质量的千分之一，葡萄糖占占菌渣与秸秆总质量的2％)，混匀后密封作为处理组。对照组和处理组均在室温条件下发酵，并于发酵56天取样，用于后续分析；称取发酵56天后的样品，用甲醇萃取其中的红霉素，固相萃取纯化后，用装有C18的液相色谱测定其中红霉素的含量，进而评价红霉素的降解效果；取发酵后样品经1:9的蒸馏水浸提后，测定发酵样品pH；取剩余样品提取其中DNA后，用荧光定量PCR仪测定ereA、ermF、mphA、msrA等抗性基因含量。
表2厌氧酸化发酵前后菌渣的pH、红霉素及抗性基因的含量
注：FM，鲜物质；同行不同小写字母(a-c)表示有显著差异(P<0.05)；ND，未检测到
与水稻秸秆混合后，添加葡萄糖和乳酸菌粉厌氧酸化发酵前后菌渣的pH、红霉素及主要抗性基因的含量如表2所示。发酵前基质的pH为7.08，红霉素含量为71.2mg/kg FM，编码红霉素酯酶基因(ereA)、编码核糖体修饰基因(ermF)、编码磷酸转移酶基因(mphA)、编码外排泵基因(mefA)的绝对含量均在较高水平。经过56天发酵后，虽然对照组红霉素含量显著降低(P<0.05)，但是ereA和mefA的抗性基因显著上升。相反，添加葡萄糖和乳酸菌粉的处理组pH下降到4.36，红霉素降解96％以上，ereA、ermF和mphA三种不同类型抗性基因分别下降84.5％、97.8％和99.9％，mefA的丰度下降到检出限以下。综合上述结果发现，较高菌渣添加量时，以水稻秸秆作为辅料，需要补充乳酸菌和可溶性糖才能使pH有效降低，红霉素充分降解，抗性基因显著削减。
实施例3
取喷雾干燥的红霉素菌渣原料和甘蔗渣，将红霉素菌渣原料和甘蔗渣按照1:12的比例混合，甘蔗渣可溶性碳水化合物含量为8.3％，表面附着乳酸菌4.2×105cfu/g混匀后密封作为处理组，处理组在室温条件下发酵，于发酵56天取样，用于后续分析；取处理后的样品，用甲醇萃取其中的红霉素，固相萃取纯化后，用装有C18的液相色谱测定其中红霉素的含量，进而评价红霉素的降解效果；取发酵后样品经1:9的蒸馏水浸提后，测定发酵样品pH；取剩余样品提取其中DNA后，用荧光定量PCR仪测定ereA、ermF、mphA、msrA等抗性基因含量。
表3厌氧酸化发酵前后菌渣的pH、红霉素及抗性基因的含量
注：FM，鲜物质；*，P<0.05；**，P<0.01
与甘蔗渣混合后，厌氧酸化发酵前后菌渣的pH、红霉素及主要抗性基因的含量如表3所示。发酵前基质的pH为7.13，红霉素含量为68.54mg/kg FM，编码红霉素酯酶基因(ereA)、编码核糖体修饰基因(ermF)、编码磷酸转移酶基因(mphA)、编码外排泵基因(mefA)的绝对含量均在较高水平。经过56天发酵后，pH下降到4.22，红霉素降解94％以上，ereA、ermF、mphA和mefA四种不同类型抗性基因分别下降67.6％、99.5％、99.6％和99.6％。综合上述结果发现，甘蔗渣中含有较高糖残留，与红霉素菌渣混合发酵后，可有效酸化培养基pH，降解菌渣中的红霉素和抗性基因，能够有效实现红霉素菌渣脱抗的目的。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种大环内酯类抗生素菌渣的厌氧酸化发酵脱抗方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）取大环内酯类抗生素素菌渣原液或喷干菌粉与秸秆和/或糟渣混合，控制大环内酯类抗生素菌渣干物质与秸秆和/或糟渣的质量比为1:2-1:9，调节水分质量含量至55-75%；
（2）根据秸秆和/或糟渣中可溶性糖和乳酸菌含量，确定是否补充可溶性糖和乳酸菌，确保可溶性糖质量含量为3-8%，乳酸菌质量含量在105 cfu/g以上，混匀密封；所述可溶性糖为可被乳酸菌直接利用的单糖或双糖；
（3）在室温条件下，进行7-56天的厌氧发酵，发酵结束后pH降低到4.5以下。
2.根据权利要求1所述的大环内酯类抗生素菌渣的厌氧酸化发酵脱抗方法，其特征在于：步骤（1）中所述秸秆和/或糟渣为植物秸秆、甘蔗渣或啤酒糟。
3.根据权利要求1所述的大环内酯类抗生素菌渣的厌氧酸化发酵脱抗方法，其特征在于：步骤（1）中所述水分含量为60-70%，步骤（2）中可溶性糖含量为5-7%。
4.根据权利要求1所述的大环内酯类抗生素菌渣的厌氧酸化发酵脱抗方法，其特征在于：步骤（2）中所述可溶性糖为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的大环内酯类抗生素菌渣的厌氧酸化发酵脱抗方法，其特征在于：步骤（2）所述乳酸菌为乳球菌属、乳杆菌属、肠球菌属、明串珠氏菌属和魏斯氏菌属中的任意一种或多种。
6.根据权利要求1所述的大环内酯类抗生素菌渣的厌氧酸化发酵脱抗方法，其特征在于：步骤（2）中所述乳酸菌添加量在106 – 108 cfu/g。
7.根据权利要求1所述的大环内酯类抗生素菌渣的厌氧酸化发酵脱抗方法，其特征在于：步骤（3）中所述密封是指通过压实和/或抽真空的方式确保发酵基质达到厌氧条件。
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