CN113288920B - ***二酚单体与植物乳杆菌dp189联合在制备预防和/或治疗帕金森病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
***二酚单体与植物乳杆菌DP189联合在制备预防和/或治疗帕金森病药物中的应用,属于功能性食品微生物领域,其中,***二酚单体的浓度为2.4mg/mL;植物乳杆菌DP189的浓度为109~1010CFU/mL;***二酚单体与植物乳杆菌DP189分别使用。***二酚单体和植物乳杆菌DP189株联合应用可以改善帕金森病模型小鼠的行为学能力;抑制帕金森病模型小鼠脑神经元的凋亡;降低炎症反应,减少炎症因子TNF‑α、IL‑1β和IL‑6的水平;阻止帕金森病模型小鼠的氧化应激反应,降低氧化应激水平。
Description
技术领域
本发明属于功能性食品微生物技术领域,具体涉及一种***二酚单体与植物乳杆菌DP189联合在制备预防和/或治疗帕金森病药物中的应用。
背景技术
帕金森病(PD)是一种神经***退行性疾病,全球60岁以上人口中大约有1%的人患有此病,我国65岁以上人群PD的患病率大约是1.7%。PD的主要病理特征为中脑黑质多巴胺能神经元丢失导致黑质纹状体***运动功能障碍,产生肌肉震颤、僵硬、运动迟缓和姿势不稳的行为学变化。非行为学症状主要包括肠道功能障碍、嗅觉减退、睡眠障碍及认知功能损害等,可早于运动障碍数十年出现,其中肠道功能障碍是PD早期最常见的非运动症状,这提示PD的发生可能始于肠道。
虽然已经证实单胺氧化酶B型抑制剂如左旋多巴(L-DOPA)等对神经***的损害具有保护改善作用,但目前发现的药物对PD也仅限针对临床症状采取对症治疗。基于此,寻找一种安全有效的药物对PD的治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种***二酚单体与植物乳杆菌DP189联合在制备预防和/或治疗帕金森病药物中的应用,用于预防和/或治疗帕金森病。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下:
本发明的***二酚单体与植物乳杆菌DP189联合在制备预防和/或治疗帕金森病药物中的应用。
作为优选的实施方式,所述***二酚单体的浓度为2.4mg/mL;所述植物乳杆菌DP189的浓度为109~1010CFU/mL;所述***二酚单体与植物乳杆菌DP189分别使用。
作为优选的实施方式,所述植物乳杆菌DP189已于2019年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为:CCTCC NO:M2019199。
作为优选的实施方式,所述植物乳杆菌DP189使用时,将其悬浮于2%吐温-80生理盐水中,浓度为109~1010CFU/mL。
作为优选的实施方式,所述***二酚单体使用时,将其溶于2%吐温-80生理盐水中,浓度为2.4mg/mL。
作为优选的实施方式,所述***二酚单体纯度≥99%。
作为优选的实施方式,所述***二酚单体采用以下方法制备:
选取新鲜的工业***花叶,风干;称取风干后的工业***花叶,加入20倍量的食品级95%乙醇进行加热回流提取两次,过滤,合并滤液,减压回收溶剂,获得含有***二酚单体的浸膏;将浸膏按照浸膏与乙酸乙酯重量比为1:10的比例投入到乙酸乙酯中,用水萃取;静置过夜后,弃水层并将乙酸乙酯层减压回收,获得含有***二酚单体的***酚类粗品,以此为样品,使用制备型高效液相色谱对其进行分离,收集得到纯度≥99%的***二酚单体。
作为优选的实施方式,所述药物的功能为(1)至(5)中的至少一项:
(1)抑制帕金森病小鼠脑神经元的凋亡;
(2)减少炎症因子TNF-α水平;
(3)减少炎症因子IL-1β水平;
(4)减少炎症因子IL-6水平;
(5)阻止机体的氧化应激反应,降低氧化应激水平。
本发明的有益效果是:
本发明采用MPTP建立帕金森病小鼠模型,同时建立正常组、模型组、阳性组、***二酚单体组、DP189组、***二酚单体+DP189组,分别进行灌胃给药,连续灌胃给药14天,探讨植物乳杆菌(L.plantarum)DP189株和***二酚单体联合应用对帕金森病模型小鼠的改善作用。研究结果显示,***二酚单体和植物乳杆菌(L.plantarum)DP189株联合应用可以改善帕金森病模型小鼠的行为学能力;抑制帕金森病模型小鼠脑神经元的凋亡;降低炎症反应,减少炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平;阻止帕金森病模型小鼠的氧化应激反应,降低氧化应激水平。因此,本发明提供的***二酚单体和植物乳杆菌(L.plantarum)DP189株联合应用可以用于制备抗帕金森病的药物、药品等,应用前景非常广阔。
附图说明
图1为实施例1中帕森金病模型小鼠行为学实验结果。图1中A为帕森金病模型小鼠水迷宫实验潜伏期变化图;图1中B为帕森金病模型小鼠自主活动实验次数变化图。图中,与模型组相比较,“*”表示具有显著性差异(P<0.05),“**”表示具有极其显著性差异(P<0.01)。
图2为实施例1中帕森金病模型小鼠大脑神经递质检测结果。图2中A为帕森金病模型小鼠大脑中5-羟色胺(5-HT)含量变化图;图2中B为帕森金病模型小鼠大脑中多巴胺(DA)含量变化图。图中,与模型组相比较,“*”表示具有显著性差异(P<0.05),“**”表示具有极其显著性差异(P<0.01)。
具体实施方式
本发明的***二酚单体(CBD)与植物乳杆菌(L.plantarum)DP189联合在制备治疗帕金森病药物中的应用。
优选的,***二酚单体(CBD)的浓度为2.4mg/mL;植物乳杆菌(L.plantarum)DP189的浓度为109~1010CFU/mL;***二酚单体(CBD)与植物乳杆菌(L.plantarum)DP189分别使用。
优选的,植物乳杆菌(L.plantarum)DP189已于2019年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心,简称CCTCC,地址为:湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心),保藏编号为:CCTCC NO:M2019199。
另外,关于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)DP189的其他信息包括分离、鉴定、保藏等均参考公开号为CN 110066753 A的中国专利(发明名称为植物乳杆菌DP189及其应用)即可。
优选的,植物乳杆菌(L.plantarum)DP189使用时,将其悬浮于2%吐温-80生理盐水中,浓度为109~1010CFU/mL。
优选的,***二酚单体(CBD)使用时,将其溶于2%吐温-80生理盐水中,浓度为2.4mg/mL。
优选的,***二酚单体(CBD)纯度≥99%。
优选的,***二酚单体(CBD)采用以下方法制备:
选取新鲜的工业***花叶,风干;称取风干后的工业***花叶,加入20倍量的食品级95%乙醇进行加热回流提取两次,过滤,合并滤液,减压回收溶剂,获得含有***二酚单体的浸膏;将浸膏按照浸膏与乙酸乙酯重量比为1:10的比例投入到乙酸乙酯中,用水萃取;静置过夜后,弃水层并将乙酸乙酯层减压回收,获得含有***二酚单体的***酚类粗品,以此为样品,使用制备型高效液相色谱对其进行分离,收集得到纯度≥99%的***二酚单体。
优选的,药物的功能为(1)至(5)中的至少一项:
(1)抑制帕金森病小鼠脑神经元的凋亡;
(2)减少炎症因子TNF-α水平;
(3)减少炎症因子IL-1β水平;
(4)减少炎症因子IL-6水平;
(5)阻止机体的氧化应激反应,降低氧化应激水平。
以日常分时段即不同时摄入植物乳杆菌(L.plantarum)DP189和***二酚单体代替治疗帕金森病的药物,可以改善帕金森病小鼠的行为学能力;抑制帕金森病小鼠脑神经元的凋亡;降低炎症反应,减少炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平;阻止机体的氧化应激反应,降低氧化应激水平。对帕金森病具有较好的预防和治疗作用,且安全、无毒副作用。
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所用到的试验材料,如无特殊说明,均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
实验材料:
液体MRS培养基:溶剂为水,含蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、KH2PO42g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸钠5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、MnSO4·4H2O 0.05g/L、吐温-801mL/L、葡萄糖20g/L;pH 6.6。
C57BL/6小鼠(体重18-22g):购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。
基础饲料:购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。
***二酚单体:选取新鲜的工业***花叶,风干,称取风干后的工业***花叶500g,加入20倍量的食品级乙醇(95%)进行加热回流提取两次,过滤,合并滤液,减压回收溶剂,得含有***二酚的浸膏;将浸膏以浸膏与乙酸乙酯的重量比为1:10的比例投入在乙酸乙酯中,并用水萃取;静置过夜后,弃水层并将乙酸乙酯层减压回收,得含有***二酚的***酚类粗品,并以此为样品,使用制备型高效液相色谱对***二酚进行分离,收集得到纯度≥99%的***二酚单体。
采用江苏酶标小鼠肿瘤坏死因子(TNF-α)ELISA试剂盒检测血清中TNF-α含量;采用江苏酶标小鼠白介素1β(IL-1β)ELISA试剂盒检测血清中IL-1β含量;采用江苏酶标小鼠白介素6(IL-6)ELISA试剂盒检测血清中IL-6含量;采用江苏酶标小鼠神经递质多巴胺(DA)ELISA试剂盒检测脑黑质中DA含量;采用江苏酶标小鼠神经递质5-羟色胺(5-HT)ELISA试剂盒检测脑黑质中5-HT含量。
其中,MPTP购于美国sigma公司。
实施例1植物乳杆菌DP189株、***二酚单体、***二酚单体与植物乳杆菌DP189株的组合物对帕金森病模型小鼠的影响
一、动物模型的建立及分组
实验选用8周的健康雄性C57BL/6小鼠,腹腔注射MPTP(30mg/kg)或生理盐水,每天一次,连续7天。MPTP治疗7天后,腹腔注射阿扑***(5mg/kg),记录30mim内的旋转次数,若小鼠恒定向左旋转,且旋转圈>7r/min,则视为造模成功,同时在最后一次MPTP治疗5~30min后应该出现竖毛、震颤、前腿抬高、竖尾等异常行动的表现,0.5~1h后症状减轻,24h后小鼠恢复正常。筛选出模型成功的小鼠,随机分为6组灌胃给药(每组15只):正常组和模型组每天9:00和16:00各灌胃含有2%吐温-80的生理盐水0.2mL/d;阳性组每天9:00灌胃L-DOPA溶液0.2mL/d,16:00灌胃含有2%吐温-80的生理盐水0.2mL/d;***二酚单体组每天9:00灌胃***二酚单体溶液0.2mL/d,16:00灌胃含有2%吐温-80的生理盐水0.2mL/d;DP189组每天9:00灌胃2%吐温-80生理盐水0.2mL/d,16:00灌胃DP189菌株0.2mL/d;***二酚单体+DP189组每天9:00灌胃***二酚单体溶液0.2mL/d,16:00灌胃DP189菌株0.2mL/d。以上各组均连续给药14d。第15天开始测定行为学实验,24h后处死小鼠并采集小鼠血清和大脑组织待检测。
二、帕森金病模型小鼠行为学实验
小鼠行为学实验结果如图1所示。该实验表明,***二酚单体和植物乳杆菌DP189株均能单独缩短小鼠的水迷宫潜伏期和增加小鼠自主活动实验的次数,但是***二酚单体和植物乳杆菌DP189株的单独作用相对于二者联合用药的作用较弱,与模型组相比较,***二酚单体+DP189组能够改善帕金森病模型小鼠的记忆能力与行为学能力,并具有极其显著性差异(P<0.01)。
三、帕森金病模型小鼠脑组织相关指标检测
帕金森病的主要病理特征为脑黑质中多巴胺能神经元死亡或丢失,导致脑中的多巴胺含量减少,最终引起发病。5-羟色胺(5-HT)为机体中合成多巴胺途径中的关键酶,它的含量的变化严重影响了集体中多巴胺的含量。通过ELISA试剂盒对小鼠大脑神经递质检测的结果如图2所示,***二酚单体+DP189组能够提高小鼠大脑中5-HT和DA的含量,与模型组相比较,5-HT含量增加了17.42%,DA含量增加了11.25%,其作用比单独用药明显,具有极其显著性差异(P<0.01)。
四、帕森金病模型小鼠血清中氧化应激指标检测
氧化应激试剂盒检测结果如表1所示。该实验表明,与正常组相比较,模型组小鼠的SOD和GSH-Px的含量较低,且ROS含量和MDA水平大幅度升高,表明采用MPTP致亚急性帕金森病小鼠模型是比较成功的。与模型组相比较,***二酚单体能够增加小鼠大脑中SOD和GSH-Px的含量,降低ROS含量和MDA水平,具有极其显著性差异(P<0.01);植物乳杆菌DP189株也显示出了较好的抗氧化活性,具有显著性差异(P<0.05);值得注意的是,***二酚单体+DP189组的抗氧化作用均强于二者单独用药组(CBD组和DP189组),其中SOD的含量比模型组增加了约41.91%,ROS含量比模型组降低了约15.13%,显示出了很好的抗氧化活性,具有极其显著性差异(P<0.01)。
表1
注:与模型组相比较,“*”表示具有显著性差异(P<0.05),“**”表示具有极其显著性差异(P<0.01)。
五、帕森金病模型小鼠血清中炎症因子水平检测
炎症因子的产生在帕金森病的发病过程中发挥了重要作用,炎症因子水平的增加会大大提高该病的发病几率。帕森金病模型小鼠血清中炎症因子水平检测结果如表2所示。实验表明,在帕金森病患者体内的炎症因子水平会远远高于正常患者体内的水平。炎症实验结果表明,***二酚单体+DP189组能够较明显地降低帕金森病小鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子的含量,二者联合用药的作用优于二者单独用药组(CBD组和DP189组),且与模型组相比较,TNF-α含量降低了22.25%、IL-6含量降低了12.61%、IL-1β含量降低了14.40%,具有极其显著性差异(P<0.01)。
表2
注:与模型组相比较,“*”表示具有显著性差异(P<0.05),“**”表示具有极其显著性差异(P<0.01)。
本发明公开了一种***二酚单体与植物乳杆菌DP189联合在制备预防和/或治疗帕金森病药物中的应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
Claims (7)
1.***二酚单体与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DP189联合在制备预防和/或治疗帕金森病药物中的应用;其特征在于,所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DP189已于2019年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为:CCTCC NO:M2019199。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述***二酚单体的浓度为2.4mg/mL;所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DP189的浓度为109~1010CFU/mL;所述***二酚单体与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DP189分别使用。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DP189使用时,将其悬浮于2%吐温-80生理盐水中,浓度为109~1010CFU/mL。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述***二酚单体使用时,将其溶于2%吐温-80生理盐水中,浓度为2.4mg/mL。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述***二酚单体纯度≥99%。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述***二酚单体采用以下方法制备:
选取新鲜的工业***花叶,风干;称取风干后的工业***花叶,加入20倍量的食品级95%乙醇进行加热回流提取两次,过滤,合并滤液,减压回收溶剂,获得含有***二酚单体的浸膏;将浸膏按照浸膏与乙酸乙酯重量比为1:10的比例投入到乙酸乙酯中,用水萃取;静置过夜后,弃水层并将乙酸乙酯层减压回收,获得含有***二酚单体的***酚类粗品,以此为样品,使用制备型高效液相色谱对其进行分离,收集得到纯度≥99%的***二酚单体。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物的功能为(1)至(5)中的至少一项:
(1)抑制帕金森病小鼠脑神经元的凋亡;
(2)减少炎症因子TNF-α水平;
(3)减少炎症因子IL-1β水平;
(4)减少炎症因子IL-6水平;
(5)阻止机体的氧化应激反应,降低氧化应激水平。
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