CN113286813A - 用于car和tcr转导的模块化多顺反子载体 - Google Patents

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Abstract

本文提供一种模块化多顺反子载体***，例如用于细胞的基因重编程以表达一种或多种抗原受体。所述***的模块化特征允许在除了特定顺反子内的一个或多个组分之外的一个或多个顺反子的交换。在特定实施方案中，所述***的模块化允许嵌合抗原受体的组分的交换，例如共刺激结构域、scFv、铰链、信号传导结构域等的交换。

Description

用于CAR和TCR转导的模块化多顺反子载体
本申请要求2018年11月19日申请的美国临时专利申请系列号62/769,414；2018年11月30日申请的美国临时专利申请系列号62/773,394；和2019年1月11日申请的美国临时专利申请系列号62/791,491的优先权，所述申请全部以全文引用的方式并入本文中。
序列表
本申请包含序列表，所述序列表已以ASCII格式以电子方式提交并通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2019年11月13日，命名为UTFC_P1152WO_SL.txt，大小为2,502字节。
背景技术
1.领域
本公开内容大体上至少涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学、重组技术和医学的领域。更具体地，其涉及多顺反子载体，例如用于表达一种或多种抗原受体。
2.相关技术的描述
尽管诊断和诊断患有癌症的患者可获得的治疗选项中存在显著技术进步，但预后仍通常保持不良并且许多患者无法治愈。免疫疗法有希望向诊断患有各种肿瘤的患者提供强效而具有靶向性的治疗，其具有根除恶性肿瘤细胞而不破坏正常组织的潜力。理论上，免疫***的T细胞能够识别对肿瘤细胞具有特异性的蛋白质模式并且通过多种效应机制介导其破坏。
用于过继癌症免疫疗法的免疫细胞(例如天然杀伤(NK)细胞)的基因重编程具有临床上相关的应用和益处，例如固有抗肿瘤监视，而无对敏化同种异体功效的先需求，无移植物抗宿主反应性，和目标肿瘤的直接细胞介导的细胞毒性和细胞溶解。施用表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞(例如过继T细胞疗法或NK细胞疗法)是一种尝试，以利用和放大患者自身免疫细胞的肿瘤根除能力，并且接着在效应子有效消除残余肿瘤然而不损害健康组织的状态下使这些效应子返回至患者。通常，CAR包含对肿瘤相关抗原(TAA)具有特异性的抗体的单链可变片段(scFv)，所述肿瘤相关抗原通过铰链和跨膜区偶联至T细胞信号传导分子的胞质结构域。
多个基因在所需比率下的共表达对广泛的基础研究和生物医学应用(包括基因重编程)具有高度吸引力。用于多基因共表达的策略包括引入多种载体、在单一载体中使用多种启动子、融合蛋白、在基因之间的蛋白水解裂解位点、内部核糖体入口位点和“自裂解”2A肽。然而，存在对用于包括CAR、T细胞受体(TCR)、细胞因子、细胞因子受体、趋化因子受体和归巢受体(仅举例)的多个基因的组合表达的方法的未满足的需求。本公开内容满足了此需要。
发明概述
本公开内容的实施方案包括涉及多顺反子载体的方法和组合物，所述多顺反子载体包含各自由一个或多个限制酶位点侧接的至少两个、至少三个或至少四个顺反子，其中至少一个顺反子编码至少一种抗原受体。在一些情况下，顺反子中的两个、三个、四个或更多个被翻译为单一多肽并且裂解为分离的多肽。载体上的相邻顺反子可通过提供使经编码的多肽成为分离的分子的能力的位点分离。例如，载体上的相邻顺反子可通过自裂解位点(例如2A自裂解位点)分离。在一些情况下，顺反子中的每一个从载体表达分离的多肽。在特定情况下，载体上的相邻顺反子通过IRES元件分离。
在本公开内容的特定实施方案中，载体上的顺反子中的至少一个包含两个或更多个模块化组分，其中顺反子内的模块化组分中的每一个由一个或多个限制酶位点侧接。例如，顺反子可包含三个、四个或五个模块化组分。在至少一些情况下，顺反子编码具有由相应模块化组分编码的受体的不同部分的抗原受体。顺反子的第一模块化组分可编码受体的抗原结合结构域。另外，顺反子的第二模块化组分可编码受体的铰链区。另外，顺反子的第三模块化组分可编码受体的跨膜结构域。另外，顺反子的第四模块化组分可编码第一共刺激结构域。另外，顺反子的第五模块化组分可编码第二共刺激结构域。另外，顺反子的第六模块化组分可编码信号传导结构域。
在本公开内容的特定方面中，载体上的两个不同顺反子各自编码不同抗原受体。两种抗原受体均可由包含两个或更多个模块化组分的顺反子(包括包含两个或更多个模块化组分的分离的顺反子)编码。抗原受体可为例如嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)。
在特定实施方案中，载体为病毒载体(例如反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体)或非病毒载体。载体可包含莫罗尼鼠白血病病毒(MMLV)5’LTR、3’LTR和/或psi包装元件。在特定情况下，psi包装并入5’LTR与抗原受体编码序列之间。载体可包含或可不包含pUC19序列。在载体的一些方面中，至少一个顺反子编码分泌的或膜结合的细胞因子(例如白介素15(IL-15)、IL-7、IL-21、IL-12、IL-18或IL-2)、趋化因子、细胞因子受体和/或归巢受体。
当2A裂解位点用于载体中时，2A裂解位点可包含P2A、T2A、E2A和/或F2A位点。
载体的任何顺反子可包含***基因。载体的任何顺反子可编码报告基因。在特定实施方案中，第一顺反子编码***基因，第二顺反子编码抗原受体，第三顺反子编码报告基因，并且第四顺反子编码细胞因子。在某些实施方案中，第一顺反子编码***基因，第二顺反子编码第一抗原受体，第三顺反子编码第二抗原受体，并且第四顺反子编码细胞因子。在特定实施方案中，抗原受体的不同部分由相应模块化组分编码，并且第二顺反子的第一组分编码抗原结合结构域，第二组分编码铰链和/或跨膜结构域，第三组分编码共刺激结构域，并且第四组分编码信号传导结构域。
本公开内容的方法和组合物涵盖在单一载体上的顺反子的任何合适顺序。
本公开内容的实施方案包括携带本文所涵盖的载体中的任一个的任何种类的细胞。在特定实施方案中，存在包含本公开内容的载体的免疫细胞，并且免疫细胞可为T细胞、外周血淋巴细胞、B细胞、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、iNKT、巨噬细胞或干细胞(例如间充质干细胞(MSC)或诱导多能干(iPS)细胞)。T细胞可为CD8+T细胞、CD4+T细胞或γ-δT细胞。在特定实施方案中，T细胞为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。任何细胞相对于个体可为同种异体或自体的。免疫细胞可为人类细胞。免疫细胞可衍生自脐带血、外周血、骨髓、CD34+细胞或iPSC。可包含多个免疫细胞作为细胞群体。在特定情况下，免疫细胞包含在药学上可接受的载体中。
在本公开内容的一个实施方案中，存在用于产生免疫细胞的方法，其包括(a)获得免疫细胞的起始群体；(b)在人工呈递细胞(APC)存在下培养免疫细胞的起始群体；(c)将本公开内容中涵盖的载体引入免疫细胞中；和(d)在APC存在下扩增免疫细胞，由此获得扩增的免疫细胞。免疫细胞的起始群体可通过使用ficoll-paque密度梯度分离单核细胞来获得。APC可为经γ辐射的APC。在方法的一些情况下，方法进一步包括冷冻保存扩增的免疫细胞的群体。
本公开内容的实施方案包括包含如本文所涵盖的任何免疫细胞群体和药学上可接受的载体的药物组合物。
在特定实施方案中，提供包含有效量的如本文所涵盖的免疫细胞的组合物，其用于治疗个体的疾病或病症，例如癌症或免疫相关病症。在特定实施方案中，存在包含有效量的本公开内容所涵盖的免疫细胞的组合物用于治疗个体的癌症或免疫相关病症的用途。
在一个实施方案中，存在治疗个体的疾病或病症的方法，其包括向个体施用有效量的本公开内容所涵盖的免疫细胞。在特定实施方案中，疾病或病症为癌症(实体癌症或血液恶性肿瘤)、自体免疫病症、移植物抗宿主疾病、同种异体移植排斥反应或炎性病状。自体免疫病症可为炎性病状并且免疫细胞可基本上不表达糖皮质激素受体。对个体已施用或可正施用类固醇疗法。免疫细胞相对于个体可为自体或同种异体的。所述方法可进一步包含向个体施用至少第二治疗剂，例如化学疗法、免疫疗法、手术、放射疗法或生物疗法。在特定实施方案中，免疫细胞经静脉内、腹膜内、气管内、瘤内、肌肉内、内视镜、病灶内、经皮、皮下、局部、通过输注或通过直接注射向个体施用。在特定实施方案中，第二治疗剂经静脉内、腹膜内、气管内、瘤内、肌肉内、内视镜、病灶内、经皮、皮下、局部、通过输注或通过直接注射向个体施用。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含各自由一个或多个限制酶位点侧接的至少两个、至少三个或至少四个顺反子，其中载体上的顺反子中的至少一个包含两个或更多个模块化组分，其中顺反子内的模块化组分中的每一个由一个或多个限制酶位点侧接。
本公开内容的其他目标、特征和优势将自以下详述而变得明显。然而，应理解，由于在本公开内容的精神和范围内的各种改变和修改将自此详述对本领域技术人员变得明显，所以详述和特定实施例尽管指示本公开内容的特定实施方案，但仅以举例说明方式给出。
附图简述
以下附图形成本说明书的一部分并且包括在内以进一步展现本公开内容的某些方面。结合本文中呈现的特定实施方案的详细描述参考这些附图中的一个或多个可更好地理解本公开内容。
图1A:包含具有至少一个具有多个模块化组分的顺反子的多个模块化顺反子的多顺反子载体的一个实施方案。X表示至少一个限制酶位点。
图1B:包含具有至少一个具有多个模块化组分的顺反子的多个模块化顺反子的多顺反子载体的另一个实施方案。X表示至少一个限制酶位点。
图2:描绘具有通过三个2A自裂解位点表达7个开放阅读框(ORF)(包括抗原受体顺反子内的组分)的四个顺反子的多顺反子反转录病毒载体的一个实例的线性表示的示意图。
图3:具有多个顺反子和三个2A裂解位点的多顺反子质粒的一个实例。
举例说明性实施方案的描述
在某些实施方案中，本公开内容提供一种利用能够以实质上相同水平表达多个顺反子的多顺反子载体的灵活的模块化***。所述***可用于细胞工程改造，从而允许多个基因的组合表达(包括过表达)。在特定实施方案中，由载体表达的基因中的一个或多个包括在特定实施方案中为非天然受体的一种、两种或更多种抗原受体。多个基因可包含但不限于：CAR、TCR、细胞因子、趋化因子、归巢受体、CRISPR/Cas9介导的基因突变、诱饵受体、细胞因子受体、嵌合细胞因子受体等。载体可进一步包含：(1)一个或多个报告分子，例如荧光或酶促报告分子，例如用于细胞测定和动物成像；(2)一种或多种细胞因子或其他信号传导分子；和/或(3)***基因。
具体地，载体可包含通过任何种类的裂解位点(例如2A裂解位点)分离的至少4个顺反子。载体可或可不基于莫罗尼鼠白血病病毒(MoMLV或MMLV)，包括具有pUC19主链中的psi包装序列的3’和5’LTR。载体可包含具有三个或更多个2A裂解位点和多个ORF的4个或更多个顺反子以用于基因交换。在一些实施方案中，***允许由一个或多个限制位点侧接的多个基因(7个或更多)的组合过表达以便通过亚克隆快速整合，并且***还包括至少三个2A自裂解位点。因此，***允许表达多种CAR、TCR、信号传导分子、细胞因子、细胞因子受体和/或归巢受体。此***还可应用于其他病毒和非病毒载体，包括但不限于慢病毒、腺病毒AAV以及非病毒质粒。
***的模块化性质还允许将基因有效亚克隆至多顺反子表达载体中的4个顺反子中的每一个和交换基因，例如用于快速测试。战略性地位于多顺反子表达载体中的限制位点允许高效交换基因。限制酶位点的实例至少包括以下：Bln I、BstE II、EcoR V、Acc I、Alu I、Apa I、BamH I、Bcl I、Bgl II、Bsm I、Cfo I、Cla I、Dde I、Dpn I、Dra I、EclX I、EcoR I、Hae III、Hind III、Hpa I、Kpn I、Ksp I、Mva I、Nco I、Nde I、Nhe I、Not I、NsiI、Pst I、Pvu I、Pvu II、Rsa I、Sac I、Sal I、Sau3A I、Sca I、Sfi I、Sma I、Spe I、Sph I、Taq I、Xba I和/或Xho I。
本文进一步提供用于用本文中涵盖的模块化载体基因工程改造免疫细胞的方法。免疫细胞可为任何种类，包括例如T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞或间充质基质细胞(MSC)。本文还提供免疫疗法的方法，其包括施用载体工程改造的免疫细胞，例如用于治疗例如癌症、感染或自体免疫疾病。
I.定义
如本文所用，关于“基本上不含”指定组分在本文中用于意指特定组分均没有被有目的地配制入组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何非预期污染引起的指定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中任何量的指定组分均不可用标准分析方法检测到的组合物。
与长期以来的专利法惯例相同，当在本说明书(包括权利要求书)中与单词包含共同使用时，单词“一个”和“一种”指代“一个或多个/一种或多种”。本公开内容的一些实施方案可由以下组成或基本上由以下组成：一个或多个本公开内容的元件、方法步骤和/或方法。预期本文所述的任何方法或组合物可关于本文所述的任何其他方法或组合物、所公开的实施方案实施，并且在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下仍获得相同或相似结果。尽管本公开内容支持仅指替代方案和“和/或”的定义，但除非明确地指示为仅指替代方案或替代方案相互排斥，否则术语“或”在权利要求书中的使用用于意指“和/或”。如本文所用，“另一个”可意指至少第二个或更多个。
如本文所用，术语“顺反子”是指可产生基因产物的核酸序列。
如本文所用，术语“模块化”是指允许其互换性的顺反子或顺反子组分，在一些情况下，例如通过分别移除和置换整个顺反子或顺反子组分，例如通过使用标准重组技术，包括利用一个或多个限制酶位点，包括独特限制酶位点，而允许互换性。
在整个本申请中，术语“约”用于指示值包括对于装置、用于测定值的方法的误差的固有偏差，或研究受试者中存在的偏差。
“免疫病症”、“免疫相关病症”或“免疫介导病症”是指其中免疫反应在疾病的发展和/或进展中起关键作用的病症。免疫介导病症例如包括自身免疫病症、同种异体移植排斥反应、移植物抗宿主疾病和炎性和过敏性病状。
“免疫反应”为例如B细胞或T细胞或先天性免疫细胞的免疫***的细胞对刺激的反应。在一个实施方案中，反应对特定抗原具有特异性(“抗原特异性反应”)。
“自体免疫疾病”是指其中免疫***针对作为正常宿主的一部分的抗原(即自体抗原)产生免疫反应(例如B细胞或T细胞反应)和随之而来的对组织的损伤的疾病。自体抗原可衍生自宿主细胞，或可衍生自例如通常定殖粘膜表面的微生物体(称为共生生物体)的共生生物体。
疾病或病状的“治疗”或疗法是指执行方案，其可包括向患者施用一种或多种药物或疗法(包括细胞)以致力于减轻疾病的至少一种体征或症状。所需治疗效果包括降低疾病进展的速率、改善或缓和疾病状态、延迟至少一种症状的发作和缓解或改良预后。缓解可在疾病或病状的体征或症状出现之前以及在其出现之后或这两种情况下出现。因此，“治疗”或“疗法”可包括“预防”或“防止”疾病或非期望病状。此外，“治疗”或“疗法”不需要完全缓解一种或多种体征或症状，不需要治愈，并且尤其包括对患者仅具有微小作用的方案。
如整个本申请所使用的，术语“治疗益处”或“治疗有效”是指关于病状的医学治疗促进或增强受试者的健康的任何事物。这包括但不限于疾病的一种或多种体征或症状的频率或严重程度降低。例如，癌症的治疗可涉及例如减小肿瘤尺寸、减小肿瘤侵袭性、减小癌症的生长速率和/或预防癌转移。癌症的治疗还可指延长患有癌症的受试者的存活期。
“受试者”和“患者”和“个体”是指人类或非人类，例如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在特定实施方案中，受试者为人类、狗、猫、马、牛等。
短语“药学上可接受或药理学上可接受”是指在按需要施用于诸如人类的动物时不产生不利、过敏性或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，包含抗体或另外的活性成分的药物组合物的制备将为本领域技术人员所已知的。此外，对于动物(例如人类)施用，应理解，制剂应满足如FDA生物标准办公室(FDA Office of BiologicalStandards)所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有水性溶剂(例如水、醇性/水性溶液、盐水溶液、肠胃外媒介物，例如氯化钠、林格氏右旋糖等)、非水性溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯，例如油酸乙酯)、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、风味剂、染料、流体和营养物补充剂，例如材料和其组合，如本领域技术人员应已知的。根据熟知参数调节药物组合物中各种组分的pH值和精确浓度。
术语“抗原呈递细胞(APC)”是指这样一类细胞，其能够呈递一种或多种可通过免疫***的特异性效应细胞识别的肽-MHC复合物形式的抗原，并且由此诱导对所呈递的一种或多种抗原的有效细胞免疫反应。术语“APC”涵盖诸如巨噬细胞、B细胞、内皮细胞、活化T细胞和树突状细胞的完整全细胞，或能够呈递抗原例如与β微球蛋白复合的纯化MHC I类分子的天然存在或合成的分子。
II.多顺反子模块化载体***
本公开内容的实施方案涵盖利用多顺反子载体的***，其中载体的至少一部分为模块化的，例如通过允许移除和置换一个或多个顺反子(或一个或多个顺反子的一个或多个组分)，例如通过利用一个或多个特异性选择其身分和位置以促进载体的模块化使用的限制酶位点。载体还具有其中多个顺反子被翻译为单一多肽并且加工成分离的多肽，由此赋予载体以实质上等摩尔浓度表达分离的基因产物的优势的实施方案。
本公开内容的载体被配置用于模块化以便能够改变载体的一个或多个顺反子和/或改变一个或多个特定顺反子的一个或多个组分。载体可经设计以利用侧接一个或多个顺反子的末端和/或侧接特定顺反子的一个或多个组分的末端的独特限制酶位点。
在某些实施方案中，本公开内容提供一种用于细胞工程改造的***，其允许可包括例如一种、两种或更多种抗原受体的多个顺反子的组合表达，包括过表达。在特定实施方案中，使用如本文所描述的多顺反子载体允许载体从相同mRNA产生等摩尔量的多种基因产物。多个基因可包含但不限于：CAR、TCR、细胞因子、趋化因子、归巢受体、CRISPR/Cas9介导的基因突变、诱饵受体、细胞因子受体、嵌合细胞因子受体等。载体可进一步包含一个或多个荧光或酶促报告分子，例如用于细胞测定和动物成像。载体还可包含***基因产物，以用于在携带载体的细胞对它们被提供至的宿主不再需要或变得有害时除去携带载体的细胞。
在特定情况下，载体可为γ-反转录病毒转移载体。反转录病毒转移载体可包含基于质粒(例如pUC19质粒，在HindIII与EcoRI限制酶位点之间的大片段(2.63kb))的主链。主链可携带来自莫罗尼鼠白血病病毒(MoMLV)的病毒组分，包括5’LTR、psi包装序列和3’LTR。LTR为发现于反转录病毒原病毒的任一侧上的长末端重复序列，并且在转移载体的情况下，囊括感兴趣的基因负荷，例如CAR和相关组分。psi包装序列(其为通过核衣壳包装的靶位点)还以顺式并入，包夹于5’LTR与CAR编码序列之间。因此，转移载体的实例的基本结构可如此配置：pUC19序列-5’LTR-psi包装序列-感兴趣的基因负荷-3’LTR-pUC19序列。此***还可应用于其他病毒和非病毒载体，包括但不限于慢病毒、腺病毒AAV以及非病毒质粒。
在特定实施方案中，载体的多个顺反子通过一个或多个提供基因从相应多个顺反子至单一转录物的表达的组分分离。随后翻译单一转录物以产生多蛋白质多肽，其经加工(例如通过裂解)以使得蛋白质变成分离的蛋白质分子。示例性元件为编码自裂解肽，例如2A肽裂解序列的位点。其他裂解位点包括弗林蛋白酶裂解位点或烟草蚀纹病毒(TEV)裂解位点。在其他情况下，载体的顺反子通过一个或多个提供分离的顺反子的不同翻译的元件(诸如IRES序列)分离。在一些情况下，载体利用两种类型的元件的组合。
感兴趣的基因负荷可包括l、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个包含可自载体表达的至少一个ORF的顺反子。本公开内容的实施方案包括其中感兴趣的基因负荷可能当前未容纳于载体中、但载体仍保留在其存在时表达和/或进一步加工顺反子所需的一个或多个结构或管家元件(例如一个或多个启动子、多个2A序列等)的状态中的载体。载体可具有多个顺反子，其能够翻译成单一多肽并且加工成分离的多肽(例如通过使用在相邻顺反子之间的2A自裂解位点)。在替代实施方案中，多个顺反子均表达为分离的多肽(例如通过使用在相邻顺反子之间的IRES元件)。
在特定情况下，载体中感兴趣的基因负荷的结构可如下：
顺反子1-2A-顺反子2-2A-顺反子3-2A-顺反子4，
其中在特定实施方案中，顺反子1、顺反子2、顺反子3和顺反子4为不同基因。在至少一些情况下，载体内的2A序列可或可不相同。
在特定实施方案中，顺反子中的至少一个编码***基因。在一些实施方案中，顺反子中的至少一个编码细胞因子。在某些实施方案中，至少一个顺反子编码抗原受体。顺反子可或可不编码报告基因。在某些实施方案中，至少两个顺反子编码两种不同抗原受体(例如CAR和/或TCR)。顺反子可或可不编码报告基因。在特定情况下，感兴趣的基因负荷如下：
***基因-2A-抗原受体-2A-报告基因-2A-细胞因子；或
***基因-2A-抗原受体-2A-细胞因子-2A-报告基因；或
***基因-2A-细胞因子-2A报告基因-2A-抗原受体；或
***基因-2A-细胞因子-2A抗原受体-2A-报告基因；或
***基因-2A-报告基因-2A-细胞因子-2A抗原受体；或
***基因-2A-报告基因-2A-抗原受体-2A-细胞因子；或
抗原受体-2A-细胞因子-2A-报告基因-2A-***基因；或
抗原受体-2A-细胞因子-2A-***基因-2A-报告基因；或
抗原受体-2A-报告基因-2A-细胞因子-2A-***基因；或
抗原受体-2A-报告基因-2A-***基因-2A-细胞因子；或
抗原受体-2A-***基因-2A-报告基因-2A-细胞因子；或
抗原受体-2A-***基因-2A-细胞因子-2A-报告基因；或
报告基因-2A-抗原受体-2A-***基因-2A-细胞因子；或
报告基因-2A-抗原受体-2A-细胞因子-2A-***基因；或
报告基因-2A-细胞因子-2A-***基因-2A-抗原受体；或
报告基因-2A-细胞因子-2A-抗原受体-2A-***基因；或
报告基因-2A-***基因-2A-抗原受体-2A-细胞因子；或
报告基因-2A-***基因-2A-细胞因子-2A-抗原受体；或
细胞因子-2A-报告基因-2A-***基因-2A-抗原受体；或
细胞因子-2A-报告基因-2A-抗原受体-2A-***基因；或
细胞因子-2A-***基因-2A-抗原受体-2A-报告基因；或
细胞因子-2A-***基因-2A-报告基因-2A-抗原受体；或
细胞因子-2A-抗原受体-2A-***基因-2A-***基因；或
细胞因子-2A-抗原受体-2A-报告基因-2A-报告基因。
在感兴趣的基因负荷的特定配置中，单一载体可包含编码第一抗原受体的顺反子和编码与第一抗原受体不相同的第二抗原受体的顺反子。在特定实施方案中，第一抗原受体编码CAR并且第二抗原受体编码TCR，或反之亦然。在特定实施方案中，包含分别编码第一抗原受体和第二抗原受体的分离的顺反子的载体还包含编码细胞因子或趋化因子的第三顺反子和编码***基因的第四顺反子。然而，***基因和/或细胞因子(或趋化因子)可不存在于载体上。
在特定情况下，感兴趣的基因负荷如下：
***基因-2A-第一抗原受体-2A-细胞因子-2A-第二抗原受体；或
***基因-2A-第一抗原受体-2A-第二抗原受体-2A-细胞因子；或
***基因-2A-细胞因子-2A-第一抗原受体-2A-第二抗原受体；或
***基因-2A-细胞因子-2A-第二抗原受体-2A-第一抗原受体；或
***基因-2A第二抗原受体-2A-第一抗原受体-2A-细胞因子；或
***基因-2A-第二抗原受体-2A-细胞因子-2A-第一抗原受体；或
第一抗原受体-2A-细胞因子-2A-第二抗原受体-2A-***基因；或
第一抗原受体-2A-细胞因子-2A-***基因-2A-第二抗原受体；或
第一抗原受体-2A-***基因-2A-第二抗原受体-2A-细胞因子；或
第一抗原受体-2A-***基因-2A-细胞因子-2A-第二抗原受体；或
第一抗原受体-2A-第二抗原受体-2A-细胞因子-2A-***基因；或
第一抗原受体-2A-第二抗原受体-2A-***基因-2A-细胞因子；或
细胞因子-2A-第一抗原受体-2A-***基因-2A-第二抗原受体；或
细胞因子-2A-第一抗原受体-2A-第二抗原受体-2A-***基因；或
细胞因子-2A-***基因-2A-第一抗原受体-2A-第二抗原受体；或
细胞因子-2A-***基因-2A-第二抗原受体-2A-第一抗原受体；或
细胞因子-2A-第二抗原受体-2A-第一抗原受体-2A-***基因；或
细胞因子-2A-第二抗原受体-2A-***基因-2A-第一抗原受体。
在一些情况下，载体中的顺反子中的一个不为报告基因或不为细胞因子。在上文所提供的顺反子的配置的替代实施方案中，替代2A肽序列，可存在允许不同顺反子的共表达的替代组分，例如IRES序列。在单一载体中，可存在所使用的2A肽裂解序列和IRES元件的组合。
在特定实施方案中，至少一个顺反子包含为模块化的多个组分本身。例如，一个顺反子可编码多组分基因产物，例如具有多个部分的抗原受体；在特定情况下，抗原受体由单一顺反子编码，从而最终产生单一多肽。编码多个组分的顺反子可具有由1、2、3、4、5个或更多个限制酶消化位点(包括对于包含顺反子的载体独特的1、2、3、4、5个或更多个限制酶消化位点)分离的多个组分(图1A和图1B)。在特定实施方案中，具有多个组分的顺反子编码具有多个相应部分(各自为受体提供独特功能)的抗原受体。在特定实施方案中，多组分顺反子的组分的每一个或大部分通过一个或多个对于载体独特的限制酶消化位点分离，从而在需要时允许分离的组分的互换性。
作为举例说明，多组分顺反子的一个实例的模块化如下配置，其中存在一个或多个如每个X表示的独特限制酶位点：
组分1--X1-组分2---X2-组分3---X3-组分4---X4-组分5---X5-等。
在特定实施方案中，多组分顺反子的各组分对应于经编码抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)的不同部分。在举例说明性实施方案中，组分1可编码受体的抗原结合结构域；组分2可编码受体的铰链结构域；组分3可编码受体的跨膜结构域；组分4可编码受体的共刺激结构域，并且组分5可编码受体的信号传导结构域。在特定实施方案中，抗原受体可包含一个或多个共刺激结构域，其各自通过独特限制酶消化位点分离以得到受体内一个或多个共刺激结构域的互换性。
参看图1A和图1B，这些举例说明提供本公开内容的一个载体的至少部分的实施方案的实例并且显示载体的模块化性质。图1A举例说明具有四个分离的顺反子的多顺反子载体，其中相邻顺反子通过2A裂解位点分离，尽管在特定实施方案中，替代2A裂解位点，存在直接或间接引起从顺反子产生分离的多肽的组分(诸如IRES序列)。在图1A中，四个分离的顺反子通过三个2A肽裂解位点分离，并且各顺反子具有侧接顺反子的各末端的限制位点(X1、X2等)以允许特定顺反子例如与另一个顺反子或其他类型序列在使用标准重组技术时的互换性。在特定实施方案中，侧接顺反子中的每一个的一个或多个限制酶位点对于载体为独特的，以允许易于重组，但在替代性实施方案中，限制酶位点对于载体不是独特的。
在特定实施方案中，载体通过允许特定顺反子内(包括在特定顺反子的多个组分内)的互换性提供独特的第二水平的模块化。特定顺反子的多个组分可通过一个或多个限制酶位点(包括对于载体独特的那些限制酶位点)分离，以允许顺反子内的一个或多个组分的互换性。在图1A中，作为实例，顺反子2包含五个分离的组分，尽管每个顺反子可存在2、3、4、5、6个或更多个组分。图1A中的实例包括具有各自由独特酶限制位点X9、X10、X11、X12、X13和X14分离，以允许标准重组以交换不同组分1、2、3、4和/或5的五个组分的顺反子2。图1B与图1A的不同之处在于举例说明在不同组分之间可存在多个限制酶位点(其为独特的，尽管替代地，一个或多个不是独特的)并且在多个限制酶位点之间可存在序列(尽管替代地可不存在)。在某些实施方案中，出于可互换的目的设计由顺反子编码的所有组分。在特定情况下，顺反子的一个或多个组分被设计成可互换，而顺反子的一个或多个其他组分可不被设计成可互换的。
在特定实施方案中，在图1A和图1B的实例中，顺反子编码具有多个组分的CAR分子或其他抗原受体。例如，顺反子2可包含编码具有由组分1、组分2、组分3等表示的分离的组分的CAR分子的序列。CAR分子可包含2、3、4、5、6、7、8个或更多个可互换组分。在特定实例中，图1A或图1B中的组分1编码用于感兴趣的抗原的scFv；组分2编码铰链；组分3编码跨膜结构域；组分4编码共刺激结构域(尽管还可存在编码由用于交换的限制位点侧接的第二或更多个共刺激结构域的组分4')；并且组分5编码信号传导结构域。在特定实例中，组分1编码CD19scFv；组分2编码IgG1铰链和/或跨膜结构域；组分3编码CD28；并且组分4编码CD3ζ。
本领域技术人员在设计载体方面认识到，各种顺反子和组分必须经配置使得其在必要时保持在框架中。
在图1A或图1B的特定实例中，顺反子1编码***基因；顺反子2编码CAR；顺反子3编码报告基因；顺反子4编码细胞因子；顺反子2的组分1编码scFv；顺反子2的组分2编码IgG1铰链；顺反子2的组分3编码CD28；并且组分4编码CDζ。在替代性实施方案中，没有顺反子编码抗原受体。
限制酶位点可为任何种类并且在其识别位点中可包括任何数目的碱基，例如4个至8个碱基；识别位点中的碱基数目可为至少4个、5个、6个、7个、8个或更多个。切割时位点可产生平端切口或粘性末端。限制酶可以是例如I型、II型、III型或IV型。限制酶位点可获自可用数据库，例如整合相关酶数据库(IntEnz)或BRENDA(全面酶信息***(TheComprehensive Enzyme Information System))。
示例性载体描绘于图2和图3中。在图2中，载体DNA为环状并且依据惯例，位置1(环顶部12点钟位置处，其中序列的其余部分在顺时钟方向上)设定在5’LTR起始处。
在其中利用自裂解2A肽的实施方案中，2A肽可为在真核细胞中翻译期间介导多肽的“裂解”的长为18-22个氨基酸(aa)的病毒寡肽。名称“2A”是指病毒基因组的特定区域并且不同病毒2A一般以其衍生自的病毒命名。第一个发现的2A为F2A(***病毒)，其后还鉴别出E2A(马鼻炎A病毒)、P2A(猪捷申病毒-1 2A)和T2A(thosea asigna病毒2A)。发现2A-介导的“自裂解”的机制为核糖体跳过2A的C端处的甘氨酰基-脯氨酰基肽键的形成。高度保守序列GDVEXNPGP(SEQ ID NO:5)由不同2A在C端共享，并且可用于产生位阻和核糖体跳跃。成功跳过和再起始翻译产生两种“裂解”蛋白质。2A序列的实例如下：
T2A:(GSG)E G R G S L L T C G D V E E N P G P(SEQ ID NO:1)
P2A:(GSG)A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(SEQ ID NO:2)
E2A:(GSG)Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:3)
F2A:(GSG)V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:4)
A.产生方法
本领域技术人员将充分装备以通过标准重组技术构建载体(参见例如Sambrook等人，2001和Ausubel等人，1996，两个均以引用的方式并入本文中)用于表达本公开内容的抗原受体。
1.调节元件
包括在可用于本公开内容的载体中的表达盒尤其含有(以5’至3'方向)可操作地连接至蛋白质编码序列的真核转录启动子、包括介入序列的剪接信号和转录终止/聚腺苷酸化序列。控制在真核细胞中编码基因的蛋白质的转录的启动子和增强子可包含多个遗传元件。细胞机构能够聚集和整合由各元件传达的调节信息，从而允许不同基因演变出不同的、常常复合的转录调节模式。例如，在本公开内容的上下文中所使用的启动子包括组成性、诱导性和组织特异性启动子。在其中载体用于产生癌症疗法的情况下，启动子可在低氧的条件下有效。
a.启动子/增强子
本文所提供的表达构建体包含驱动抗原受体和其他顺反子基因产物的表达的启动子。启动子一般包含用于定位RNA合成的起始位点的序列。其最佳已知实例为TATA盒，但在不具有TATA盒的一些启动子诸如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子中，覆盖起始位点本身的离散元件有助于固定起始的位置。另外的启动子元件调节转录起始频率。通常，这些位于起始位点上游的区域中，尽管已显示多个启动子也含有起始位点下游的功能元件。为了“在启动子控制下”引入编码序列，将转录阅读框的转录起始位点的5’端置于所选择的启动子的“下游”(即3’)。“上游”启动子刺激DNA的转录并且促进经编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间距通常为灵活的，使得当元件反向或相对于彼此移动时保留启动子功能。在tk启动子中，例如启动子元件之间的间距可在活性开始下降之前增加至相距50bp。视启动子而定，似乎个别元件可合作地或独立地起作用以活化转录。启动子可或可不与“增强子”(其是指涉及核酸序列的转录活化的顺式作用调节序列)结合使用。
启动子可为天然地与核酸序列缔合的一种启动子，如可通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列获得。此类启动子可称为“内源”的。相似地，增强子可为天然地与核酸序列缔合、位于该序列下游或上游的一种增强子。或者，某些优势将通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子(其是指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的启动子)控制下来获得。重组或异源增强子还指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的增强子。此类启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，和从任何其他病毒或原核或真核细胞分离的启动子或增强子，和不“天然存在”的启动子或增强子，即含有不同转录调节区的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，最常用于重组DNA构建的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp-)启动子***。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列以外，可结合本文所公开的组合物使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)产生序列。此外，预期还可使用引导非核细胞器(例如线粒体、叶绿体和其相似物)内的序列的转录和/或表达的控制序列。
自然地，使用有效引导DNA区段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中的表达的启动子和/或增强子很重要。分子生物学领域的技术人员一般已知使用启动子、增强子和细胞类型组合用于蛋白质表达(参见例如Sambrook等人1989，其以引用的方式并入本文中)。所用启动子可为组成性、组织特异性、诱导性和/或可用于在合适条件下引导所引入的DNA区段的高水平表达，例如有利于大规模产生重组蛋白质和/或肽。启动子可为异源性或内源性。
另外，任何启动子/增强子组合(按照例如真核启动子数据库EPDB，通过万维网epd.isb-sib.ch/)也可用于驱动表达。另一个可能实施方案为使用T3、T7或SP6细胞质表达***。若提供适当的细菌聚合酶，则真核细胞可支持从某些细菌启动子的细胞质转录，作为递送复合物的一部分或作为另外的基因表达构建体。
启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如β肌动蛋白启动子、GADPH启动子、金属硫蛋白启动子；和串联反应元件启动子，例如环状AMP反应元件启动子(cre)、血清反应元件启动子(sre)、佛波酯启动子(TPA)和靠近最小TATA盒的反应元件启动子(tre)。还有可能使用人类生长激素启动子序列(例如
Figure BDA0003159474960000191
登录号X05244，核苷酸283-341所描述的人类生长激素最小启动子)或小鼠乳腺肿瘤启动子(可获自ATCC，目录号ATCC45007)。在某些实施方案中，启动子为CMV IE、C型凝集素-1(dectin-1)、C型凝集素-2、人类CD11c、F4/80、SM22、RSV、SV40、Ad MLP、β-肌动蛋白、MHC I类或MHC II类启动子，然而可用于驱动治疗性基因表达的任何其他启动子均可用于实施本公开内容。
在某些方面中，本公开内容的方法还涉及增强子序列，即提高启动子活性并且具有顺式作用潜力的核酸序列，其作用与方向无关，即使在相对长的距离(远离目标启动子多达数千个碱基)起作用。然而，增强子功能不一定受限于此类长距离，因为其在非常接近特定启动子下仍有功能。
b.起始信号和连锁表达
特定的起始信号也可用于本公开内容提供的表达构建体中以用于编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域的普通技术人员将能够容易地确定这一点并提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框“在读框内”，以确保整个***序列的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。表达效率可以通过包含适当的转录增强子元件来增强。
在某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5’甲基化Cap依赖性翻译的核糖体扫描模型，并在内部位点开始翻译。来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件以及来自哺乳动物信使的IRES已有记载。IRES元件可以连接到异源的开放阅读框。多个开放阅读框可以一起转录，每个阅读框由一个IRES分隔，从而创建多顺反子信息。凭借IRES元件，每个开放阅读框对于核糖体是可以接近的以用于有效翻译。使用单个启动子/增强子来转录单个信使可以有效地表达多个基因。
如本文中其他地方所详述，某些2A序列元件可用于在本公开内容中所提供的构建体中产生基因的连锁表达或共表达。例如，裂解序列可用于通过连接开放阅读框以形成单一顺反子来共表达基因。示例性裂解序列为马鼻炎A病毒(E2A)或F2A(***病毒2A)或“2A样”序列(例如Thosea asigna病毒2A；T2A)或猪捷申病毒-1(P2A)。在特定实施方案中，在单一载体中，多个2A序列不相同，尽管在替代实施方案中，相同载体利用两个或更多个相同2A序列。2A序列的实例提供于US2011/0065779中，其以全文引用的方式并入本文中。
c.复制起点
为了在宿主细胞中繁殖载体，它可以包含一个或多个复制起点(通常称为“ori”)，例如对应于如上文所述的EBV的oriP的核酸序列或在编程中具有类似或提升的功能的遗传工程化的oriP，复制起点是在其上起始复制的特定核酸序列。可替代地，可以使用如上文所述的其他染色体外复制病毒的复制起点或自主复制序列(ARS)。
d.选择和可筛选标记物
在一些实施方案中，可以通过在表达载体中包括标记物来体外或体内鉴定含有本公开内容的构建体的细胞。此类标记物将赋予细胞可鉴别的变化，从而允许容易地鉴别含有表达载体的细胞。通常，选择标记物是赋予允许选择的特性的标记物。阳性选择标记物是该标记物的存在允许其选择的标记物，而阴性选择标记物是其存在阻止其选择的标记物。阳性选择标记物的一个例子是抗药性标记物。
通常药物选择标记物的包含有助于克隆和鉴定转化体，例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标记物。除了赋予允许基于条件的实施区分转化体的表型的标记物之外，还预期了其他类型的标记物，包括可筛选标记物，例如以比色分析为基础的GFP。可替代地，可以使用可筛选的酶作为阴性选择标记物，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还知道如何使用免疫标记物，可能与FACS分析结合使用。所使用的标记物被认为并不重要，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择和可筛选标记物的其他例子是本领域技术人员公知的。
B.经基因工程改造的抗原受体
载体可编码一种或多种抗原受体，例如经工程改造的TCR、CAR、诱饵受体、细胞因子受体、嵌合细胞因子受体等。例如对于不同抗原的多种CAR和/或TCR可与本公开内容的载体***一起使用。单一载体可编码两个分离的CAR分子，或单一载体可编码一个或多个CAR分子，其中至少一个对两种不同抗原具有特异性，例如双特异性CAR、双特异性TCR或双特异性CAR/TCR。由本公开内容的载体编码的抗原受体、载体本身和携带载体的细胞由人工产生并且不存在于自然界中。
在一些实施方案中，CAR包含特异性结合于抗原的细胞外抗原识别结构域。CAR可经特定设计以靶向特定组织或细胞类型的抗原。在一些实施方案中，抗原是在细胞表面表达的蛋白质。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR并且抗原是经加工的肽抗原，例如细胞内蛋白质的肽抗原，其像TCR一样在主要组织相容性复合物(MHC)分子的情况下在细胞表面上被识别。
示例性的抗原受体(包括CAR和重组TCR)以及用于将受体工程化和引入细胞的方法包括描述于例如以下中的那些：国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337、美国专利号:6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118以及欧洲专利申请号EP2537416，和/或Sadelain等人,2013；Davila等人,2013；Turtle等人,2012；Wu等人,2012描述的那些。在一些方面，遗传工程化的抗原受体包括美国专利号7,446,190中描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中描述的那些。
1.嵌合抗原受体
在一些实施方案中，CAR由载体编码并且包含至少：a)细胞内信号传导结构域、b)跨膜结构域和c)包含至少一个抗原结合区的细胞外结构域。
在一些实施方案中，工程化抗原受体包括CAR，包括激活或刺激性CAR、共刺激CAR(参见WO2014/055668)和/或抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人，2013)。CAR通常包括与一种或多种细胞内信号传导组分连接的细胞外抗原(或配体)结合结构域，在一些方面，通过接头和/或跨膜结构域连接。此类分子通常模拟或近似通过天然抗原受体的信号、通过与共刺激受体组合的此类受体的信号和/或通过单独的共刺激受体的信号。CAR可为第一代、第二代或第三代或后续世代。
本公开内容的某些实施方案涉及核酸(包括编码抗原特异性CAR多肽(包括已被人源化以降低免疫原性的CAR(hCAR)，其包含细胞内信号传导结构域、跨膜结构域以及包含一个或多个信号传导基序的胞外结构域)的核酸)的用途。在某些实施方案中，CAR可以识别包含一种或多种抗原之间的共享空间的表位。在某些实施方案中，结合区可包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，该特异性来源于与受体结合的肽(例如，细胞因子)。
预期人类CAR核酸可衍生自用于增强人类患者的细胞免疫疗法的人类基因。在特定实施方案中，本公开内容包括由载体编码的全长CAR cDNA或编码区。抗原结合区或结构域可包含衍生自特定人单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的VH和VL链的片段，例如美国专利7,109,304中描述的那些，该专利以引用方式并入本文。该片段还可以是任何数量的人抗原特异性抗体的不同抗原结合结构域。在更具体的实施方案中，该片段是由针对人类密码子使用优化以用于在人类细胞中表达的序列编码的抗原特异性scFv。
该布置可以是多聚体，例如双抗体或多聚体。多聚体最有可能通过将轻链和重链的可变部分交叉配对成双抗体而形成。构建体的铰链部分可以有多种选择，从完全删除到保留第一个半胱氨酸，到脯氨酸而不是丝氨酸取代，到截短到第一个半胱氨酸。可或可不删除Fc部分。任何稳定和/或二聚化的蛋白质都可以达到这个目的。可以使用Fc结构域的仅一个，例如来自人免疫球蛋白的CH2或CH3结构域。还可以使用已被修饰以改善二聚化的人类免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3区域。还可以仅使用免疫球蛋白的铰链部分。还可以使用CD8α的部分。
在一些实施方案中，CAR核酸包含编码其他共刺激受体诸如跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域(例如CD28细胞内信号传导结构域)的序列。其他共刺激受体包括但不限于CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10、DAP12和4-1BB(CD137)中的一个或多个。除了由CD3ζ起始的初级信号以外，由***于人类CAR中的人类共刺激受体提供的另外的信号可用于NK细胞的完全活化并且可有助于提高过继免疫疗法的体内持久性和治疗成功。
在一些实施方案中，CAR构建为对特定抗原(或标记物或配体)(例如待通过过继疗法靶向的特定细胞类型中表达的抗原，例如癌症标记物，和/或旨在诱导抑制反应的抗原，例如在正常或非患病细胞类型上表达的抗原)具有特异性。因此，CAR通常在其胞外部分中包括一种或多种抗原结合分子，例如一种或多种抗原结合片段、结构域或部分，或一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，例如来源于单克隆抗体(mAb)的可变重(VH)和可变轻(VL)链的单链抗体片段(scFv)。
在嵌合抗原受体的某些实施方案中，受体的抗原特异性部分(其可称为包含抗原结合区的细胞外结构域)包含肿瘤相关抗原结合结构域或病原体特异性抗原结合结构域。抗原包括通过模式识别受体，例如C型凝集素-1识别的碳水化合物抗原。肿瘤相关抗原可为任何种类，只要其表达于肿瘤细胞的细胞表面上即可。肿瘤相关抗原的示例性实施方案包括CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、CD56、EGFR、c-Met、AKT、Her2、Her3、上皮肿瘤抗原、黑素瘤相关抗原、突变p53、突变ras等。在某些实施方案中，当存在少量肿瘤相关抗原时，CAR可与细胞因子共表达以提高持久性。例如，CAR可与IL-2、IL-21、IL-12、IL-18或IL-15共表达。
编码嵌合受体的开放阅读框的序列可以从基因组DNA来源、cDNA来源获得，或可以合成(例如，通过PCR)，或通过其组合获得。取决于基因组DNA的大小和内含子的数量，可期望的是使用cDNA或其组合，因为发现内含子稳定mRNA。此外，使用内源性或外源性非编码区来稳定mRNA可能是进一步有利的。
预期嵌合构建体可以以裸DNA形式或在合适载体中引入免疫细胞中。通过电穿孔使用裸DNA稳定转染细胞的方法为本领域中已知的。参见例如美国专利号6,410,319。裸DNA一般是指编码嵌合受体的DNA，所述嵌合受体以对于表达合适的定向含于表达载体中。本公开内容的多顺反子模块化载体可为病毒载体或可不为病毒载体，例如质粒。尽管对于举例说明性实施方案，本文详述的载体为反转录病毒载体，但在其他情况下，载体还为病毒载体，但替代地为例如腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体。
可使用任何载体将嵌合构建体引入免疫细胞中。根据本公开内容方法使用的合适载体可在免疫细胞中是非复制性的。已知大量基于病毒的载体，其中维持在细胞中的病毒的拷贝数足够低以维持细胞的活力，例如基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。在特定情况下，载体基于莫洛尼鼠白血病病毒。
在一些方面，抗原特异性结合或识别成分与一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域连接。在一些实施方案中，CAR包括与CAR的胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用与CAR中的结构域之一天然缔合的跨膜结构域。在一些情况下，选择或修饰(通过氨基酸取代)跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
在一些实施方案中，跨膜结构域来源于天然或合成来源。在来源为天然的情况下，在一些方面中，结构域来源于任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区包括来源于以下(即至少包含以下的一个或多个跨膜区)的那些：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、ICOS/CD278、GITR/CD357、NKG2D和DAP分子。可替代地，一些实施方案中的跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成的跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，在合成跨膜结构域的每一端将发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
在某些实施方案中，本文所公开的遗传修饰免疫细胞(例如T、NK、iNKT、B或MSC细胞)的平台技术包含(i)使用电穿孔装置的非病毒基因转移(例如核转染)，(ii)通过胞内结构域信号传导的CAR(例如CD28/CD3-ζ、CD137/CD3-ζ或其他组合)，(iii)具有将抗原识别结构域连接至细胞表面的可变长度的细胞外结构域的CAR，和在一些情况下，(iv)能够鲁棒地和数值上扩增CAR+免疫细胞的衍生自K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)(Singh等人，2008；Singh等人，2011)。
2.T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，遗传工程化抗原受体包括重组TCR和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。“T细胞受体”或“TCR”是指含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)和能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽的分子。在一些实施方案中，TCR呈αβ形式。
通常，以αβ和γδ形式存在的TCR通常在结构上相似，但表达它们的T细胞可能具有不同的解剖学位置或功能。TCR可以在细胞表面上或以可溶形式发现。通常，TCR发现于T细胞(或T淋巴细胞)表面，在其上它通常负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原。在一些实施方案中，TCR还可以包含恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见例如Janeway等人，1997)。例如，在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N-末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C-末端的短胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白缔合。除非另有说明，术语“TCR”应理解为包括其功能性TCR片段。该术语还包括完整或全长的TCR，包括αβ形式或γδ形式的TCR。
因此，为了本文的目的，提及TCR包括任何TCR或功能片段，例如TCR的抗原结合部分，其结合在MHC分子中结合的特定抗原肽，即MHC-肽复合物。TCR的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(可以互换使用)是指含有TCR的结构性结构域的一部分但结合完整的TCR所结合的抗原(例如MHC-肽复合物)的分子。在某些情况下，抗原结合部分包含足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点的TCR的可变结构域，例如TCR的可变α链和可变β链，例如通常其中每条链包含三个互补决定区。
在一些实施方案中，TCR链的可变结构域缔合以形成环，或类似于免疫球蛋白的互补决定区(CDR)，其通过形成TCR分子的结合位点赋予抗原识别和确定肽特异性。通常，与免疫球蛋白一样，CDR由框架区(FR)分隔(参见，例如，Jores等人，1990；Chothia等人，1988；Lefranc等人，2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责识别经加工的抗原的主要CDR，尽管α链的CDR1也已显示与抗原肽的N-末端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C-末端部分相互作用。CDR2被认为识别MHC分子。在一些实施方案中，β-链的可变区可包含进一步的高变(HV4)区。
在一些实施方案中，TCR链包含恒定结构域。例如，像免疫球蛋白一样，TCR链(例如，α-链、β-链)的细胞外部分可以包含两个免疫球蛋白结构域，即在N端的可变结构域(例如，Va或Vp；通常是基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,"Sequences of Proteinsof Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,Public HealthService National Institutes of Health,1991,第5版)和与细胞膜相邻的一个恒定结构域(例如，a-链恒定结构域或Ca，其通常是基于Kabat的氨基酸117至259，β-链恒定结构域或Cp，其通常是基于Kabat的氨基酸117至295)。例如，在一些情况下，通过该两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和含有CDR的两个膜远端可变结构域。TCR结构域的恒定结构域含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而在两条链之间建立连接。在一些实施方案中，TCR可在α链和β链的每一个中具有额外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中包含两个二硫键。
在一些实施方案中，TCR链可包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，TCR链包含细胞质尾部。在一些情况下，该结构允许TCR与其他分子(如CD3)结合。例如，含有恒定结构域和跨膜区的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中，并与CD3信号传导装置或复合物的不变亚基缔合。
通常，CD3是一种多蛋白复合物，其可具有在哺乳动物中的三个不同的链(γ、δ和ε)以及ζ链。例如，在哺乳动物中，复合物可以包含CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链以及CD3ζ链的同源二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是含有单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区带负电荷，这是允许这些链与带正电荷的T细胞受体链结合的特征。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的细胞内尾部各包含单个保守基序，被称为基于酪氨酸的免疫受体激活基序或ITAM，而每条CD3ζ链具有三个。通常，ITAM参与TCR复合体的信号传导能力。这些辅助分子具有带负电的跨膜区域，并在将信号从TCR传播到细胞中发挥作用。CD3-和ζ链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。
在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体，或它可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是包含例如通过一个或多个二硫键连接的两条单独链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体。在一些实施方案中，鉴定针对靶抗原(例如，癌抗原)的TCR并将其引入细胞中。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，例如通过公开可用的TCR DNA序列的聚合酶链反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，TCR获自生物来源，例如获自细胞诸如T细胞(例如细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其他可公开获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，可从患者分离高亲和力T细胞克隆，并分离TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，针对靶抗原的TCR克隆已经在用人免疫***基因(例如，人白细胞抗原***，或HLA)工程化的转基因小鼠中产生。参见例如肿瘤抗原(参见例如Parkhurst等人，2009和Cohen等人，2005)。在一些实施方案中，噬菌体展示用于分离针对靶抗原的TCR(参见例如Varela-Rohena等人，2008和Li等人，2005)。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以根据TCR序列的知识合成产生。
C.细胞因子的共表达
一种或多种细胞因子可从载体共表达为与抗原受体分离的多肽。例如，白介素-15(IL-15)为组织限制性的，并且仅在病理性条件下观察到其血清中或全身性的任何含量。IL-15具有过继疗法所需的几种属性。IL-15为诱导天然杀伤细胞的发展和细胞增殖、通过缓解肿瘤驻留细胞的功能性抑制来促进已建立肿瘤的根除和抑制AICD的稳态细胞因子。
在一些实施方案中，本公开内容涉及CAR和/或TCR载体与IL-15的共同利用。除IL-15之外，预想了其他细胞因子。这些包括但不限于促进用于人类应用的细胞的活化和增殖的细胞因子、趋化因子和其他分子。表达IL-15的NK或T细胞能够持续支持细胞因子信号传导，其对其在输注后的存活至关重要。
在基因修饰之后，可立即输注细胞或可保存细胞。在某些方面中，在基因修饰之后，细胞可在基因转移至细胞中后约1、2、3、4、5天或更多天内以散装群体形式离体繁殖数天、数周或数月。在另一个方面中，克隆转染子并且离体扩增证明存在单一整合或游离维持的表达盒或质粒的克隆和嵌合受体的表达。经选择用于扩增的克隆证明特异性识别和溶解表达CD19的目标细胞的能力。重组免疫细胞可通过用IL-2或结合共同γ链的其他细胞因子(例如，IL-7、IL-12、IL-15、IL-21和其他)刺激来扩增。重组免疫细胞可通过用人工抗原呈递细胞刺激来扩增。在另一个方面中，经遗传修饰的细胞可冷冻保存。
D.抗原
在由经遗传工程改造的抗原受体靶向的抗原中的是在待通过过继细胞疗法靶向的疾病、病状或细胞类型的情形下表达的那些抗原。在疾病和病状中的是增殖性、赘生性和恶性疾病和病症，包括癌症和肿瘤，包括血液癌、免疫***癌症，例如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，例如B、T和骨髓白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤以及自体免疫或同种免疫病状。在一些实施方案中，相比于正常或非靶向细胞或组织，抗原选择性地表达或过表达在疾病或病状的细胞，例如肿瘤或病原性细胞上。在其他实施方案中，抗原表达在正常细胞上和/或表达在经工程改造的细胞上。在一些情况下，抗原与免疫相关病症相关。
任何合适的抗原可用于本公开内容方法中。示例性抗原包括但不限于来自感染原的抗原分子、自体/自身抗原、肿瘤/癌症相关抗原和肿瘤新抗原(Linnemann等人，2015)。在特定方面中，抗原包括NY-ESO,EGFRvIII,Muc-1,Her2,CA-125,WT-1,Mage-A3,Mage-A4,Mage-A10,TRAIL/DR4和CEA。在特定方面中，两种或更多种抗原受体的抗原包括但不限于CD19,EBNA,WT1,CD123,NY-ESO,EGFRvIII,MUC1,HER2,CA-125,WT1,Mage-A3,Mage-A4,Mage-A10,TRAIL/DR4和/或CEA。这些抗原的序列在本领域中已知，例如CD19(登录号NG_007275.1)、EBNA(登录号NG_002392.2)、WT1(登录号NG_009272.1)、CD123(登录号NC_000023.11)、NY-ESQ(登录号NC_000023.11)、EGFRvIII(登录号NG_007726.3)、MUC1(登录号NG_029383.1)、HER2(登录号NG_007503.1)、CA-125(登录号NG_055257.1)、WT1(登录号NG_009272.1)、Mage-A3(登录号NG_013244.1)、Mage-A4(登录号NG_013245.1)、Mage-A10(登录号NC_000023.11)、TRAIL/DR4(登录号NC_000003.12)和/或CEA(登录号NC_000019.10)。
肿瘤相关抗原可衍生自***癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、间皮瘤、卵巢癌或黑素瘤。示例性肿瘤相关抗原或肿瘤细胞衍生抗原包括MAGE1、3和MAGE4(或其他MAGE抗原，例如国际专利公开号W099/40188中所公开的那些MAGE抗原)；PRAME；BAGE；RAGE，Lage(还称为NY ESO 1)；SAGE；和HAGE或GAGE。肿瘤抗原的这些非限制性实例表达于广泛的肿瘤类型，例如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌中。参见例如美国专利号6,544,518。***癌肿瘤相关抗原包括例如***特异性膜抗原(PSMA)、***特异性抗原(PSA)、***酸性磷酸盐、NKX3.1和***的六跨膜上皮抗原(STEAP)。
其他肿瘤相关抗原包括Plu-1、HASH-1、HasH-2、Cripto和Criptin。另外，肿瘤抗原可为自身肽激素，例如全长***释放激素(GnRH)，一种可用于治疗许多癌症的长度为10个氨基酸的短肽。
肿瘤抗原包括衍生自特征在于肿瘤相关抗原表达，例如HER-2/neu表达的癌症的肿瘤抗原。感兴趣的肿瘤相关抗原包括谱系特异性肿瘤抗原，例如黑素细胞-黑素瘤谱系抗原MART-1/Melan-A、gp100、gp75、mda-7、酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白质。举例说明性肿瘤相关抗原包括但不限于衍生自或包含以下中的任何一个或多个的肿瘤抗原：p53、Ras、c-Myc、细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶(例如A-Raf、B-Raf和C-Raf、细胞周期素依赖性激酶)、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、MART-1、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC2、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、TRK受体、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、Wilms肿瘤抗原(WT1)、AFP、-连环蛋白/m、半胱天冬酶-8/m、CEA、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌凝蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、BCR-ABL、干扰素调节因子4(IRF4)、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RAR、肿瘤相关钙信号转导蛋白1(TACSTD1)TACSTD2、受体酪氨酸激酶(例如表皮生长因子受体(EGFR)(特别地，EGFRvIII)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR))、细胞质酪氨酸激酶(例如src-家族、syk-ZAP70家族)、整合素连接激酶(ILK)、转录的信号转导蛋白和活化因子STAT3、STATS和STATE、低氧诱导因子(例如HIF-1和HIF-2)、核因子-κB(NF-B)、Notch受体(例如Notch1-4)、c-Met、雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)、WNT、细胞外信号调节激酶(ERK)和其调节亚基、PMSA、PR-3、MDM2、间皮素、肾细胞癌-5T4、SM22-α、碳酸酐酶I(CAI)和IX(CAIX)(还称为G250)、STEAD、TEL/AML1、GD2、蛋白酶3、hTERT、肉瘤移位断点、EphA2、ML-IAP、EpCAM、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期素B1、聚唾液酸、MYCN、RhoC、GD3、岩藻糖基GM1、间皮素(mesothelian)、PSCA、sLe、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、RGsS、SART3、STn、PAX5、OY-TES1、***蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、豆荚蛋白、TIE2、Page4、MAD-CT-1、FAP、MAD-CT-2、fos相关抗原1、CBX2、CLDN6、SPANX、TPTE、ACTL8、ANKRD30A、CDKN2A、MAD2L1、CTAG1B、SUNC1、LRRN1和个体基因型(idiotype)。
抗原可包括表位区或表位肽，其衍生自肿瘤细胞中突变的基因或衍生自相比于正常细胞在肿瘤细胞中以不同水平转录的基因，例如端粒酶、存活素、间皮素、突变的ras、bcr/ab1重排、Her2/neu、突变或野生型p53、细胞色素P450 1B1，和异常表达的内含子序列，例如N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V；在骨髓瘤和B细胞淋巴瘤中产生独特个体基因型的免疫球蛋白基因的克隆重排；包括衍生自癌病毒过程的表位区或表位肽的肿瘤抗原，例如人类***状瘤病毒蛋白E6和E7；Epstein bar病毒蛋白LMP2；具有肿瘤选择性表达的非突变癌胚蛋白，例如癌胚抗原和甲胎蛋白。
在其他实施方案中，抗原获自或衍生自病原性微生物或机会性病原性微生物(在本文中还称作传染病微生物)，例如病毒、真菌、寄生物和细菌。在某些实施方案中，衍生自此类微生物的抗原包括全长蛋白质。
其抗原预期用于本文所述的方法的举例说明性病原性生物体包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、A型、B型和C型流感、水泡性口炎病毒(VSV)、水泡性口炎病毒(VSV)、多瘤病毒(例如BK病毒和JC病毒)、腺病毒、包括抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的葡萄球菌属和包括肺炎链球菌的链球菌属。如本领域技术人员将理解的，衍生自这些和其他病原性微生物、用作如本文所描述的抗原的蛋白质和编码蛋白质的核苷酸序列可在出版物和公开数据库例如
Figure BDA0003159474960000331
和
Figure BDA0003159474960000332
中确定。
衍生自人类免疫缺陷病毒(HIV)的抗原包括HIV病毒粒子结构蛋白(例如gp120、gp41、p17、p24)的任一个、蛋白酶、逆转录酶或由tat、rev、nef、vif、vpr和vpu编码的HIV蛋白。
衍生自单纯疱疹病毒(例如HSV1和HSV2)的抗原包括但不限于表达自HSV晚期基因的蛋白质。晚期基因组主要编码形成病毒粒子的蛋白质。此类蛋白质包括形成病毒衣壳的五种蛋白质(UL)：UL6、UL18、UL35、UL38和主要衣壳蛋白UL19、UL45和UL27，其中每一个可用作如本文所述的抗原。预期用作本文中的抗原的其他示例性HSV蛋白包括ICP27(H1、H2)、糖蛋白B(gB)和糖蛋白D(gD)蛋白。HSV基因组包含至少74个基因，各自编码可潜在地用作抗原的蛋白质。
衍生自巨细胞病毒(CMV)的抗原包括CMV结构蛋白、在病毒复制的即刻早期和早期期间表达的病毒抗原、糖蛋白I和III、衣壳蛋白、鞘蛋白、低基质蛋白pp65(ppUL83)、p52(ppUL44)、IE1和1E2(UL123和UL122)、来自UL128-UL150的基因簇的蛋白质产物(Rykman等人，2006)、包膜糖蛋白B(gB)、gH、gN和pp150。如本领域技术人员将理解，用作本文所述的抗原的CMV蛋白质可在公开数据库，例如
Figure BDA0003159474960000341
和
Figure BDA0003159474960000342
中鉴别(参见例如Bennekov等人，2004；Loewendorf等人，2010；Marschall等人，2009)。
预期用于某些实施方案的衍生自Epstein-Ban病毒(EBV)的抗原包括EBV溶解蛋白gp350和gp110、在潜伏周期感染期间产生的EBV蛋白，包括Epstein-Ban核抗原(EBNA)-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-前导蛋白(EBNA-LP)和潜伏膜蛋白(LMP)-1、LMP-2A和LMP-2B(参见例如Lockey等人，2008)。
预期用于本文中的衍生自呼吸道合胞病毒(RSV)的抗原包括由RSV基因组编码的十一种蛋白质，或其抗原性片段中的任一个：NS1、NS2、N(核衣壳蛋白)、M(基质蛋白)SH、G和F(病毒外壳蛋白)、M2(第二基质蛋白)、M2-1(延伸因子)、M2-2(转录调节)、RNA聚合酶和磷蛋白P。
预期使用的衍生自水泡性口炎病毒(VSV)的抗原包括由VSV基因组编码的五种主要蛋白和其抗原性片段中的任一个：大蛋白(L)、糖蛋白(G)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)和基质蛋白(M)(参见例如Rieder等人，1999)。
预期用于某些实施方案的衍生自流感病毒的抗原包括血球凝集素(HA)、神经氨酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白M1和M2、NS1、NS2(NEP)、PA、PB1、PB1-F2和PB2。
示例性病毒抗原还包括但不限于腺病毒多肽、甲病毒多肽、杯状病毒多肽(例如杯状病毒衣壳抗原)、冠状病毒多肽、犬瘟热病毒多肽、埃博拉病毒多肽、肠病毒多肽、黄病毒多肽、肝炎病毒(AE)多肽(B型肝炎核心或表面抗原、C型肝炎病毒E1或E2糖蛋白、核心或非结构蛋白)、疱疹病毒多肽(包括单纯疱疹病毒或水痘带状疱疹病毒糖蛋白)、感染性腹膜炎病毒多肽、白血病病毒多肽、马尔堡病毒多肽、正粘病毒多肽、***瘤病毒多肽、副流感病毒多肽(例如血球凝集素和神经氨酸苷酶多肽)、副粘病毒多肽、细小病毒多肽、瘟病毒多肽、小核糖核酸病毒多肽(例如脊髓灰质炎病毒衣壳多肽)、痘病毒多肽(例如牛痘病毒多肽)、狂犬病病毒多肽(例如狂犬病病毒糖蛋白G)、呼肠孤病毒多肽、反转录病毒多肽和轮状病毒多肽。
在某些实施方案中，抗原可为细菌抗原。在某些实施方案中，感兴趣的细菌抗原可为分泌的多肽。在其他某些实施方案中，细菌抗原包括具有暴露于细菌的外细胞表面上的多肽的一个或多个部分的抗原。
预期使用的衍生自包括抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的葡萄球菌属的抗原包括毒性调节子，例如Agr***、Sar和Sae、Arl***、Sar同系物(Rot、MgrA、SarS、SarR、SarT、SarU、SarV、SarX、SarZ和TcaR)、Srr***和TRAP。可充当抗原的其他葡萄球菌蛋白质包括Clp蛋白质、HtrA、MsrR、顺乌头酸酶、CcpA、SvrA、Msa、CfvA和CfvB(参见例如Staphylococcus:Molecular Genetics,2008 Caister Academic Press,Ed.JodiLindsay)。金黄色葡萄球菌的两个物种(N315和Mu50)的基因组已测序并且公开可用，例如在PATRIC(PATRIC:The VBI PathoSystems Resource Integration Center,Snyder等人，2007)。如本领域技术人员将理解，用作抗原的葡萄球菌蛋白质还可在其他公开数据库例如
Figure BDA0003159474960000363
Figure BDA0003159474960000361
和
Figure BDA0003159474960000362
中鉴别。
预期用于本文所述的某些实施方案的衍生自肺炎链球菌的抗原包括肺炎链球菌溶血素、PspA、胆碱-结合蛋白A(CbpA)、NanA、NanB、SpnHL、PavA、LytA、Pht和菌毛蛋白(RrgA；RrgB；RrgC)。肺炎链球菌的抗原性蛋白质也是本领域中已知的并且可在一些实施方案中用作抗原(参见例如Zysk等人，2000)。肺炎链球菌的毒性菌株的完整基因组序列已测序并且如本领域技术人员应理解的，本文中所用的肺炎链球菌蛋白质还可在其他公开数据库例如
Figure BDA0003159474960000365
Figure BDA0003159474960000366
和
Figure BDA0003159474960000364
中鉴别。用于根据本公开内容的抗原的尤其感兴趣的蛋白质包括预测暴露于肺炎双球菌表面的毒性因子和蛋白质(参见例如Frolet等人，2010)。
可用作抗原的细菌抗原的实例包括但不限于放线菌(Actinomyces)多肽、芽孢杆菌(Bacillus)多肽、拟杆菌(Bacteroides)多肽、鲍特氏菌(Bordetella)多肽、巴尔通体(Bartonella)多肽、疏螺旋体(Borrelia)多肽(例如伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)OspA)、布鲁氏菌(Brucella)多肽、弯曲杆菌(Campylobacter)多肽、嗜二氧化碳噬细胞菌(Capnocytophaga)多肽、衣原体(Chlamydia)多肽、棒状杆菌(Corynebacterium)多肽、柯克斯氏体(Coxiella)多肽、潜蚤(Dermatophilus)多肽、肠球菌(Enterococcus)多肽、埃利希体(Ehrlichia)多肽、艾氏菌(Escherichia)多肽、弗朗西斯氏菌(Francisella)多肽、梭杆菌(Fusobacterium)多肽、血巴通氏体(Haemobartonella)多肽、嗜血杆菌(Haemophilus)多肽(例如b型流感嗜血杆菌外膜蛋白质)、螺旋杆菌(Helicobacter)多肽、克雷伯氏菌(Klebsiella)多肽、L-型细菌多肽、钩端螺旋体(Leptospira)多肽、李斯特菌(Listeria)多肽、分枝杆菌(Mycobacteria)多肽、支原体(Mycoplasma)多肽、奈瑟氏菌(Neisseria)多肽、新立克次体(Neorickettsia)多肽、诺卡氏菌(Nocardia)多肽、巴氏杆菌(Pasteurella)多肽、消化球菌(Peptococcus)多肽、消化链球菌(Peptostreptococcus)多肽、肺炎球菌(Pneumococcus)多肽(即肺炎链球菌(S.pneumoniae)多肽)(参见本文描述)、变形杆菌(Proteus)多肽、假单胞菌(Pseudomonas)多肽、立克次体(Rickettsia)多肽、罗克利马体(Rochalimaea)多肽、沙门氏菌(Salmonella)多肽、志贺菌(Shigella)多肽、葡萄球菌(Staphylococcus)多肽、A组链球菌(Streptococcus)多肽(例如化脓性链球菌(S.pyogenes)M蛋白)、B组链球菌(无乳链球菌(S.agalactiae))多肽、密螺旋体(Treponema)多肽和耶尔森菌(Yersinia)多肽(例如鼠疫耶尔森菌(Y.pestis)F1和V抗原)。
真菌抗原的实例包括但不限于犁头霉(Absidia)多肽、枝顶孢(Acremonium)多肽、交链孢(Alternaria)多肽、曲霉菌(Aspergillus)多肽、蛙粪霉菌(Basidiobolus)多肽、平脐蠕孢(Bipolaris)多肽、芽生菌(Blastomyces)多肽、念珠菌(Candida)多肽、球孢子菌(Coccidioides)多肽、耳霉(Conidiobolus)多肽、隐球菌(Cryptococcus)多肽、弯孢霉(Curvalaria)多肽、表皮癣菌(Epidermophyton)多肽、外瓶霉(Exophiala)多肽、地丝菌(Geotrichum)多肽、组织胞浆菌(Histoplasma)多肽、马杜拉分支菌(Madurella)多肽、马拉色菌(Malassezia)多肽、小孢子菌(Microsporum)多肽、丛梗孢(Moniliella)多肽、被孢霉(Mortierella)多肽、毛霉菌(Mucor)多肽、拟青霉菌(Paecilomyces)多肽、青霉菌(Penicillium)多肽、单胞瓶霉(Phialemonium)多肽、瓶霉(Phialophora)多肽、原壁菌(Prototheca)多肽、假霉样真菌(Pseudallescheria)多肽、假微座孢(Pseudomicrodochium)多肽、腐霉菌(Pythium)多肽、鼻孢子菌(Rhinosporidium)多肽、根霉菌(Rhizopus)多肽、齿梗孢(Scolecobasidium)多肽、孢子丝菌(Sporothrix)多肽、匍柄霉(Stemphylium)多肽、毛癣菌(Trichophyton)多肽、毛孢子菌(Trichosporon)多肽和木丝霉(Xylohypha)多肽。
原生动物寄生虫抗原的实例包括但不限于巴倍虫(Babesia)多肽、肠袋虫(Balantidium)多肽、贝诺虫(Besnoitia)多肽、隐胞子虫(Cryptosporidium)多肽、艾美球虫(Eimeria)多肽、脑胞内原虫(Encephalitozoon)多肽、内阿米巴(Entamoeba)多肽、梨形鞭毛虫(Giardia)多肽、哈蒙德虫(Hammondia)多肽、肝簇虫(Hepatozoon)多肽、等孢子球虫(lsospora)多肽、利什曼原虫(Leishmania)多肽、微孢子虫(Microsporidia)多肽、新孢子虫(Neospora)多肽、小孢子虫(Nosema)多肽、五鞭毛滴虫(Pentatrichomonas)多肽、疟原虫(Plasmodium)多肽。蠕虫寄生虫抗原的实例包括但不限于棘唇线虫(Acanthocheilonema)多肽、猫圆线虫(Aelurostrongylus)多肽、钩虫(Ancylostoma)多肽、血管圆线虫(Angiostrongylus)多肽、蛔虫(Ascaris)多肽、布鲁丝线虫(Brugia)多肽、仰口线虫(Bunostomum)多肽、毛细线虫(Capillaria)多肽、夏氏线虫(Chabertia)多肽、古柏线虫(Cooperia)多肽、环体线虫(Crenosoma)多肽、网尾线虫(Dictyocaulus)多肽、膨结线虫(Dioctophyme)多肽、棘唇线虫(Dipetalonema)多肽、裂头绦虫(Diphyllobothrium)多肽、Diplydium多肽、恶丝虫(Dirofilaria)多肽、龙线虫(Dracunculus)多肽、蛲虫(Enterobius)多肽、类丝虫(Filaroides)多肽、血矛线虫(Haemonchus)多肽、兔唇蛔虫(Lagochilascaris)多肽、罗阿丝虫(Loa)多肽、曼森线虫(Mansonella)多肽、米勒线虫(Muellerius)多肽、侏体吸虫(Nanophyetus)多肽、板口线虫(Necator)多肽、细颈线虫(Nematodirus)多肽、结节线虫(Oesophagostomum)多肽、盘尾丝虫(Onchocerca)多肽、后睾吸虫(Opisthorchis)多肽、奥斯特线虫(Ostertagia)多肽、副丝虫(Parafilaria)多肽、并殖吸虫(Paragonimus)多肽、副蛔虫(Parascaris)多肽、泡翼线虫(Physaloptera)多肽、原圆线虫(Protostrongylus)多肽、腹腔丝虫(Setaria)多肽、旋尾线虫(Spirocerca)多肽、迭宫绦虫(Spirometra)多肽、冠丝虫(Stephanofilaria)多肽、类圆线虫(Strongyloides)多肽、圆线虫(Strongylus)多肽、吸吮线虫(Thelazia)多肽、弓蛔线虫(Toxascaris)多肽、弓蛔虫(Toxocara)多肽、旋毛虫(Trichinella)多肽、毛圆线虫(Trichostrongylus)多肽、鞭虫(Trichuris)多肽、钩虫(Uncinaria)多肽和吴策线虫(Wuchereria)多肽。(例如恶性疟原虫(P.falciparum)环孢子(PfCSP))、孢子体表面蛋白2(PfSSP2)、肝状态抗原l的羧基末端(PfLSAl c-term)和输出蛋白1(PfExp-1)、肺囊虫(Pneumocystis)多肽、肉孢子虫(Sarcocystis)多肽、血吸虫(Schistosoma)多肽、泰累尔梨浆虫(Theileria)多肽、弓形虫(Toxoplasma)多肽和锥虫(Trypanosoma)多肽。
体外寄生虫抗原的实例包括但不限于来自以下的多肽(包括抗原以及过敏原)：跳蚤；蜱，包括硬蜱和软蜱；苍蝇，例如蠓、蚊子、白蛉、黑蝇、马蝇、角蝇、鹿蝇、采采蝇、螫蝇、引起蝇蛆病的蝇和库蠓；蚂蚁；蜘蛛，虱子；螨虫；以及蝽类(true bug)，例如床虱和猎蝽。
E.***基因
本公开内容的经修饰以携带本公开内容所涵盖的载体的细胞可包含一种或多种***基因。如本文所用，术语“***基因”定义为在施用前药或其他试剂时实现基因产物向杀死其宿主细胞的化合物的转变的基因。可使用的***基因/前药组合的实例为单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)和更昔洛韦、阿昔洛韦或FIAU；氧化还原酶和环己酰亚胺；胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酸激酶(Tdk::Tmk)和AZT；和脱氧胞苷激酶和胞嘧啶***糖苷。
可使用大肠杆菌(E.coli)嘌呤核苷磷酸化酶，所谓的***基因，其将前药6-甲基嘌呤脱氧核糖苷转化为有毒嘌呤6-甲基嘌呤。与前药疗法一起使用的***基因的其他实例是大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因和HSV胸苷激酶基因。
示例性***基因包括CD20、CD52、EGFRv3或诱导性半胱天冬酶9。在一个实施方案中，EGFR变体III(EGFRv3)的截短形式可用作可通过西妥昔单抗(Cetuximab)切除的***抗原。可用于本公开内容中的本领域已知的其他***基因包括：嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、细胞色素p450酶(CYP)、羧肽酶(CP)、羧酸酯酶(CE)、硝基还原酶(NTR)、鸟嘌呤核糖基转移酶(XGRTP)、糖苷酶、甲硫氨酸-α,γ-裂解酶(MET)和胸苷磷酸化酶(TP)。在特定实施方案中，利用编码在细胞膜上表达的不可分泌的TNFα蛋白质的突变体TNF-α***基因，从而允许其被抑制剂(例如抗体)靶向，如描述于2018年11月19日申请的美国临时专利申请62/769,405，和2018年11月30日申请的美国临时专利申请62/773,372，和2019年1月11日申请的美国临时专利申请62/791,464中，其均以全文引用的方式并入本文中。
III.免疫细胞
本公开内容的某些实施方案涉及表达一种或多种抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)的免疫细胞。免疫细胞可为任何种类，例如T细胞(例如调节T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或γ-δT细胞)、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、B细胞、干细胞(例如间充质干细胞(MSC)或诱导多能干(iPSC)细胞)。在一些实施方案中，细胞为单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜曙红细胞和/或嗜碱性粒细胞。本文还提供产生和工程改造免疫细胞的方法以及使用和施用细胞的方法，例如用于过继细胞疗法，在此情况下细胞相对于接受者可为自体或同种异体的。因此，免疫细胞可用作免疫疗法，例如以靶向癌细胞。
免疫细胞可从受试者(具体地人类受试者，包括需要治疗的个体)分离。免疫细胞可获自感兴趣的受试者，例如疑似患有特定疾病或病状的受试者、疑似易患特定疾病或病状的受试者、或正针对特定疾病或病状接受治疗的受试者。免疫细胞可从其存在于受试者中的任何位置收集，包括但不限于血液、脐带血、脾、胸腺、***和骨髓。经分离的免疫细胞可直接使用，或其可保存一段时间，例如通过冷冻。
免疫细胞可从其存在的任何组织富集/纯化，包括但不限于血液(包括由血液库或脐带血库收集的血液)、脾、骨髓、在手术程序期间移除和/或暴露的组织和通过活检程序获得的组织。富集、分离和/或纯化免疫细胞的组织/器官可分离自活受试者和非活受试者，其中非活受试者为器官供体。在特定实施方案中，免疫细胞分离自血液，例如外周血或脐带血。在一些方面中，免疫细胞分离自具有增强的免疫调节能力(例如通过CD4阳性或CD8阳性T细胞抑制性来测量)的脐带血。在特定方面中，免疫细胞分离自混合的血液，具体地混合的脐带血，以增强免疫调节能力。混合的血液可来自2个或更多个来源，例如3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个来源(例如，供体受试者)。
免疫细胞群体可获自需要疗法或患有与降低的免疫细胞活性相关的疾病的受试者。因此，细胞可以是所述需要疗法的受试者的自体细胞。可替代地，免疫细胞群体可获自供体，优选为组织兼容性匹配供体。免疫细胞群体可收获自外周血、脐带血、骨髓、脾或所述受试者或供体中有免疫细胞存在的任何其他器官/组织。免疫细胞可分离自一群受试者和/或供体，例如来自混合的脐带血。
当免疫细胞群体获自不同于受试者的供体时，供体优选为同种异体的，其限制条件为获得的细胞为受试者兼容性的，使其可引入至受试者中。同种异体供体细胞可为或可不为人类白血球抗原(HLA)兼容性的。为了与受试者相容，可处理同种异体细胞，以降低免疫原性(Fast等人，2004)。
IV.治疗方法
在一些实施方案中，本公开内容提供用于疗法(包括免疫疗法)的方法，其包括施用有效量的本公开内容所涵盖的免疫细胞，所述免疫细胞经工程改造以表达本文所提供的模块化载体***。在一些实施方案中，医学疾病或病症通过在接受个体中转移引发免疫反应的免疫细胞群体来治疗。在本公开内容的某些实施方案中，癌症或感染通过转移引发免疫反应的免疫细胞群体来治疗。本文提供用于治疗个体的癌症或延缓其进展的方法，其包括向个体施用有效量的抗原特异性细胞疗法(对一种或多种抗原具有特异性)。本公开内容的方法可应用于治疗免疫病症、实体癌症、血液癌症和病毒感染。
在需要治疗的个体患有癌症的情况下，癌症可为血液癌症或可包含实体瘤，本公开内容治疗方法可用于的肿瘤包括任何恶性细胞类型，例如在实体瘤或血液恶性肿瘤中发现的那些。示例性实体瘤可包括但不限于选自以下的器官或组织的肿瘤：胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、***、皮肤、甲状腺、胆囊、脾、肝、骨、子宫内膜、睾丸、子宫颈、食道、***和***。示例性血液肿瘤包括骨髓瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、骨髓瘤等。可以使用本文提供的方法治疗的癌症的其他实例包括但不限于肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、各种类型的头颈癌和黑色素瘤。
癌症具体可以是以下组织学类型，尽管不限于这些：赘生物，恶性；癌；癌，未分化；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；***状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；***状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；组合的肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；支气管肺泡腺癌；***状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；***状和滤泡性腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属物癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；盯聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；***状囊腺癌；***状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；有鳞状上皮化生的腺癌；胸腺瘤，恶性；卵巢间质瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；雄性母细胞瘤，恶性；塞尔托利细胞癌；莱氏细胞肿瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；雀斑样痣恶性黑色素瘤；肢端雀斑黑色素瘤；结节性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；蓝色痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；基质肉瘤；混合性肿瘤，恶性；缪氏混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间质瘤，恶性；布伦纳瘤，恶性；叶状瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺瘤，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西氏肉瘤；血管外皮瘤，恶性；***肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间质软骨肉瘤；骨的巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；霍奇金氏；类肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥散性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥散性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴母细胞性NHL；高级小非裂解细胞NHL；巨大肿块NHL(bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；Waldenstrom巨球蛋白血症；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞性白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞性白血病；骨髓性白血病；嗜碱性粒细胞性白血病；嗜酸性粒细胞性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞性白血病；巨核母细胞性白血病；髓样肉瘤；毛细胞性白血病；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；急性髓细胞性白血病(AML)；和慢性成髓细胞性白血病。
特定实施方案涉及白血病的治疗方法。白血病是血液或骨髓的癌症，其特征在于血细胞通常是白血球(白细胞)的异常增殖(通过繁殖产生)。它是被称为血液肿瘤的广泛疾病的一部分。白血病是涵盖多种疾病的广义术语。白血病在临床和病理上分为急性和慢性两种形式。
在本公开内容的某些实施方案中，免疫细胞递送至有需要的个体，例如患有癌症或感染的个体。随后，细胞增强个体的免疫***以攻击相应癌细胞或病原性细胞。在一些情况下，向个体提供一次或多次剂量的免疫细胞。在向个体提供两次或更多次剂量的免疫细胞的情况下，施用之间的持续时间应足以允许在个体中繁殖的时间，并且在特定实施方案中，剂量之间的持续时间为1、2、3、4、5、6、7天或更多天。
本公开内容的某些实施方案提供治疗或预防免疫调节病症的方法。在一个实施方案中，受试者患有自体免疫疾病。自体免疫疾病的非限制性实例包括：斑秃，强直性脊柱炎，抗磷脂综合征，自身免疫性Addison病，肾上腺的自身免疫性疾病，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性肝炎，自身免疫性***和***，自身免疫性血小板减少症，***，大疱性类天疱疮，心肌病，乳糜泻性皮炎(celiac spate-dermatitis)，慢性疲劳免疫功能障碍综合症(CFIDS)，慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病，Churg-Strauss综合征，瘢痕性类天疱疮，CREST综合征，冷凝集素病，克罗恩病，盘状狼疮，原发性混合性冷球蛋白血症，纤维肌痛-纤维肌炎，肾小球肾炎，格雷夫斯病，格林-巴利，桥本氏甲状腺炎，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，IgA神经病，青少年关节炎，扁平苔藓，红斑性狼疮，美尼尔病，混合性***病，多发性硬化，1型或免疫介导的糖尿病，重症肌无力，肾病综合征(例如微小病变，局灶性肾小球硬化或膜性肾病)，寻常型天疱疮，恶性贫血，结节性多动脉炎，多发性软骨炎，多腺综合征，风湿性多发性肌痛，多发性肌炎和皮肌炎，原发性无丙种球蛋白血症，原发性胆汁性肝硬化，银屑病，银屑病关节炎，雷诺现象，雷特综合症，类风湿性关节炎，结节病，硬皮病，干燥综合征，僵硬综合症，***性红斑狼疮，红斑狼疮，溃疡性结肠炎，葡萄膜炎，血管炎(例如结节性多动脉炎，大动脉炎，颞动脉炎/巨细胞性动脉炎或疱疹样皮炎性血管炎)，白癜风和韦格纳肉芽肿病。因此，可以使用本文公开的方法治疗的自身免疫性疾病的一些实例包括但不限于多发性硬化症，类风湿性关节炎，***性红斑狼疮，I型糖尿病，克罗恩氏病；溃疡性结肠炎，重症肌无力，肾小球肾炎，强直性脊柱炎，血管炎或银屑病。受试者还可以患有过敏性疾病，例如哮喘。
在另一个实施方案中，受试者是移植的器官或干细胞的接受者，并且免疫细胞用于预防和/或治疗排斥。在特定的实施方案中，受试者患有移植物抗宿主疾病或有发展移植物抗宿主疾病的风险。GVHD是使用或包含来自相关或不相关供体的干细胞的任何移植的可能的并发症。GVHD有两种，急性的和慢性的。急性GVHD出现在移植后的前三个月内。急性GVHD的特征包括手和脚上出现可能扩散并变得更严重的微红色的皮疹，并且具有皮肤剥落或起泡。急性GVHD还可影响胃和肠，在这种情况下会出现痉挛、恶心和腹泻。皮肤和眼睛发黄(黄疸)表明急性GVHD影响了肝脏。慢性GVHD根据其严重程度进行分级：阶段/等级1是轻微的；阶段/等级4是严重的。慢性GVHD在移植后三个月或之后发展。慢性GVHD的症状与急性GVHD的症状相似，但此外，慢性GVHD还可能影响眼睛中的粘液腺、口腔中的唾液腺以及润滑胃粘膜和肠道的腺体。可以利用本文公开的任何免疫细胞的群体。移植器官的实例包括实体器官移植物，例如肾脏、肝脏、皮肤、胰腺、肺和/或心脏，或细胞移植物，例如胰岛、肝细胞、成肌细胞、骨髓或造血或其他干细胞。移植物可以是复合移植物，例如面部的组织。免疫细胞可以在移植之前、与移植同时或在移植之后施用。在一些实施方案中，免疫细胞在移植前施用，例如在移植前至少1小时，至少12小时，至少1天，至少2天，至少3天，至少4天，至少5天，至少6天，至少1周，至少2周，至少3周，至少4周或至少1个月施用。在一个具体的非限制性实例中，治疗有效量的免疫细胞的施用在移植前3-5天进行。
在一些实施方案中，可以在免疫细胞疗法之前向受试者施用非清髓性淋巴清除化疗(nonmyeloablative lymphodepleting chemotherapy)。非清髓性淋巴清除化疗可以是任何合适的此类疗法，其可以通过任何合适的途径进行施用。非清髓性淋巴清除化疗可包括，例如，施用环磷酰胺和氟达拉滨，特别是如果癌症是黑色素瘤(其可以是转移性的)时。施用环磷酰胺和氟达拉滨的示例性途径是静脉内。同样，可以施用任何合适剂量的环磷酰胺和氟达拉滨。在特定方面，施用约60mg/kg的环磷酰胺两天，此后施用约25mg/m2的氟达拉滨五天。
在某些实施方案中，将促进免疫细胞的生长和活化的生长因子与免疫细胞同时或在免疫细胞后施用至受试者。免疫细胞生长因子可以是促进免疫细胞的生长和活化的任何合适的生长因子。合适的免疫细胞生长因子的实例包括白介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12，它们可以单独使用或以多种组合(例如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7，IL-12和IL-15或IL-12和IL2)使用。
治疗有效量的免疫细胞可以通过多种途径施用，包括肠胃外施用，例如静脉内、腹膜内、肌内、胸骨内或关节内注射或输注。
用于过继细胞疗法的免疫细胞的治疗有效量是在被治疗的受试者中达到期望效果的量。例如，这可以是抑制进展或引起自身免疫或同种免疫疾病的消退所必需的或能够缓解由自身免疫疾病引起的症状(例如疼痛和炎症)的免疫细胞的量。它可能是缓解与炎症相关的症状(例如疼痛、水肿和体温升高)所必需的量。它也可以是减少或防止移植的器官的排斥所必需的量。
可以以与用于疾病相一致的治疗方案施用免疫细胞群体，例如在一到几天内单次或几次剂量以改善疾病状态或在延长的时间内的定期剂量以抑制疾病进展并预防疾病复发。制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径以及疾病或病症的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。免疫细胞的治疗有效量将取决于所治疗的受试者、病痛的严重程度和类型以及施用方式。在一些实施方案中，可用于治疗人受试者的剂量范围为至少3.8×104、至少3.8×105、至少3.8×106、至少3.8×107、至少3.8×108、至少3.8×109、或至少3.8×1010个免疫细胞/m2。在某些实施方案中，用于治疗人受试者的剂量范围为约3.8×109至约3.8×1010个免疫细胞/m2。在另外的实施方案中，免疫细胞的治疗有效量可以为约5×106个细胞/kg体重至约7.5×108个细胞/kg体重,例如约2×107个细胞至约5×108个细胞/kg体重,或约5×107个细胞至约2×108个细胞/kg体重。免疫细胞的确切数量由本领域技术人员根据受试者的年龄、体重、性别和生理状况来容易地确定。可以从由体外或动物模型测试***得出的剂量反应曲线推断有效剂量。
免疫细胞可以与一种或多种其他治疗剂组合施用以治疗免疫介导的病症。组合疗法可包括但不限于一种或多种抗微生物剂(例如抗生素，抗病毒剂和抗真菌剂)，抗肿瘤剂(例如氟尿嘧啶，甲氨蝶呤，紫杉醇，氟达拉滨，依托泊苷，阿霉素或长春新碱)，免疫消耗剂(例如氟达拉滨，依托泊苷，阿霉素或长春新碱)，免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤或糖皮质激素，例如***或***)，抗炎剂(例如，糖皮质激素，例如氢化可的松、***或***，或非甾体抗炎剂，例如乙酰水杨酸、布洛芬或萘普生钠)，细胞因子(例如白介素10或转化生长因子-β)，激素(例如***)或疫苗。另外，可以施用免疫抑制剂或致耐受剂，包括但不限于钙调神经磷酸酶抑制剂(例如环孢菌素和他克莫司)；mTOR抑制剂(例如雷帕霉素)；霉酚酸酯，抗体(例如识别CD3、CD4、CD40、CD154、CD45、IVIG或B细胞)；化疗剂(例如甲氨蝶呤，苏消安，白消安)；辐照；或趋化因子，白介素或其抑制剂(例如BAFF，IL-2，抗IL-2R，IL-4，JAK激酶抑制剂)。取决于所需的效果，可以在施用免疫细胞之前、期间或之后施用此类另外的药剂。细胞和试剂的这种施用可以通过相同的途径或通过不同的途径，并且可以在相同的部位或在不同的部位。
A.药物组合物
本文还提供包含免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)和药学上可接受的载体的药物组合物和制剂。
本文所述的药物组合物和制剂可通过将具有所需纯度的活性成分(例如细胞)与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences第22版，2012)混合来制备，其呈冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的载体通常在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯(alkyl paraben)，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；盐形成抗衡离子(counter-ion)，例如钠；金属配合物(例如锌蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0003159474960000491
BaxterInternational，Inc.)。某些示例性sHASEGP(包括rHuPH20)和使用方法描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。一方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
B.组合疗法
在某些实施方案中，本实施方案的组合物和方法涉及与至少一种另外的疗法组合的免疫细胞群。另外的疗法可以是放射疗法、手术(例如，肿块切除术和***切除术)、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述的组合。另外的疗法可以是辅助治疗或新辅助疗法的形式。
在一些实施方案中，另外的疗法是小分子酶抑制剂或抗转移剂的施用。在一些实施方案中，另外的疗法是副作用限制剂(例如，旨在减少治疗的副作用的发生和/或严重性的药剂，例如抗恶心剂等)的施用。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，另外的疗法是手术。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，另外的疗法是γ辐照。在一些实施方案中，另外的疗法是靶向PBK/AKT/mTOR途径疗法、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、细胞凋亡抑制剂和/或化学预防剂。另外的疗法可以是本领域已知的一种或多种化学治疗剂。
可以相对于另外的癌症疗法(例如免疫检查点疗法)在之前、期间、之后或以各种组合施用免疫细胞疗法。施用间隔可以从同时至数分钟至数天至数周。在其中免疫细胞疗法与另外的治疗剂分开地提供给患者的实施方案中，通常将确保在每次递送的时间之间没有显著的时间段到期，使得两种化合物将仍然能够发挥对患者有利的联合作用。在这样的情况下，预期可以在彼此约12至24或72小时内，更具体地在彼此约6-12小时内为患者提供抗体疗法和抗癌疗法。在某些情况下，可能期望将治疗时间显著延长，其中在各自施用之间流逝几天(2、3、4、5、6或7天)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
可以采用各种组合。对于下面的实例，免疫细胞疗法为“A”，和抗癌疗法为“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
考虑到试剂的毒性(如果有的话)，本实施方案的任何化合物或疗法向患者的施用将遵循用于施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测归因于组合疗法的毒性的步骤。
1.化学疗法
根据本发明的实施方案可以使用多种化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物治疗癌症。“化学治疗剂”用于意指在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些试剂或药物通过其在细胞内的活性模式分类，例如其是否并且在哪一阶段影响细胞周期。或者，试剂可基于其直接交联DNA、***DNA中或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝***失常的能力表征。
化学治疗剂的实例包括烷基化剂，例如噻替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯，诸如白消安，英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，诸如苯并多巴，卡波醌，米特多巴和尤利多巴；乙烯亚胺和甲基三聚氧胺，包括六甲蜜胺，三乙三聚氰胺，三乙磷酰胺，三乙硫代磷酰胺和三甲基三聚氰胺；多聚乙酰(特别是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓朴替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新，卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；海兔素；多卡霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；水鬼蕉碱；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥，诸如苯丁酸氮芥，双氯乙基-β-萘胺，氯磷酰胺，雌氮芥，异环磷酰胺，甲氮芥，盐酸甲氧氮芥，美法仑，新恩比兴，胆甾醇苯乙酸氮芥，松龙氮芥，曲磷胺，和尿嘧啶氮芥；亚硝基尿素，诸如卡莫司汀，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，特别是卡奇霉素γII和卡奇霉素ωII)；达米辛，包括达米辛A；双膦酸盐，诸如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔类抗生素生色团，aclacinomysin，放线菌素，安曲霉素，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C，卡拉比辛，洋红霉素，嗜癌菌素，色霉素，放线菌素D，道诺霉素，地托比星，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，多柔比星(包括吗啉基-多柔比星，氰基吗啉基-多柔比星，2-吡咯啉基-多柔比星，和脱氧多柔比星)，表柔比星，伊达比星，去甲氧正定霉素，麻西罗霉素，丝裂霉素例如丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，培洛霉素，potfiromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑菌素，链唑霉素，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，和佐柔比星；抗代谢物例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸，蝶酰三谷氨酸，和三甲曲沙；嘌呤类似物例如氟达拉滨，6-巯嘌呤，硫咪嘌呤，和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如环胞苷，阿扎胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，和氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮，丙酸甲雄烷酮，表硫雄醇，美雄烷，和睾内脂；抗肾上腺，例如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；bisantrene；依达曲沙；得弗伐胺；地美可辛；地斯可纳；elfornithine；elliptinium acetate；埃博霉素；乙环氧定；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；美登素，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基肼；甲基苄肼；PSK多糖复合物；丙亚胺；根霉素；西佐糖；螺锗；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素，疣孢菌素(verracurin)A，杆孢菌素A和蛇行菌素)；乌拉坦；长春地辛；氮烯唑胺；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；溴丙哌嗪；gacytosine；阿糖胞苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；硫替派；紫杉烷，例如紫杉醇和多西他赛吉西他滨(docetaxel gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位复合物例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；能灭瘤(novantrone)；鬼臼噻吩甙；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊利替康(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；difluorometlhylornithine(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨；卡铂，丙卡巴嗪，plicomycin，吉西他滨，那韦尔滨，法呢基蛋白转移酶抑制剂，反式铂(transplatinum)和上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
2.放射疗法
引起DNA损伤并已被广泛使用的其他因素包括通常已知的γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。也可以考虑其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束辐照(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV辐照。最有可能的是所有这些因素影响对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的装配和维持的广泛损害。X射线的剂量范围从长时间(3-4周)的50至200伦琴的每日剂量到2000至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围广泛变化，并且取决于同位素的半衰期、所发射的辐照的强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。
3.免疫疗法
本领域技术人员将理解，另外的免疫疗法可以与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依靠使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗
Figure BDA0003159474960000531
是这样的实例。免疫效应子可以是例如对肿瘤细胞表面上的某些标记物具有特异性的抗体。单独的抗体可以充当疗法的效应子，或者它可以募集其他细胞来实际影响细胞杀伤。抗体也可以与药物或毒素(化疗剂，放射性核素，蓖麻毒蛋白A链，霍乱毒素，百日咳毒素等)缀合，并用作靶向剂。可替代地，效应子可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
抗体-药物缀合物已作为癌症治疗剂的开发的突破性方法出现。癌症是世界上死亡主要原因中的一个。抗体-药物缀合物(ADC)包含与杀细胞药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。这种方法将单克隆抗体针对其抗原靶标的高特异性与高效的细胞毒性药物结合在一起，从而产生了“经武装的”单克隆抗体，其可将有效载荷(药物)递送至具有丰富抗原水平的肿瘤细胞。药物的靶向递送还将其在正常组织中的暴露降至最低，从而降低了毒性并改善了治疗指数。FDA对两种ADC药物，2011年的
Figure BDA0003159474960000533
(本妥昔单抗(brentuximab vedotin))和2013年的
Figure BDA0003159474960000532
(曲妥珠单抗(trastuzumabemtansine)或T-DM1)的批准证实该方法。当前在癌症治疗的临床试验的各种阶段存在超过30种ADC候选药物(Leal等人，2014)。随着抗体工程改造和接头-有效负载优化变得越来越成熟，新型ADC的发现和发展越来越取决于合适于此方法的新型靶标的鉴别和验证和靶向MAb的产生。ADC靶标的两个标准是肿瘤细胞中的上调/高水平的表达和鲁棒的内在化。
在免疫疗法的一方面，肿瘤细胞必须带有一些易于靶向的标记物物，即其在大多数其他细胞上不存在。存在许多肿瘤标记物，并且在本发明的实施方案的背景下，这些肿瘤标记物中的任何一种都可能适于靶向。常见的肿瘤标记物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化的路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erbB和p155。免疫疗法的可替代的方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相结合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN、趋化因子、例如MIP-1、MCP-1、IL-8和生长因子，例如FLT3配体。
当前在研究中或在使用中的免疫疗法的实例为免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等人，1998)；细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；和单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander，2012；Hanibuchi等人，1998；美国专利5,824,311)。预期可以将一种或多种抗癌疗法与本文所述的抗体疗法一起使用。
在一些实施方案中，免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点调高信号(例如共刺激分子)或调低信号。可能被免疫检查点阻滞靶向的抑制性免疫检查点包括腺苷A2A受体(A2AR)，B7-H3(也称为CD276)，B和T淋巴细胞弱化剂(BTLA)，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)，淋巴细胞激活基因3(LAG3)，程序性死亡1(PD-1)，T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞激活的V-结构域Ig抑制剂(VISTA)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子，配体或受体的重组形式，或者特别是抗体，例如人抗体(例如国际专利公开WO2015016718；Pardoll，Nat Rev Cancer，12(4):252-64，2012；均以引用的方式并入本文中)。可以使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别是可以使用抗体的嵌合、人源化或人形式。如技术人员将知道的，替代和/或等效名称可以用于本公开内容中提及的某些抗体。在本公开内容的上下文中，这样的替代和/或等效名称是可互换的。例如，已知lambrolizumab也已知为替代和等效名称MK-3475和派姆单抗(pembrolizumab)。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合伴侣结合的分子。在一个具体方面，PD-1配体结合伴侣是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合伴侣结合的分子。在特定方面，PDL1结合伴侣是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合伴侣结合的分子。在一个具体方面，PDL2结合伴侣是PD-1。拮抗剂可以是抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利号US8735553、US8354509和US8008449中，其均以引用的方式并入本文中。用于本文所提供的方法的其他PD-1轴拮抗剂是本领域中已知的，例如描述于美国专利申请号US20140294898、US2014022021和US20110008369中，所有文献均以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自纳武单抗、派姆单抗和CT-011。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗(也称为MDX-1106-04，MDX-1106，ONO-4538，BMS-936558和
Figure BDA0003159474960000551
)是WO2006/121168中所描述的抗PD-1抗体。派姆单抗(也称为MK-3475，Merck3475，lambrolizumab，
Figure BDA0003159474960000561
和SCH-900475)是WO2009/114335中所描述的抗PD-1抗体。CT-011(也称为hBAT或hBAT-1)是WO2009/101611中所描述的抗PD-1抗体。AMP-224(也称为B7-DCIg)是WO2010/027827和WO2011/066342中所描述的PDL2-Fc融合可溶受体。
可以在本文提供的方法中靶向的另一个免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列的Genbank登录号为L15006。CTLA-4发现于T细胞的表面，并当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时，充当“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助T细胞的表面表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28相似，并且两种分子均与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(分别也称为B7-1和B7-2)结合。CTLA4将抑制信号传递给T细胞，而CD28传递刺激信号。细胞内CTLA4也存在于调节性T细胞中，并且可能对它们的功能很重要。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化导致CTLA-4(B7分子的抑制受体)的表达增加。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。
适用于本发明方法的抗人-CTLA-4抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域众所周知的方法产生。可替代地，可以使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，以下中所公开的抗CTLA-4抗体可用于本文所公开的方法：US 8,119,129,WO 01/14424,WO98/42752；WO 00/37504(CP675,206，也称为曲美单抗(tremelimumab)；以前称为替西单抗(ticilimumab))、美国专利号6,207,156；Hurwitz等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(17):10067-10071；Camacho等人(2004)J Clin Oncology 22(145):Abstract No.2505(antibody CP-675206)；和Mokyr等人(1998)Cancer Res58:5301-5304。前述出版物中的每一个的教导内容以引用的方式并入本文中。还可使用与这些本领域中公认的抗体中的任一个竞争结合CTLA-4的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请号WO2001014424、WO2000037504和美国专利号8,017,114中；所有文献均以引用的方式并入本文中。
示例性的抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也称为10D1，MDX-010，MDX-101和
Figure BDA0003159474960000571
)或其抗原结合片段和变体(参见例如WO 01/14424)。在其他实施方案中，抗体包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抗体包含伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体竞争结合CTLA-4上的相同表位和/或结合至CTLA-4上的相同表位。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。
用于调节CTLA-4的其他分子包括诸如描述于美国专利号US5844905、US5885796和国际专利申请号WO1995001994和WO1998042752中的CTLA-4配体和受体；所有文献均以引用的方式并入本文中，以及例如描述于美国专利号US8329867中的免疫粘附素，其以引用的方式并入本文中。
4.手术
大约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，包括预防性、诊断或分期性、治愈性和姑息手术。治愈性手术包括切除(其中全部或部分癌组织被物理移除、切除和/或破坏)，并且可以与其他疗法(例如本实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法)结合使用。肿瘤切除术是指肿瘤的至少一部分的物理移除。除肿瘤切除术外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制手术(莫氏手术)。
在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成空腔。通过灌注、直接注射或向该区域局部施用另外的抗癌疗法，可以实现治疗。例如，可以每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复这种治疗。这些治疗也可以具有不同的剂量。
5.其他试剂
预期可以将其他药剂与本实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的疗效。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体的上调和GAP连接的药剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其他生物药剂。通过增加GAP连接数增加细胞间信号传导将增加对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可以与本实施方案的某些方面结合使用以改善治疗的抗过度增殖功效。预期细胞粘附的抑制剂可改善本发明实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步预期增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他试剂(例如抗体c225)可与本公开内容实施方案的某些方面组合使用以改善治疗功效。
V.制品或试剂盒
本文还提供了包含免疫细胞的制品或试剂盒。制品或试剂盒可进一步包括包装插页，该包装插页包含用于使用免疫细胞以治疗或延迟个体中癌症的进展或增强患有癌症的个体的免疫功能的说明。本文所述的任何抗原特异性免疫细胞可包括在制品或试剂盒中。合适的容器包括例如瓶子、小药瓶、袋子和注射器。容器可以由多种材料(例如玻璃、塑料(例如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(例如不锈钢或哈氏合金))形成。在一些实施方案中，容器容纳制剂，并且在容器上或与容器相关的标签可以指示使用说明。制品或试剂盒还可以包括从商业和用户角度出发期望的其他材料，包括其他缓冲液，稀释剂，过滤器，针头，注射器和带有使用说明的包装插页。在一些实施方案中，制品还包括一种或多种其他药剂(例如化学治疗剂和抗肿瘤剂)。用于一种或多种药剂的合适容器包括例如瓶子、小药瓶、袋子和注射器。
实施例
包括以下实施例以证明本公开内容的特定实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本公开内容的方法的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成其实践的特定方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，可以在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下在所公开的特定实施方案中进行许多改变，并且仍可获得类似或相似的结果。
实施例1-模块化载体***
载体以γ-反转录病毒转移载体形式产生。反转录病毒转移载体pSFG4具有基于pUC19质粒的主链(HindIII与EcoRI限制酶位点之间的大片段[2.63kb])，其携带来自莫罗尼鼠白血病病毒(MoMLV)的病毒组分，包括5’LTR、psi包装序列和3’LTR。LTR为发现于反转录病毒原病毒的任一侧上的长末端重复，并且在转移载体的情况下，囊括感兴趣的基因负荷，例如CAR和相关基因组分。psi包装序列(其为通过核衣壳包装的靶位点)也以顺式并入，包夹在5’LTR与CAR编码序列之间。因此，pSFG4转移载体的基本结构可如此概述：pUC19序列-5’LTR-psi包装序列-感兴趣的基因负荷-3’LTR-pUC19序列。
示例性载体描绘于图2和图3中。在图3中，载体DNA为环状并且依据惯例，位置1(环顶部12点钟位置处，序列的其余部分在顺时针方向上)设定在5’LTR的起始处。
鉴于本公开内容，可以在不进行过度实验的情况下进行和执行本文公开和要求保护的所有方法。尽管已经根据优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员而言明显的是，可以在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下对所述方法以及本文描述的方法的步骤或步骤顺序进行变化。更具体地，将明显的是，化学和生理相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，而同时将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这些类似的替代和修改都被认为落入所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念之内。
参考资料
就提供示例性的程序或补充本文所示的内容的其他细节的程度，以下参考文献通过应用明确并入本文。
美国专利5,844,905
美国专利5,885,796
美国专利6,207,156
美国专利6,410,319
美国专利6,451,995
美国专利7,070,995
美国专利7,109,304
美国专利7,265,209
美国专利7,354,762
美国专利7,446,179
美国专利7,446,190
美国专利7,446,191
美国专利8,324,353
美国专利8,329,867
美国专利8,354,509
美国专利8,479,118
美国专利8,735,553
美国专利8,008,449
美国专利8,017,114
美国专利8,119,129
美国专利8,252,592
美国专利8,339,645
美国专利8,398,282
美国专利申请US2002131960
美国专利申请US20110008369
美国专利申请US2013287748
美国专利申请US20130149337
美国专利申请US20140294898
美国专利申请US2014022021
WO1995001994
WO1998042752
WO199842752
WO2001014424
WO2000037504
WO200014257
WO200037504
WO200114424
WO2012129514
WO2013126726
WO2013166321
WO2013071154
WO2013123061
WO2014055668
WO2014031687
EP专利申请EP2537416
Ausubel等人,1996,(eds.)Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons Inc
Camacho等人(2004)J Clin Oncology 22(145):Abstract No.2505
Cohen等人(2005)J Immunol.175(9):5799–5808
Chothia等人(1988)EMBO J.7(12):3745-55
Davila等人(2013)Hematol Oncol Clin North Am.27(2):341-53
Fedorov等人(2013)Science Translational Medicine,Vol.5,Issue 215,pp.215ra172
Hurwitz等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(17):10067-10071
Jores等人(1990)Proc Natl Acad Sci U S A.87(23):9138-42
Lefranc等人(2003)Dev Comp Immunol.27(1):55-77
Li等人(2005)Nature Biotechnology volume 23,pages 349–354
Lockey等人(2008)Front Biosci.1；13:5916-27
Mokyr等人(1998)Cancer Res 58:5301-5304
Parkhurst等人(2009)Clin Cancer Res.15(1):169-80
Sadelain等人(2013)Cancer Discov.3(4):388-98
Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1st ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press
Singh等人(2008)Cancer Res.；68(8):2961-71
Singh等人(2011)Cancer Res.15；71(10):3516-27
Turtle等人(2012)Curr Opin Immunol.24(5):633-9.
Varela-Rohena等人(2008)Immunol Res.42(1-3):166-81.
Wu等人(2012)Cancer J.18(2):160-75。
序列表
<110> 得克萨斯大学体系董事会
<120> 用于CAR和TCR转导的模块化多顺反子载体
<130> UTFC.P1152WO
<140>
<141>
<150> 62/791,491
<151> 2019-01-11
<150> 62/773,394
<151> 2018-11-30
<150> 62/769,414
<151> 2018-11-19
<160> 5
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的说明：合成肽"
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(3)
<223> /注释="此区域可或可不存在"
<400> 1
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的说明：合成肽"
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(3)
<223> /注释="此区域可或可不存在"
<400> 2
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的说明：合成肽"
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(3)
<223> /注释="此区域可或可不存在"
<400> 3
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的说明：合成肽"
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(3)
<223> /注释="此区域可或可不存在"
<400> 4
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /注释="未知的说明：2A 保守序列"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任意氨基酸
<400> 5
Gly Asp Val Glu Xaa Asn Pro Gly Pro
1 5

Claims (64)

1.多顺反子载体，其包含各自由一个或多个限制酶位点侧接的至少三个顺反子，其中至少一个顺反子编码至少一种抗原受体。
2.权利要求1的载体，其中所述顺反子中的两个、三个、四个或更多个能够翻译为单一多肽并且所述多肽可裂解为分离的多肽。
3.权利要求2的载体，其中所述顺反子中的四个能够翻译为单一多肽并且能够裂解为分离的多肽。
4.权利要求1至3中任一项的载体，其中所述载体上的相邻顺反子通过2A自裂解位点分离。
5.权利要求1的载体，其中所述顺反子中的每一个被配置为从所述载体表达分离的多肽。
6.权利要求5的载体，其中所述载体上的相邻顺反子通过IRES元件分离。
7.权利要求1至6中任一项的载体，其中所述载体上的至少一个顺反子包含两个或更多个模块化组分，其中顺反子内的所述模块化组分中的每一个由一个或多个限制酶位点侧接。
8.权利要求7的载体，其中顺反子包含三个、四个或五个模块化组分。
9.权利要求7或8的载体，其中顺反子编码具有由相应模块化组分编码的受体的不同部分的抗原受体。
10.权利要求9的载体，其中顺反子的第一模块化组分编码所述受体的抗原结合结构域。
11.权利要求9或10的载体，其中顺反子的第二模块化组分编码所述受体的铰链区。
12.权利要求9、10或11的载体，其中顺反子的第三模块化组分编码所述受体的跨膜结构域。
13.权利要求9至12中任一项的载体，其中顺反子的第四模块化组分编码第一共刺激结构域。
14.权利要求9至13中任一项的载体，其中顺反子的第五模块化组分编码第二共刺激结构域。
15.权利要求9至14中任一项的载体，其中顺反子的第六模块化组分编码信号传导结构域。
16.权利要求1至15中任一项的载体，其中所述载体上的两个不同顺反子各自编码抗原受体。
17.权利要求16的载体，其中两种抗原受体均由包含两个或更多个模块化组分的顺反子编码。
18.权利要求1至17中任一项的载体，其中所述抗原受体为嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)。
19.权利要求1至17中任一项的载体，其中所述载体为病毒载体或非病毒载体。
20.权利要求19的载体，其中所述病毒载体为反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
21.权利要求1至20中任一项的载体，其中所述载体包含莫罗尼鼠白血病病毒(MMLV)5’LTR、3’LTR和psi包装元件。
22.权利要求21的载体，其中所述psi包装并入于5’LTR与抗原受体编码序列之间。
23.权利要求1至22中任一项的载体，其中所述载体包含pUC19序列。
24.权利要求1至23中任一项的载体，其中至少一个顺反子编码细胞因子、趋化因子、细胞因子受体和/或归巢受体。
25.权利要求24的载体，其中所述细胞因子为白介素15(IL-15)、IL-7、IL-12、IL-21、IL-18或IL-2。
26.权利要求4的载体，其中2A裂解位点包含P2A、T2A、E2A和/或F2A位点。
27.权利要求1至26中任一项的载体，其中顺反子包含***基因。
28.权利要求1至27中任一项的载体，其中顺反子编码报告基因产物。
29.权利要求1至28中任一项的载体，其中第一顺反子编码***基因，第二顺反子编码抗原受体，第三顺反子编码报告基因产物，并且第四顺反子编码细胞因子。
30.权利要求29的载体，其中所述抗原受体的不同部分由相应模块化组分编码，并且其中所述第二顺反子的第一组分编码抗原结合结构域，第二组分编码铰链和/或跨膜结构域，第三组分编码共刺激结构域，并且第四组分编码信号传导结构域。
31.免疫细胞，其包含权利要求1至30中任一项的载体。
32.权利要求31的免疫细胞，其中所述免疫细胞为T细胞、外周血淋巴细胞、B细胞、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、iNKT细胞、巨噬细胞、干细胞或其混合物。
33.权利要求32的免疫细胞，其中所述干细胞为间充质干细胞(MSC)或诱导多能干(iPS)细胞。
34.权利要求31的免疫细胞，其中所述免疫细胞衍生自iPS细胞。
35.权利要求31的免疫细胞，其中所述T细胞为CD8+T细胞、CD4+T细胞或γ-δT细胞。
36.权利要求32或35的免疫细胞，其中所述T细胞为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
37.权利要求31至36中任一项的免疫细胞，其中所述免疫细胞相对于个体是同种异体的。
38.权利要求31至36中任一项的免疫细胞，其中所述免疫细胞相对于个体是自体的。
39.权利要求31至38中任一项的免疫细胞，其中所述免疫细胞为人类细胞。
40.权利要求31至39中任一项的免疫细胞，其中所述免疫细胞衍生自脐带血、外周血、骨髓、CD34+细胞或iPSC。
41.权利要求40的免疫细胞，其中所述免疫细胞衍生自脐带血。
42.权利要求31至41中任一项的免疫细胞，其中所述免疫细胞包含在细胞群体中。
43.权利要求31至42中任一项的免疫细胞，其中所述免疫细胞包含在药学上可接受的载体中。
44.产生扩增免疫细胞的方法，其包括：
(a)获得免疫细胞的起始群体；
(b)在人工呈递细胞(APC)的存在下培养所述免疫细胞的起始群体；
(c)将权利要求1至30中任一项的载体引入所述免疫细胞中；和
(d)在APC的存在下扩增所述免疫细胞，由此获得扩增的免疫细胞。
45.权利要求44的方法，其中所述免疫细胞的起始群体通过使用ficoll-paque密度梯度分离单核细胞来获得。
46.权利要求44或45的方法，其中所述APC为经γ辐射的APC。
47.权利要求44的方法，其进一步包含冷冻保存所述扩增的免疫细胞的群体。
48.药物组合物，其包含权利要求31至43中任一项的免疫细胞群体和药学上可接受的载体。
49.包含有效量的权利要求31至43中任一项的免疫细胞的组合物，其用于治疗个体的疾病或病症。
50.权利要求49的组合物，其中所述疾病为癌症或所述病症为免疫相关病症。
51.包含有效量的权利要求31至43中任一项的免疫细胞的组合物的用途，其用于治疗个体的癌症或免疫相关病症。
52.治疗个体的疾病或病症的方法，其包括向所述个体施用有效量的权利要求31至43中任一项的免疫细胞。
53.权利要求52的方法，其中所述疾病或病症为癌症、自体免疫病症、移植物抗宿主疾病、同种异体移植排斥反应或炎性病状。
54.权利要求53的方法，其中所述自体免疫病症为炎性病状并且所述免疫细胞基本上不表达糖皮质激素受体。
55.权利要求54的方法，其中对所述受试者已施用或正施用类固醇疗法。
56.权利要求52至55中任一项的方法，其中所述免疫细胞相对于所述个体为自体的。
57.权利要求52至55中任一项的方法，其中所述免疫细胞相对于所述个体为同种异体的。
58.权利要求52、53、56或57中任一项的方法，其中所述疾病为癌症。
59.权利要求58的方法，其中所述癌症为实体癌症或血液恶性肿瘤。
60.权利要求59的方法，其进一步包括向所述个体施用至少第二治疗剂。
61.权利要求60的方法，其中所述第二治疗剂包含化学疗法、免疫疗法、手术、放射疗法或生物疗法。
62.权利要求52至61中任一项的方法，其中所述免疫细胞是经静脉内、腹膜内、气管内、瘤内、肌肉内、内视镜、病灶内、经皮、皮下、局部、通过输注或通过直接注射向所述个体施用。
63.权利要求61或62的方法，其中所述第二治疗剂是经静脉内、腹膜内、气管内、瘤内、肌肉内、内视镜、病灶内、经皮、皮下、局部、通过输注或通过直接注射向所述个体施用。
64.一种多顺反子载体，其包含各自由一个或多个限制酶位点侧接的至少四个顺反子，其中所述载体上至少一个顺反子包含两个或更多个模块化组分，其中顺反子内的所述模块化组分中的每一个由一个或多个限制酶位点侧接。
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US62/791,491 2019-01-11
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022183167A1 (en) * 2021-02-25 2022-09-01 Alaunos Therapeutics, Inc. Recombinant vectors comprising polycistronic expression cassettes and methods of use thereof
KR20240046833A (ko) * 2021-07-16 2024-04-09 사나 바이오테크놀로지, 인크. 세포 기반 요법을 위한 다시스트론성 벡터

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003064665A2 (en) * 2002-02-01 2003-08-07 Oxford Biomedica (Uk) Limited Viral vector
CN101016543A (zh) * 2000-11-17 2007-08-15 罗切斯特大学 筛选编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的多核苷酸的方法
US20130071414A1 (en) * 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
CN106163547A (zh) * 2014-03-15 2016-11-23 诺华股份有限公司 使用嵌合抗原受体治疗癌症
WO2016197108A1 (en) * 2015-06-05 2016-12-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treatment with natural killer cells matched for killer immunoglobulin receptor type
CN107208099A (zh) * 2015-02-06 2017-09-26 热生物制品有限公司 共表达疫苗和共刺激分子的载体
CN107614519A (zh) * 2015-10-23 2018-01-19 优瑞科生物技术公司 抗体/t细胞受体嵌合构建体及其用途
CN107849102A (zh) * 2015-05-15 2018-03-27 希望之城 嵌合抗原受体组合物
CN108473957A (zh) * 2015-04-17 2018-08-31 诺华股份有限公司 改善嵌合抗原受体表达细胞的功效和扩增的方法
CN108699124A (zh) * 2016-01-21 2018-10-23 辉瑞大药厂 靶向表皮生长因子受体变体iii的嵌合抗原受体

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5824311A (en) 1987-11-30 1998-10-20 Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of tumors with monoclonal antibodies against oncogene antigens
US4870287A (en) 1988-03-03 1989-09-26 Loma Linda University Medical Center Multi-station proton beam therapy system
US5851795A (en) 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US5846945A (en) 1993-02-16 1998-12-08 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
US5801005A (en) 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
EP0665852A1 (en) 1993-07-09 1995-08-09 Amgen Boulder Inc. Recombinant ctla4 polypeptides and methods for making the same
GB9506466D0 (en) 1994-08-26 1995-05-17 Prolifix Ltd Cell cycle regulated repressor and dna element
US6451995B1 (en) 1996-03-20 2002-09-17 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Single chain FV polynucleotide or peptide constructs of anti-ganglioside GD2 antibodies, cells expressing same and related methods
US5760395A (en) 1996-04-18 1998-06-02 Universities Research Assoc., Inc. Method and apparatus for laser-controlled proton beam radiology
US5739169A (en) 1996-05-31 1998-04-14 Procept, Incorporated Aromatic compounds for inhibiting immune response
US5844905A (en) 1996-07-09 1998-12-01 International Business Machines Corporation Extensions to distributed MAC protocols with collision avoidance using RTS/CTS exchange
JP2001523958A (ja) 1997-03-21 2001-11-27 ブライハム アンド ウィミンズ ホスピタル，インコーポレイテッド 免疫療法のｃｔｌａ−４結合ペプチド
HU228467B1 (en) 1998-02-05 2013-03-28 Smithkline Beecham Biolog Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccination
EP1109921A4 (en) 1998-09-04 2002-08-28 Sloan Kettering Inst Cancer FOR PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANE-ANTI-SPECIFIC FUSION RECEPTORS AND THEIR USE
US6410319B1 (en) 1998-10-20 2002-06-25 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
MXPA01006422A (es) 1998-12-23 2002-06-04 Pfizer Inc Abgenix Inc Anticuerpos monoclonales humanos de ctla-4.
PL203951B1 (pl) 1999-04-19 2009-11-30 Smithkline Beecham Biolog Kompozycja adiuwantowa, kompozycja szczepionki oraz sposób jej wytwarzania, szczepionka oraz zastosowanie
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
MXPA02001911A (es) 1999-08-24 2003-07-21 Medarex Inc Anticuerpos ctla-4 humanos y sus usos.
CA2410510A1 (en) 2000-06-02 2001-12-13 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Artificial antigen presenting cells and methods of use thereof
US7446179B2 (en) 2000-11-07 2008-11-04 City Of Hope CD19-specific chimeric T cell receptor
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
WO2005012493A2 (en) 2003-07-31 2005-02-10 Immunomedics, Inc. Anti-cd19 antibodies
WO2006017325A2 (en) 2004-07-13 2006-02-16 Cell Genesys, Inc. Aav vector compositions and methods for enhanced expression of immunoglobulins the same
DK2439273T3 (da) 2005-05-09 2019-06-03 Ono Pharmaceutical Co Humane monoklonale antistoffer til programmeret død-1(pd-1) og fremgangsmåder til behandling af cancer ved anvendelse af anti-pd-1- antistoffer alene eller i kombination med andre immunterapeutika
ES2663323T3 (es) 2007-03-30 2018-04-12 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Expresión constitutiva de ligandos coestimuladores en linfocitos T transferidos de manera adoptiva
ES2616355T3 (es) 2007-06-18 2017-06-12 Merck Sharp & Dohme B.V. Anticuerpos para el receptor humano de muerte programada PD-1
US8479118B2 (en) 2007-12-10 2013-07-02 Microsoft Corporation Switching search providers within a browser search box
MX2010008786A (es) 2008-02-11 2010-12-01 Curetech Ltd Anticuerpos monoclonales para tratamiento de tumores.
WO2009114335A2 (en) 2008-03-12 2009-09-17 Merck & Co., Inc. Pd-1 binding proteins
JP5173594B2 (ja) 2008-05-27 2013-04-03 キヤノン株式会社 管理装置、画像形成装置及びそれらの処理方法
US8119129B2 (en) 2008-08-01 2012-02-21 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-CTLA4 antibody with dasatinib for the treatment of proliferative diseases
EA201170375A1 (ru) 2008-08-25 2012-03-30 Эмплиммьюн, Инк. Антагонисты pd-1 и способы их применения
JP2013512251A (ja) 2009-11-24 2013-04-11 アンプリミューン、インコーポレーテッド Ｐｄ−ｌ１／ｐｄ−ｌ２の同時阻害
DK3053932T3 (da) 2010-02-19 2020-10-19 Xencor Inc Hidtil ukendte ctla4-ig-immunoadhesiner
MX347078B (es) 2010-12-09 2017-04-10 Univ Pennsylvania Uso de celulas t modificadas por receptor de antigeno quimerico para tratar cancer.
WO2012129514A1 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method and compositions for cellular immunotherapy
US8398282B2 (en) 2011-05-12 2013-03-19 Delphi Technologies, Inc. Vehicle front lighting assembly and systems having a variable tint electrowetting element
MX359234B (es) 2011-11-11 2018-09-20 Hutchinson Fred Cancer Res Inmunoterapia de celulas t objetivadas en ciclina a1 para cancer.
EP2814846B1 (en) 2012-02-13 2020-01-08 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
WO2013126726A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Double transgenic t cells comprising a car and a tcr and their methods of use
AU2013256159B2 (en) 2012-05-03 2018-08-09 Fred Hutchinson Cancer Center Enhanced affinity T cell receptors and methods for making the same
JP2014022858A (ja) 2012-07-17 2014-02-03 Murata Mfg Co Ltd 電力増幅器
SG10201701339RA (en) 2012-08-20 2017-03-30 Seattle Children S Hospital Dba Seattle Children S Res Inst Method and compositions for cellular immunotherapy
WO2014055668A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Compositions and methods for immunotherapy
US9308236B2 (en) 2013-03-15 2016-04-12 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic inhibitors of the PD-1/PD-L1 and CD80(B7-1)/PD-L1 protein/protein interactions
CN105682683A (zh) 2013-08-02 2016-06-15 阿杜罗生物科技控股有限公司 结合cd27激动剂以及免疫检查点抑制以用于免疫刺激
HRP20221262T1 (hr) 2013-09-13 2022-12-09 Beigene Switzerland Gmbh Protutijela anti-pd1 i njihova uporaba kao terapeutskih i dijagnostičkih sredstava
EP3092304A2 (en) * 2014-01-08 2016-11-16 1Globe Biomedical Co., Ltd. Novel synthetic biology-based adcc technology
MX370018B (es) * 2014-04-25 2019-11-28 Bluebird Bio Inc Metodos mejorados para la elaboracion de terapias celulares adoptivas.
HUE060047T2 (hu) * 2014-10-09 2023-01-28 Univ Yamaguchi CAR expressziós vektor és CAR-t expresszáló T-sejtek
CN114958764A (zh) * 2015-04-08 2022-08-30 诺华股份有限公司 Cd20疗法、cd22疗法和与cd19嵌合抗原受体（car）表达细胞的联合疗法
MX2019011404A (es) * 2017-03-27 2020-02-05 Noile Immune Biotech Inc Receptor de antigeno quimerico.
AU2018306307A1 (en) * 2017-07-25 2020-02-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Enhanced chimeric antigen receptors and use thereof

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101016543A (zh) * 2000-11-17 2007-08-15 罗切斯特大学 筛选编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的多核苷酸的方法
WO2003064665A2 (en) * 2002-02-01 2003-08-07 Oxford Biomedica (Uk) Limited Viral vector
US20130071414A1 (en) * 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
CN106163547A (zh) * 2014-03-15 2016-11-23 诺华股份有限公司 使用嵌合抗原受体治疗癌症
CN107208099A (zh) * 2015-02-06 2017-09-26 热生物制品有限公司 共表达疫苗和共刺激分子的载体
CN108473957A (zh) * 2015-04-17 2018-08-31 诺华股份有限公司 改善嵌合抗原受体表达细胞的功效和扩增的方法
CN107849102A (zh) * 2015-05-15 2018-03-27 希望之城 嵌合抗原受体组合物
WO2016197108A1 (en) * 2015-06-05 2016-12-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treatment with natural killer cells matched for killer immunoglobulin receptor type
CN107614519A (zh) * 2015-10-23 2018-01-19 优瑞科生物技术公司 抗体/t细胞受体嵌合构建体及其用途
CN108699124A (zh) * 2016-01-21 2018-10-23 辉瑞大药厂 靶向表皮生长因子受体变体iii的嵌合抗原受体

Also Published As

Publication number Publication date
TW202033542A (zh) 2020-09-16
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US20220033848A1 (en) 2022-02-03

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