CN113281507A - 一种金黄色葡萄球菌快速检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种金黄色葡萄球菌快速检测方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN113281507A
CN113281507A CN202110561712.0A CN202110561712A CN113281507A CN 113281507 A CN113281507 A CN 113281507A CN 202110561712 A CN202110561712 A CN 202110561712A CN 113281507 A CN113281507 A CN 113281507A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
staphylococcus aureus
enrichment
concentration
vancomycin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110561712.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113281507B (zh
Inventor
齐燕飞
孙瑞蒙
邹杭锦
张扬
张新明
盛蓉田
吕瑞娟
陈丽霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin University
Original Assignee
Jilin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin University filed Critical Jilin University
Priority to CN202110561712.0A priority Critical patent/CN113281507B/zh
Publication of CN113281507A publication Critical patent/CN113281507A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113281507B publication Critical patent/CN113281507B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56938—Staphylococcus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/305—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • G01N2333/31—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Magnetic Means (AREA)

Abstract

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，它包括：Fe3O4磁珠特异性富集生物探针、万古霉素溶液、胶体金溶液，磁铁。它通过Fe3O4磁珠特异性富集生物探针实现金黄色葡萄球菌的富集和分离，利用万古霉素诱导胶体金冻融后发生聚集变化，根据胶体的聚集颜色变化，对金黄色葡萄球菌进行定量检测，定量检测时变异系数小，线性范围广，方法灵敏度高，检测定量限为2.1 CFU/mL，另外本发明成本较低，操作简单，易于实施，缩短了检测时间，稳定性好。

Description

一种金黄色葡萄球菌快速检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌快速检测方法及试剂盒。
背景技术
食源性致病菌作为食品中生物性污染物对人类健康构成重大威胁。常见的食源性致病菌为单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes），大肠杆菌O157：H7（Escherichia coil），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），肠炎沙门氏菌（Salmonella）等，它们是引起人们住院最常见的原因，程度较为严重的可引起死亡。金黄色葡萄球菌简称金葡菌，隶属葡萄球菌属，是一种十分常见的食源性致病菌。金葡菌抵抗不良生存环境的能力很强，广泛存在于自然界，如水、空气、尘埃、人和动物的***物中，极易导致食品的污染，引发多种疾病，如肺炎、假膜性结肠炎、心包炎甚至败血症等。金葡菌在特定条件下产生的肠毒素是引导食物中毒主要致病因子之一。 肠毒素对肠道破坏极大，可以引发恶心、反复呕吐、腹痛、腹泻、休克等急性中毒症状，严重可导致循环衰竭。由于金黄色葡萄球菌的生长不需要十分丰富的营养，抵抗不良环境能力和耐盐性较强，可以对各种食品构成污染。目前，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒中占较大比例。我国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒病例约占食物中毒病例总数的20% ~25%，美国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒数量占细菌性食物中毒总量的33%，加拿大占到45%。目前，食源性致病菌的检测方法主要有传统分离培养法、分子生物学检测方法、免疫学方法、生物传感技术等，虽然这些方法能实现对食源性致病菌的检测，但仍存在各自的缺点。金黄色葡萄球菌指标是GB4789系列食品微生物检验中最基本、最常见的检测项目。传统的培养法对金葡菌的测量方法费时费力，需要大量人工操作。如国标GB 4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》，该方法需要预增菌、增菌、培养、生化鉴定等一系列步骤，花费时间在60小时以上，还需要BPW、TTB、SC增菌液，XLD，BS，HE，显色培养基，后续生化鉴定也需要大量的试剂。培养法费时费力。PCR技术操作复杂、成本高以及需要操作技术较高的工作人员；酶联免疫法价格昂贵，并且其活性容易受到温度、pH等环境因素的影响。因此，迫切需要开发一种操作简单、易于实施、快速和灵敏度高的检测方法。
食品样品基质复杂，待检目标细菌少，需要新型的前处理技术和方法。Fe3O4磁性纳米粒子具有良好的生物相容性、导电性、磁性、无毒且易于合成。利用Fe3O4磁性纳米粒子偶联抗体、核酸、适配体可广泛应用于免疫学检测、细胞分离、蛋白质纯化等领域。在食源性致病菌的检测方面，Fe3O4磁性纳米粒子有效结合抗原-抗体反应的特异性和磁珠的磁场响应性，可实现从复杂基质中对目标菌的快速分离和富集提高检测效率，是有效的样品前处理方法，具有较好的开发应用前景。万古霉素作为一种广谱糖肽类抗生素，可以与革兰氏阳性菌细胞壁上的肽聚糖相结合，基于此实现与革兰氏阳性菌结合，从而达到检测的目的。2017年，孟祥玉通过合成万古霉素功能化磁珠，通过流式细胞技术在120min内实现了金黄色葡萄球菌的特异性检测，检测限为3.3 CFU/mL（Meng X, Yang G, Li F, Wei H, Xu H:Sensitive detection of Staphylococcus aureus with vancomycin-conjugatedmagnetic beads as enrichment carriers combined with flow cytometry. ACSapplied material and interfaces2017;9(25):21464-21472）。胶体金具有良好的生物相容性、大比表面积、光电特性、表面等离子共振性质，被广泛应用于生物传感领域。当金纳米粒子尺寸大于3.5nm时，其具有较大的摩尔吸光系数，且随着粒径的增加摩尔吸光系数逐渐降低，紫外可见吸收峰蓝移，呈现肉眼可见的颜色变化而被广泛用于比色传感检测中。
综上所述，为了实现金黄色葡萄球菌现场筛检，开发一种快速，灵敏度高，特异性强的检测方法和试剂盒，对食品微生物检验等领域具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种金黄色葡萄球菌快速检测方法及试剂盒。
一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，它包括：Fe3O4磁珠特异性富集生物探针、万古霉素溶液、胶体金溶液，磁铁,洗液；
所述的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针是金黄色葡萄球菌适配体修饰的四氧化三铁磁珠特异性富集生物探针；
所述的金黄色葡萄球菌适配体基因序列为5’NH2-GCA ATG GTA CGG TAC TTC CTCGGC ACG TTC TCA GTA GCG CTC GCT GGT CAT CCC ACA GCT ACG TCA AAA GTG CAC GCTACT TTG CTA A-3’；
所述的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针浓度为0.1-0.5mg/mL；所述的万古霉素溶液浓度为7.8125μM-500μM；所述的胶体金粒径为13-48nm；
所述的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针是由以下方法制备的：
1） 将六水合氯化铁和柠檬酸三钠加入到乙二醇溶液中，完全溶解后，使六水合氯化铁终浓度为0.2mol/L，柠檬酸三钠终浓度为0.034mol/L；
2）向1）加入乙酸钠，乙酸钠终浓度为0.73mol/L，搅拌30min；
3）将上述溶液2）转移反应釜中200℃反应10h，冷却后，取出黑色溶液，用磁铁吸出黑色固体四氧化三铁，依次用蒸馏水、乙醇交替洗涤3-5次，得到羧基化Fe3O4磁珠；
4）取羧基化Fe3O4磁珠，溶于pH 6的PBS缓冲液，使其浓度达到1-4mg/mL；
5）向4）中加入固体1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐（EDC）和 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），使其在4）的缓冲溶液浓度均达到2.5-6mg/mL, 37℃孵育60min，PBS洗涤3次，重悬于pH 7.4的PBS缓冲液，加入浓度为6µM-10µM金黄色葡萄球菌适配体10μL-60μL；
6）混合溶液在4℃孵育过夜，用磁铁分离溶液，弃去上清，再用pH 7.4PBS缓冲液洗涤3次，重悬于7.4 PBS缓冲液中，得到Fe3O4磁珠特异性富集生物探针；
所述的EDC和 NHS最适浓度为5mg/mL；
所述的金黄色葡萄球菌适配体最适浓度为10µM，最适体积为60μL；
所述的胶体金溶液是由以下方法制备的：将合成所需玻璃器皿用硝酸和盐酸体积比为1:3的混合液浸泡30min，用超纯水冲洗三遍，氮气吹干，将1mM的氯金酸加热至沸腾，在搅拌的状态下快速加入4mmol/L柠檬酸三钠，20min后，得胶体金溶液。
一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，它包括：Fe3O4磁珠特异性富集生物探针、万古霉素溶液、胶体金溶液，磁铁，用1%甲醛灭活的109菌液阳性标准品、阴性质控去离子水；所述的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针最适浓度为0.3mg/mL；所述的万古霉素溶液最适浓度为62.5μM；所述的胶体金最适粒径为13nm；
一种金黄色葡萄球菌快速检测方法，它包括：
1）待检食品样品研磨后，取5g匀浆，加入PBS缓冲液10 m L，充分混匀后，将425µL浸提液转入离心管中；
2）加入Fe3O4磁珠特异性富集生物探针75μL, 漩涡混匀后在37℃下富集60min,磁分离，用移液器吸出上清。PBS缓冲液洗涤3遍，磁分离后吸出洗涤液后舍弃；
3）加入50μL，62.5μM万古霉素溶液，旋转混合孵育30min，磁富集；
4）取上清15μL加入到300uL胶体金溶液中，-80℃冷冻10min后，70℃解冻，测定其吸光度值；
所述步骤2）的富集时间为60min，步骤4）冷冻温度为-80℃，冷冻时间10min。
本发明提供了一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，它包括：Fe3O4磁珠特异性富集生物探针、万古霉素溶液、胶体金溶液，磁铁。它通过Fe3O4磁珠特异性富集生物探针实现金黄色葡萄球菌的富集和分离，利用万古霉素诱导胶体金冻融后发生聚集变化，根据胶体的聚集颜色变化，对金黄色葡萄球菌进行定量检测，定量检测时变异系数小，线性范围广，方法灵敏度高，检测下限为0.21 CFU/mL，定量限为2.1CFU/mL,另外本发明成本较低，操作简单，易于实施，缩短了检测时间，稳定性好。
附图说明
图1 四氧化三铁磁性纳米粒子和胶体金的紫外光谱、红外光谱图、粒径和zeta电位图；
图2 胶体金、万古霉素和胶体金万古霉素混合液的zeta电位图；
图3 万古霉素用量优化；
图4 （a）胶体金粒径优化,(b)胶体金冻融后吸光度归一化值，（c) 不同粒径胶体金的吸收光谱,（d）冻融对不同粒径胶体金与万古霉素混合液光谱的影响；
图5 （a-d）胶体金万古霉素混合指示液冷冻时间的优化和（e-g）胶体金万古霉素混合指示液溶解温度的优化；
图6 （a,b）适配体用量优化，（c,d）四氧化三铁磁珠特异性富集生物探针用量优化和（e,f）富集时间优化；
图7金黄色葡萄球菌检测的标准曲线，线性回归方程和相关系数；
图8金黄色葡萄球菌检测的选择性。
具体实施方式
实施例1羧基化四氧化三铁磁珠的制备
将六水合氯化铁和柠檬酸三钠加入到乙二醇中，完全溶解后，使六水合氯化铁终浓度为0.2mol/L，柠檬酸三钠终浓度为0.034mol/L，再加入乙酸钠，乙酸钠终浓度为0.73mol/L，搅拌30min。将混合物转移到反应釜，200℃反应10h，冷却后，取出黑色溶液，用磁铁吸出黑色固体四氧化三铁，依次用蒸馏水、乙醇交替洗涤3-5次，得到羧基化四氧化三铁纳米粒子即羧基化四氧化三铁磁珠，放入4℃冰箱备用。四氧化三铁的水合粒径为562nm见图1(b)，红外光谱和紫外光谱见图1(c)，电位见图1(d)。
实施例2四氧化三铁磁珠特异性富集生物探针的制备
取羧基化四氧化三铁磁珠溶于pH 6的磷酸盐缓冲液中，使其浓度达到2mg/mL，加入固体EDC和NHS，使其浓度均达到5mg/mL,在37℃孵育60min，用PBS洗涤三次，重悬于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入10µM金黄色葡萄球菌适配体：5’NH2-GCA ATG GTA CGG TACTTC CTC GGC ACG TTC TCA GTA GCG CTC GCT GGT CAT CCC ACA GCT ACG TCA AAA GTGCAC GCT ACT TTG CTA A-3’ 60μL。混合溶液在37℃孵育4小时。用磁铁分离溶液，弃去上清。再用pH 7.4磷酸盐缓冲液洗涤三次后，重悬于7.4磷酸盐缓冲液中，得到金黄色葡萄球菌适配体修饰的四氧化三铁磁珠特异性富集生物探针即Fe3O4磁珠特异性富集生物探针。四氧化三铁磁珠特异性富集生物探针的电位见图1(d)。
所述的磷酸盐缓冲液配置方法为：取NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4 1.44g和KH2PO40.24g溶于800mL蒸馏水中，用NaOH调节pH至6和7.4，定溶至1000mL。
实施例3金纳米粒子（胶体金）的制备
先将合成所需要的玻璃器皿用王水（硝酸：盐酸=1:3）浸泡30min，用超纯水冲洗三遍，氮气吹干，将100mL浓度为1mM的氯金酸加热至沸腾，在搅拌的状态下快速加入0.1032g柠檬酸三钠，使其浓度达到0.4mM,柠檬酸三钠，20min后，溶液由淡黄色变为酒红色，得到13nm的金纳米粒子，冷却至室温后，在4℃黑暗条件下保存。金纳米粒子的紫外光谱见图1(a)，水合粒径见图1(b)，电位见图1(d)。
实施例4万古霉素溶液的配制
准确称取0.005g-0.35g万古霉素，室温下溶于去离子水中，形成7.8125μM-500μM的万古霉素溶液，放入4℃冰箱备用。
实施例5万古霉素用量优化实验
本实施例提供一种冻融后，万古霉素诱导胶体金聚集的金黄色葡萄球菌快速特异检测方法，万古霉素用量的优化包括以下步骤：取300μL金纳米粒子溶液，依次向其中加入15μL 15.625μM-500μM万古霉素，然后将上述溶液混合均匀，-80℃冷冻10min后70℃解冻，用紫外-可见分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。
实验结果如图3所示，从图3中可以看出当加入的万古霉素量低于62.5μM后，金纳米粒子开始聚集。
实施例6金纳米粒子粒径优化实验
利用柠檬酸钠还原法制备了粒径为13nm、14nm、18nm、30nm和48nm金纳米粒子，用紫外-可见分光光度计分别测定紫外吸收光谱；然后准确移取各粒径金纳米粒子溶液300μL，向其中加入15μL，62.5μM万古霉素，-80℃冷冻10min，70℃解冻，扫描紫外吸收光谱。
实验结果如图4所示，不同粒径金纳米粒子的水合粒径见图4（a）；从图4(b)(c)中可以看出不同粒径金纳米粒子的吸收峰在520nm-535nm发生改变；从图(d)中可以看出18nm、30nm和48nm金纳米粒子在冻融后呈现聚集状态，14nm金纳米粒子聚集程度较低，而13nm金纳米粒子几乎没有变化。因此，本实验优选13nm金纳米粒子。
实施例7金纳米粒子与万古霉素冷冻时间和冻融温度优化实验
一、金纳米粒子与万古霉素冷冻温度和时间优化实验
（1）取300uL金纳米粒子溶液，向其中加入15μL，62.5μM万古霉素，然后将上述溶液混合均匀，在-20℃放置15min、30min、60min、120min和180min, 70℃解冻后。用紫外-可见分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。
实验结果如图5(a)(c)所示，从图5(a)(c)中可以看出-20℃冷冻15min和30min后，溶液不能完全冷冻；在冷冻60-180min时，金纳米粒子聚集程度随时间逐渐增大；
（2）取300uL金纳米粒子溶液，向其中加入15μL，62.5μM万古霉素，然后将上述溶液混合均匀，在-80℃放置5min、10min、20min、30min和60min, 70℃解冻。后用紫外-可见分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。
实验结果如图5(b)(d)所示，从图5(b)(d)中可以看出-80℃时冷冻时，金纳米粒子聚集程度随时间逐渐增大，大于10min时冷冻时金纳米粒子聚集程度相似。本发明优选，-80℃冷冻，冷冻时间10min。
二、金纳米粒子与万古霉素解冻温度优化实验
取300uL金纳米粒子溶液，向其中加入15μL，62.5μM万古霉素，然后将上述溶液混合均匀，-80℃冷冻10min后，置于25℃、37℃、50℃、60℃和70℃解冻，用紫外-可见分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。
实验结果如图5(e)(f)(g)所示，从图5(e)(f)(g)中可以看出解冻温度不影响金纳米粒子的聚集，吸收峰几乎没有变化，但随着解冻温度的增加，解冻所需要的时间逐渐减少。本发明优选70℃快速解冻。
实施例8 Fe3O4磁珠特异性富集生物探针富集金黄色葡萄球菌用量优化实验
一、适配体用量优化实验
（1）Fe3O4磁珠特异性富集生物探针的制备
将羧基化四氧化三铁磁珠溶于pH 6的磷酸缓冲液中，使其浓度达到2mg/mL，加入固体EDC和NHS，使其浓度均达到5mg/mL,在37℃孵育60min，用PBS洗涤三次，重悬于pH7.4的PBS中，加入适配体，并用pH7.4的PBS定容体系体积为1 mL，适配体的总浓度分别为0μM，0.2μM，0.3μM，0.4μM，0.5μM，0.6μM和0.7μM， 37℃孵育4小时，用磁铁分离溶液，弃去上清，用pH7.4PBS缓冲液洗涤三次后，重悬于pH7.4PBS缓冲液中，即制得7种不同适配体浓度修饰的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针，放于4℃备用。
（2）Fe3O4磁珠特异性富集生物探针对金黄色葡萄球菌的富集效率
分别准确移取375μL，pH等于7.4的PBS溶液放于7个微量离心管中，依次向其中加入75μL步骤1中制备的7种不同浓度的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针，将上述溶液混合均匀后，加入50μL 3×107CFU/mL金黄色葡萄球菌，置于37℃富集60min，磁铁吸附分离后，取上清。将上清稀释1000倍后，取10μL上清液均匀涂布在LB固体培养皿中，培养24h后计数。
实验结果如图6(a)(b)所示，从图6(a)(b)中可以看出随着适配体体积的增加，富集效率逐渐增加；当适配体浓度为0.6μM，富集效率为93.9%，之后富集效率不再随体积的增加而增加。因此本发明优选适配体修饰探针的浓度为0.6μM。
二、Fe3O4磁珠特异性富集生物探针用量的优化实验
分别准确移取375uLpH等于7.4的PBS溶液，依次向其中加入0，0.1，0.2,0.3,0.4和0.5mg/mLFe3O4磁珠特异性富集生物探针75μL，将上述溶液混合均匀后，加入50μL 3×107CFU/mL金黄色葡萄球菌，置于37℃富集60min，磁铁吸附取上清；将上清稀释1000倍后，取10uL上清液均匀涂布在LB固体培养皿中，培养24h后计数。
实验结果如图6(c)(d)所示，从图6(c)(d)中可以看出随着Fe3O4磁珠特异性富集生物探针用量的增加，富集效率逐渐增加；当Fe3O4磁珠特异性富集生物探针浓度为0.3mg/mL时，富集效率为93.7%，之后富集效率趋于稳定。因此本发明Fe3O4磁珠特异性富集生物探针的优选浓度为0.3mg/mL。
三、金黄色葡萄球菌磁富集时间优化实验
(1)105CFU/mL金黄色葡萄球菌磁富集时间优化实验
分别准确移取375uL，pH等于7.4的PBS溶液，向其中加入75μL 0.3mg/mL Fe3O4磁珠特异性富集生物探针，将上述溶液混合均匀后，加入105CFU/mL金黄色葡萄球菌50μL，置于37℃富集0min、10min、15min、20min、30min和60min，磁铁吸附，取上清。将上清稀释1000倍后，取10μL上清液均匀涂布在LB固体培养皿中，培养24h后计数。
(2)108CFU/mL金黄色葡萄球菌磁富集时间优化实验
分别准确移取375μL pH等于7.4的PBS溶液，向其中加入75μL 0.3mg/mL Fe3O4磁珠特异性富集生物探针，将上述溶液混合均匀后，加入108CFU/mL金黄色葡萄球菌50μL，置于37℃富集0min、10min、15min、20min、30min、60min和120min，磁铁吸附取上清；将上清稀释1000倍后，取10uL上清液均匀涂布在LB固体培养皿中，培养24h后计数。
实验结果如图6(e)(f) (g)(h)所示，从图6(e)(f) (g)(h)中可以看出105CFU/mL金黄色葡萄球菌在富集60min后，富集效率为93.7%；108CFU/mL金黄色葡萄球菌在富集60min后，富集效率为93.4%；因此本发明优选富集时间为60min。
实施例9金黄色葡萄球菌检测实验
一种金黄色葡萄球菌快速检测方法，包括：
（1）稀释金黄色葡萄球菌溶液
准备好微量离心管，编上编码，分别为1、2、3、4、5、6，在1号管中加入300微升106CFU/mL金黄色葡萄球菌溶液，用枪头反复吹打5次，然后在2-6号微量离心管中加入900微升标准稀释液，在1号管中取100微升加入到2号管，后面过程依次类推。最后稀释完，第1个管中液体在200微升，2-5号管为900微升,6号管为1000微升。金黄色葡萄球菌浓度是从大到小，依次为106-10 CFU/mL。
（2）Fe3O4磁珠特异性富集生物探针对金黄色葡萄球菌的富集
分别准确移取375μLpH等于7.4的PBS溶液，向其中加入75μL 0.3mg/mLFe3O4磁珠特异性富集生物探针，10-106CFU/mL金黄色葡萄球菌50μL，混合均匀，置于37℃孵育60min，用磁铁吸附分离，弃去上清，用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤三次，吸附去上清。
（3）万古霉素的加入
向分离出的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针吸附的金黄色葡萄球菌中加入62.5μM万古霉素50μL，37℃下孵育30min，再次用磁铁富集。
（4）胶体金溶液的加入
取步骤（3）的上清15μL加入到300μL金纳米粒子溶液中，-80℃冷冻10min后，70℃解冻。
（5）显色
根据解冻后的胶体金溶液的颜色和聚集状态指示金黄色葡萄球菌的含量。
（6）读数
用可见分光光度计在400-800nm处扫描紫外吸收光谱，记录564nm处的吸收光强度，根据标准曲线，阴性样本校正，测定金黄色葡萄球菌的浓度。
利用本发明的比色方法对金黄色葡萄球菌的检测如图7所示，其中，图7是用金纳米粒子与万古霉素复合物检测不同浓度的金黄色葡萄球菌时的线性校正曲线。由图7可以看出，该方法对于金黄色葡萄球菌检测线性范围为10-106CFU/mL，线性关系良好，相关系数为0.94646，检测下限为0.29 CFU/mL，检测的定量限为2.1CFU/mL。
实施例10特异性实验
分别准确移取375μL，pH等于7.4的PBS溶液和75μL 0.3mg/mL Fe3O4磁珠特异性富集生物探针，依次向其中加入50μL 106CFU/mL大肠杆菌O157:H7、106CFU/mL假单胞菌、106CFU/mL单核细胞增生李斯特菌和104CFU/mL金黄色葡萄球菌，将上述溶液混合均匀后，置于37℃富集60min，用磁铁吸附倒去上清；然后加入50μL 62.5uM万古霉素37℃下孵育30min，再次用磁铁富集，取上清15μL加入到300uL金纳米粒子溶液中，-80℃冷冻10min后，70℃解冻，测定其吸收值。
实验结果如图8所示，从图8中可以看出该方法可以特异性识别金黄色葡萄球菌。因此，磁富集，万古霉素诱导的胶体金聚集法与对金黄色葡萄球菌检测选择性高，特异性好。
实施例11金黄色葡萄球菌试剂盒的制备和使用
一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，它包括：Fe3O4磁珠特异性富集生物探针、胶体金、万古霉素溶液，磁铁、用1%甲醛灭活的109菌液阳性标准品、阴性质控去离子水。
一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒的使用步骤如下：
待检食品样品研磨后，取5g匀浆，加入PBS缓冲液10 m L，充分混匀后，将375µL浸提液转入离心管中，向该离心管中加入Fe3O4磁珠特异性富集生物探针75μL, 漩涡混匀后在37℃下富集60min, 磁分离，用移液器吸出上清。PBS缓冲液洗涤3遍，磁分离后舍弃洗涤液，舍弃，再加入50μL万古霉素溶液，旋转混合孵育30min，再次用磁铁富集，取上清15μL加入到300uL金纳米粒子溶液中，-80℃冷冻10min后，70℃解冻，测定其吸收值。利用可见分光光度计，测定吸收值，也可目视观察。按上述同样的方法检测试剂盒中提供的阴性质控品及阳性质控品样品，并利用标准菌液制作标准曲线，阳性质控品样品的吸收值大于阴性质控品，则表明试剂盒失效。

Claims (10)

1.一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，它包括：Fe3O4磁珠特异性富集生物探针、万古霉素溶液、胶体金溶液，磁铁；所述的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针是金黄色葡萄球菌适配体修饰的四氧化三铁磁珠特异性富集生物探针。
2.根据权利要求1所述的一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，其特征在于：所述的金黄色葡萄球菌适配体基因序列为SEQ ID NO.1。
3.根据权利要求2所述的一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，其特征在于：所述的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针浓度为0.1-0.5mg/mL；所述的万古霉素溶液浓度为7.8125μM-500μM；所述的胶体金粒径为13-48nm。
4.根据权利要求3所述的一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，其特征在于：所述的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针是由以下方法制备的：
1） 将六水合氯化铁和柠檬酸三钠加入到乙二醇中，完全溶解后，使六水合氯化铁终浓度为0.2mol/L，柠檬酸三钠终浓度为0.034mol/L；
2）向1）加入乙酸钠，乙酸钠终浓度为0.73mol/L，搅拌30min；
3）将上述溶液2）转移反应釜中200℃反应10h，冷却后，取出黑色溶液，用磁铁吸出黑色固体四氧化三铁，依次用蒸馏水、乙醇交替洗涤3-5次，得到羧基化Fe3O4磁珠；
4）取羧基化Fe3O4磁珠，溶于pH 6的PBS缓冲液，使其浓度达到1-4mg/mL；
5）向4）中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐和 N-羟基琥珀酰亚胺，使其在4）的缓冲液中的浓度均达到2.5-6mg/mL ，7℃孵育60min，PBS洗涤3次，重悬于pH 7.4的PBS缓冲液，加入浓度为6µM-10µM金黄色葡萄球菌适配体10μL-60μL；
6）混合溶液在4℃孵育过夜，用磁铁分离溶液，弃去上清，再用pH 7.4PBS缓冲液洗涤3次，重悬于7.4 PBS缓冲液中，得到Fe3O4磁珠特异性富集生物探针。
5.根据权利要求4所述的一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，其特征在于：所述的EDC和 NHS浓度为5mg/mL。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，其特征在于：所述的金黄色葡萄球菌适配体浓度为10µM，体积为60μL。
7.根据权利要求6所述的一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，其特征在于：所述的胶体金溶液是由以下方法制备的：将合成所需玻璃器皿用硝酸和盐酸体积比为1:3的混合液浸泡30min，用超纯水冲洗三遍，氮气吹干，将1mM的氯金酸加热至沸腾，在搅拌的状态下快速加入4mmol/L柠檬酸三钠，20min后，得胶体金溶液。
8.一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，它包括：Fe3O4磁珠特异性富集生物探针、万古霉素溶液、胶体金溶液，磁铁，用1%甲醛灭活的109菌液阳性标准品、阴性质控去离子水；所述的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针浓度为0.3mg/mL；所述的万古霉素溶液浓度为62.5μM；所述的胶体金粒径为13nm。
9.一种食品中金黄色葡萄球菌快速检测方法，它包括：
1）待检食品样品研磨后，取5g匀浆，加入PBS缓冲液10 m L，充分混匀后，将425µL浸提液转入离心管中；
2）加入Fe3O4磁珠特异性富集生物探针75μL, 漩涡混匀后在37℃下富集60min, 磁分离，用移液器吸出上清。PBS缓冲液洗涤3遍，磁分离后吸出洗涤液，舍弃；
3）加入50μL万古霉素溶液，旋转混合孵育30min，磁富集；
4）取上清15μL加入到300uL胶体金溶液中，-80℃冷冻10min后，70℃解冻，测定其吸收值。
10.根据权利要求9所述的一种金黄色葡萄球菌快速检测方法，其特征在于：所述步骤2）的富集时间为60min，步骤4）冷冻温度为-80℃，冷冻时间10min。
CN202110561712.0A 2021-05-23 2021-05-23 一种金黄色葡萄球菌快速检测方法及试剂盒 Active CN113281507B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110561712.0A CN113281507B (zh) 2021-05-23 2021-05-23 一种金黄色葡萄球菌快速检测方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110561712.0A CN113281507B (zh) 2021-05-23 2021-05-23 一种金黄色葡萄球菌快速检测方法及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113281507A true CN113281507A (zh) 2021-08-20
CN113281507B CN113281507B (zh) 2022-08-16

Family

ID=77280844

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110561712.0A Active CN113281507B (zh) 2021-05-23 2021-05-23 一种金黄色葡萄球菌快速检测方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113281507B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114371287A (zh) * 2021-12-02 2022-04-19 鲁东大学 一种基于免疫磁分离和点击化学反应的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒及其检测方法
CN117110607A (zh) * 2023-09-16 2023-11-24 鲁东大学 一种检测副溶血性弧菌的组合物及其应用

Citations (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030077670A1 (en) * 2001-06-22 2003-04-24 Cheng Anthony K. Homogeneous assay of vancomycin using a stable particle-vancomycin conjugate, a novel rate enhancer, and a novel dose response modulator
US20040043512A1 (en) * 2002-08-27 2004-03-04 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Self-calibration system for a magnetic binding assay
US20060057613A1 (en) * 2004-07-26 2006-03-16 Nanosphere, Inc. Method for distinguishing methicillin resistant S. aureus from methicillin sensitive S. aureus in a mixed culture
US20060228357A1 (en) * 2005-04-06 2006-10-12 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
CN1987464A (zh) * 2006-09-29 2007-06-27 浙江大学 磁捕获技术在NF－κB蛋白分离与检测中的应用方法
EP2238258A1 (en) * 2007-12-24 2010-10-13 Zeus Scientific, Inc. Methods and compositions including diagnostic kits for the detection of staphylococcus aureus
US20120077206A1 (en) * 2003-07-12 2012-03-29 Accelr8 Technology Corporation Rapid Microbial Detection and Antimicrobial Susceptibility Testing
CN102858153A (zh) * 2010-03-12 2013-01-02 加利福尼亚大学董事会 纳米粒子稳定化的脂质体的触发活性物释放
CN103149207A (zh) * 2013-03-05 2013-06-12 中国科学院大学 一种基于纳米金的可视化快速检测牛奶中抗生素的方法
EP2694685A1 (en) * 2011-04-08 2014-02-12 Azzazy, Hassan, Mohamed, Ei-said Detection of nucleic acids using unmodified gold nanoparticles
CN103575889A (zh) * 2012-08-03 2014-02-12 北京勤邦生物技术有限公司 一种检测万古霉素的试纸条及方法
CN103994984A (zh) * 2014-06-05 2014-08-20 吉林大学 一种利用适配体和正电AuNPs比色检测四环素的方法
CN104502585A (zh) * 2014-12-30 2015-04-08 中山大学 用于抗生素检测的纳米传感器及其制备方法和应用
CN106248931A (zh) * 2016-08-08 2016-12-21 武汉中科志康生物科技有限公司 一种抗生素及基于该抗生素的细菌快速层析检测卡
CN106997799A (zh) * 2016-01-22 2017-08-01 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种高性能金壳磁性微球的制备方法及其sers应用
CN107167469A (zh) * 2017-05-24 2017-09-15 东南大学 一种鉴别***和阴性细菌的指示材料及其制备方法和应用
CN107941779A (zh) * 2017-09-30 2018-04-20 中国人民解放军总医院 基于万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒和纳米标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法
CN108586592A (zh) * 2018-04-23 2018-09-28 中国科学院上海生命科学研究院 调控根瘤植物的根瘤数目的基因及其在高效固氮方面的应用
US20180292394A1 (en) * 2016-04-11 2018-10-11 Joshua Caine Soldo Sample depletion and enrichment to improve the quality of diagnostic test results
CN109807344A (zh) * 2019-01-22 2019-05-28 天津大学 去甲万古霉素修饰的金纳米粒子及其制备方法与应用
CN109975542A (zh) * 2019-02-22 2019-07-05 中山大学 一种生物分子检测试剂盒以及生物分子检测方法
CN110133262A (zh) * 2019-04-25 2019-08-16 吉林大学 一种细菌检测试剂盒
CN110713603A (zh) * 2019-09-18 2020-01-21 山东大学 一种聚合物、其制备方法及作为检测细菌及抗菌材料的应用
CN110836881A (zh) * 2019-11-21 2020-02-25 山西大学 石墨相氮化碳/金纳米粒子比色荧光检测抗生素的方法
CN111097038A (zh) * 2020-01-16 2020-05-05 长春工业大学 万古霉素修饰的二硫化钼/金纳米针复合材料及其制备方法
US20200217860A1 (en) * 2019-01-09 2020-07-09 Beijing Diagreat Biotechnologies Co., Ltd. Time-resolved fluorescent immunochromatographic test strip for detecting vancomycin as well as preparation method and application thereof
CN111505278A (zh) * 2020-04-15 2020-08-07 西北农林科技大学 一种金黄色葡萄球菌检测试纸条、检测方法及应用
CN112250766A (zh) * 2020-08-31 2021-01-22 河北省科学院生物研究所 一种抗万古霉素单克隆抗体及其应用
CN112272703A (zh) * 2017-10-31 2021-01-26 Encodia有限公司 采用核酸编码和/或标签进行分析的试剂盒
WO2021045682A1 (en) * 2019-09-04 2021-03-11 Agency For Science, Technology And Research Colorimetric method for bacteria detection
CN112649602A (zh) * 2020-06-17 2021-04-13 吉林大学 可视化基于免疫磁珠检测金黄色葡萄球菌试剂盒

Patent Citations (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030077670A1 (en) * 2001-06-22 2003-04-24 Cheng Anthony K. Homogeneous assay of vancomycin using a stable particle-vancomycin conjugate, a novel rate enhancer, and a novel dose response modulator
US20040043512A1 (en) * 2002-08-27 2004-03-04 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Self-calibration system for a magnetic binding assay
US20120077206A1 (en) * 2003-07-12 2012-03-29 Accelr8 Technology Corporation Rapid Microbial Detection and Antimicrobial Susceptibility Testing
US20060057613A1 (en) * 2004-07-26 2006-03-16 Nanosphere, Inc. Method for distinguishing methicillin resistant S. aureus from methicillin sensitive S. aureus in a mixed culture
US20060228357A1 (en) * 2005-04-06 2006-10-12 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
CN1987464A (zh) * 2006-09-29 2007-06-27 浙江大学 磁捕获技术在NF－κB蛋白分离与检测中的应用方法
EP2238258A1 (en) * 2007-12-24 2010-10-13 Zeus Scientific, Inc. Methods and compositions including diagnostic kits for the detection of staphylococcus aureus
CN102858153A (zh) * 2010-03-12 2013-01-02 加利福尼亚大学董事会 纳米粒子稳定化的脂质体的触发活性物释放
US20140356859A1 (en) * 2011-04-08 2014-12-04 American University Of Cairo (Auc) Detection of nucleic acids using unmodified gold nanoparticles
EP2694685A1 (en) * 2011-04-08 2014-02-12 Azzazy, Hassan, Mohamed, Ei-said Detection of nucleic acids using unmodified gold nanoparticles
CN103575889A (zh) * 2012-08-03 2014-02-12 北京勤邦生物技术有限公司 一种检测万古霉素的试纸条及方法
CN103149207A (zh) * 2013-03-05 2013-06-12 中国科学院大学 一种基于纳米金的可视化快速检测牛奶中抗生素的方法
CN103994984A (zh) * 2014-06-05 2014-08-20 吉林大学 一种利用适配体和正电AuNPs比色检测四环素的方法
CN104502585A (zh) * 2014-12-30 2015-04-08 中山大学 用于抗生素检测的纳米传感器及其制备方法和应用
CN106997799A (zh) * 2016-01-22 2017-08-01 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种高性能金壳磁性微球的制备方法及其sers应用
US20180292394A1 (en) * 2016-04-11 2018-10-11 Joshua Caine Soldo Sample depletion and enrichment to improve the quality of diagnostic test results
CN106248931A (zh) * 2016-08-08 2016-12-21 武汉中科志康生物科技有限公司 一种抗生素及基于该抗生素的细菌快速层析检测卡
CN107167469A (zh) * 2017-05-24 2017-09-15 东南大学 一种鉴别***和阴性细菌的指示材料及其制备方法和应用
CN107941779A (zh) * 2017-09-30 2018-04-20 中国人民解放军总医院 基于万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒和纳米标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法
CN112272703A (zh) * 2017-10-31 2021-01-26 Encodia有限公司 采用核酸编码和/或标签进行分析的试剂盒
CN108586592A (zh) * 2018-04-23 2018-09-28 中国科学院上海生命科学研究院 调控根瘤植物的根瘤数目的基因及其在高效固氮方面的应用
US20200217860A1 (en) * 2019-01-09 2020-07-09 Beijing Diagreat Biotechnologies Co., Ltd. Time-resolved fluorescent immunochromatographic test strip for detecting vancomycin as well as preparation method and application thereof
CN109807344A (zh) * 2019-01-22 2019-05-28 天津大学 去甲万古霉素修饰的金纳米粒子及其制备方法与应用
CN109975542A (zh) * 2019-02-22 2019-07-05 中山大学 一种生物分子检测试剂盒以及生物分子检测方法
CN110133262A (zh) * 2019-04-25 2019-08-16 吉林大学 一种细菌检测试剂盒
WO2021045682A1 (en) * 2019-09-04 2021-03-11 Agency For Science, Technology And Research Colorimetric method for bacteria detection
CN110713603A (zh) * 2019-09-18 2020-01-21 山东大学 一种聚合物、其制备方法及作为检测细菌及抗菌材料的应用
CN110836881A (zh) * 2019-11-21 2020-02-25 山西大学 石墨相氮化碳/金纳米粒子比色荧光检测抗生素的方法
CN111097038A (zh) * 2020-01-16 2020-05-05 长春工业大学 万古霉素修饰的二硫化钼/金纳米针复合材料及其制备方法
CN111505278A (zh) * 2020-04-15 2020-08-07 西北农林科技大学 一种金黄色葡萄球菌检测试纸条、检测方法及应用
CN112649602A (zh) * 2020-06-17 2021-04-13 吉林大学 可视化基于免疫磁珠检测金黄色葡萄球菌试剂盒
CN112250766A (zh) * 2020-08-31 2021-01-22 河北省科学院生物研究所 一种抗万古霉素单克隆抗体及其应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALAALDIN M. ALKILANY 等: "Colloidal Stability of Citrate and Mercaptoacetic Acid Capped Gold Nanoparticles upon Lyophilization: Effect of Capping Ligand Attachment and Type of Cryoprotectants", 《LANGMUIR》 *
DAN CHENG 等: "Dual Recognition Strategy for Specific and Sensitive Detection of Bacteria Using Aptamer-Coated Magnetic Beads and Antibiotic-Capped Gold Nanoclusters", 《ANAL. CHEM.》 *
HONGWEI GU 等: "Presenting Vancomycin on Nanoparticles to Enhance Antimicrobial Activities", 《NANO LETTERS》 *
ZHANG YAN 等: "Selective fluorescence labeling and sensitive determination of Staphylococcus aureus by microchip electrophoresis with a multiple-concentration approach", 《CHINESE CHEMICAL LETTERS》 *
江美娟 等: "聚集诱导发光材料在生物成像、疾病诊断及治疗的应用", 《科技导报》 *
陈菊移等: "基于预孵育处理的牛奶中四环素增敏型胶体金检测", 《食品与机械》 *
龚滨 等: "载万古霉素硅溶胶涂层的制备及其体外抑菌作用观察", 《解放军医学杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114371287A (zh) * 2021-12-02 2022-04-19 鲁东大学 一种基于免疫磁分离和点击化学反应的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒及其检测方法
CN117110607A (zh) * 2023-09-16 2023-11-24 鲁东大学 一种检测副溶血性弧菌的组合物及其应用
CN117110607B (zh) * 2023-09-16 2024-01-26 鲁东大学 一种检测副溶血性弧菌的组合物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113281507B (zh) 2022-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113281507B (zh) 一种金黄色葡萄球菌快速检测方法及试剂盒
CN110133262B (zh) 一种细菌检测试剂盒
CN111024943A (zh) 一种用于沙门氏菌快速检测的关开型复合荧光纳米探针及其制备方法
CN113176243B (zh) 一种食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法
CN110118759B (zh) 一种基于表面钝化和共价偶联的土霉素荧光检测方法
CN101865919A (zh) 一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法
CN113866408A (zh) 基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌o157：h7的方法
CN113881790B (zh) 磁性四氧化三铁@适配体及其与荧光试纸条联合在检测食源性致病菌方面的应用
CN108303532A (zh) 一种非诊断目的的大肠埃希氏菌o157:h7的快速检测方法
CN105675877B (zh) 一种基于双色时间分辨荧光标记‑磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法
CN111139288B (zh) 基于适配体识别-杂交链式反应同时检测金黄色葡萄球菌肠毒素a、b的荧光传感器
CN105950471B (zh) 一种基于免疫磁珠技术快速捕获克罗诺杆菌的方法及应用
CN113984728B (zh) 一种用于单增李斯特菌快速检测的荧光生物传感器构建方法
Duan et al. Preparation of immunomagnetic iron-dextran nanoparticles and application in rapid isolation of E. coli O157: H7 from foods
CN110018303A (zh) 一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测体系构造方法
CN111323596B (zh) 一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒及其制备方法
CN113655005B (zh) 一种基于核壳型金铂纳米团簇对大肠杆菌o157:h7的检测方法
CN114371287A (zh) 一种基于免疫磁分离和点击化学反应的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒及其检测方法
CN115236050B (zh) 一种基于氮硫共掺石墨烯量子点的荧光探针对鼠伤寒沙门氏菌的检测方法
CN105203578A (zh) 一种检测微生物的方法
CN116590008B (zh) 一种用于大肠杆菌o157:h7检测的基于背景消除的比率荧光探针及制备方法
CN114966012B (zh) 基于超顺磁性二维材料的低场核磁共振均相免疫检测食源性致病菌的方法
CN115856297B (zh) 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试剂盒的制备方法及试剂盒
CN116773442A (zh) 一种食源性致病菌快速光色多信号检测试剂盒及方法
CN110296972B (zh) 一种基于sers技术的金黄色葡萄球菌定量检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant