CN113278683B - 一种比率型ecl生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明构建了一种比率电化学发光(ECL)生物传感器，用于检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS‑COV‑2)的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)基因。熵驱动循环扩增反应由SARS‑COV‑2RdRp基因参与，然后输出一条Bandage DNA，可与另外两个单链S1和S2结合形成双链DNAWalker，开始下一个循环反应。双足DNA Walker完成行走过程后，将DNA四面体(TDNAs)顶部的发夹结构去除。随后，利用PEI‑Ru@Ti3C2@AuNPs‑S7探针与Au‑g‑C3N4表面被切除的TDNAs发夹部分进行特异性结合，通过电化学发光共振能量转移(ECL‑RET)实现信号变化。

Description

一种比率型ECL生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种比率型ECL生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的2019年新型冠状病毒病(COVID-19)的爆发，已经危及到全世界人民的健康。在开发有效的疫苗之前，为了防止新型冠状病毒疾病的传播，首先要快速准确地诊断COVID-19，尤其是对无症状患者的诊断。目前，市场上对新型冠状病毒疾病的检测主要有两种策略。一种策略是利用基于聚合酶链式反应(PCR)技术检测SARS-COV-2RNA。但PCR的操作过程比较复杂，需要设计不同的引物和温度，准确率低，通常会出现假结果。另一种策略是基于抗体的血清学和免疫学检测，但是，患者感染SARS-COV-2后，要等到体内产生抗体才能立即检测出病毒。因此，需要一种快速、准确、简单、可靠的检测方法来检测SARS-COV-2，以管理这一流行病。
与其他检测技术相比，电化学发光(ECL)具有灵敏度高、操作简单的特点，可用于实验各种分析物。传统的ECL策略依靠单一信号的强度来检测分析物，容易受到环境和底物等其他干扰因素的影响。然而，利用比率信号比来检测分析物的比率ECL可以有效避免环境和基质的干扰，检测精度提高。与双电压比对法相比，双波长比率发ECL生物传感器具有多共反应物和电压范围窄等两个优点。前者ECL生物传感器主要依靠供体和受体之间的电化学发光共振能量转移(ECL-RET)，通过重叠供体的ECL发射光谱和受体的紫外-可见光(UV-Vis)吸收光谱来提高双信号比。虽然Au纳米粒子(Au NPs)装饰的石墨-C3N4(Au-g-C3N4)具有良好的生物相容性和出色的发光效率，作为供体材料已经引起了人们的关注，但目前仍有大量适合的受体材料缺乏。巧合的是，Ru(II)在460-470nm处有较强的紫外-可见光吸收峰，与Au-g-C3N4的ECL发射峰重叠。
为了提高ECL生物传感器的灵敏度，各种循环扩增策略被引入，包括杂交链反应(HCR)、滚圈扩增(RCA)、催化发夹组装(CHA)、聚合酶链反应(PCR)等。这些循环扩增策略要么设计过程复杂，二级结构复杂，要么需要酶和可变温度参与反应。作为一种简单、等温、无酶、快速检测的策略，近年来提出了熵驱动反应。熵驱动反应是一种通过作用于脚趾的链式位移反应。在循环扩增过程中发生多次杂交和分离，然后形成大量靶标DNA。此外，自发的、可控的、可连续移动的酶驱动的轨道上的DNA Walker被引入生物传感器作为扩增策略。然而，由于单足DNA Walker的行走空间有限，无法提高行走效率。相比之下，双足DNA Walker具有较大的行走空间和较高的效率。因此，同时引入熵驱动和双足DNA Walker扩增策略，可以大大提高生物传感器的灵敏度。
DNA四面体(TDNAs)构建的电极表面可以降低背景信号，提高靶DNA的杂交效率。作为每条TDNA的四条单链之一，可以设计成与靶DNA结合的最长单链，具有合成容易、机械刚性强、捕获的探针在电极表面分布均匀等优点。DNA四面体传感器的ECL信号更高，当***中没有目标存在时，TDNAs传感器的背景信号较低。这是因为TDNAs构建的生物传感器可以有效防止非特异性吸附。因此，构建TDNAs生物传感器可以提高检测灵敏度。
发明内容
本发明提供一种快速、准确、简单、可靠的检测SARS COV-2RdRp的探针组、试剂或试剂盒。
第一，本发明提供一种探针组，其特征在于，所述探针组包括：
第一探针，为由4条单链DNA分子形成的四面体探针，4条单链DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.6所示；
第二探针，为2条单链DNA分子互补杂交得到，2条单链DNA分子的核苷酸序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO2所示；
第三探针，为1条单链DNA分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
可选的，所述探针组还包括第四探针，为3条单链DNA分子互补杂交得到，3条单链DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.10所示的单链DNA分子；可选的，所述探针组还包括第五探针，第五探针为1条单链DNA分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
可选的，所述四面体探针为由发夹结构修饰的四面体探针。
一种检测SARS COV-2RdRp的试剂或试剂盒，包括上述的探针组。
一种生物传感器，包括权利要求1所述的第一探针。
一种生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
S1：玻璃碳电极用Au-g-C3N4修饰，获得Au-g-C3N4/GCE；
S2：将在TDNAs通过金-硫键固定到Au-g-C3N4/GCE表面；TDNAs为第一探针。
可选的，还包括将Au-g-C3N4/GCE浸泡含MCH溶液中的步骤。
一种检测SARS COV-2RdRp的方法，包括利用上述的探针组、上述的试剂或试剂盒、上述的生物传感器、上述方法制备得到的生物传感器检测SARS COV-2RdRp基因的步骤。
可选的，上述方法具体包括如下步骤：
1)将上述制备得到的生物传感器在待测溶液中孵育；可选的，孵育时间为40min以上；孵育温度为37℃；
2)将含有第二探针和内切酶的溶液加入步骤1)孵育后的混合液中；
3)修饰有PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs的第三探针加入步骤2)的混合液中；
可选的，待测溶液包括Substrate和Fuel；
Substrate由SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.10所示的单链DNA分子形成的杂交复合物；
Fuel为SEQ ID NO.11所示的单链DNA分子。
可选的，所述生物传感器为比率型ECL生物传感器。
本发明合理设计了一种双波长比率型ECL生物传感器，结合熵驱动和双足DNAWalker循环扩增策略以及DNA四面体，检测SARS-COV-2RdRp基因，这种ECL生物传感器具有以下优点：
首先，在该比率型ECL生物传感器中，设计了Au-g-C3N4作为优良供体，PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs作为优良受体，以实现ECL-RET；
其次，与传统的DNA Walker不同，双足DNA Walker是通过Bandage DNA结合相邻的两只脚(S1和S2作为双足DNA Walker的两只脚)在行走轨道上行走。但是，没有通过BandageDNA结合的两只脚由于相距较远，无法在轨道上行走。此外，由发夹结构修饰的TDNA在电极表面作为双足DNA行走者的行走轨迹。
第三，将熵驱动和双足DNA Walker两种扩增策略结合起来，实现了超灵敏的检测。生物传感器的检测范围可以从10aM到10pM，检测限低至7.8aM。双波长比率ECL生物传感器用于人血清中表现出优异的回收率，可用于临床早期诊断。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是基于熵驱动和双足DNA Walker扩增策略、DNA四面体的比率型ECL生物传感器及用于检测SARS-COV-2RdRp基因的示意图；
图2(A)PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs的紫外-可见光吸收光谱(灰色曲线)和Au-g-C3N4的ECL光谱(红色曲线)，ECL曲线通过一系列滤光片获得，在含有0.1M S2O8 2-的0.1M PBS(pH＝7.4)中测量；
(B)Au-g-C3N4/GCE(曲线a)和PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs/GCE(曲线b)的ECL谱，在0V至-1.5V下扫描；
(C)为PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs-S7探针修饰前后的ECL强度变化曲线；曲线a为电极没有经过PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs-S7探针修饰时；曲线b为电极经过PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs-S7探针修饰时；
(D)在不同浓度(0aM，10aM，10fM和10pM)的SARS COV-2RdRp的比率型ECL生物传感器使用一系列间隔20nm的过滤器进行测试，在含有0.1M S2O8 2-的0.1M PBS(pH＝7.4)中测量；
图3(A)Au-g-C3N4的TEM表征，插图为g-C3N4；
(B)Au-g-C3N4的EDX光谱，插图为g-C3N4的EDX；
(C)g-C3N4(曲线a)和Au-g-C3N4(曲线b)的紫外-可见吸收光谱；
(D)g-C3N4(曲线a)和Au-g-C3N4(曲线b)的ECL强度曲线，g-C3N4(曲线a')和Au-g-C3N4(曲线b')的循环伏安曲线，在含有0.1M S2O8 2-的GCE测试中改性；
图4(A)Ti3C2的TEM表征；(B)PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs的TEM表征；(C)(B)的纳米粒子相应尺寸分布图；(D)PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs的EDX光谱；
图5凝胶电泳分析
(A)TDNAs构建过程；泳道1：S3，泳道2：S3-S4，泳道3：S3-S4-S5，泳道4：S3-S4-S5-S6；
(B)熵驱动的循环放大反应，泳道1:Scaffold，泳道2：Blocker，泳3：Bandage，泳道4：Substrate，泳道5Substrate+SARS-COV-2RdRp,泳道6:Substrate+SARS-COV-2RdRp+Fuel；
(C)双足DNA Walker，泳道1,S1探针，泳道2,S2探针，泳道3,S1+S2，泳道4,S1+S2+Bandage；
图6生物传感器的分步构建过程的特征
(A)通过循环伏安(CV)表征生物传感器的构建过程
(B)通过电化学交流阻抗谱(EIS)表征生物传感器的构建过程；
(C)用不同物质改性的电极的ECL响应；
(A)-(C)中：(a)裸GCE；(b)GCE/Au-g-C3N4；(c)GCE/Au-g-C3N4/TDNAs；(d)GCE/Au-g-C3N4/TDNAs/MCH；(e)GCE/Au-g-C3N4/TDNAs/MCH用SARS COV-2RdRp和Nb.BbvCI处理；(f)用PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs-S7进一步孵育；
图7A(a)在460纳米ECL信号强度与SARS-COV-2RdRp(10aM，100aM，1fM，10fM，100fM，1pM，10pM)浓度的对数之间的关系；(b)在620纳米ECL信号强度与SARS-COV-2RdRp(10aM，100aM，1fM，10fM，100fM，1pM，10pM)浓度的对数之间的关系
(B)SARS-COV-2RdRp的校准曲线；
(C)ECL生物传感器的稳定性；
分别在460纳米(左)和620纳米(右)对浓度为10pMSARS-COV-2RdRp进行16个连续测量；
(D)ECL生物传感器的选择性
(a)1pM的SARS-COV-2RdRp，(b)100pM的SARS-COV RdRp(SEQ ID NO.14所示的单链DNA分子)，(c)100pM的随机DNA，(d)空白溶液的比率；
ECL信号测量使用一系列间隔20nm的过滤器，在含有0.1M S2O8 2-的0.1M PBS(pH＝7.4)中测量。
具体实施方式
化学品和材料
三水氯化金(HAuCl4-3H2O)、柠檬酸钠、过硫酸钾(K2S2O8)和硼氢化钠(NaBH4)均来自阿拉丁生化科技有限公司。Ti3C2分散液和g-C3N4均来自江苏新农材料科技有限公司。Tris(4,4'-dicarboxylic acid-2,2'-bipyridyl)ruthenium(II)dicbloride(Ru(dcbpy)3Cl2)；来自中国苏州。三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)和6-巯基己醇(MCH)获得自Sigma-Aldrich(St Louis,MO,USA)。Nb.BbvCI和10×NEB缓冲液从New England Biolabs(美国)获得。DNA序列由Genscript Bio-technology Co.Ltd.合成仪器设备
透射电子显微镜(TEM)图像由JEOL(日本)公司的JEM-2100F获得。循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)由电化学工作站(上海晨华仪器有限公司，中国)测量，在5.0mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行。采用南京大学生命科学分析化学国家重点实验室的ECL-6B采集ECL信号。紫外-可见光吸收光谱用微孔板读数仪(Spectra Max M5e)测定,波长范围为250nm～700nm(Molecular Devices Co.Ltd.,USA)。原子力显微镜(AFM)图像由Dimension ICON(Bruker)获得。凝胶图像由Bio-Rad ChemDoc XRS拍摄。
Au-g-C3N4的制备：
将50μL的HAuCl4(0.01M)溶液和4mL的g-C3N4(0.15mg mL-1)混合在一起，超声搅拌10分钟，然后搅拌1小时。然后，向混合后的溶液中注入100μL新鲜的NaBH4(0.01M)溶液，在冰浴中处理20分钟。连续向上述混合溶液中加入50μL质量分数为1％柠檬酸钠溶液，并将混合溶液在25℃下连续搅拌20分钟。最后，为了除去多余的AuNPs、柠檬酸钠和NaBH4，将上述混合溶液以12000rpm的转速离心后用超纯水洗涤，并超声处理3次，得到纯净的Au-g-C3N4，将其重新分散在1mL H2O中，并在4℃下保存，以备下次实验使用。
PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs-S7探针的合成按照以下步骤：
1、将10mg三(4,4’-二羧酸-2,2’-联吡啶)钌(II)二氯化物[Ru(dcbpy)3 2+]、EDC和NHS同时溶于5mL PBS(0.1M，pH＝7.4)中，连续搅拌2h，得到含有Ru(dcbpy)3 2+的混合液中，该混合液中EDC终浓度为200mM，NHS终浓度为50mM；
2、将5ml 5mg/ml Ti3C2悬浮液和PEI混合均匀后，形成混合液A，混合液中PEI的质量分数为1％，将混合液A加入上述含有Ru(dcbpy)3 2+的混合溶液中1h。随后，向上述溶液中加入600μL HAuCl4(0.01M)和600μL新鲜NaBH4(0.01M)，搅拌1小时，为了去除多余的杂质，将制备的PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs离心，洗涤3次，重新分散在1mL PBS(0.1M，pH＝7.4)中。
3、为了制备PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs-S7探针，向1mL Ru@Ti3C2@AuNPs中加入200μL S7(10μM，S7为SEQ ID NO.12所示的单链DNA分子3’端巯基标记所得)，并在4℃的冰箱中储存过夜。成功制备了PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs-S7探针。
TDNAs的制备
将10μL的4个单链DNA (S3、S4、S5、S6；S3为SEQ ID NO.3所示单链DNA分子5’端巯基标记所得，S4为SEQ ID NO.4所示单链DNA分子5’端巯基标记所得，S5为SEQ ID NO.5所示单链DNA分子5’端巯基标记所得，S6为SEQ ID NO.6所示单链DNA分子5’端巯基标记所得)溶解在含有10mM TCEP和50mM MgCl2的PBS缓冲液(pH＝7.4)中。然后，将四种单链DNA混合在一起，在95℃下放置5分钟，冷却至室温，依次保存3小时。最后，得到坚固的TDNAs。
表1寡核苷酸的不同序列
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Figure BDA0003065327660000101
实施例1比率型ECL生物传感器的构建及用于检测SARS COV-2RdRp基因
一、比率型ECL生物传感器构建方法，包括如下步骤：
1、对玻璃碳电极(GCE)进行清洗。将10μL的Au-g-C3N4固定在GCE上以获得Au-g-C3N4/GCE，并在室温下干燥。随后，将得到的Au-g-C3N4/GCE浸泡在100μL含10mM TCEP的TDNAs(1μM)溶液中8小时，以减少S-S键。接着，将修饰后的GCE浸泡在60μL的MCH(100μM)溶液中1小时，以防止非特异性吸附。在上述每个步骤中，需要用PBS溶液洗去未连接的物质。将构建好的电极(MCH/TDNAS/Au-g-C3N4/GCE)存放在4℃的冰箱中，以备下次实验使用。
2、将MCH/TDNAS/Au-g-C3N4/GCE在37℃的熵驱动反应混合物中孵育40min，熵驱动反应混合物包括不同浓度的SARS-COV-2RdRp基因、Substrate和Fuel(浓度为1μM，如SEQ IDNO.11所示的单链DNA分子)；Substrate由Scaffold、Blocker和Bandage杂交形成(Scaffold、Blocker和Bandage依次为SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.10所示的单链DNA分子，三条链(摩尔比为1:1：1)在95度下条件下孵育五分钟后，再降温到室温下，得到稳定的杂交复合物)，Substrate浓度为1μM。并将两种单链S1(SEQ ID NO.1)、S2(SEQ ID NO.2)和Nb.BbvCI内切酶(10U)同时加入到混合溶液中，S1的终浓度为60nM，S2的终浓度为60nM，随后完成DNA Walker在电极表面的行走过程。最后，将合成的浓度为1.67μM的PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs-S7探针溶液滴在改性电极表面，得到PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs-S7/MCH/TDNAs/Au-g-C3N4/GCE(比率型ECL生物传感器)。
二、比率型ECL生物传感器构建成功的验证
1)基于Au-g-C3N4与PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs之间的ECL-RET原理，设计了比率型ECL生物传感器。如图2A所示，Au-g-C3N4的ECL发射光谱与PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs的紫外-可见光吸收光谱匹配良好。说明Au-g-C3N4供体和PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs受体之间可以实现ECL-RET。此外，当扫描电压为-1.5-0V，***存在S2O8 2-时，Au-g-C3N4/GCE上有ECL发射峰(图2B)。然而，PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs/GCE没有出现ECL发射峰，说明PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs受体在阴极电压下没有干扰Au-g-C3N4供体的ECL发射。
图2C为PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs-S7探针修饰前后的ECL强度变化曲线。当电极没有经过PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs-S7探针修饰时，在460nm处出现了强大的ECL信号，在620nm处出现了微弱的ECL信号。相反,当用PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs-S7探针修饰电极时,在460nm处出现微弱的ECL信号,在620nm处出现强大的ECL信号。进一步表明，Au-g-C3N4供体与PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs受体之间的ECL-RET是合理的。
如图2D所示，采用一系列滤光片来探讨ECL强度随SARS-COV-2RdRp基因不同浓度增加的变化。当SARS-COV-2RdRp在***中不存在时，只有ECL发射峰出现在460nm处。但随着浓度的增加，460nm处的ECL信号强度逐渐降低，相应地，620nm处的ECL发射峰继续增加。这些结果成功地证明了ECL-RET的比率型ECL生物传感器可以有效地检测SARS-COV-2RdRp基因。
2)Au-g-C3N4的表征
从图3A可以看出，8±1nm的AuNPs均匀地分散在Au-g-C3N4的表面。图3B是能量色散X射线(EDX)分析。结果表明，Au-g-C3N4的EDX谱中存在C、N、Au的元素峰，而g-C3N4的EDX谱中没有观察到Au的元素峰(如图3B插图所示)。
利用紫外-可见光吸收光谱对Au-g-C3N4进行表征，如图3C所示。其中，g-C3N4在360nm处拥有一个独特的峰，AuNPs在520nm处拥有一个特征峰。所制备的Au-g-C3N4含有两个特征，证明Au-g-C3N4合成成功。
图3D验证了Au-g-C3N4的ECL特性，Au-g-C3N4的ECL信号强度(曲线b)大于g-C3N4(曲线a)，这得益于Au NPs出色的导电性。CV曲线也验证了Au-g-C3N4(曲线b')与单组分g-C3N4(曲线a')相比，具有出色的导电性。
3)PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs的特性分析
图4A为单层Ti3C2的TEM表征。从图4B可以看出，AuNPs均匀地分散在Ti3C2的表面，没有出现聚集现象，说明Ti3C2作为一种优良的载体可以防止AuNPs的聚集。由图4C可见，AuNPs的直径为4.5±1nm。用EDX表征的PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs纳米复合材料中出现了C、N、O、Ti、Au、Ru的元素峰(图4D)，说明PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs纳米复合材料合成成功。
4)TDNAs的特性
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)来展示TDNAs的构建过程，如图5A所示。泳道1至4是由单链S1到四链TDNAs的构建过程。从凝胶中可以看出，随着DNA链数的逐渐增加，相应的带更靠后，这与预期结果一致。采用AFM对TDNA进行表征，TDNAs的高度为5±0.2nm，与理论值5.27nm几乎一致。这进一步证明了TDNAs的成功构建。
5)熵驱动和双足DNA Walker的特征分析
PAGE用于验证熵驱动反应，如图5B所示，Scaffold、Blocker和Bandage DNA的条带分别显示在道1、道2和道3。
道4为Scaffold、Blocker和Bandage DNA形成的Substrate。
在Substrate体系中引入SARS-COV-2RdRp，在Scaffold的帮助下，底物(Substrate)转化为Intermediate 2和Bandage DNA，在道5中可以看到两条新的带生成。
通过在体系中引入Substrate、SARS-COV-2(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的单链DNA分子)RdRp和Fuel，最终生成Waste，在道6中可以观察到Bandage和Blocker，但是SARS-COV-2RdRp没有参与反应。
图5C反映了双足DNA Walker的构造。当体系中没有Bandage DNA时，S1和S2不能相互结合(道3)，且带的位置与单一的S1(道1)或S2(道2)一致。但是，当体系中存在Bandage，S1和S2可以形成双足的DNA时，分子量较大，形成的复合物条带泳速很慢(道4)。因此，证明通过引入Bandage DNA，成功构建了双足DNA Walker。
6)分步组装比率型ECL生物传感器的特性分析
在图6A中，CV用来表征比率型ECL生物传感器的构建过程。裸电极(曲线a)保持了最大的电流峰值。当Au-g-C3N4(曲线b)沉积在电极表面时，电流峰值下降。然后继续在电极上修饰TDNAs(曲线c)和MCH(曲线d)，电流峰继续下降说明电极表面吸附的物质导电性差。当引入SARS-COV-2RdRp和Nb.BbvCI时(曲线e)，电极表面完成了DNA Walker的行走过程。因此，TDNAs被切除，峰值电流增加。最后，对PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs-S7探针的特异性结合(曲线f)进行修饰，修饰后的电极导致峰值电流增大。
图6B所示的EIS表征了该比率型ECL生物传感器的构建过程。裸电极(曲线a)的阻抗值最小。继续修饰Au-g-C3N4(曲线b)、TDNAs(曲线c)、MCH(曲线d)，阻抗值逐渐增大。当SARS-COV-2RdRp和Nb.BbvCI(曲线e)呈现时，表面的TDNA被剪掉，阻抗值略有降低。最后，将导电性好的PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs-S7探针(曲线f)在电极上进行修饰，得到的阻抗有所下降。
图6C所示为表征用不同物质改性的电极的ECL响应。将电极浸泡在含有0.1MS2O8 2-的PBS溶液中进行测量。裸电极(曲线a)没有ECL响应。在电极表面固定Au-g-C3N4(曲线b)，具有良好的发光性能，呈现较高的ECL信号。当将导电性能差的TDNA(曲线c)和MCH(曲线d)修饰在电极表面时，ECL信号逐渐降低。随后，引入SARS-COV-2RdRp(曲线e)，ECL信号略有恢复。最后，将PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs-S7探针(曲线f)与TDNAs连接，ECL信号降低。
通过以上三种方法，可以确认该比率型ECL生物传感器的构建成功。
7)优化分析条件
为了获得比率型ECL生物传感器的最佳性能，对一些实验参数进行了优化，包括DNA Walker S1和S2的浓度、Nb.BbvCI的用量、Nb.BbvCI的消化时间以及熵驱动反应的孵化时间。结果表明，随着S1和S2浓度的增加，ECL信号逐渐降低，并趋于稳定在60nM。当Nb.BbvCI的用量达到10U时,ECL曲线趋于稳定。Nb.BbvCI的最佳消化时间为60min。熵驱动反应的最佳时间为40min(将MCH/TDNAS/Au-g-C3N4/GCE在37℃的熵驱动反应混合物中孵育的最佳时间为40min)。因此，选择DNA walker的S1和S2的浓度为60nM，10U和60min为Nb.BbvCI的最佳用量和最佳消化时间，最佳熵驱动反应时间为40min。
三、比率ECL生物传感器的机理
基于熵驱动和DNA walker的循环扩增策略，本实施例合成了一种检测SARS-COV-2RdRp基因的比率型ECL生物传感器。熵驱动和DNA walker扩增策略的原理如图1所示。SARS-COV-2RdRp基因作为触发器启动左上角的熵驱动反应。借助于底物(由Scaffold、Blocker、Bandage三条链组成)，SARS-COV-2RdRp可以与Scaffold结合，形成Intermediate1。此时，由于Bandage DNA和Scaffold的结合力较弱，Bandage DNA被释放，Intermediate 1转化为Intermediate 2。Intermediate 2暴露出来的单链像“脚趾”一样的部分(称为toehold)与Fuel结合，产生双链Waste、Blocker和SARS-COV-2RdRp基因作为催化剂，刺激下一个循环。
经过多次循环，大量的Bandage DNA被输出。随后，S1链、S2链和Bandage结合成双足DNA Walker，以启动DNA Walker反应。最初，在Au-g-C3N4/GCE的表面上修饰TDNA，以获得460nm处的强ECL信号。在Nb.BbvCI内切酶的能量下，双足DNA Walker可以自发地在TDNAs顶部的发夹上行走。因此，大量的TDNAs顶部的发夹被去除，并与PEI-Ru@Ti3C2@AuNPs-S7探针特异性结合。通过ECL-RET，在460nm处的ECL信号被熄灭，在620nm处产生ECL信号。根据460nm处ECL信号的下降程度和620nm处ECL信号的增加程度，可以定量检测SARS COV-2RdRp基因。结合两种信号放大策略,该比率型ECL生物传感器有效地检测了SARS-COV-2RdRp基因。
实施例2用比率型ECL生物传感器检测SARS-COV-2RdRp
1、在实施例1摸索的最佳的条件下，采用实施例1中得到的比率型ECL生物传感器检测SARS-COV-2RdRp基因(检测方法见实施例1中的第一)。图7A描述了随着SARS-COV-2RdRp浓度从10aM增加到10pM，ECL信号强度在460nm处下降，在620nm处增加。图7A还描述了460nm处ECL信号强度的变化具有很好的线性关系，即y＝-502.82lgC(RdRp)-986.17，R2＝0.9944。620nm处ECL信号强度的变化也显示出y＝805.79lgC(RdRp)+14704.28的优良线性关系，R2＝0.9950。为了获得更高的可靠性，评价了随着SARS-COV-2RdRp浓度的增加，ECL(460nm)/ECL(620nm)的对数值，如图7B所示。根据检测限(LOD)＝3σ/k，计算出LOD为7.8aM。
2、比率型ECL生物传感器(实施例1中的)的选择性和稳定性
为了评估比率生物传感器的选择性，引入了一些干扰。当比率型ECL生物传感器检测的熵驱动反应混合物分别含有1pM的SARS-COV-2RdRp、100pM的SARS-COV RdRp、100pM的随机DNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的单链DNA分子)和空白中(检测方法见实施例1中的第一)。从图7D可以看出，由SARS-COV-2RdRp处理的比率型ECL生物传感器与其他干扰物处理的比率型ECL生物传感器相比，表现出明显的区别。因此，所构建的比率型ECL生物传感器具有出色的选择性。为了评估比率型ECL生物传感器的稳定性，用比率型ECL生物传感器检测PBS中含有的浓度为10pM SARS-COV-2RdRp(SEQ ID NO.13)，连续扫描16个周期。从图7C可以看出，ECL信号在460nm处仍然稳定，相对标准偏差(RSD)为2.34％，ECL信号在620nm处稳定，RSD为3.61％。
3、比率型ECL生物传感器在实际样品分析中的适用性
生物传感器用于临床早期检测是很有必要的。回收实验在50倍稀释的人血清中进行，如表2所示。该比率型ECL生物传感器检测含有不同浓度SARS-COV-2RdRp的血清(检测方法见实施例1中的第一)，发现其回收值为92.00％～103.56％，RSD为1.51％～4.30％。结果表明,该比率型ECL生物传感器可用于实际样品的检测。
表2.SARS-COV-2RdRp在50倍稀释的人血清中的检测回收结果。
Figure BDA0003065327660000181
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 江苏省原子医学研究所
<120> 一种比率型ECL生物传感器及其制备方法和应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggttcggaaa tctcctgatg agtttttttt ttttttccaa cgatcctcag caaggt 56
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gggacgtaac agcatacgct tccgaacctt tttttttttt ttccaacgat cctcagcaag 60
gt 62
<210> 3
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgcagaacct tgctgaggat cgttggttct gcatttttat gccatagcca gatacgttcc 60
taaggattct taggctttcc cttaaaggcc taaagg 96
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgtatctggc tatggcattt cttaggctag aggtttgctt ttactaggag acttcagc 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gattccatgg cttcctattt gcaaacctct agcctaagtt cctttaggcc tttaaggg 58
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ataggaagcc atggaatctt agcctaagaa tccttaggtt gctgaagtct cctagtaa 58
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggcaatggta aacctatacg actgaatact 30
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
attcattgga caatggcgag catacgcatc tcctgatgag gttccacctg 50
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgccattgtc caatgaat 18
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctcatcagga gatgcgtatg ctgttacgtc cc 32
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctcatcagga gatgcgtatg ctcgccattg tccaatgaat 40
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aatgcagaac caacg 15
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
caggtggaac ctcatcagga gatgc 25
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccaggtggaa catcatccgg tgatgc 26

Claims (6)

1.探针组，其特征在于，所述探针组包括：
第一探针，为由4条单链DNA分子形成的四面体探针，4条单链DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.6所示；
第二探针，为2条单链DNA分子互补杂交得到，2条单链DNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示；
第三探针，为1条单链DNA分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述探针组还包括第四探针，为3条单链DNA分子互补杂交得到，3条单链DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.10所示的单链DNA分子；所述探针组还包括第五探针，第五探针为1条单链DNA分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
2.一种检测SARS COV-2RdRp的试剂或试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的探针组。
3.根据权利要求2所述的检测SARS COV-2RdRp的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括生物传感器，所述生物传感器包括权利要求1中所述的第一探针。
4.根据权利要求3所述的检测SARS COV-2RdRp的试剂或试剂盒，其特征在于，所述生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
S1：玻璃碳电极用Au-g-C3N4修饰，获得Au-g-C3N4/GCE；
S2：将TDNAs通过金-硫键固定到Au-g-C3N4/GCE表面；所述TDNAs为权利要求1中的第一探针。
5.根据权利要求4所述的检测SARS COV-2RdRp的试剂或试剂盒，其特征在于，还包括将Au-g-C3N4/GCE浸泡含MCH溶液中的步骤。
6.根据权利要求5所述的检测SARS COV-2RdRp的试剂或试剂盒，其特征在于，所述生物传感器为比率型ECL生物传感器。
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