CN113278544B - 一种副干酪乳杆菌、其发酵液的制备方法、应用及产品 - Google Patents

一种副干酪乳杆菌、其发酵液的制备方法、应用及产品 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种副干酪乳杆菌、其发酵液的制备方法、应用及产品。所述副干酪乳杆菌，其分类命名为LactobacilluspuracaseiXS45m3，于2021年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M2021391。本发明提供的副干酪乳杆菌发酵液，经实验证实，无细胞毒性，促进胶原蛋白增生的作用使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性。能应用于制备包括提高皮肤弹性、清除皮肤自由基在内的抗衰老用皮肤外用涂覆剂。

Description

一种副干酪乳杆菌、其发酵液的制备方法、应用及产品
技术领域
本发明属于微生物领域，更具体地，涉及一种副干酪乳杆菌、其发酵液的制备方法、应用及产品。
背景技术
随着工业化程度和人们生活水平的提高，衰老、敏感、痘痘等一系列的皮肤问题受到越来越多人的关注。
目前公认的益生菌除了对肠道菌群有显著影响外，一些益生菌菌株还可以在皮肤水平上显示出强大的免疫调节、平衡皮肤微生态等特性，体现在改善神经肽介导的皮肤炎症，修复受损的皮肤屏障，抑制皮肤有害菌群，调节皮肤微生态平衡等功能。
副干酪乳杆菌是一种革兰氏阴性菌，作为一种国家批准的可食用益生菌，普遍运用于乳制品、保健品、饮料、幼儿食品中，是经市场认可的有益菌，具有调节肠道健康的有益效果。
在改善皮肤方面，有研究采用离体皮肤器官评价副干酪乳杆菌的效果，发现副干酪乳杆菌可以调节与皮肤相关的反应性炎症机制，在恢复皮肤屏障功能和皮肤反应性相关的关键生物学过程中均有有益作用，也报道了口服副干酪乳杆菌在改善皮肤屏障功能恢复及减少局部皮肤发炎方面的作用，此外有研究显示副干酪乳杆菌发酵液具有显著的抗氧化能力，同时是一种无细胞毒性的生物表面活性剂，可作为优异的护肤品原料，这都提示了我们副干酪乳杆菌在护肤应用上具有巨大的潜力。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种副干酪乳杆菌、其发酵液的制备方法、应用及产品，其目的在于利用所述副干酪乳杆菌发酵液所独具的优异的促进胶原蛋白含量提升的作用，将其作为具有抗皱或抗衰作用的皮肤外用涂敷剂的有效成分，由此提供一种低成本的效果卓越的抗衰老或抗皱成分。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种副干酪乳杆菌，其分类命名为Lactobacillus puracaseiXS45m3，于2021年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2021391。
按照本发明的另一个方面，提供了所述副干酪乳杆菌发酵液的制备方法，其包括以下步骤：
将活化后的菌种按照1％～3％的接种量接种至发酵培养基；
发酵培养基中加入以干重计质量分数在1-3‰的红景天、1-3‰的千年草、1-3‰的银耳，作为发酵营养料。
发酵完成后过滤除菌，获得滤液为所述副干酪乳杆菌发酵液。
优选地，所述副干酪乳杆菌发酵液的制备方法，其发酵培养基中加入以干重计质量分数在2‰的红景天、3‰的千年草、1‰的银耳，作为发酵营养料。
优选地，所述副干酪乳杆菌发酵液的制备方法，其所述发酵培养基按照如下方法之一制备：
发酵培养基1：每取5-10g大豆蛋白粉、3-5g豆粕、1-5g淀粉、1-5g NaCl、以及0.5-1g MgSO4，定容至1L，调节pH值在4-7之间；或
发酵培养基2：每取30mL-50mL燕麦酶解液、1-5g胶原蛋白粉、1-5g豆粕、0.5-2g葡萄糖、1-5g NaCl、以及0.1-0.5g FeSO4，定容至1L，调节pH值在5-6之间；所述燕麦酶解液制备方法如下：每5-10g燕麦粉碎后，加入100mL水混匀后加热至40℃，加入2-5g淀粉酶解3-5小时。
优选地，所述副干酪乳杆菌发酵液的制备方法，其所述发酵培养基按照如下方法制备：
发酵培养基1：每取5g大豆蛋白粉、3g豆粕、5g淀粉、5g NaCl、以及0.5MgSO4，定容至1L，调节pH值至6；或
发酵培养基2：每取30mL燕麦酶解液、5g胶原蛋白粉、5g豆粕、2g葡萄糖、5g NaCl、以及0.1g FeSO4，定容至1L，调节pH值至6；所述燕麦酶解液制备方法如下：每5g燕麦粉碎后，加入100mL水混匀后加热至40℃，加入2g淀粉酶解5小时。
优选地，所述副干酪乳杆菌发酵液的制备方法，其发酵条件为：置于37℃摇床120rpm培养48小时。
按照本发明的另一个方面，提供了所述副干酪乳杆菌发酵液的应用，其特征在于，应用于制备皮肤外用涂覆剂。
优选地，所述的副干酪乳杆菌发酵液的应用，其应用于制备包括提高皮肤弹性、清除皮肤自由基在内的抗衰老用皮肤外用涂覆剂。
按照本发明的另一个方面，提供了一种皮肤外用涂覆剂，其包括所述副干酪乳杆菌发酵液。
优选地，所述皮肤外用涂覆剂，其含有5％-20％的所述副干酪乳杆菌发酵液。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明提供的副干酪乳杆菌发酵液，经实验证实，无细胞毒性，促进胶原蛋白增生的作用使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性。能应用于制备包括提高皮肤弹性、清除皮肤自由基在内的抗衰老用皮肤外用涂覆剂。
优选方案，选取具有促进所述副干酪乳杆菌XS45m3生长作用明显的益生元：千年草、红景天、银耳，通过恰当配比作为营养包，促进所述副干酪乳杆菌发酵效果，结果显示促进胶原蛋白含量提升15％，尤其是在配合含有燕麦酶解液的发酵培养基2时，提升效果尤为明显，甚至超过50％。说明含有恰当配比益生元的发酵培养基，其成分对副干酪乳杆菌XS45m3生长及其发酵液促进胶原蛋白含量提升的能力具有较大影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的副干酪乳杆菌，其分类命名为Lactobacillus puracasei XS45m3，于2021年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2021391。
其酵液的制备方法，包括以下步骤：
将活化后的菌种按照1％～3％的接种量接种至发酵培养基，置于37℃摇床120rpm培养48小时；
所述活化后的菌种，按照如下方法制备：
取出保存于-80℃冰箱的副干酪乳杆菌甘油冻存管，置于室温融化后在无菌环境下使用接种环挑取菌种，划线接种于MRS固体平板上，37℃培养24小时，观察平板上菌落形态确认为副干酪乳杆菌且无污染后，挑取平板上的单菌接种至MRS液体培养基中，37℃培养24小时得到所述活化后的菌种。
所述发酵培养基按照如下方法制备：
发酵培养基1：5g大豆蛋白粉、3g豆粕、5g淀粉、5g NaCl、0.5g MgSO4，定容至1L，调ph调至4-7。
发酵培养基2：30mL燕麦酶解液(5g燕麦粉碎后，加入100mL水混匀后加热至40℃，加入2g淀粉酶解5小时)、5g胶原蛋白粉、5g豆粕、2g葡糖糖、5g NaCl、0.1g FeSO4，定容至1L，ph调至5-6。
发酵时加入以干重计质量分数在1-3‰的红景天、1-3‰的千年草、以及1-3‰的银耳，作为发酵营养料；优选加入含有2‰红景天、3‰千年草、1‰银耳的发酵营养料。
发酵完成后过滤除菌，获得滤液为所述副干酪乳杆菌发酵液。
本发明提供的副干酪乳杆菌涂覆剂，可用于制备皮肤外用涂覆剂，如面霜、面膜等，具有提高皮肤弹性、清除皮肤自由基的抗皮肤衰老效果；其中副干酪乳杆菌发酵液的添加比例在5-20％之间。
以下为实施例：
实施例1益生菌的分离纯化及保种
实验室收集得到18-28岁健康人群的面部皮肤微生物样本，经无菌无氧水梯度稀释后，选择适宜梯度的稀释液涂布于MRS固体培养基，37℃培养48小时。挑取典型菌落划线于MRS固体培养基2-3次，培养得到纯菌落。经16S rDNA分子鉴定为一株副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌XS45m3(Lactobacillus puracaseiXS45m3)，该菌株已于2021年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC。
实施例2
选取银耳、灵芝、鹰嘴豆、红景天、茯苓、苦瓜、千年草共7种材料粉碎，分别按照5‰的质量比添加至MRS培养基中，以空白的MRS培养基为对照，分别接入2％活化好的副干酪乳杆菌XS45m3，培养24小时后梯度稀释，取适宜的稀释浓度平板涂布计数。
Figure BDA0003059252220000051
结果如上表所示，在MRS培养中添加不同的植物成分，对副干酪乳杆菌的生长有不同的影响，其中银耳、红景天、茯苓、千年草对其生长有促进作用，灵芝、鹰嘴豆、苦瓜对其生长有抑制作用。本发明选取三种对副干酪乳杆菌生长促进作用最为明显的植物成分作为发酵时的营养包，分别为银耳、红景天与千年草。
实施例3
(1)菌种活化
取出保存于-80℃冰箱的副干酪乳杆菌XS45m3甘油冻存管，置于室温融化后在无菌环境下使用接种环挑取菌种，划线接种于MRS固体平板上，37℃培养48小时，观察平板上菌落形态确认为副干酪乳杆菌菌且无污染后，挑取平板上的单菌接种至MRS液体培养基中，37℃培养24小时备用。
(2)发酵培养基的制备
发酵培养基1：5g大豆蛋白粉、3g豆粕、5g淀粉、5g NaCl、0.5g MgSO4，离子水定容至1L，调ph调至6。
发酵培养基2：30mL燕麦酶解液(5g燕麦粉碎后，加入100mL离子水混匀后加热至40℃，加入2g淀粉酶解5小时)、5g胶原蛋白粉、5g豆粕、2g葡糖糖、5g NaCl、0.1g FeSO4，离子水定容至1L，ph调至6。
(3)发酵营养料的制备
称取1-3g红景天、1-3g千年草、1-3g银耳，分别添加到发酵培养基1和发酵培养基2，混合均匀后得到发酵营养料。
(4)益生菌发酵
菌种活化得到的菌液按照1％-3％的接种量接种至发酵培养基中，并加入不同的发酵营养料，置于37℃摇床120rpm培养48小时。
Figure BDA0003059252220000061
(5)发酵液过滤
益生菌发酵完成后过滤，滤液为益生菌发酵液。
实施例4细胞毒性评价实验
以3×104细胞/孔的密度将HaCaT细胞接种到96孔板中，37℃、5％CO2条件下培养24小时后吸除上清，按照实验方案分组，实验组每孔分别加入100μL含有5％实施例3制备的发酵液S1-S6的无血清DMEM培养液；阴性对照组使用无血清DMEM培养液。37℃，5％CO2条件下培养24小时，吸除上清，加入100μL含有5mg/mL MTT溶液的培养基，37℃温育4小时，除去MTT溶液，加入100μL DMSO避光低速震荡10分钟，于490nm处测定吸光值。每组实验设置3个平行，结果以均值±标准差表示。
细胞相对存活率＝An/A0
注：An为实验组吸光值，A0为阴性对照组吸光值。
Figure BDA0003059252220000071
根据ISO 10993-5:2009描述的毒性评价标准，细胞存活率高于70％时可定义为无细胞毒性；以上结果证实，实施例3中制备的发酵液无细胞毒性。
实施例5发酵液刺激胶原蛋白增生实验
以5×103细胞/孔的密度将HSF细胞接种到96孔板中，37℃，5％CO2条件下培养24小时，吸走上清后根据实验分组
实验组：每孔中分别加入100μL含有5％实施例3制备的发酵液A1-A6的DMEM(无血清)培养基；
对照组：每孔中加入DMEM(无血清)培养基100μL；
37℃，5％CO2条件下培养48小时，收集培养基上清，使用ELISA试剂盒检测Ⅰ型胶原。每组实验设置3个平行，结果以均值±标准差表示。
Figure BDA0003059252220000081
注：“*”表示与对照组比较，P<0.05。
胶原蛋白含量的增加可以使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性。由表-可知，经实施例3制备的发酵液S1-S6处理的HSF细胞与未经处理的HSF细胞所产生的胶原蛋白相比较，实验组的胶原蛋白含量均有提高，且与对照组差异显著，其中实验组中S2、S4、S6的胶原蛋白含量高于S1、S3、S5。表明S1-S6发酵液都可刺激HSF细胞产生胶原蛋白，发酵培养基1与发酵培养基2发酵制备的发酵液相比，发酵培养基2发酵制备的发酵液刺激HSF细胞产生胶原蛋白含量较高。其中最佳组合为S4。
实施例6
以5×103细胞/孔的密度将HSF细胞接种到96孔板中，37℃，5％CO2条件下培养24小时，吸走上清后根据实验分组。
实验组：每孔中加入含有H2O2(400μmol/L)的DMEM(无血清)培养基100μL，处理1小时后，吸除上清，使用PBS清洗去除H2O2后，每孔中分别加入100μL含有5％实施例3制备的发酵液S1-S6的DMEM(无血清)培养基；
模型组：每孔中加入含有H2O2(400μmol/L)的DMEM(无血清)培养基100μL，处理1小时后，吸除上清，使用PBS清洗去除H2O2后，加入100μL的DMEM(无血清)培养基；
对照组：每孔中加入DMEM(无血清)培养基100μL；
培养24h，将细胞用PBS洗涤，并与40μM H2DCFDA在37℃温育30分钟。然后将细胞置于多功能酶标仪上在485nm的激发波长和528nm的发射波长下测量每孔的荧光强度。每组实验设置3个平行，结果以均值±标准差表示。
Figure BDA0003059252220000091
注：“*”表示与对照组比较，P<0.05。
由表-可知，经H2O2处理的HSF细胞(模型组与实验组)与未经处理的HSF细胞(对照组)内ROS比较，模型组与实验组细胞内ROS含量显著高于对照组，其中模型组细胞内ROS含量最高，实验组经实施例3制备的发酵液S1-S6干预后，其细胞内ROS含量显著下降，均低于模型组细胞内ROS含量；且发现相同发酵程序中，发酵培养基2发酵制备的发酵液处理的细胞内ROS含量，低于发酵培养基1发酵制备的发酵液处理的细胞内ROS含量。表明H2O2可刺激HSF细胞内产生大量的ROS，通过副干酪乳杆菌发酵液进行干预，可有效清除细胞内ROS含量，且发酵培养基2发酵制备的发酵液清除细胞内ROS优于发酵培养基1发酵制备的发酵液。
实施例7人群实验
经实施例3制备的发酵液S4按照5％加入到面霜中，应用于人体皮肤表面。选择年龄28-45岁的受试者10人，共分为2组，每组样品受试者5人。受试者每天早晚洁面后，将面霜均匀涂抹于面部，连续使用2周，在试验期间受试者不使用其他护肤品及药物，并保持正常的作息及饮食。在试验的开始前和结束后分别对受试者皮肤进行评价。面霜基料由湖北嫦娥药业有限公司提供。
Figure BDA0003059252220000092
Figure BDA0003059252220000101
经实施例3制备的发酵液S4按照10％加入到面膜液中，将面膜纸浸泡到25mL含有发酵液的面膜液中。选择年龄28-45岁的受试者10人，共分为2组，每组样品受试者5人，每周使用2次，连续使用4周，在试验期间受试者不使用其他护肤品及药物，并保持正常的作息及饮食。在试验的开始前(0d)、中间(14d)和结束后(28d)分别对受试者皮肤进行评价。面膜液基料由湖北嫦娥药业有限公司提供。
Figure BDA0003059252220000102
实验结果如下表：
面霜实验结果
Figure BDA0003059252220000103
面膜实验结果
Figure BDA0003059252220000104
Figure BDA0003059252220000111
注：毛孔“+”的个数越多，表示毛孔与越大；弹性“+”的个数越多，表示皮肤弹性越好；光泽“+”越多，表示皮肤光泽越好；皱纹“+”越多，表示皮肤皱纹越多；黑色素“+”越多，表示皮肤黑色素沉着越多。
从实验结果可以看出，本发明提供的含有实施例3制备的副干酪乳杆菌发酵液S4的面霜和面膜能够具有增加肌肤弹性、提升肌肤光泽，改善肌肤毛孔粗大、减少皱纹的功效，发酵液S4是一种抗肌肤衰老的有效成分。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种副干酪乳杆菌，其特征在于，其分类命名为Lactobacillus puracasei XS45m3，于2021年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2021391。
2.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌的发酵液制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将活化后的菌种按照1%~3%的接种量接种至发酵培养基；
发酵培养基中加入以干重计质量分数在1-3‰的红景天、1-3‰的千年草、1-3‰的银耳，作为发酵营养料，在发酵培养料中进行发酵；
发酵完成后过滤除菌，获得滤液为所述副干酪乳杆菌发酵液。
3.如权利要求2所述的副干酪乳杆菌的发酵液制备方法，其特征在于，发酵培养基中加入以干重计质量分数在2‰的红景天、3‰的千年草、1‰的银耳，作为发酵营养料。
4.如权利要求2所述的副干酪乳杆菌的发酵液制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为：
发酵培养基1：每取5g大豆蛋白粉、3g豆粕、5g淀粉、5g NaCl、以及0.5 MgSO4，定容至1L，调节pH值至6。
5.如权利要求2所述的副干酪乳杆菌的发酵液制备方法，其特征在于，所述发酵培养基按照如下方法制备：
发酵培养基2：每取30mL燕麦酶解液、5g胶原蛋白粉、5g豆粕、2g葡萄糖、5g NaCl、以及0.1g FeSO4，定容至1L，调节pH值至6；所述燕麦酶解液制备方法如下：每5g燕麦粉碎后，加入100mL水混匀后加热至40℃，加入2g淀粉酶解5小时。
6.如权利要求2所述的副干酪乳杆菌的发酵液制备方法，其特征在于，发酵条件为：置于37℃摇床120rpm培养48小时。
7.如权利要求2至6任意一项中所述的副干酪乳杆菌发酵液的应用，其特征在于，应用于制备皮肤外用涂覆剂。
8.如权利要求7所述的副干酪乳杆菌发酵液的应用，其特征在于，应用于制备包括提高皮肤弹性、清除皮肤自由基在内的抗衰老用皮肤外用涂覆剂。
9.一种皮肤外用涂覆剂，其特征在于，包括如权利要求2至6任意一项中所述的副干酪乳杆菌发酵液。
10.如权利要求9所述的皮肤外用涂覆剂，其特征在于，含有5%-20%的如权利要求2至6任意一项中所述的副干酪乳杆菌发酵液。
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