CN113274495A - 一种光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物及制备使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物及制备使用方法,合成方法包括如下步骤:(1)乙酰葡萄糖胺与多巴胺进行氧化共沉积,脱乙酰化得到葡萄糖胺,制备得到阳离子单糖改性的聚多巴胺纳米材料(PDG)。(2)利用PDG上邻苯双酚结构的还原性,将HAuCl4原位还原为单质金纳米颗粒,制备合成葡萄糖胺改性的聚多巴胺@金杂化纳米材料(PDG@Au)。(3)将NO供体TCF和PDG@Au共混于玻璃样品瓶中,磁力搅拌离心洗涤得到PDG@Au‑NO纳米材料。(4)在PDG@Au表面修饰由单体N‑3‑丙烯酰胺基苯基硼酸(APBA)与单体4‑丙烯酰基吗啉(AMP)通过RAFT聚合制备而成的双嵌段共聚物p(AM‑b‑APBA),制备PDG@Au/PBA。此合成方法得到的纳米材料具有良好的抗菌和对生物被膜的消散作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程材料领域,涉及一种光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物及制备使用方法。
背景技术
由于细菌进化和生存的需要以及抗生素的滥用,使得细菌耐药性问题变得日趋严峻。据统计80%的细菌都是以生物被膜的形式存在,无论是在恶劣环境还是抗生素存在的条件下均显示出了极强的抗性。为了应对不可忽视的耐药菌危机,一方面,需要减少抗生素的用量,避免抗生素的滥用,另一方面,开发新的针对细菌生物被膜感染的治疗方法也变得迫在眉睫。
NO(Nitric oxide)作为气体信号分子,可通过调节细菌细胞中的细胞内第二信使环鸟苷二磷酸(Cyclicdiguanylate-guanosine monophosphate,c-di-GMP)从而诱导细菌生物被膜的消散。研究表明,细胞内c-di-GMP调控着生物被膜的生命周期,包含附着,定植,成熟和扩散等过程。通常,c-di-GMP的浓度增加会促进生物被膜形成,而其浓度降低则会使更多的细菌进入浮游模式,但具体的c-di-GMP调控的机制尚未完全阐明。在生物被膜生命周期的发展后期,通过内源性合成NO来激活细菌磷酸二酯酶降解c-di-GMP,从而促进生物被膜的消散。此外,生物被膜也可由低浓度的外源性NO 来进行诱导消散,因此近年来也出现了许多基于外源性NO的抗生物被膜策略。然而,由于NO的自由基性质,其在生物环境中的半衰期相对较短而难以被直接应用于消散生物被膜的抗菌策略。
为了在较长的治疗时间内实现NO的高效负载和持续释放,就需要适当的储存和递送载体。为此,我们选择了葡萄糖胺修饰的聚多巴胺@金杂化纳米材料作为一氧化氮的载体,以巯基修饰的N-亚硝基-N-氧基-对-硫代甲基苯并胺盐(Thiolated Cupferron, TCF)作为热敏型的NO供体,通过与纳米载体上金纳米颗粒形成的金-硫键实现NO 的有效负载。该体系兼具近红外光响应释放NO的特性和良好的光热转化性能,能够在近红外光的辐照下,协同NO气体疗法和光热疗法实现对生物被膜的有效清除。
发明内容
要解决的技术问题
为了避免现有技术的不足之处,本发明提出一种光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物及制备使用方法。
技术方案
一种光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物,其特征在于:以葡萄糖胺和亲水性嵌段共聚物修饰的聚多巴胺@金杂化纳米材料为载体,以巯基修饰的N-亚硝基(4- 巯基甲基苯基)-羟胺铵为热敏型NO供体;各组分的及其含量范围为:
本发明中,载体通过多巴胺与葡萄糖胺氧化共聚,实现了纳米载体等电点的提高,以至于在生理pH下呈正电荷。其次,利用聚多巴胺上邻苯二酚对贵金属离子的还原性制备了具有生物成像潜力的聚多巴胺@金纳米杂化材料。最后,通过pH响应的苯硼酸酯键在其表面修饰上亲水性嵌段共聚物构建了生物被膜微酸环境响应的电荷反转表面,实现了纳米载体在生物被膜中的长滞留时间。所述模型药物通过与纳米载体上金纳米颗粒形成的金-硫键实现有效负载,可凭借纳米载体的光热转化特性,实现NIR 光致释放NO。
一种所述光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物的制备方法,其特征在于步骤如下:
步骤1、合成抗生物被膜的聚多巴胺@金杂化纳米材料:
1.1)将三羟甲基氨基甲烷在室温下溶于200mL的超纯水并置于容器中,得到三羟甲基氨基甲烷的水溶液;所述的三羟甲基氨基甲烷水溶液的浓度为1-2mg/mL,三羟甲基氨基甲烷的物质的量为2mM;
1.2)室温下,将乙酰葡萄糖胺与多巴胺盐酸盐依次加入步骤1.1)得到的三羟甲基氨基甲烷水溶液中,反应1-1.5h,得到混合溶液;所述的步骤1.2)中乙酰葡萄糖胺与多巴胺盐酸盐的摩尔比为1:1-1.5;
1.3)将浓盐酸与混合溶液在80-90℃下冷凝回流,反应1-1.5h得到的PDG纳米粒子溶液;所述混合溶液的质量浓度为1-2mg/mL,浓盐酸的物质的量为12M;
1.4)将PDG纳米粒子溶液与HAuCl4分散在装有20mL超纯水中,在室温下磁力搅拌1-2h使其完全反应;反应结束后将产物转移至离心管中进行离心处理后,最后分散在pH为7.4的PBS缓冲液中,得到产物PDG@Au;所述的PDG纳米粒子溶液的浓度为0.1-0.2mg/mL,HAuCl4的物质的量为0.25mM;
步骤2:合成双嵌段共聚物p(AM-b-AMPBA)修饰的PDG@Au纳米粒子
2.1)在0℃下,将3-氨基苯基硼酸溶解于NaHCO3溶液中并搅拌,使用恒压滴液漏斗在15分钟内将预冷的丙烯酰氯逐滴加入到剧烈搅拌的混合物中,再将HCl溶液缓慢加入至pH达到1.0,此时溶液中有大量白色沉淀产生;将反应混合物过滤并用冷水洗涤,滤液用乙酸乙酯萃取3次;有机相用饱和食盐水洗涤,减压蒸发除去溶剂,得到褐色固体,将其与上述白色沉淀合并后在超纯水中重结晶,得到产物灰白色APBA 晶体;所述的3-氨基苯基硼酸、NaHCO3溶液与丙烯酰氯的摩尔比为1:4:2;
2.2)将链转移试剂2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸与APBA晶体以及引发剂偶氮二异丁腈在室温下溶于体积比为95/5的DMF/H2O混合溶剂中,并置于 Schlenk反应管中,利用双排管***对体系进行除氧操作后,封闭Schlenk反应管,然后置于70-80℃的油浴中,反应24-36h后将Schlenk反应管放入液氮中骤冷以停止聚合反应;然后在剧烈搅拌下将解冻后的溶液逐滴加入100mL无水***中,产生大量淡黄色沉淀;悬浊液使用布氏漏斗抽滤并用***多次洗涤黄色沉淀;室温下真空干燥 2-4h后得到产物大分子链转移试剂pAPBA-CTA;APBA晶体的摩尔浓度为1-2mol/L, [APBA]:[DMP]:[AIBN]的摩尔比为30:1:0.1;
2.3)将单体4-丙烯酰基吗啉与链转移试剂pAPBA-CTA和引发剂AIBN在室温下溶于体积比为95/5的DMF/H2O混合溶剂中,并置于10mL Schlenk反应管中,利用双排管***对体系进行除氧操作后,封闭Schlenk反应管,然后置于70-75℃的油浴中,反应24-36h后将Schlenk反应管放入液氮中骤冷停止反应;解冻后,在搅拌下将上述 Schlenk反应管中的反应混合物逐滴加入过量***中,产生大量白色沉淀;悬浊液使用布氏漏斗抽滤并用***多次洗涤白色沉淀,在室温下真空干燥2-4h后得到共聚物p(AM-b-AMPBA)-CTA;所述[AMP]:[pAPBA-CTA]:[AIBN]的摩尔比为70:1:0.1,单体 AMP的浓度为1mol/L;
2.4)将步骤1.4)中得到的PDG@Au溶液和步骤2.3)中得到的p(AM-b-AMPBA) 分散在装有pH值为9.5的20-30mL的PBS中,在冰盐浴中磁力搅拌,直到反应完全;接着以9000-10000rpm离心10-20分钟,用pH 7.4PBS缓冲液离心洗涤两次并冷冻干燥得到PDG@Au/PBA纳米载体;所述PDG@Au溶液的浓度为0.1mg/mL, p(AM-b-AMPBA)的浓度为0.7μg/mL;
步骤3:合成光致释放NO抗生物被膜的纳米材料
3.1)将固体硫代乙酸钾和4-硝基苄基溴置于装有15mL无水四氢呋喃的圆底烧瓶中,在25-35℃下搅拌12-15h得到4-硝基苄基乙硫醇酸酯;通过减压蒸馏除去四氢呋喃来纯化该产物后再溶于二氯甲烷中,并使用分液漏斗用水洗涤三次,前两次为去离子水,最后一次为饱和食盐水;之后,使用无水硫酸钠干燥二氯甲烷溶液后,通过减压蒸馏除去二氯甲烷,得到产物4-硝基苄基乙硫醇酯;所述的硫代乙酸钾和4-硝基苄基溴的摩尔比为1-2:1;
3.2)将4-硝基苄基乙硫醇酸酯溶于甲醇溶液中,再将其与氯化铵水溶液混合,其中MeOH:H2O比例为5:1,得到混合溶液;将上述混合溶液置于50-60℃油浴之中,剧烈搅拌至混合均匀后,保持剧烈搅拌并添加过量Zn粉,最后,将混合物在50-60℃下搅拌3-4h,使用薄层色谱法监测反应进程,当反应物完全反应完成后,将混合物置于冰中以终止反应;使用布什漏斗将副产物Zn(OH)2与未反应完的锌粉滤出,之后,将固体残余物用20mL***彻底洗涤三次,并保持洗涤后的***;将滤液与洗涤后的***合并后,使用分液漏斗用20mL***洗涤三次,从而将共混溶液中的甲醇和水除去,然后将分液出的***用无水硫酸钠干燥;将干燥后地***溶液冷却于冰盐浴混合物中;再将剧烈的氨气鼓泡通入醚溶液15-20分钟,之后,在15分钟内分小批少量添加亚硝酸异丁酯,同时保持冷却和剧烈的氨气鼓泡;通过减压蒸馏除去***,得到产物N-亚硝基(4-巯基甲基苯基)-羟胺铵;所述氯化铵与4-硝基苄基乙硫醇酸酯的摩尔比为2:1,所述混合溶液的体积为14.4mL;
3.3)将步骤3.2)中得到的TCF和步骤1.4)中得到的PDG@Au共混于40mL玻璃样品瓶中,在冰盐浴中遮光磁力搅拌72-84小时;之后,通过离心处理,并用pH 7.4 的PBS缓冲液离心洗涤两次,得到产物PDG@Au-NO;所述TCF的浓度为20mg/mL, PDG@Au的浓度为0.1mg/mL;
3.4)将PDG@Au-NO溶液和p(AM-b-AMPBA)分散在pH值为9.5的20mL PBS 中,在冰盐浴中遮光磁力搅拌8-10小时之后,通过离心,用pH 7.4PBS缓冲液离心洗涤两次,得到产物PDG@Au-NO/PBA溶液;所述PDG@Au-NO溶液的浓度为0.1 mg/mL,p(AM-b-AMPBA)的浓度为0.7μg/mL。
所述步骤1.1)中的三羟甲基氨基甲烷是在2800rpm的高速分散的条件下溶解的。
所述的步骤1.4)、步骤3.3)和步骤3.4)中产物的离心处理的转速不得低于9000rpm。
所述的步骤2.4)中磁力搅拌时间不得低于8h。
所述的步骤3.1)中用无水硫酸钠干燥二氯甲烷溶液的时间不得低于4h。
所述的步骤3.2)中用无水硫酸钠干燥***溶液的时间不得低于4h。
一种所述光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物的使用方法,其特征在于:所述光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物用于抗菌和抑制细菌。
一种所述光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物的使用方法,其特征在于:所述光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物用于生物被膜的生长、繁殖。
一种所述光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物的使用方法,其特征在于:所述光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物用于促进伤口愈合以及抗炎症因子。
有益效果
本发明提出的一种光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物及制备使用方法,优越性在于:
(1)提供了一种能够抗生物被膜的光致释放NO的纳米药物,利用葡萄糖胺修饰的聚多巴胺@金杂化纳米材料作为载体,一方面聚多巴胺在NIR区域有一定的吸收特性,可在NIR的刺激下实现温度的升高而不会损伤感染部位附近的正常组织。此外,为了实现更高效的光热杀菌,利用胺基修饰的带正电的聚多巴胺纳米粒子与带负电的细菌的电荷吸附作用实现靶向细菌。更进一步地,利用聚多巴胺NP上邻苯双酚的还原性原位还原金纳米颗粒(AuNP)以实现潜在的光热增强作用,根据加热-冷却曲线和相应的热时间常数(τs),确定光热转换效率(η)为19.7%;
(2)本发明提供了一种能够抗生物被膜的光致释放NO的纳米药物,将热敏型的 NO供体TCF,修饰到具有光热转换特性的纳米载体PDG@Au/PBA上。在NIR刺激下,PDG@Au/PBA快速升温,从而加速TCF的分解,大量释放NO。若无NIR辐照,在较短时间内(1小时以内)PDG@Au-NO/PBA几乎没有释放,但是一旦施加NIR刺激,PDG@Au-NO/PBA会迅速释放NO,即说明PDG@Au-NO/PBA,可以通过NIR 刺激按需释放NO,且随着光照时间的增长,NO释放量也会增加;
(3)本发明提供了一种能够抗生物被膜的光致释放NO的纳米药物,一方面,通过pH响应的苯硼酸酯键在其表面修饰上亲水性嵌段共聚物构建了生物被膜微酸环境响应的电荷反转表面,使得纳米载体表面呈电负性,与体内的蛋白具有较低的相互吸附作用,从而延长了纳米载体在血液中的循环时间和在生物被膜中的滞留时间,这解决了现有药物递送载体无法兼顾延长其血液循环时间与增强药物靶向病灶的技术问题;
(4)本发明提供了一种能够抗生物被膜的光致释放NO的纳米药物,由于NO的杀菌效果有限,因此本发明通过协同气体和光热疗法进行杀菌,具体而言,所制得的 PDG@Au-NO/PBA经过近红外光辐照快速升温,进而促使TCF受热加速释放NO,协同NO和光热疗法协同抗菌。而AuNC上产生的金离子、NO与AuNC上产生的活性氧可以生成杀菌作用更强的活性氮如ONOO-,对耐药菌具有极强的杀伤效果。
(5)本发明提供了一种能够抗生物被膜的光致释放NO的纳米药物,具有良好的生物相容性以及较低的溶血率、细胞毒性和光毒性。其中,PDG@Au-NO/PBA实验组在低浓度时,NO具有促进细胞生长的能力,在37.5μg mL-1时细胞的存活率可以达到 120%左右,其结果与相关文献报道的相一致。但是在高浓度下二者均具有一定的细胞毒性。在600μg mL-1时细胞几乎完全死亡。因此在使用纳米材料进行治疗时应该注意其剂量的大小。此外,由于经纳米材料处理的血红细胞均没有出现血细胞破损的情况,因此纳米材料具有良好的血液相容性。
因此本发明提供的一种光致释放NO抗生物被膜的纳米药物,抑菌、消散生物被膜效果明显,在抗生物被膜方面显示出重要的应用前景,同时也为相应给药***的设计和发展打下基础。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的制备PDG@Au-NO/PBA的简明工艺流程图。
图2为本发明实施例1中PDA,PDNG和PDG的电镜形貌图。
图3为本发明实施例1中(a)PDA,PDG纳米载体的XPS O1s结合能谱图;(b) PDA,PDG纳米载体的XPS N1s结合能谱图;(c)PDA,PDG纳米载体的MALDI-TOF MS谱图;(d)PDG可能的化学结构模型。
图4为本发明实施例1中PDG@Au的电镜形貌图。
图5为本发明实施例1中PDG@Au和PDG@Au/PBA的DLS表征图。
图6为本发明实施例1中(a)PDG@Au和PDG@Au-NO以PDG为背景的UV-Vis 吸收谱图;(b)PDG@Au在1W cm-2NIR辐照下的光热转换曲线;(c) PDG@Au-NO/PBA在NIR刺激下可按需释放NO;(d)PDG@Au-NO和 PDG@Au-NO/PBA不同时长NIR辐照下的NO释放情况;(e)PDG@Au-NO和PDG@Au-NO/PBA长效释放NO表征图。
图7为本发明实施例1中(a)不同浓度的纳米材料处理血红细胞后,血细胞的破裂溶解情况;(b)PDG,PDG@Au,PDG@Au-NO和PDG@Au-NO/PBA的溶血率;(c) 不同浓度的PDG@Au/PBA和PDG@Au-NO/PBA处理细胞后的存活率。
图8为本发明实施例1中(a)不同实验组中两种耐药菌的菌落数;(b)革兰氏阳性耐药菌MRSA在不同条件处理后通过梯度稀释点板计算统计的菌落数量;(c)革兰氏阴性耐药菌MDREC在不同条件处理后通过梯度稀释点板计算统计的菌落数量。
图9为本发明实施例1中不同测试组中细菌的形貌表征。
图10为本发明实施例1中不同测试组中生物被膜结晶紫染色表征。
图11为本发明实施例1中平板计数法评估不同实验组生物被膜中耐药菌的存活率。
具体实施方式
现结合实施例、附图对本发明作进一步描述:
实施例1
光致释放NO抗生物被膜的纳米材料的制备方法,包括如下步骤:
第一步,合成抗生物被膜的聚多巴胺@金杂化纳米材料(PDG@Au)
使用量筒量取200mL的去离子水于500mL烧杯中,在2800rpm下高速分散,然后将242mg三羟甲基氨基甲烷和256mg乙酰葡萄糖胺依次加入到烧杯中。5min 后将220mg多巴胺盐酸盐加到上述溶液中引发反应,在室温、2800rpm的高速分散的条件下反应1h。反应结束后将反应液转移至50mL的离心管中,在10000rpm下离心,用去离子水清洗后,冷冻干燥得到PDNG。
将所得PDNG以较为合适的浓度分散于无水乙醇中,再超声分散均匀后,用10μL 的移液枪取适量样品溶液滴于用食人鱼溶液清洗过的硅片之上,待自然晾干后,用扫描电镜进行表征;再将所得PDNG以较为合适的浓度分散于无水乙醇中,再超声分散均匀后,用10μL的移液枪取适量样品溶液滴于碳膜铜网之上,待自然晾干后,用投射电镜进行表征,图2为PDNG的电镜形貌图,形貌为球形,粒径均一,大小为150nm 左右。
将4mL浓度为1.5mg/mL的PDNG水溶液和8mL浓度为12M的浓盐酸加入到 50mL的圆底烧瓶中,在85℃下冷凝回流1h。反应结束后将反应液转移至50mL的离心管中,在9500rpm下离心15min,然后用1M PBS缓冲液离心重悬两次,最后一次分散在Milli-Q中冷冻干燥得到PDG。
所得样品的化学结构组成用XPS O1s和N1s结合能谱图和其MALDI-TOF MS谱图进行表征,图3为PDA,PDG纳米载体的XPS O1s和N1s结合能谱图,PDG的O1s 区域的高分辨结合能图谱分峰拟合出除了529.3eV和531.0eV的两个典型峰,还有 531.0eV处的新典型峰,该峰被分配给PDG中所含的葡萄糖胺上的氧(C-O-C)。因此可以基本可判断PDG中含有葡萄糖胺。通过分析N1s区域高分辨结合能分峰图谱 (图3(a)),PDA和PDG均可分峰拟合出聚多巴胺通过席夫碱反应形成的C=N峰 (396.5eV和396.7eV),聚多巴胺上胺基被氧化回环形成以及通过迈克尔加成形成的 C-NH峰(397.5eV)和多巴胺上的胺基与葡萄糖胺上的胺基-NH2峰(398.2eV)。。从图中对比发现PDG的-NH2峰的面积比PDA的大,从而说明随着葡萄糖胺的修饰导致纳米载体上胺基含量的增多。在PDG的质谱图中除了分析出了PDA中含有的峰以外还分析出了,三(羟甲基)氨基甲烷-氢络合物(122m/z),葡萄糖胺-氢络合物(180m/z) 以及(羟甲基)氨基甲烷-氢络合物和葡萄糖胺通过氢键形成的复合物-氢络合物(301 m/z)。证明PDG的成功合成。
将浓度为0.1mg/mL的PDG纳米粒子与浓度为0.25mM的HAuCl4分散在装有20 mL超纯水的玻璃样品瓶中,室温下磁力搅拌1h。反应结束后将反应液转移至50mL 的离心管中,在9500rpm下离心15min,然后用去离子水离心清洗两次,最后一次分散在pH为7.4的PBS缓冲液中,冷冻干燥得到PDG@Au。
所得样品的形貌用透射电镜进行表征,将所得PDG@Au以较为合适的浓度分散于无水乙醇中,再超声分散均匀后,用10μL的移液枪取适量样品溶液滴于碳膜铜网之上,待自然晾干后,用透射电镜进行表征,图4为制备的[email protected], [email protected](PDG@Au),[email protected]和[email protected]的电镜形貌图,随着HAuCl4的浓度的增加,PDG@Au上的AuNP的尺寸也在不断变大。
PDG@Au的光热转换性能表征
PDG@Au的光热转换性能表征用808nm激光以1.0W cm-2的功率密度照射200μL 不同浓度下PDG@Au纳米载体10分钟。使用9Hz热成像仪每隔1分种记录一次PDG @Au纳米载体溶液的实时温度,从而可以PDG@Au纳米颗粒的加热-冷却曲线(10 分钟照射,10分钟冷却)。并且通过以下公式计算光热转化效率(η):
Q0=hS(Tmax,water-Tsurr)
图6(b)制备的PDG@Au在1W cm-2NIR辐照下的光热转换曲线,根据上式计算得到PDG@Au的光热转换效率为19.7%。
第二步,合成双嵌段共聚物p(AM-b-AMPBA)修饰的PDG@Au纳米粒子
在0℃下,将5g的3-氨基苯基硼酸溶解在浓度为2M的73mL的NaHCO3溶液中,并置于100mL的茄形瓶中,在室温下剧烈搅拌。使用恒压滴液漏斗在15min内将5.9mL提前预冷的丙烯酰氯逐滴加入到上述剧烈搅拌的混合溶液中。将浓度为1M 的HCl溶液缓慢加入反应液中,并用pH试纸监测pH达到1.0时停止滴加,得到大量白色沉淀。将反应混合物过滤并用冷水洗涤,将滤液用乙酸乙酯萃取3次,得到的有机相用饱和食盐水洗涤,减压蒸发除去溶剂,得到褐色固体,将其与上述沉淀合并。在超纯水中重结晶,得到5.0g灰白色的APBA晶体。
在10mL Schlenk反应管中,将0.39g摩尔浓度为1mol/L的单体APBA,0.024g 链转移试剂2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(DMP),1.1mg引发剂偶氮二异丁腈AIBN溶于DMF/H2O(95/5,v/v)混合溶剂。利用双排管***对体系进行除氧操作。具体而言,将Schlenk反应管用液氮冷冻,待溶液冻实后抽真空5min,随后充入氩气,在氩气氛围中将体系解冻。重复冷冻-抽气-解冻操作5次除去体系中的氧气。封闭Schlenk反应管,然后置于70℃的油浴中。反应24h后将Schlenk反应管放入液氮中骤冷以停止聚合反应。然后在剧烈搅拌下将解冻后的溶液逐滴加入100mL无水***中,产生大量淡黄色沉淀。悬浊液使用布氏漏斗抽滤并用***多次洗涤滤饼。室温下真空干燥2h后得到产物大分子链转移试剂pAPBA-CTA。
在10mL Schlenk反应管中,将0.282g摩尔浓度为1mol/L的单体AMP,0.14g 数均分子量为6,088g/mol的链转移试剂pAPBA-CTA和9.2mg引发剂AIBN溶于 DMF/H2O(95/5,v/v)混合溶剂。进行冷冻-抽气-解冻循环5次除去体系中的氧气。封闭Schlenk反应管,然后置于70℃的油浴中。反应24h后将Schlenk反应管放入液氮中骤冷停止反应。解冻后,在剧烈搅拌下将反应混合物逐滴加入过量***中,产生大量白色沉淀。悬浊液使用布氏漏斗抽滤并用***多次洗涤滤饼。室温下真空干燥2h 后得到产物共聚物p(AM-b-AMPBA)-CTA。
在10mL Schlenk反应管中,将150mg的p(APBA-b-AMP)-CTA,30.63mg的三 (三甲基硅烷基)硅烷,8.1mg的AIBN溶于1mL的DMF/H2O混合溶剂(95/5,v/v)。封闭Schlenk反应管,在80℃下搅拌反应8小时。之后,在剧烈搅拌下将反应混合物逐滴加入过量***中,产生大量白色沉淀。悬浊液使用布氏漏斗抽滤并用***多次洗涤滤饼。室温下真空干燥2h后得到产物共聚物p(AM-b-AMPBA)。
将0.1mg/mL的PDG@Au溶液和0.7μg/mLp(AM-b-AMPBA)分散在装有pH值为 9.5的20mL PBS的玻璃样品瓶中,在冰盐浴中磁力搅拌8小时。之后,通过以9500rpm 离心15分钟,使用pH值为7.4的PBS收集产物,用pH 7.4PBS缓冲液离心洗涤两次,冷冻干燥得到产物PDG@Au/PBA。
所得样品的化学结构组成通过动态光散射仪来表征。将PDG@Au/PBA分别稀释在pH为7.4和pH为5.5的0.01mol/L的PBS中,向DLS测试专业小皿中加入1mL 的溶液后,即可测试该纳米载体的粒径和Zeta电位。图5为PDG@Au/PBA在不同pH 下的Zeta电位值,由于嵌段共聚物p(AM-b-AMPBA)具有较高比例嵌段的聚乙酰吗啉,因此当PDG@Au表面修饰上p(AM-b-AMPBA)后,其表面由于葡萄糖胺电离导致的正电荷会被p(AM-b-AMPBA)遮盖从而呈电负性,当PDG@Au/PBA在pH 5.5的酸性环境下苯硼酸酯键不稳定,p(AM-b-AMPBA)从PDG@Au表面水解,从而导致 PDG@Au/PBA水解为表面为正电荷PDG@Au;(b)为本发明实施例中制备的 PDG@Au和PDG@Au/PBA在不同pH下的水合粒径图,在生理pH 7.4时 PDG@Au/PBA与PDG@Au的具有较大的尺寸差别,然而,当PDG@Au/PBA与 PDG@Au在酸性环境中几乎没有尺寸的差别。即说明PDG@Au/PBA上的 p(AM-b-AMPBA)在生理pH 7.4时可以稳定的存在于PDG@Au的表面,但在酸性pH 5.5时,硼酸酯键的水解导致p(AM-b-AMPBA)从PDG@Au表面脱离。
第三步,合成光致NO释放抗生物被膜的纳米材料
将0.63g固体硫代乙酸钾和1.0g 4-硝基苄基溴加入装有15mL无水四氢呋喃(THF)的圆底烧瓶中。该混合物在30℃下搅拌13h以形成4-硝基苄基乙硫醇酸酯。通过减压蒸馏除去四氢呋喃来纯化该产物,然后将混合溶于二氯甲烷中,并使用分液漏斗用水洗涤三次,前两次为去离子水,最后一次为饱和食盐水。之后,使用无水硫酸钠干燥二氯甲烷溶液4-6小时后,通过减压蒸馏除去二氯甲烷,得到0.70g固体4- 硝基苄基乙硫醇酯。
将149.8mg氯化铵水溶液与296.2mg 4-硝基苄基乙硫醇酸酯甲醇溶液共混,其混合溶液最终体积为14.4mL,其中MeOH:H2O比例为5:1。然后,置于50℃油浴之中,剧烈搅拌,混合均匀后,保持剧烈搅拌并添加0.18g过量Zn粉,最后,将混合物在50℃下剧烈搅拌3h,使用薄层色谱法(TLC)检测反应进程。若反应物完全反应完,将混合物置于冰中以终止反应。使用布什漏斗将副产物Zn(OH)2与未反应完的锌粉滤出,之后,将固体残余物用20mL***彻底洗涤三次,并保持洗涤后的***。将滤液与洗涤后的***合并后,使用分液漏斗按之前的步骤洗涤三次,从而将共混溶液中的甲醇和水除去。然后将分液出的***用无水硫酸钠干燥4-6小时。将干燥后地***溶液冷却于冰盐浴混合物中。再将剧烈的氨气鼓泡通入醚溶液15分钟,之后,在15分钟内分小批少量添加730μL亚硝酸异丁酯,同时保持冷却和剧烈的氨气鼓泡。使用薄层色谱法(TLC)检测反应进程。之后,通过减压蒸馏除去***,得到产物TCF。
将0.5mL浓度为20mg/mL的TCF和19.5mL浓度为0.1mg/mL的PDG@Au 共混于40mL玻璃样品瓶中,在冰盐浴中遮光磁力搅拌72小时。之后,通过以9500rpm 离心15分钟收集产物,并用pH 7.4PBS缓冲液离心洗涤两次,得到产物PDG@Au-NO。
所得样品的化学结构组成通过紫外可见光谱(UV-Vis)来表征。将提前稀释在超纯水中的纳米溶液吸取1mL置入石英比色皿中,以相同浓度的PDG溶液为测试背景, PDG@Au负载上TCF后其吸收峰发生了红移,以及在360nm处出现一个小峰,即NO 供体已被成功负载。
将浓度为0.1mg/mL的PDG@Au-NO溶液和浓度为0.7μg/mL的p(AM-b-AMPBA) 分散在pH值为9.5的20mL PBS中,在冰盐浴中遮光磁力搅拌8小时之后,通过以 9500rpm离心15分钟收集产物,用pH 7.4PBS缓冲液离心洗涤两次,得到 PDG@Au-NO/PBA溶液。
PDG@Au-NO或PDG@Au-NO/PBA释放NO的动力学特性与总量的检测。将 PDG@Au-NO或PDG@Au-NO/PBA在NIR辐照(1.0W cm-2)0、2.5、5、7.5、10分钟后,使用格里斯(Griess)试剂测量从PDG@Au-NO或PDG@Au-NO/PBA释放出的NO。此外将PDG@Au-NO或PDG@Au-NO/PBA孵育1至73小时后,然后再暴露于NIR辐照下10分钟后,用Griess试剂测量了PDG@Au-NO或PDG@Au-NO/PBA 在有无NIR辐照下释放的NO。
图6(c)为制备的PDG@Au-NO/PBA在NIR刺激下的按需释放NO图,在NIR 刺激下,PDG@Au/PBA快速升温,从而加速TCF的分解,大量释放NO。若无NIR 辐照,在较短时间内(1小时以内)PDG@Au-NO/PBA几乎没有释放,而一旦施加 NIR刺激,PDG@Au-NO/PBA会迅速释放NO。这说明PDG@Au-NO/PBA可在NIR 刺激下按需释放NO;图6(d)为制备的PDG@Au-NO和PDG@Au-NO/PBA不同时长NIR辐照下的NO释放情况,在没有NIR辐照的实验组中无论是PDG@Au-NO还是 PDG@Au-NO/PBA的NO释放量均没有明显变化,而随着光照时间的增长,无论是 PDG@Au-NO还是PDG@Au-NO/PBA的NO释放量均有增加;图6(e)为制备的 PDG@Au-NO和PDG@Au-NO/PBA的长效释放NO表征图,在37℃下,若无NIR辐照,随着时间的增加,PDG@Au-NO和PDG@Au-NO/PBA均表现出缓慢释放NO的特点,可持续释放NO长达20小时甚至更多。而一旦施加NIR辐照,PDG@Au-NO 和PDG@Au-NO/PBA快速释放出NO。因此,PDG@Au-NO和PDG@Au-NO/PBA 均在生理温度下缓慢释放低浓度的NO,而NIR光刺激下,光生热致快速释放NO。
光致释放NO抗生物被膜纳米材料的血液相容性检测
通过将不同浓度的纳米材料与血细胞共培养后评估材料对血红细胞的相容性。从兔耳采集新鲜血液5mL,并加入肝素钠防止血液凝固,再将兔血在室温静置2小时。然后用pH为7.2的Tris-Nacl溶液对血液以1:5(血液:缓冲液)的比例稀释,并不断通过离心的方式(1000rpm×10min),清洗血液至上清液澄清。最后弃去上层清液,保存下层血红细胞(RBCs)并用生理盐水将其稀释为体积比为5%的溶液。之后将纳米材料按浓度为(2400,1200,600,300,150,75μg mL-1)稀释至孔板中,并使用紫外消毒灭菌。将材料与血红细胞以1:1的体积比混合,其中生理盐水和0.1%Triton X-100中的红细胞分别被作为阴性和阳性对照。再置于恒温摇床中遮光共培养6小时。之后通过离心的方式将孔板中的材料与上清液分离,吸取80μL的上清液置于新的96 孔板中,再使用多功能微孔板检测仪检测上清液在540nm处的UV吸收值。并按下式计算溶血率。此外,将一部分测试组按上述条件培养在EP管中,以供拍照记录。
图7(a)可以看出,对比阳性对照,使用曲拉通处理的阳性对照中血细胞完全破损,导致离心后上清液呈血红色,而纳米材料处理的血红细胞均没有出现血细胞破损的情况;图7(b)可以发现随着纳米材料浓度的升高,溶血率随着不断保持上升,但是总体上始终保持在一个较低的溶血率的范围内,在600μg mL-1浓度下,纳米材料最高溶血率约为6%。因此,纳米材料具有良好的血液相容性。
光致释放NO抗生物被膜纳米材料的细胞毒性检测
将PDG@Au/PBA和PDG@Au-NO/PBA在96孔板中梯度稀释成3,1.5,0.75, 0.375,0.1875mg mL-1,放入到生物安全柜中紫外灯照射45分钟灭菌,以免对细胞造成污染。再用低糖培养基(αMEN+10%FBS+1%双抗)复苏成纤维细胞(NIH3T3),待其在37℃,5%CO2恒温培养箱中状态良好之后,以5000个细胞/孔的密度接种到96孔板中,并置于培养箱中24小时。之后,将材料以体积比1:5(材料:细胞溶液)的比例,与细胞混合,平行组设为5组。(与细胞共培养的纳米材料浓度为0.6, 0.3,0.15,0.075,0.0375mg mL-1)共培养4小时后,对NIR测试组,施加10min, 1W cm-2的NIR辐照。随后再培养1天后将细胞培养液吸取,并用PBS缓慢清洗三次,将Alamarblue(10%)的低糖培养液溶液与孔板中的细胞反应6小时,再利用酶标仪测量混合溶液的荧光值(激发波长为530nm,发射波长为590nm),最后通过荧光值计算细胞的细胞存活率。
使用alarmbule染色成纤维细胞(NIH3T3)的方法评估PDG@Au/PBA和 PDG@Au-NO/PBA的细胞相容性。图7(c)可以看出,无论是PDG@Au/PBA还是 PDG@Au-NO/PBA在浓度为150μg mL-1以下时,与NIH3T3细胞培养24小时后均没有表现出明显毒性。其中,PDG@Au-NO/PBA实验组在低浓度时,NO具有促进细胞生长的能力,在37.5μg mL-1时细胞的存活率可以达到120%左右,其结果与相关文献报道的相一致。但是在高浓度下二者均具有一定的细胞毒性。在600μg mL-1时细胞几乎完全死亡。因此在使用纳米材料进行治疗时应该注意其剂量的大小。我们也探究了在相同条件下NIR辐照后NIH3T3细胞的活性大小。类似地,在较低浓度下,使用 NIR刺激后再与NIH3T3细胞培养24小时后均没有表现出毒性,甚至 PDG@Au-NO/PBA在75μg mL-1和37.5μg mL-1浓度下,促进细胞的生长。因此纳米材料具有较低的细胞毒性。
光致释放NO抗生物被膜纳米材料的抗浮游耐药菌性能检测
使用接种环在接种了细菌的LB固琼脂板上刮擦1-2个菌落接种至LB液体培养基中,在37℃控温摇床中培养到对数期(OD600=1.0),取一定体积对数期的细菌菌液通过离心(5000rpm×5min)除去LB液体培养基,用等体积的PBS缓冲液重悬,重复三次,得到不含LB培养液的菌液,并将菌液浓度控制在107~108cfu mL-1。吸取100 μL上述浓度的菌液加入装有100μL纳米材料的1.5mL EP离心管中,其中纳米材料均分散在pH为7.4的PBS缓冲液之中,并且对照组为PBS,实验组分别为PDG, PDG@Au,PDG@Au-NO和PDG@Au-NO/PBA,实验组分为无NIR激光辐照组和有NIR激光辐照组,每组的平行组为3组。将混有耐药菌和材料的EP离心管置于恒温恒湿培养箱中培养4小时,4小时后将NIR激光辐照组取出,用1W cm-1的NIR辐照10min后,再置于恒温恒湿培养箱中培养1小时。之后,利用多通道移液器以10倍的浓度梯度对所有测试组的菌液进行梯度稀释。再将稀释的菌液取5μL滴于灭菌的LB 固体培养基的表面,并将其放置在37℃恒温恒湿培养箱中培养10小时后计算菌落的个数。并将稀释1000倍的菌液取100μL置于LB固体培养基的表面使用涂抹棒涂抹均匀置于恒温恒湿培养箱中培养12-24小时,再对其拍照记录。
此外,细菌的形貌通过SEM进行观察。将PDG@Au,PDG@Au-NO,PDG@Au+NIR 和PDG@Au-NO+NIR测试组的菌液通过离心(5000rpm,5min)除去PBS以及多余的纳米材料,将细菌用4%多聚甲醛固定液重悬并在4℃冰箱中固定过夜,固定后,通过离心除去4%多聚甲醛固定液,使用不同浓度梯度的乙醇(20%,40%,50%, 60%,80%,90%,95%,100%)脱水。其中用20%,40%,50%,60%的乙醇各脱水10分钟,80%,90%的乙醇各脱水30分钟,95%,100%的乙醇各脱水60分钟,将脱水完毕的样品取5μL滴至硅片上自然风干。再使用叔丁醇置换乙醇30分钟,并在-20℃冰箱中冷冻4h,之后快速将硅片置于真空干燥箱中干燥4小时以上。使用离子溅射仪对样品硅片进行喷金处理,再用SEM对细菌形貌进行表征。
通过标准平板计数法评估了以上10种实验测试组中的耐药菌的存活情况,并对各组中的细菌菌落数进行了统计与分析。如图8(a)所示,仅仅通过NIR辐照菌液,是无法对两种耐药菌产生任何的杀伤作用,主要是因为,细菌对长波长的光如可见光以及NIR光等没有吸收。因此当NIR辐照细菌菌液时,NIR会直接穿过细菌。而不像紫外光,易被细菌的DNA吸收,从而干扰细菌DNA的复制与转录,导致细菌死亡。当使用纳米材料处理细菌时,如图8(b)和(c)在没有NIR辐照的情况时,PDG,PDG@Au 对革兰氏阳性菌MRSA具有一定的杀伤效果,杀菌率达到百分之94%左右,其主要原因可能是由于作为革兰氏阳性菌的MRSA表面具有厚厚的肽聚糖,同时表明富含葡萄糖胺受体,因此,PDG上葡萄糖胺的修饰,导致纳米材料通过碳水化合物作用与碳水化合物作用以及主配体作用与MRSA具有良好的亲和力,并且其表面正电荷的存在,通过吸附细菌细胞壁中带负电荷的磷壁酸,破环细胞壁结构,从而导致细菌死亡。而PDG,PDG@Au对革兰氏阴性菌虽也展示出一定杀伤效果杀菌率达到百分之62%左右,其原因可能是由于其表面葡萄糖胺受体较少,纳米材料与MDREC仅通过电荷作用相互吸引。因此相比MDREC,革兰氏阳性菌MRSA更易实现更高的杀菌率。而 PDG@Au-NO和PDG@Au-NO/PBA在没有NIR辐照的下,均没有杀菌性能。而且,释放的低浓度NO促进了细菌的生长,或者帮助细菌抵抗纳米材料正电荷的杀伤作用。但是一旦对纳米材料施以NIR辐照,PDG,PDG@Au,PDG@Au-NO和 PDG@Au-NO/PBA均表现出优异的杀菌效果。无论对MRSA还是MDREC均能实现接近100%的杀菌率。其中PDG@Au-NO和PDG@Au-NO/PBA实验组相比于PDG和 PDG@Au实验组表现出更为高效的灭菌效果,将细菌浓度控制在104cfu mL-1以下。通过上述实验表明,NIR辐照下的PDG@Au-NO和PDG@Au-NO/PBA能够实现NO 及其光热协同杀菌作用,使其不仅能够对革兰氏阳性耐药菌造成有效的杀伤作用,也能对革兰氏阴性耐药菌产生强有力的抗菌效果。
为了进一步探究纳米材料的杀菌机理,我们使用扫描电镜对PBS(Control), PDG@Au,PDG@Au+NIR,PDG@Au-NO和PDG@Au-NO+NIR五组测试组的细菌形貌进行了表征,表征结果如图9所示。和对照组相比,PDG@Au,PDG@Au+NIR, PDG@Au-NO和PDG@Au-NO+NIR对细菌的细胞膜造成了不同程度的损伤,从图上可清楚地观察到细菌的细胞壁上均附着纳米材料,这说明纳米材料对细菌具有较好的靶向性,尤其是MRSA。此外,细菌细胞壁布满了皱褶,或者出现破损和不规则的空洞,特别是PDG@Au-NO+NIR实验组,细菌的形态呈皱缩状,且细菌细胞附近还布满丝绸状物质,这可能是细菌细胞壁破损后流出的内容物。说明,纳米材料可以通过破坏细菌细胞壁的完整性杀死细菌,这是其他有关于光热杀菌的结果相一致。但是NO对细菌的杀伤作用主要形成活性氮,通过裂解细菌的DNA,亚硝化蛋白质等方式杀死细菌。
光致释放NO抗生物被膜纳米材料的消散生物被膜性能检测
使用接种环在接种了细菌(MDREC,MRSA)的LB固琼脂板上刮擦1~2个菌落接种至TSB液体培养液中,在37℃控温摇床中培养到对数期(OD600=1),将菌液用 TSB液体培养液稀释至106~107cfu mL-1。取100μL稀释过的菌液置于96孔板(Tissue Culture Plate,BIOFIL)中,并将其放置在37℃恒温恒湿培养箱中培养24小时,使其在孔板的底部形成生物被膜。将PDG/PBA,PDG@Au/PBA,PDG@Au-NO和PDG@Au-NO/PBA通过离心除去上清液,并重悬于TSB液体培养液中。然后缓慢吸取96孔板中TSB液体培养液,将浮游细菌除去,之后缓慢加入100μL PDG, PDG@Au/PBA,PDG@Au-NO和PDG@Au-NO/PBA的TSB溶液,并置于37℃恒温恒湿培养箱4小时。再将96孔板中的溶液缓慢吸出,使用PBS缓冲液缓慢的清洗孔板中的生物被膜三次。之后,使用结晶紫染色法定量表征不同实验组生物被膜的含量。具体操作如下:
使用同体积的甲醇固定孔板中的生物被膜,1小时后,吸出孔板中的甲醇,并在超净台中干燥15分钟。用质量比为1%的结晶紫溶液对生物被膜进行染色,染色10 分钟后,从孔板中吸出多余的结晶紫溶液,并用PBS缓冲液轻柔地清洗生物被膜中的结晶紫溶液。之后,置于干燥箱中干燥24小时。对96孔板中不同测试组进行拍照记录。然后使用体积比为30%冰醋酸溶液对生物被膜进行脱色,30分钟后吸取80μL的结晶紫脱色液置于多功能微孔板探测器检测在590nm处得紫外吸收值,吸收值对应生物被膜含量的高低。
如图10(a,b)所示,分别使用PBS,PDG/PBA,PDG@Au/PBA,PDG@Au-NO 和PDG@Au-NO/PBA处理成熟的耐药菌生物被膜,可以发现在没有负载NO的实验组均没有表现出消散生物被膜的性能。而负载有NO的实验组均表现出优异的生物被膜消散性能。通过图10(c,d)可以看出PDG@Au-NO和PDG@Au-NO/PBA消散生物被膜的能力呈浓度依耐性,150μg mL-1的纳米材料可以消散70%以上的生物被膜,随着NO浓度的升高,生物被膜消散率可以达到80%左右。
光致释放NO抗生物被膜纳米材料的抗生物被膜内细菌性能检测
在96孔板中分别形成MRSA和MDREC生物被膜,加入100μL,150μg mL-1 的PDG/PBA,PDG@Au/PBA,PDG@Au-NO和PDG@Au-NO/PBA,并且将测试组分为有NIR辐照组和无NIR辐照组。之后,将96孔板置于37℃恒温恒湿培养箱中(1, 2,3,4,5,6,7,8)小时后将孔板取出,对NIR辐照组以1W cm-1的NIR辐照10min,将96孔板置于37℃恒温恒湿培养箱中1小时,然后进行10倍梯度稀释,并将稀释的菌液取5μL滴于灭菌的LB固体培养基的表面,并将其放置在37℃恒温恒湿培养箱中培养10小时计算菌落的个数。
通过平板计数法评估对照组PBS和实验组PDG/PBA,PDG@Au/PBA,PDG@Au/PBA和PDG@Au-NO/PBA(实验组同样分为有无NIR辐照两类)对MRSA 和MDREC生物被膜的灭杀作用。其实验结果见图11,与抗游离的耐药菌的结果不同,在抗生物被膜时,所有没有NIR辐照的测试组,完全没有杀伤生物被膜中耐药菌的性能。因此在对抗生物被膜时,纳米材料无法通过电荷作用杀菌。而NIR辐照测试组中,均表现出一定的杀伤作用,其中释放NO的实验组中杀菌效果明显优于其他测试组。 PDG@Au-NO/PBA组对MRSA和MDREC均表现出最强的杀伤性。但是对比两种耐药菌的细菌的存活量时,PDG@Au-NO/PBA+NIR处理后的MRSA菌落数降104cfu mL-1,而MDREC的菌落数大约维持在107cfu mL-1。总体来说,纳米材料能够有效的对抗两种耐药菌生物被膜,其中对MRSA的效果更佳。
实施例2
将第一步的乙酰葡萄糖胺和多巴胺盐酸盐的质量由256mg和220mg改为256mg 和200mg,冷凝回流时间由1h改为0.5h,磁力搅拌时间1h改为0.5h;将第二步的 p(AM-b-AMPBA)的浓度由0.7μg/mL改为0.4μg/mL,磁力搅拌时间由8h改为6h;将第三步的TCF浓度由20mg/mL改为10mg/mL,磁力搅拌时间由72h改为60h;其他制备条件不变,制备光致释放NO抗生物被膜的纳米材料。
实施例3
将第一步的乙酰葡萄糖胺和多巴胺盐酸盐的质量由256mg和220mg改为256mg 和240mg,冷凝回流时间由1h改为2h,磁力搅拌时间1h改为2h;将第二步的 p(AM-b-AMPBA)的浓度由0.7μg/mL改为1.0μg/mL,磁力搅拌时间由8h改为10h;将第三步的TCF浓度由20mg/mL改为30mg/mL,磁力搅拌时间由72h改为84h;其他制备条件不变,制备光致释放NO抗生物被膜的纳米材料。
上述实施方式用来解释说明本发明,而不是对本发明进行限制,在本发明的精神和权利要求的保护范围内,对本发明做出的任何修改和改变,都落入本发明的保护范围。
Claims (10)
2.一种权利要求1所述光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物的制备方法,其特征在于步骤如下:
步骤1、合成抗生物被膜的聚多巴胺@金杂化纳米材料:
1.1)将三羟甲基氨基甲烷在室温下溶于200mL的超纯水并置于容器中,得到三羟甲基氨基甲烷的水溶液;所述的三羟甲基氨基甲烷水溶液的浓度为1-2mg/mL,三羟甲基氨基甲烷的物质的量为2mM;
1.2)室温下,将乙酰葡萄糖胺与多巴胺盐酸盐依次加入步骤1.1)得到的三羟甲基氨基甲烷水溶液中,反应1-1.5h,得到混合溶液;所述的步骤1.2)中乙酰葡萄糖胺与多巴胺盐酸盐的摩尔比为1:1-1.5;
1.3)将浓盐酸与混合溶液在80-90℃下冷凝回流,反应1-1.5h得到的PDG纳米粒子溶液;所述混合溶液的质量浓度为1-2mg/mL,浓盐酸的物质的量为12M;
1.4)将PDG纳米粒子溶液与HAuCl4分散在装有20mL超纯水中,在室温下磁力搅拌1-2h使其完全反应;反应结束后将产物转移至离心管中进行离心处理后,最后分散在pH为7.4的PBS缓冲液中,得到产物PDG@Au;所述的PDG纳米粒子溶液的浓度为0.1-0.2mg/mL,HAuCl4的物质的量为0.25mM;
步骤2:合成双嵌段共聚物p(AM-b-AMPBA)修饰的PDG@Au纳米粒子
2.1)在0℃下,将3-氨基苯基硼酸溶解于NaHCO3溶液中并搅拌,使用恒压滴液漏斗在15分钟内将预冷的丙烯酰氯逐滴加入到剧烈搅拌的混合物中,再将HCl溶液缓慢加入至pH达到1.0,此时溶液中有大量白色沉淀产生;将反应混合物过滤并用冷水洗涤,滤液用乙酸乙酯萃取3次;有机相用饱和食盐水洗涤,减压蒸发除去溶剂,得到褐色固体,将其与上述白色沉淀合并后在超纯水中重结晶,得到产物灰白色APBA晶体;所述的3-氨基苯基硼酸、NaHCO3溶液与丙烯酰氯的摩尔比为1:4:2;
2.2)将链转移试剂2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸与APBA晶体以及引发剂偶氮二异丁腈在室温下溶于体积比为95/5的DMF/H2O混合溶剂中,并置于Schlenk反应管中,利用双排管***对体系进行除氧操作后,封闭Schlenk反应管,然后置于70-80℃的油浴中,反应24-36h后将Schlenk反应管放入液氮中骤冷以停止聚合反应;然后在剧烈搅拌下将解冻后的溶液逐滴加入100mL无水***中,产生大量淡黄色沉淀;悬浊液使用布氏漏斗抽滤并用***多次洗涤黄色沉淀;室温下真空干燥2-4h后得到产物大分子链转移试剂pAPBA-CTA;APBA晶体的摩尔浓度为1-2mol/L,[APBA]:[DMP]:[AIBN]的摩尔比为30:1:0.1;
2.3)将单体4-丙烯酰基吗啉与链转移试剂pAPBA-CTA和引发剂AIBN在室温下溶于体积比为95/5的DMF/H2O混合溶剂中,并置于10mL Schlenk反应管中,利用双排管***对体系进行除氧操作后,封闭Schlenk反应管,然后置于70-75℃的油浴中,反应24-36h后将Schlenk反应管放入液氮中骤冷停止反应;解冻后,在搅拌下将上述Schlenk反应管中的反应混合物逐滴加入过量***中,产生大量白色沉淀;悬浊液使用布氏漏斗抽滤并用***多次洗涤白色沉淀,在室温下真空干燥2-4h后得到共聚物p(AM-b-AMPBA)-CTA;所述[AMP]:[pAPBA-CTA]:[AIBN]的摩尔比为70:1:0.1,单体AMP的浓度为1mol/L;
2.4)将步骤1.4)中得到的PDG@Au溶液和步骤2.3)中得到的p(AM-b-AMPBA)分散在装有pH值为9.5的20-30mL的PBS中,在冰盐浴中磁力搅拌,直到反应完全;接着以9000-10000rpm离心10-20分钟,用pH 7.4PBS缓冲液离心洗涤两次并冷冻干燥得到PDG@Au/PBA纳米载体;所述PDG@Au溶液的浓度为0.1mg/mL,p(AM-b-AMPBA)的浓度为0.7μg/mL;
步骤3:合成光致释放NO抗生物被膜的纳米材料
3.1)将固体硫代乙酸钾和4-硝基苄基溴置于装有15mL无水四氢呋喃的圆底烧瓶中,在25-35℃下搅拌12-15h得到4-硝基苄基乙硫醇酸酯;通过减压蒸馏除去四氢呋喃来纯化该产物后再溶于二氯甲烷中,并使用分液漏斗用水洗涤三次,前两次为去离子水,最后一次为饱和食盐水;之后,使用无水硫酸钠干燥二氯甲烷溶液后,通过减压蒸馏除去二氯甲烷,得到产物4-硝基苄基乙硫醇酯;所述的硫代乙酸钾和4-硝基苄基溴的摩尔比为1-2:1;
3.2)将4-硝基苄基乙硫醇酸酯溶于甲醇溶液中,再将其与氯化铵水溶液混合,其中MeOH:H2O比例为5:1,得到混合溶液;将上述混合溶液置于50-60℃油浴之中,剧烈搅拌至混合均匀后,保持剧烈搅拌并添加过量Zn粉,最后,将混合物在50-60℃下搅拌3-4h,使用薄层色谱法监测反应进程,当反应物完全反应完成后,将混合物置于冰中以终止反应;使用布什漏斗将副产物Zn(OH)2与未反应完的锌粉滤出,之后,将固体残余物用20mL***彻底洗涤三次,并保持洗涤后的***;将滤液与洗涤后的***合并后,使用分液漏斗用20mL***洗涤三次,从而将共混溶液中的甲醇和水除去,然后将分液出的***用无水硫酸钠干燥;将干燥后地***溶液冷却于冰盐浴混合物中;再将剧烈的氨气鼓泡通入醚溶液15-20分钟,之后,在15分钟内分小批少量添加亚硝酸异丁酯,同时保持冷却和剧烈的氨气鼓泡;通过减压蒸馏除去***,得到产物N-亚硝基(4-巯基甲基苯基)-羟胺铵;所述氯化铵与4-硝基苄基乙硫醇酸酯的摩尔比为2:1,所述混合溶液的体积为14.4mL;
3.3)将步骤3.2)中得到的TCF和步骤1.4)中得到的PDG@Au共混于40mL玻璃样品瓶中,在冰盐浴中遮光磁力搅拌72-84小时;之后,通过离心处理,并用pH 7.4的PBS缓冲液离心洗涤两次,得到产物PDG@Au-NO;所述TCF的浓度为20mg/mL,PDG@Au的浓度为0.1mg/mL;
3.4)将PDG@Au-NO溶液和p(AM-b-AMPBA)分散在pH值为9.5的20mL PBS中,在冰盐浴中遮光磁力搅拌8-10小时之后,通过离心,用pH 7.4PBS缓冲液离心洗涤两次,得到产物PDG@Au-NO/PBA溶液;所述PDG@Au-NO溶液的浓度为0.1mg/mL,p(AM-b-AMPBA)的浓度为0.7μg/mL。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述的步骤1.1)中的三羟甲基氨基甲烷是在2800rpm的高速分散的条件下溶解的。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述的步骤1.4)、步骤3.3)和步骤3.4)中产物的离心处理的转速不得低于9000rpm。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述的步骤2.4)中磁力搅拌时间不得低于8h。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述的步骤3.1)中用无水硫酸钠干燥二氯甲烷溶液的时间不得低于4h。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述的步骤3.2)中用无水硫酸钠干燥***溶液的时间不得低于4h。
8.一种权利要求1所述光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物的使用方法,其特征在于:所述光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物用于抗菌和抑制细菌。
9.一种权利要求1所述光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物的使用方法,其特征在于:所述光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物用于生物被膜的生长、繁殖。
10.一种权利要求1所述光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物的使用方法,其特征在于:所述光致释放一氧化氮抗生物被膜的纳米药物用于促进伤口愈合以及抗炎症因子。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114377021A (zh) * | 2022-01-18 | 2022-04-22 | 中国科学技术大学 | 一种光响应一氧化氮递送/光热协同材料的制备及其应用 |
CN114956315A (zh) * | 2022-05-24 | 2022-08-30 | 华南理工大学 | 一种利用no缓释剂控制膜生物反应器中膜污染的方法 |
CN115351288A (zh) * | 2022-08-23 | 2022-11-18 | 西北工业大学 | 一种金纳米花及其制备方法和应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050281871A1 (en) * | 2002-12-20 | 2005-12-22 | Roehm Gmbh & Co. Kg | Methods for coating substrates for pharmaceutical uses with a mixture of two film-forming coating agents |
CN109045297A (zh) * | 2018-08-24 | 2018-12-21 | 东华大学 | 一种苯硼酸-聚乙二醇修饰的聚多巴胺包裹的锂皂石四氧化三铁纳米颗粒的制备方法 |
CN109337084A (zh) * | 2018-09-10 | 2019-02-15 | 天津理工大学 | 具有活性氧和pH双重响应性及电荷反转特性的智能基因载体的制备方法 |
CN109820838A (zh) * | 2019-03-06 | 2019-05-31 | 暨南大学 | 一种光热控释氢气纳米材料及其制备方法与应用 |
-
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050281871A1 (en) * | 2002-12-20 | 2005-12-22 | Roehm Gmbh & Co. Kg | Methods for coating substrates for pharmaceutical uses with a mixture of two film-forming coating agents |
CN109045297A (zh) * | 2018-08-24 | 2018-12-21 | 东华大学 | 一种苯硼酸-聚乙二醇修饰的聚多巴胺包裹的锂皂石四氧化三铁纳米颗粒的制备方法 |
CN109337084A (zh) * | 2018-09-10 | 2019-02-15 | 天津理工大学 | 具有活性氧和pH双重响应性及电荷反转特性的智能基因载体的制备方法 |
CN109820838A (zh) * | 2019-03-06 | 2019-05-31 | 暨南大学 | 一种光热控释氢气纳米材料及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
FAN RONG 等: ""Nitric Oxide-Releasing Polymeric Materials for Antimicrobial Applications: A Review"", 《ANTIOXIDANTS》 * |
ZHANG YUAN 等: ""Near-Infrared Light-Triggered Nitric-OxideEnhanced Photodynamic Therapy and LowTemperature Photothermal Therapy for Biofilm Elimination"", 《ACS NANO》 * |
李国巍 等: ""树枝状聚酰胺—胺/聚多巴胺修饰的四氧化三铁作为一氧化氮供体及其光热协同抗菌研究"", 《2018(第3届)抗菌科学与技术论坛论文摘要集》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114377021A (zh) * | 2022-01-18 | 2022-04-22 | 中国科学技术大学 | 一种光响应一氧化氮递送/光热协同材料的制备及其应用 |
CN114377021B (zh) * | 2022-01-18 | 2024-03-29 | 中国科学技术大学 | 一种光响应一氧化氮递送/光热协同材料的制备及其应用 |
CN114956315A (zh) * | 2022-05-24 | 2022-08-30 | 华南理工大学 | 一种利用no缓释剂控制膜生物反应器中膜污染的方法 |
CN115351288A (zh) * | 2022-08-23 | 2022-11-18 | 西北工业大学 | 一种金纳米花及其制备方法和应用 |
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