CN113267622B - 一种检测氯羟吡啶的试纸条及方法 - Google Patents

一种检测氯羟吡啶的试纸条及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113267622B
CN113267622B CN202110503206.6A CN202110503206A CN113267622B CN 113267622 B CN113267622 B CN 113267622B CN 202110503206 A CN202110503206 A CN 202110503206A CN 113267622 B CN113267622 B CN 113267622B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chlorohydroxypyridine
test strip
hapten
sample
carrier protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110503206.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113267622A (zh
Inventor
万宇平
赵义良
何方洋
丛倩千
王志恒
王兆芹
马玉华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Qinbang Biotechnology Co ltd
Beijing Qinbang Technology Co ltd
Original Assignee
Shandong Qinbang Biotechnology Co ltd
Beijing Qinbang Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Qinbang Biotechnology Co ltd, Beijing Qinbang Technology Co ltd filed Critical Shandong Qinbang Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110503206.6A priority Critical patent/CN113267622B/zh
Publication of CN113267622A publication Critical patent/CN113267622A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113267622B publication Critical patent/CN113267622B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2430/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving synthetic organic compounds as analytes
    • G01N2430/10—Insecticides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测氯羟吡啶的试纸条及方法。该试纸条包括试纸和微孔试剂，所述试纸包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有氯羟吡啶半抗原‑载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述微孔试剂上冻干有氯羟吡啶单克隆抗体‑胶体金标记物。用本发明试纸条检测氯羟吡啶的方法简便、快速、直观、准确、便于携带、适用范围广、成本低、易推广使用。

Description

一种检测氯羟吡啶的试纸条及方法
技术领域
本发明涉及一种检测氯羟吡啶的试纸条及方法，具体涉及一种用于检测氯羟吡啶的胶体金试纸条，其特别适用于动物源性食品中氯羟吡啶残留的检测。
背景技术
氯羟吡啶(Clopidol)属吡啶类化合物，因其对球虫病具有较强的抑制作用，而在畜禽养殖业中被广泛应用。研究表明，在畜禽养殖过程中贸然停用该类药物，往往会导致球虫病爆发，而连续或过量的用药则会造成氯羟吡啶在动物体内的残留，并会随着食物链进行蓄积和传递。氯羟吡啶具有致畸性，对人类的健康构成了极大的威胁。随着人们对食品安全的日益重视，动物源性食品中药物残留的限量要求也日益严格。我国国家标准GB 31650中规定了食品中氯羟吡啶的最大残留限量。
目前已报道的检测氯羟吡啶的方法主要是气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱质谱法和液相色谱质谱法等仪器方法。这些方法均须在实验室条件下操作，样品前处理繁琐费时，还需配备昂贵的仪器设备，检测成本较高、耗时长、操作复杂，在实际应用过程中有很大的限制性，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适于动物源性食品中氯羟吡啶残留的胶体金试纸条，可满足大量样品现场筛选和监控，能够更好地满足我国食品监管部门等开展检测工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够检测动物源性食品中氯羟吡啶残留的胶体金试纸条，并且提供一种高效、准确、简便、适于现场监控和大量样本筛查的检测方法。
本发明所提供的检测氯羟吡啶的试纸条，包括试纸和微孔试剂；所述试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫，其依次连接，所述反应膜上具有包被有氯羟吡啶半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线；所述微孔试剂上冻干有氯羟吡啶单克隆抗体-胶体金标记物，其具有微孔塞。
所述氯羟吡啶单克隆抗体是以氯羟吡啶半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。
所述氯羟吡啶半抗原-载体蛋白偶联物由氯羟吡啶半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝清蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，所述氯羟吡啶半抗原是由氯羟吡啶与4-马来酰亚胺苯乙酸酰肼反应得到，其分子结构式为：
Figure GDA0004235609130000021
所述底板为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫为聚酯纤维或玻璃纤维材质；所述吸水垫为吸水滤纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：
1)制备冻干有氯羟吡啶单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；
2)制备具有包被有氯羟吡啶半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、底板组装成试纸；
4)将1)和3)制备好的冻干有氯羟吡啶单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。
具体地说，步骤包括：
1)将氯羟吡啶与4-马来酰亚胺苯乙酸酰肼进行反应，制备氯羟吡啶半抗原；
2)将氯羟吡啶半抗原与载体蛋白偶联，制备氯羟吡啶半抗原-载体蛋白偶联物；
3)用氯羟吡啶半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌氯羟吡啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
5)分别将氯羟吡啶半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线(T)和质控线(C)上；
6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
7)将制备的氯羟吡啶单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到氯羟吡啶单克隆抗体-胶体金标记物；
8)将氯羟吡啶单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中后，将微孔试剂加上微孔塞；
9)将样品吸收垫用含1％牛血清白蛋白、pH为7.2的0.2mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h备用；
10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫，最后切成3.95mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封；
11)将制备好的微孔试剂和试纸组装成试纸条，2～8℃条件下保存12个月。
本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测动物源性食品中氯羟吡啶残留的方法，它包括步骤：
(1)样品前处理；
(2)用试纸条进行检测；
(3)分析检测结果。
本发明的氯羟吡啶快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将氯羟吡啶单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中，样品中的氯羟吡啶先与其充分反应，形成药物-抗体-胶体金标记物；再滴入试纸条卡孔内，样本中的药物在流动过程中与反应膜检测线上的氯羟吡啶半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合氯羟吡啶单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅来判断待测样品液中是否含有氯羟吡啶残留。
检测时，样品经处理后滴入微孔试剂内，充分反应后再加入试纸条卡孔内，当氯羟吡啶在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的氯羟吡啶半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(T)和质控线(C)上各出现一条红色条带，且T线显色比C线显色深或与C线显色一致；如果氯羟吡啶在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与氯羟吡啶全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与氯羟吡啶半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带或比C线显色浅。如图4所示。
阴性：当质控线(C)显示出红色条带，检测线(T)同时也显示出红色条带，且(T)线颜色接近或深于(C)线时，判为阴性。
阳性：当质控线(C)显示出红色条带，而检测线(T)不显色或(T)线颜色浅于(C)线时，判为阳性。
无效：当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。
本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的氯羟吡啶单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；将金标抗体冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。用本发明试纸条检测氯羟吡啶的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。
附图说明
图1为氯羟吡啶半抗原合成图。
图2为试纸剖面结构示意图。
图3为微孔试剂图。
图4为试纸条检测结果判定图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
实施例1检测氯羟吡啶的试纸条的制备
该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：
1)制备冻干有氯羟吡啶单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；
2)制备具有包被有氯羟吡啶半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、底板组装成试纸；
4)将1)和3)制备好的冻干有氯羟吡啶单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。
下面分步详细叙述：
1、氯羟吡啶半抗原的合成(合成路线见附图1)
取氯羟吡啶1.92g，加2mol/L氢氧化钠水溶液40mL溶解，加含有4-马来酰亚胺苯乙酸酰肼4.93g的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20mL，加碘化亚铜1.9g，加热，100℃反应4h；停止反应，加水100mL，加6mol/L盐酸中和到pH值为7，加1,2-二氯乙烷200mL×3，萃取三次，合并有机相，蒸干，无水乙醇120mL重结晶，得到马来酰亚胺化氯羟吡啶半抗原产物0.74g，即为氯羟吡啶半抗原。
2、免疫原的制备
取牛血清白蛋白(BSA)50mg，加0.1mol/L pH＝9.5的CB缓冲液6mL溶解，加含有氨-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)酸酯(SPDP)11.6mg的DMF溶液1mL，室温反应4h，停止反应，用0.02mol/L PBS透析纯化，除去未反应的SPDP，得到引入二硫吡啶基的BSA溶液，记为A液；取三(2-酰乙基)磷盐酸盐(TCEP)11mg，加0.5mol/L pH＝7.0的PB缓冲液2mL溶解，滴加到A液中，4℃反应30min，得到巯基化BSA，记为B液；取氯羟吡啶半抗原15mg，加1mL DMF溶解，加入到B液中，室温反应3h，用0.02mol/L PBS透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到氯羟吡啶半抗原-BSA偶联物，即为免疫原。
3、包被原的制备
取卵清白蛋白(OVA)50mg，加0.1mol/L pH＝9.5的CB缓冲液6mL溶解，加含有SPDP9mg的DMF溶液1mL，室温反应4h，停止反应，用0.02mol/L PBS透析纯化，除去未反应的SPDP，得到引入二硫吡啶基的OVA溶液，记为A液；取TCEP 11mg，加0.5mol/L pH＝7.0的PB缓冲液2mL溶解，滴加到A液中，4℃反应30min，得到巯基化OVA，记为B液；取氯羟吡啶半抗原8.2mg，加1mL DMF溶解，加入到B液中，室温反应3h，用0.02mol/L PBS透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到氯羟吡啶半抗原-OVA偶联物，即为包被原。
4、氯羟吡啶单克隆抗体的制备
(1)动物免疫
将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。
(2)细胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
(3)细胞冻存和复苏
将杂交瘤细胞用冻存液制成1×106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
(4)单克隆抗体的制备与纯化
增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。
所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量分数)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量分数)；所述细胞培养基的pH为7.4。
5、羊抗鼠抗抗体的制备
以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
6、氯羟吡啶单克隆抗体-胶体金标记物的制备
(1)胶体金的制备
用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％(质量分数)，取100mL置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入1.5mL 1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，在日光下观察颜色为酒红色。
(2)氯羟吡啶单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入5～50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述氯羟吡啶单克隆抗体，继续搅拌混匀30min；静置10min后加入10％ BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1％，静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。
复溶缓冲液：含BSA的质量分数为0.1％～0.5％、蔗糖的质量分数2％～4％、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
7、微孔试剂的制备
向微孔试剂微孔板中加入100μL氯羟吡啶单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有氯羟吡啶单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封保存。
8、样品吸收垫的制备
将样品吸收垫用含1％牛血清白蛋白、pH为7.2的0.2mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h备用。
9、反应膜的制备
将氯羟吡啶半抗原-OVA偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。
包被过程：用0.01mol/L、pH 7.2的磷酸缓冲液将氯羟吡啶半抗原-OVA偶联物稀释到1mg/mL，用Bio dot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T线)，包被量为1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/mL，用Bio dot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C线)，包被量为1.0μL/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥16h，备用。
10、试纸条的组装
根据附图2所示试纸剖面结构，将样品吸收垫(1)、反应膜(2)、吸水垫(3)依次按顺序粘贴在PVC底板(6)上；样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线(4)和质控线(5)，检测线(T线)和质控线(C线)均为与所述试纸的长相垂直的条状带；检测线位于靠近样品吸收垫的末端的一侧；质控线位于远离样品吸收垫的末端的一侧；将试纸用机器切成3.95mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封。
根据附图3所示微孔试剂图，微孔试剂7上具有微孔塞8。
将上述试纸与微孔试剂组装成试纸条，在2～8℃的环境中贮存，有效期12个月。
实施例2动物源性食品中氯羟吡啶的检测
1、样本前处理
(1)鲜蛋样本
将鲜蛋破碎至100mL烧杯，充分混匀(蛋清和蛋黄搅匀)；称取(2.00±0.05)g混匀好的鲜蛋样本至10mL聚苯乙烯离心管中，加入0.5mL NaCl溶液，涡旋仪涡动2min，再加入3mL样本提取剂，涡旋仪涡动2min，以不低于3000r/min室温(20～25℃)离心5min；移取2mL上层有机相至10mL聚苯乙烯离心管中，于50～60℃水浴氮气或空气流下吹干；加入300μL样本复溶液，用涡旋仪涡动30s后得待检样本液。
(2)组织样本
用均质器均质组织样本；称取(2.00±0.05)g均质好的组织样本至10mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL样本提取液，涡旋仪涡动2min，以不低于3000r/min室温(20～25℃)离心5min；上层相对澄清的部分为样本液(如部分样本油脂太多，上层为白色的乳浊液时，取中间相对澄清的部分)，吸取150μL样本液再加入900μL样本提取液，涡旋混匀即为待测液(2mL聚苯乙烯离心管为稀释容器)。
(3)生鲜乳样本
样本恢复至室温后直接检测，待检样本必须为均匀液体，不能有结块、发酸或沉淀。
2、用试纸条检测
用微量移液器吸取100μL待测样本液于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀；室温(20～25℃)孵育3min后，吸取混匀液100μL垂直滴于加样孔中；液体流动开始计时，反应5～8min，判定结果。
3、分析检测结果
阴性(－)：T线显色比C线显色深或与C线显色一致，表示样本中氯羟吡啶浓度低于检测限，如图4a、4b。
阳性(+)：T线显色比C线显色浅或T线不显色，表示样本中氯羟吡啶浓度等于或高于检测限，如图4c、4d.
无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效，如图4e、4f。
实施例3样本检测实例
1、检测限试验
取空白鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋样本，在其中分别添加氯羟吡啶至终浓度为7.5μg/kg、15μg/kg、30μg/kg；取空白鸡肉、猪肉、牛肉样本，在其中分别添加氯羟吡啶至终浓度为1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg；取空白生乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳样本，在其中分别添加氯羟吡啶至终浓度为5μg/L、10μg/L、20μg/L；取试纸条进行检测，每个样本重复测定三次。
用试纸条检测动物源性食品时，当鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋样本中无氯羟吡啶和其添加浓度为7.5μg/kg，鸡肉、猪肉、牛肉样本中无氯羟吡啶和其添加浓度为1mg/kg，生乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳样本中无氯羟吡啶和其添加浓度为5μg/L时，试纸条上显示出T线显色比C线显色深或与C线显色一致，呈阴性；当鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋样本中氯羟吡啶添加浓度为15μg/kg、30μg/kg，鸡肉、猪肉、牛肉样本中氯羟吡啶添加浓度为2mg/kg、4mg/kg，生乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳样本中氯羟吡啶添加浓度为10μg/L、20μg/L时，试纸条上显示出T线显色比C线显色浅或T线不显色，呈阳性，表明本试纸条对动物源性食品中氯羟吡啶的检测限为：鲜蛋样本15μg/kg，组织样本2mg/kg，生鲜乳样本10μg/L。
2、假阳性率、假阴性率试验
取空白鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋、鸡肉、猪肉、牛肉、生乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳样本及添加氯羟吡啶至检测限浓度的阳性鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋、鸡肉、猪肉、牛肉、生乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳样本各20份，用3个批次生产的试纸条分别进行检测，计算其阴阳性率。
结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性动物源性食品时，结果全为阳性，可知阳性符合率为100％，假阴性率为0；检测20份阴性动物源性食品时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。说明本发明的检测氯羟吡啶的试纸条可以对动物源性食品中氯羟吡啶残留进行快速检测。
3、特异性试验
用本试纸条检测10mg/kg地克珠利、二硝托胺、尼卡巴嗪、磺胺喹噁啉、磺胺二甲嘧啶、丁氧喹酯、癸氧喹酯、盐酸氯丙啉、盐酸氯苯胍等类似药物时，试纸条上显示出T线显色比C线显色深或与C线显色一致，呈阴性，说明本试纸条对这些药物无交叉反应。

Claims (4)

1.一种检测氯羟吡啶的试纸条，包括试纸和微孔试剂，所述试纸包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有氯羟吡啶半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述微孔试剂上冻干有氯羟吡啶单克隆抗体-胶体金标记物；所述氯羟吡啶单克隆抗体是以氯羟吡啶半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述氯羟吡啶半抗原-载体蛋白偶联物由氯羟吡啶半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝清蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白；其特征在于所述氯羟吡啶半抗原的合成方法为：取氯羟吡啶1.92g，加2mol/L氢氧化钠水溶液40mL溶解，加含有4-马来酰亚胺苯乙酸酰肼4.93g的N,N-二甲基甲酰胺溶液20mL，加碘化亚铜1.9g，加热，100℃反应4h；停止反应，加水100mL，加6mol/L盐酸中和到pH值为7，加1,2-二氯乙烷200mL×3，萃取三次，合并有机相，蒸干，无水乙醇120mL重结晶，得到氯羟吡啶半抗原，其分子结构式为：
Figure FDA0004235609120000011
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫依次黏贴在底板上组成，所述微孔试剂上具有微孔塞。
3.一种制备权利要求1-2任一项所述试纸条的方法，其包括步骤：
1)制备冻干有氯羟吡啶单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；
2)制备具有包被有氯羟吡啶半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、底板组装成试纸；
4)将1)和3)制备好的冻干有氯羟吡啶单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。
4.一种检测动物源性食品中氯羟吡啶残留的方法，其包括步骤：
1)样品前处理；
2)用权利要求1-2任一项所述的试纸条进行检测；
3)分析检测结果。
CN202110503206.6A 2021-05-10 2021-05-10 一种检测氯羟吡啶的试纸条及方法 Active CN113267622B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110503206.6A CN113267622B (zh) 2021-05-10 2021-05-10 一种检测氯羟吡啶的试纸条及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110503206.6A CN113267622B (zh) 2021-05-10 2021-05-10 一种检测氯羟吡啶的试纸条及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113267622A CN113267622A (zh) 2021-08-17
CN113267622B true CN113267622B (zh) 2023-07-07

Family

ID=77230194

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110503206.6A Active CN113267622B (zh) 2021-05-10 2021-05-10 一种检测氯羟吡啶的试纸条及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113267622B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113817045B (zh) * 2021-11-23 2022-02-25 北京纳百生物科技有限公司 氯羟吡啶人工抗原合成法及其在胶体金试剂盒中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103018440A (zh) * 2012-11-23 2013-04-03 河南科技学院 一种氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡
WO2018006269A1 (zh) * 2016-07-05 2018-01-11 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光免疫检测试剂盒
CN110312734A (zh) * 2017-02-20 2019-10-08 东曹株式会社 抗体分离能力改善的Fc结合性蛋白质及使用其的抗体的分离方法
CN111334479A (zh) * 2020-04-16 2020-06-26 江南大学 一株氯羟吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株tyl及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2240495B1 (en) * 2008-02-01 2015-07-15 Genentech, Inc. Nemorubicin metabolite and analog reagents, antibody-drug conjugates and methods

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103018440A (zh) * 2012-11-23 2013-04-03 河南科技学院 一种氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡
WO2018006269A1 (zh) * 2016-07-05 2018-01-11 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光免疫检测试剂盒
CN110312734A (zh) * 2017-02-20 2019-10-08 东曹株式会社 抗体分离能力改善的Fc结合性蛋白质及使用其的抗体的分离方法
CN111334479A (zh) * 2020-04-16 2020-06-26 江南大学 一株氯羟吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株tyl及其应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development of a gold nanoparticle-based strip assay for detection of clopidol in the chicken;Mengjia Chao 等;Food and Agricultural Immunology;31(1);全文 *
Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection of clopidol residues in chicken tissues;Jin-qing Jiang 等;J Sci Food Agric;94(11);全文 *
Preparation, Characterization and in Vitro Efficacy of Albumin Conjugates of Doxorubicin;Felix Kratz 等;Biol Pharm Bull;第21卷(第1期);全文 *
氯羟吡啶人工抗原合成和鉴定;谢忠良 等;食品科学;30(01);全文 *
氯羟吡啶人工抗原的合成及抗体特性;张海棠 等;西北农业学报;23(02);全文 *
氯羟吡啶抗原合成和多克隆抗体制备;冯才伟;郭鑫;;中国畜牧兽医;38(4);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113267622A (zh) 2021-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111239399B (zh) 一种检测丙溴磷的试纸条及方法
CN109324182B (zh) 一种检测二甲戊灵的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN109239336B (zh) 一种检测异丙威的试纸条及其应用
CN110850090A (zh) 一种检测联苯菊酯的试纸条及其应用
CN107271665B (zh) 一种检测沙丁胺醇的试纸条及其应用
CN105044365A (zh) 检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法
CN113267622B (zh) 一种检测氯羟吡啶的试纸条及方法
CN106918705B (zh) 检测甲氰菊酯的试纸及其应用
CN111965360B (zh) 一种检测腐霉利的试纸条及方法
CN111735951B (zh) 一种检测甲氰菊酯的试纸条及其应用
CN112067811B (zh) 一种检测互隔交链孢霉素的试纸条及其应用
CN113603767B (zh) 一种泰拉霉素半抗原及其抗体与试纸条
CN108717121B (zh) 一种同时检测四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物的试纸条及方法
CN113156125B (zh) 一种检测米酵菌酸的试纸条及方法
CN110441517B (zh) 一种检测6-苄基腺嘌呤的试纸条及方法
CN113030463B (zh) 一种检测疫苗中蛋白a等杂质的试纸条及其应用
CN111751535B (zh) 一种检测硫丹的试纸条及其应用
CN111896738B (zh) 一种检测蛇形菌素的试纸条及其应用
CN116008554B (zh) 一种检测兽药奥芬达唑的试纸条及方法
CN111856000B (zh) 一种检测氯丹的试纸条及方法
CN109971727B (zh) 一种分泌抗氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN111965359B (zh) 一种检测溴虫腈的试纸条及方法
CN111289752A (zh) 一种检测三氯杀螨醇的试纸条及方法
CN113960307B (zh) 一种检测稻瘟灵的试纸条及其制备方法和应用
CN113156127B (zh) 一种检测毒死蜱的试纸条及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: No.8, Gaoxin 4th Street, Huilongguan international information industry base, Changping District, Beijing

Applicant after: Beijing Qinbang Technology Co.,Ltd.

Applicant after: Shandong Qinbang Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: No.8, Gaoxin 4th Street, Huilongguan international information industry base, Changping District, Beijing

Applicant before: BEIJING KWINBON BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Applicant before: Shandong Qinbang Biotechnology Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant