CN113265480B - 枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物、Taqman探针及应用 - Google Patents

枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物、Taqman探针及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物、Taqman探针及应用。本发明的枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物和探针序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。本发明利用所述引物能够从枯草芽孢杆菌HMB19198菌株扩增出片段单一的目的片段，实现了HMB19198菌株的特异性检测，本发明所述引物具有特异性高、检测效率高、假阳性率低、保存时间长等特点。利用本发明引物，通过实时定量PCR技术可以快速定量枯草芽孢杆菌HMB19198菌株在植物叶片中的群体数量，具有高通量、快速和准确的优点。

Description

枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物、Taqman探针及 应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物、Taqman探针及应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，具有生长和繁殖速度较快、形成耐逆、抗热的芽孢等特点。枯草芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，与病原菌竞争营养，同时，枯草芽孢杆菌生长过程中会合成并分泌脂肽类物质、羊毛硫菌素、二元肽、铁载体、聚酮类化合物等活性物质，这些活性物质对植物病原菌有明显的抑制作用，有的还能诱导植物产生***抗性。因此，枯草芽孢杆菌成为开发微生物杀菌剂的重要资源，越来越受到科学家的重视。
中国专利文献CN102586142A(申请号201210028079.X)公开了一种防治黄瓜霜霉病及其微生物菌剂，其中公开了枯草芽孢杆菌HMB19198菌株能有效地防治黄瓜霜霉病。
为了加强对HMB19198菌株的保护，以及快速识别HMB19198菌株，建立枯草芽孢杆菌HMB19198菌株特异性检测技术尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物和探针。
本发明的再一目的在于提供上述引物和探针的应用。
根据本发明具体实施方式的枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物和探针，所述引物的核苷酸序列为：
SEQ ID NO.1：5’-ATGTGTATAATAAGAAAAGTCGAATTGGAA-3’，
SEQ ID NO.2：5’-TCATTTGATGTTGAAGTCAAGAAGT-3’；
所述探针的核苷酸序列为：
SEQ ID NO.3：5’-AACATTCGAAAAACATTCGAAAAACATTC-3’。
本发明的引物和探针是针对枯草芽孢杆菌HMB19198菌株独特基因的序列设计得到，枯草芽孢杆菌HMB19198菌株独特基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：
5’-ATGTGTATAATAAGAAAAGTCGAATTGGAAAACATTCGAAAAACATTCGAAAAACATTCGAAAAACATTTTTAAAAAACTTCTTGACTTCAACATCAAATGA-3’。
根据本发明具体实施方式的枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物和探针，所述探针的5’端标记荧光基团，所述探针的3’端标记淬灭基团。其中，荧光基团可选FAM、HEX、TET等，淬灭基团可选TAMRA、BHQ、MGB等。
TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测***可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
根据本发明具体实施方式的枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物和探针，所述探针的5’端标记有FAM荧光染料，所述探针的3'端标记有淬灭基团TamerMGB。
本发明还提供枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物和探针的应用，具体可以应用于定量检测枯草芽孢杆菌HMB19198菌株，如检测枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的检测试剂盒，或实时荧光定量检测枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的方法。
其中，检测枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的检测试剂盒，包含上述特异性引物和探针，还包含DNA裂解液、扩增反应液、引物混合液和阳性对照液，MGB标记609-Taqman探针。
DNA裂解液包括100mM NaCl、pH值为8.0的10mM Tris-Cl、pH值为8.0的25mM EDTA、1％W/V的十二烷基硫酸钠、1.7μg/μL蛋白酶K和2mg/mL溶菌酶；所述扩增反应液包括全式金PCR缓冲液、25mM MgCl2溶液、2.0mM脱氧核糖核苷酸溶液和TaqmanMGB探针。
本发明的荧光定量PCR可以使用全式金试剂盒，对反应条件进行优化，确定了20μL反应体系：：Probe qPCR Mix 10μL，10μm/L引物各1.0μL，5μm/L探针1.0μL，模板1μL，用灭菌ddH2O补足至20μL。
PCR扩增的反应程序为：94℃30S,58℃45S，40个循环，并在每次延伸结束时收集荧光信号。
本发明的有益效果：
本发明针对枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的独特基因片段，设计引物及探针，并扩增出片段单一的目的片段，而在其他细菌中均没有扩增信号，从而本发明利用所述引物及探针实现了HMB19198菌株的特异性检测。
本发明可以检测10拷贝的样本DNA，在重组质粒1×101～1×107拷贝数范围内线性关系良好，实现了枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性定量检测，可以准确预测枯草芽胞杆菌HMB19198的数量。同时，本发明利用上述引物和探针定期监测了HMB19198在番茄叶片的定植情况，与普通涂板相比，具有特异性高、检测效率高、假阳性率低、灵敏度大等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实时荧光定量PCR反应检测枯草芽孢杆菌HMB19198的标准曲线；
图2是CFU传统计数法与本发明的引物检测枯草芽孢杆菌HMB19198的对比结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明所用的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株HMB19198，已于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5613。
实施例1设计特异性引物
通过基因组测序技术，构建枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的细菌完成图，获得该菌株的全部开放阅读框序列。通过在NCBI数据库中进行批量序列比对，本发明发现HMB19198菌株的独有基因HMB19198-609，该基因是一个功能未知基因。在现有的NCBI数据库中没有该基因的同源基因。
HMB19198菌株的独有基因HMB19198-609的核苷酸序列，如SEQ ID NO.4所示：
5’-ATGTGTATAATAAGAAAAGTCGAATTGGAAAACATTCGAAAAACATTCGAAAAACATTCGAAAAACATTTTTAAAAAACTTCTTGACTTCAACATCAAATGA-3’。
根据HMB19198菌株中该基因片段设计针对HMB19198菌株的特异性引物及探针。本发明自行设计引物，经过比较，选择引物序列如下：
q609-F：5’-ATGTGTATAATAAGAAAAGTCGAATTGGAA-3’；
q609-R：5’-TCATTTGATGTTGAAGTCAAGAAGT-3’。
609-Taqman的探针序列：
5’-AACATTCGAAAAACATTCGAAAAACATTC-3’。
实施例2考察引物的特异性
分别提取枯草芽孢杆菌HMB19198、番茄叶片、芽孢杆菌属的基因组，利用q609-F/q-609-R引物和609-Taqman探针进行检测。
荧光定量PCR使用全式金试剂盒(AQ221)，对反应条件进行优化，确定了20μL反应体系：Probe qPCR Mix 10μL，q609-F/R引物(10μm/L)各1.0μL，609-Taqman探针(5μm/L)1.0μL，模板1μL，用灭菌ddH2O补足至20μL。
扩增程序为94℃30S,58℃45S，40cycles，在每次延伸结束时收集荧光信号。
特异性检测结果见表1：
表1探针特异性检测结果
Figure BDA0003105396790000051
由表1可知，本发明的引物和探针仅对枯草芽孢杆菌HMB19198有扩增曲线，对番茄叶片基因组无扩增曲线，说明番茄对检测体系无干扰，同时其他菌株无无干扰。
实施例3建立标准曲线
以枯草芽孢杆菌HMB19198菌株基因组为模板，以实施例1筛选得到的引物q609-F/q609-R进行扩增，将扩增产物纯化后克隆到载体pMD19-T上，通过热激转化的方法转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5a感受态细孢中进行繁殖。
通过PCR，在带有氨苄抗生素的LB培养皿上筛选含有重组质粒的菌落，获得含有特异性序列的重组质粒。利用质粒提取试剂盒提取重组质粒，将提取的重组质粒用内切酶EcoRI进行酶切验证，酶切验证正确的重组载体进行测序。
将测序正确的重组载体进行酶切，产物通过琼脂糖凝胶电泳后切胶回收相应片段，利用Promega Gel Extaction Kit进行片段回收，利用分光光度计测定线性化的重组质粒的DNA浓度，并根据公式计算重组质粒DNA的拷贝数。
用ddH2O将上述质粒载体稀释成1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL稀释液。
以上述拷贝数梯度稀释的DNA为模板，以q609-F/q609-R为引物，以609-Taqman为探针，采用TaqMan荧光探针的方法进行实时荧光定量PCR反应。建立质粒拷贝数与Ct值的标准曲线。
结果如图1所示，标准曲线为y＝-3.4552x+41.188(R2＝0.9904)，扩增效率为94.72％，其中x表示拷贝数取对数，y表示Ct值；本发明引物在重组质粒1×101～1×107拷贝数范围内线性关系良好，可以准确检测枯草芽孢杆菌HMB19198的数量。
此外，当重组质粒为10拷贝数时，可测得Ct值为36，因此，本发明的引物能够检出枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的最低拷贝数为10，本发明的引物对枯草芽孢杆菌HMB19198菌株具有较高的灵敏度。
实施例4本发明引物的应用
(S1)将OD600＝1.00的枯草芽孢杆菌HMB19198均匀喷在番茄叶片上，分别在0、2、4、6、8天后采集叶片，将待测叶片一分为二，一份样品梯度稀释涂布LB平板，另一份在液氮条件下研磨后，利用试剂盒提取基因组DNA，
(S2)实时定量PCR扩增：以基因组DNA为模板，加入609-Taqman探针，以q609-F和q609-R为引物进行实时定量PCR扩增：
20μL反应体系：Probe qPCR Mix 10μL，q609-F/R引物(10μm/L)各1.0μL，609-Taqman探针(5μm/L)1.0μL，模板1μL，用灭菌ddH2O补足至20μL；
扩增程序为94℃30S,58℃45S，40cycles，在每次延伸结束时收集荧光信号；
(S3)根据扩增结果，对枯草芽孢杆菌HMB19198菌株进行定量。
结果如图2所示，CFU传统计数法第4天时检测结果波动较大、误差大，并且，CFU法不能区分样品中的HMB19198是否有混杂的环境芽孢杆菌，因此CFU计数方法不能准确反应番茄叶片中实际的HMB19198的定殖数量；而Taqman检测方法的HMB19198检测数量随着时间变化较小，且误差小，说明重复性好。
因此，本发明建立的基于Taqman-MGB探针的检测枯草芽孢杆菌HMB19198方法具有较高的准确性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 河北省农林科学院植物保护研究所
<120> 枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物、Taqman探针及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtgtataa taagaaaagt cgaattggaa 30
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcatttgatg ttgaagtcaa gaagt 25
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacattcgaa aaacattcga aaaacattc 29
<210> 4
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtgtataa taagaaaagt cgaattggaa aacattcgaa aaacattcga aaaacattcg 60
aaaaacattt ttaaaaaact tcttgacttc aacatcaaat ga 102

Claims (8)

1.枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物和探针，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：
SEQ ID NO.1：5’-ATGTGTATAATAAGAAAAGTCGAATTGGAA-3’，
SEQ ID NO.2：5’-TCATTTGATGTTGAAGTCAAGAAGT-3’；
所述探针的核苷酸序列为：
SEQ ID NO.3：5’-AACATTCGAAAAACATTCGAAAAACATTC-3’；
枯草芽孢杆菌HMB19198菌株，于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5613。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团，所述探针的3’端标记淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端标记有FAM荧光染料，所述探针的3'端标记有淬灭基团TamerMGB。
4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物和探针在鉴定枯草芽孢杆菌HMB19198菌株中的应用。
5.检测枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求1所述的特异性引物和探针。
6.检测枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的特异性引物和探针进行PCR扩增的步骤。
7.根据权利要求6所述的检测枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系为：Probe qPCR Mix 10 μL，10 μm/L引物各1.0 μL，5 μm/L探针 1.0 μL，模板1 μL，用灭菌ddH2O补足至20 μL。
8.根据权利要求6所述的检测枯草芽孢杆菌HMB19198菌株的方法，其特征在于，PCR扩增的反应程序为：94℃ 30S, 58℃ 45S，40个循环。
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