CN113265383A - 多形汉逊酵母基因编辑***、其应用以及基因编辑方法 - Google Patents

多形汉逊酵母基因编辑***、其应用以及基因编辑方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑***，所述***包含以下组件：(1)Cas9蛋白，所述Cas9蛋白整合于多形汉逊酵母基因组中和(2)sgRNA表达载体；sgRNA表达载体包括sgRNA表达盒；其中，sgRNA表达盒由RNA pol II型启动子和终止子以及相应的核酶识别序列HH和HDV组成。本发明的基因编辑***具有极高的基因组编辑效率和较高的同源整合能力，由此进一步拓展了汉逊酵母作为细胞工厂的应用潜力，使其在遗传改造过程中更加简洁、快速、方便和精准。

Description

多形汉逊酵母基因编辑***、其应用以及基因编辑方法
技术领域
本发明属于微生物基因工程应用领域，具体涉及一种多形汉逊酵母基因编辑***及其应用。
背景技术
自然界中，存在一类“甲基营养型”微生物，能够利用C1化合物(甲烷、甲醇等)为碳源进行生长代谢，它们主要包括一些原核细菌以及甲醇酵母。其中，多形汉逊酵母是一种重要的甲基营养型酵母，具有广泛的底物谱，能够天然利用木糖和甲醇等碳源，而且能够耐受50℃以上高温，这些优良特性使其成为一种潜在的优良微生物细胞工厂。举例来说，汉逊酵母能够天然利用木糖和耐高温的特性，使其长期以来一直作为蛋白表达以及纤维素乙醇发酵的优良宿主。汉逊酵母作为一种非传统酵母，尽管具有诸多优良特性，但其基因操作难度较大，缺少稳定的表达载体，同源整合效率低等。这都将影响后续对其甲醇代谢过程的改造和强化。
近年来，CRISPR-Cas9***被广泛应用于真核、原核、模式以及非模式等众多生物体系，并以其较高的编辑效率和精准性正逐步成为目前基因组编辑的常规工具。CRISPR-Cas9***行使基因编辑功能依赖Cas9蛋白和导向RNA(sgRNA)。Cas9蛋白是一种RNA介导的核酸内切酶，其上的两个活性位点，HNH功能域和RuvC功能域，能够断裂双链DNA分子。而Cas9蛋白发挥功能需要核定位信号(NLS)和sgRNA。作为CRISPR***的另一关键组件，sgRNA由靶向RNA(crRNA)和反向激活RNA(tracrRNA)组成。20bp的crRNA来源于靶向序列，且其3’端含有标志性的PAM序列(NGG)。sgRNA形成特定的二级结构并引导Cas9蛋白靶向特定序列完成双链DNA断裂。一旦断裂形成，细胞就会启动DNA修复机制，通过非同源末端链接和同源重组等机制完成断裂修复。非同源末端链接修复的DNA会发生碱基的缺失或突变导致基因失活，而同源重组修复的DNA会引入特定模板序列。
CRISPR-Cas9***已经成功应用于汉逊酵母，实现了基因的定点敲除和同源整合。首先，Numamoto等使用pHpTDH3启动Cas9蛋白表达，sgRNA的启动子来源于汉逊酵母自身的tRNACUG。当靶向基因HpADE12、HpPHO1、HpPHO11和HpPHO84时，基因突变效率达到17～71％(Numamoto et al.J.Biosci.Bioeng.,2017,124(5):487-492.)；其次，Juergens等利用含有复制起始位点(panARS)的游离质粒来表达Cas9蛋白和sgRNA。以来源于Arxulaadeninivorans的pTEF1和ScPHO5基因的终止子构建SpCas9D147Y,P411T表达盒。同时，为了确保sgRNA的有效表达，他们选用II型启动子(pScTDH3)，并在sgRNA序列两端引入核酶识别位点。但是，最终靶向HpADE2基因的突变效率只有9％左右(Juergens et al.FEMS YeastRes.,2018,18(3):foy012.)；最后，通过将Cas9蛋白和sgRNA表达组件整合至rDNA位点，Wang等成功实现50％以上的基因敲除效率，且能够成功实现单基因以及多基因的同源重组过程，取得了目前为止汉逊酵母中最好的基因组编辑效果(Wang etal.Biotechnol.Biofuels,2018,11(1):277.)。
尽管目前能够利用CRISPR-Cas9***实现基因组的编辑过程，但是效率相对较低，特别是同源重组效率远远达不到成为细胞工厂宿主菌的要求。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明旨在提供一种具有高编辑效率和高同源重组效率的多形汉逊酵母基因编辑***，该***包含整合表达Cas9的多形汉逊酵母和游离表达的sgRNA表达载体。本发明还旨在提供改造的重组***多形汉逊酵母菌株。
本发明的关键在于构建完善的汉逊酵母CRISPR-Cas9基因操作***，提高基因编辑效率，同时，探索非同源末端链接和同源重组间的关系，实现提高同源重组的目的，最终为构建汉逊酵母细胞工厂奠定良好的分子基础。
本发明的一方面提供了一种多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑***，所述多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑***包含以下组件：
(1)Cas9蛋白，所述Cas9蛋白整合于多形汉逊酵母基因组中；
(2)sgRNA表达载体；
在优选的实施方式中，所述Cas9蛋白为组成型启动子表达的Cas9蛋白，所述sgRNA表达载体为游离的sgRNA表达载体；
sgRNA表达载体包括sgRNA表达盒；其中，sgRNA表达盒由RNA pol II型启动子和终止子以及相应的核酶识别序列HH和HDV组成。
所述RNA pol II型启动子为pTEF1。所述sgRNA转录后的多余序列通过核酶识别序列HH和HDV切除。
提供一种整合型表达CAS9基因的多形汉逊酵母工程菌株。进一步地，所述的菌株以来源于巴斯德毕赤酵母的3-磷酸甘油醛基因组成型启动子(pGAP)表达Cas9蛋白，并以单交换的方式整合至汉逊酵母AOX1位点。
在优选的实施方式中，所述sgRNA表达载体含有来源于乳酸克鲁维酵母的自主复制起始序列panARS。
在优选的实施方式中，所述sgRNA表达载体含有来源于汉逊酵母自身的URA3基因作为抗性基因和反向筛选标记。
所述sgRNA表达载体包含sgRNA表达盒，在汉逊酵母中扩增的复制起点(panARS)，且该载体带有URA3基因和氨苄抗生素抗性基因，具有简单筛选和质粒丢失特性。
在优选的实施方式中，所述sgRNA表达载体使用固定的N6序列。
在优选的实施方式中，所述多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑***包括来源于酵母的单独或组合过表达的同源重组相关蛋白Rad51、Rad52和Sae2。采用此种策略可以提高汉逊酵母同源重组效率。可以过表达来源于酵母的同源重组相关蛋白Rad51、Rad52和Sae2中的任意一种、两种以及三种。进一步地，所述酵母包含酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和汉逊酵母(Ogatcaea(Hansenula)polymorpha)。
在优选的实施方式中，敲除或者抑制非同源末端连接关键复合体Ku70/Ku80中的任意一种。进一步地，所述抑制(下调)KU80基因表达，是通过将其启动子替换为受甲硫氨酸抑制启动子pMET3实现的，以降低汉逊酵母非同源末端链接强度。
在优选的实施方式中，所述原位替换通过以下步骤进行：
(1)采用电击转化方法，电击结束后，细胞使用1mL含有1.7～10mM甲硫氨酸的YPD液体培养基孵育1h；
(2)筛选平板添加与步骤(1)等浓度的甲硫氨酸，菌体涂布后置于37℃静置培养2～3天。
本发明的另一方面提供了一种基因编辑方法，所述方法采用上述多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑***，并包括以下步骤：
(1)以所述sgRNA表达载体出发，构建靶向于目标供体的sgRNA表达载体；
(2)以重叠延伸PCR的方法构建基因敲除和表达的供体DNA片段，同源臂长度为200bp～1000bp；
(3)以将sgRNA表达载体和供体DNA分子导入汉逊酵母细胞。
在一个实施方式中，使用电击转化的方法将sgRNA表达载体和供体DNA分子导入汉逊酵母细胞。
在优选的实施方式中，所述基因编辑方法在所述步骤(3)之后，还包括以下步骤：
(4)验证正确的转化子置于含有5-氟乳清酸的培养基中培养，进行质粒丢失，质粒丢失后的重组汉逊酵母进行下一轮基因组编辑。
优选地，所述同源臂长度为200bp、500bp、1000bp。
优选地，通过电击转化的方法将sgRNA表达载体和供体DNA分子按照各500～1000ng的量导入汉逊酵母细胞。
优选地，所述5-氟乳清酸的培养基中的浓度为0.8～1.2g/L。
本发明的又一方面提供了上述多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑***或上述基因编辑方法在基因无缝敲除、定点整合、体内载体多片段自组装或体内多片段定点组装中至少一种的应用。
在优选的实施方式中，在所述基因无缝敲除中，同源臂长度为200～1000bp；
在所述定点整合中，所述片段长度为5.5kb，同源臂长度为1000bp；
在所述体内载体多片段自组装中，所述载体长度为20kb，所述片段数量为3～5段。
在所述体内多片段定点组装中，所述片段全长为7.4kb～15.2kb，所述片段的数量为1～4段；
优选地，所述同源臂长度为500～1000bp，位于启动子或终止子区域。
本申请能产生的有益效果包括但不限于：
与现有的汉逊酵母CRISPR/Cas9***相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明所述的CRISPR/Cas9基因编辑***具有极高的基因组编辑效率；
(2)本发明所述的CRISPR/Cas9基因编辑***具有较高的同源整合能力，并且证实了通过过表达同源重组相关蛋白以及下调非同源末端连接强度均可以改善汉逊酵母同源重组活力，间接证明了二者的体内竞争关系；
(3)本发明进一步拓展了汉逊酵母作为细胞工厂的应用潜力，使其在遗传改造过程中更加简洁、快速、方便和精准。
附图说明
图1(a)和图1(b)示出了Cas9基因在汉逊酵母中的整合表达。其中，图1(a)示出Cas9基因单交换整合表达盒；图1(b)是通过RT-PCR验证Cas9基因表达情况。
图2是根据实施例1的sgRNA表达载体优化示意图。
图3(a)和图3(b)是根据实施例1的示出sgRNA表达载体构建简化过程的示意图(从可变序列N6序列到固定N6序列)。
图4是根据实施例2的酿酒酵母同源重组修复机制示意图。
图5是根据实施例2的过表达HR相关蛋白菌株同源重组效率验证。
图6(a)和图6(b)是根据实施例3的汉逊酵母KU80基因启动子替换及甲硫氨酸浓度确定。
图7(a)～图7(c)是根据实施例3的抑制NHEJ中KU80基因的表达能够促进汉逊酵母同源重组。
图8(a)～图8(c)是根据实施例4的基因无缝敲除效率验证及同源臂长度的影响。
图9(a)～图9(c)是根据实施例4的基因定点整合效率验证及同源臂长度影响。
图10(a)～图10(c)是根据实施例4的载体体内自组装效率验证。
图11是根据实施例4的多片段体内定点整合实验设计示意图。
图12(a)和图12(b)是根据实施例4的多片段体内定点整合转化效率与阳性率验证。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
本发明依托CRISPR/Cas9***，构建了完善的汉逊酵母基因操作平台。首先，以II型启动子控制gRNA表达，CAS9基因整合的汉逊酵母对ADE2基因盒和KU80基因的编辑效率分别达到97.2％和100％；在此基础上，过表达同源重组相关蛋白(同时过表达来源于酿酒酵母的Rad51、Rad52和Sae2)和下调非同源末端连接关键基因KU80(原位替换启动子为pHpMET3)成功将汉逊酵母同源重组效率提高到60～70％(详见下述的实施例1)，而且维持良好的细胞生长状况和转化效率。最后，成功将具有高同源重组能力的重组汉逊酵母应用于基因无缝敲除、定点整合、多片段载体体内自组装和多基因定点整合等实际代谢工程改造过程中，取得了目前为止最好的精准基因组编辑效果，为后续构建汉逊酵母细胞工厂奠定了良好基础。
实施例1
CRISPR/Cas9***构建
(1)CAS9基因的整合表达
本发明出发菌株多形汉逊酵母购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌株保藏号CGMCC No.2.2412。
本发明进行的PCR扩增、酶切和连接等常规分子生物学操作遵循标准流程。高保真PCR酶PrimeSTAR，DNA maker(DL2,000,DL10,000和DL15,000),Q.cut快切限制性内切酶等购于宝生物工程(大连)有限公司。
高保真PCR酶(Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase)、快速验证taq酶(2×Taq Master Mix(Dye Plus))和ClonExpress II One Step Cloning Kit等购于南京诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme Biotech Co.,Ltd)。
Figure BDA0002565692440000061
Master Mix购于NEB。
质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒以及胶回收试剂盒购于OMEGA和生工生物工程(上海)股份有限公司。
构建CAS9基因整合汉逊酵母。首先，以引物pGAP-Fw-EcoRI(CGCCGCgaattcTTTTTGTAGAAATGTCTTGG)和pGAP-Rv-XhoI(CCGTCGctcgagTGTGTTTTGATAGTTGTTCA)扩增来源于毕赤酵母的pGAP启动子，以EcoR I和Xho I分别对载体pPICZ A和pGAP进行酶切连接，获得重组载体pPICZA-pGAP。扩增人源的CAS9基因(引物Cas9-Fw-SacII：ATTGATccgcggATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGC和Cas9-Rv-SacII:ATTGATccgcggTCACACCTTCCTCTTCTTCTTGGGG)，并利用Sac II位点连接于pPICZA-pGAP。将获得的表达载体进行单酶切后，转化汉逊酵母495，以单交换的方式整合于汉逊酵母基因组(如图1(a)所示)。获得的正确转化子命名为495-3。
同时。为了证实Cas9基因在汉逊酵母中表达，提取Cas9整合菌株495-3的RNA，并以其反转录形成的cDNA为模板，扩增部分Cas9序列(如图1(b)所示)。出发菌株495并未扩出条带，而495-3和阳性对照均出现明显条带(1％琼脂糖电泳，电压115V，15min)，证明Cas9基因正确整合到汉逊酵母基因组，并且能够正常表达。之后的实施例均以菌株495-3为宿主菌构建CRISPR/Cas9遗传操作平台。
(2)sgRNA表达***构建
为了使gRNA表达组件稳定游离存在，将来源于乳酸克鲁维酵母的复制起点panARS构建于gRNA表达载体(如图2所示)。质粒转化后能够在汉逊酵母中发挥功能且以游离方式存在，在5-氟乳清酸存在条件下，含有URA3基因的质粒能够正常丢失，保证后续基因操作的连续进行。在URA3基因存在时，会将5-氟乳清酸转化为有毒的5-氟尿嘧啶，导致细胞死亡。因此，细胞会自动将含有URA3基因的质粒丢掉，保证正常生长；进行一轮编辑以后，如果不将gRNA表达载体丢掉就无法进行下一轮基因编辑。所以利用5-氟乳清酸的反向筛选作用，进行方便的质粒丢失，保证连续的基因编辑操作。
首先，发明人构建了RNA pol III型启动子启动的sgRNA表达盒，其在转录后不会在gRNA两端添加额外序列。为保证gRNA正常行使功能，发明人构建了以汉逊酵母自身tRNACUG启动子启动的双向gRNA表达盒(如图2所示)。将其与含有整合Cas9的汉逊酵母495-3结合，靶向HpADE2基因的突变效率小于0.1％(如表1所示)，说明该***虽然能够行使基因编辑功能，但是效率极低。更换为汉逊酵母自身的终止子tSNR6，编辑效率也只有微弱提升(0.46％，如表1所示)，无法进行后续应用。
接下来，发明人通过更换RNA pol II型启动子(pTEF1)来提高sgRNA的表达量，并引入核酶识别序列HH和HDV完全切除sgRNA转录后的多余序列。由于gRNA表达水平的显著提高，基因编辑效率大幅度提高。当靶向HpADE2基因时，突变效率达到97.2％，比III启动子的突变效率提高了200多倍(表1)。相似地，当把HpKU80基因作为靶向基因时，选取的8个转化子经测序全部发生突变，突变效率达到100％(如表1所示)。该基因编辑效率是目前所有报道的文献中最高的，能够很好地实现基因的定点敲除，也为后续提高同源重组效率奠定基础。
最后，为了简化sgRNA构建和替换过程，我们固定了HH序列5’端的6bp碱基(ATCTGA)，使其与HH的3’端后6个碱基互补配对，而不是与gRNA上前6bp碱基互补配对。这一策略尽管会导致成熟sgRNA的5‘端多出6bp碱基，但是经过实验证实，编辑效率没有受到显著影响。对于HpADE2基因而言，固定的N6序列不会影响基因编辑效率，依然维持在90％以上；但是，对于HpKU80基因，固定的N6序列会在一定程度上降低基因编辑效率，这种效率的降低也可能是由于挑取测序的突变子数量较少。因此，综合gRNA构建的复杂程度、基因编辑效率、以及实验成本等，后续的gRNA载体构建均使用固定的N6序列(如图3(a)和图3(b)所示)。
表1 gRNA表达载体优化结果汇总表
Figure BDA0002565692440000081
Figure BDA0002565692440000091
实施例2
促进汉逊酵母同源重组介导的DNA修复机制
在酿酒酵母中，当发生双链DNA分子断裂以后，Mre11和Sae2等蛋白形成复合体，对断裂处DNA末端进行剪切形成单链DNA。随后，同源重组相关蛋白Rad52结合到单链DNA分子上，招募包括Rad51在内的多种HR相关蛋白形成复合体，为链扩张以及D-loop的形成做准备。最后，通过同源模板序列的搜索，在DNA聚合酶(Pol)和连接酶的作用上，实现模板DNA分子同源整合(所述反应过程如图4所示)。
因此，发明人将来源于酿酒酵母的HR相关蛋白(Rad51，Rad51和Sae2)以及汉逊酵母的HR相关蛋白(HpRad51和HpRad52)进行单独和组合表达。如图5所示，以无缝敲除HpLSC2基因(GeneBank ID:XM_018355144.1)为例，计算不同菌株同源重组效率。从而表征单独或组合表达来源于酿酒酵母的HR相关蛋白对汉逊酵母同源重组效率有不同程度的促进作用。其中，同源重组效率定义为挑取验证的转化子中阳性克隆数量与全部克隆数量的比值。阳性克隆通过菌液PCR方式验证，如图8(a)所示，由于无缝敲除了基因编码框，阳性克隆的PCR条带明显小于阴性克隆，通过统计PCR条带减小的转化子数量来计算同源重组效率。结果如图5所示，重组菌株的同源重组效率与对照菌株相比提高10～20％。特别是同时过表达Rad51、Rad52和Sae2三个基因时(菌株Y34)，同源重组效率达到了70％左右，提高了1.2倍以上，说明这三个蛋白在同源重组过程中发挥了显著的协同作用。来源于汉逊酵母自身的HR相关蛋白，发明人只获得了过表达HpRad52的菌株，过表达HpRad51导致菌株死亡。单独过表达HpRad52虽然也能提高HR效率，但是其效果并没有同时过表达Rad51，Rad51和Sae2理想。
实施例3
削弱汉逊酵母非同源末端连接水平
为了下调KU80基因表达强度，发明人将来源于汉逊酵母自身的504bp长度的MET3基因启动子(pHpMET3)以同源重组方式整合到汉逊酵母基因组，原位替换KU80基因的启动子。获得的转化子经过PCR验证以及测序正确，用于后续实验分析。pHpMET3启动子受到甲硫氨酸的抑制，因此，在转化过程中YPD孵育过程以及筛选平板中均添加系列浓度的甲硫氨酸。
具体的操作步骤包括：
(1)采用常规的电击转化方法，电击结束后，细胞使用1mL含有1.7mM、2.5mM、5.0mM和10mM的甲硫氨酸的YPD液体培养基孵育1h；
(2)筛选平板添加与上述步骤(1)浓度的甲硫氨酸，菌体涂布后置于37℃静置培养2～3天。
实验结果如图6(a)和图6(b)所示，虽然添加甲硫氨酸会在一定程度上降低转化效率，但却显著提高了同源重组效率达到一倍以上。而不同浓度的甲硫氨酸在转化效率和同源重组效率之间没有显著差别，因此，在后续实验的应用中均添加1.7mM的甲硫氨酸来抑制KU80基因的表达。
以脂酰辅酶A氧化酶(HpPOX1)为靶向基因，下调KU80基因的菌株Ku80-dw的细胞生长状况和同源重组效率分别如图7(a)和图7(b)所示。Ku80-dw的转化效率虽然比生型菌株略有降低，却要显著高于KU80基因敲除菌株，而且由于同源重组效率的提高(从40％到64％)，菌株Ku80-dw具有最高的阳性克隆数。与此同时，三个菌株在发酵前期细胞生长状况没有显著差别，但是随着发酵过程进行，特别是对数后期以及稳定期之后，KU80基因敲除菌株的生长状况明显低于另外两株菌，主要是由于细胞生长后期DNA损伤增加，而KU80基因对DNA损伤修复存在影响。但是，Ku80下调菌株生长没有受到影响，与野生型保持一致。综上所述，抑制非同源末端连接关键基因Ku80的策略，在提高HR效率的同时，保证了较高的转化效率和良好的细胞生长状况，为后续菌株改造奠定基础。
实施例4
汉逊酵母CRISPR/Cas9***在代谢改造过程中的应用
(1)无缝敲除
结合实施例2和实施例3，将菌株Ku80-dw和y34应用于进一步的基因组编辑与代谢工程改造研究中。首先是基因无缝敲除，同时探究同源臂长度对同源重组效率的影响。以无缝敲除HpLSC2基因为例，应用长度为200bp，500bp和1000bp的同源臂。实验结果如图8(a)～图8(c)所示。同源臂长度为1000bp时，与之前的结果一致，两个重组菌株Ku80-dw和y34同源重组效率均为60～70％，显著高于对照菌株；但是随着同源臂长度的缩短，两个重组菌株Ku80-dw和y34表现出不同的同源重组能力。一方面，当同源臂长度缩短至500bp和200bp时，菌株Ku80-dw同源重组效率显著降低，基本与对照菌株持平；另一方面，菌株y34在同源臂缩短的条件下依然呈现出较强的同源重组能力，当同源臂为500bp时，同源重组效率与1000bp时相似，达到60～70％。即使同源臂缩短至200bp时，同源重组效率依然维持在40～50％。因此，菌株y34在进一步的代谢工程改造过程中具有更广泛的应用前景，成为后续研究的关键菌株。
(2)基因定点整合
为了测试菌株y34对于大片段定点整合的能力，发明人以整合ScIDP2基因(Genebank ID：NM_001182061.1)的完整表达盒至FAA1位点(Long chain fatty acyl-CoAsynthetase,genebank ID:XM_018353564.1)为例(长度达到5.5kb)，同样采用200bp，500bp和1000bp三种长度的同源臂。实验结果如图9(b)所示，当同源臂长度为1000bp时，同源重组效率达到40～50％。但是，同源臂长度的降低会严重地降低大片段定点整合的阳性率(500bp时的20％和200bp时的8.3％)，说明难度增大的同源整合过程需要配备相对较长的同源臂长度。难度较小的基因无缝敲除工作，可以选择200～500bp同源臂长度，而大片段整合，1000bp的同源臂能够保证更理想的阳性率。
(3)载体体内自组装
发明人将20kb大小的载体分为3段、4段和5段进行体内重组过程。该载体以pPICZA为基本骨架，分别含有AmpR和URA3分别作为大肠杆菌和汉逊酵母的筛选标记，含有Ori和panARS分别作为大肠杆菌和汉逊酵母的复制起点。同时，含有5个基因的完整表达盒，包括pHpDAS1-FaCoAR-pYX212t、CYC1t-ADH5-pHpFGH、pHpAOX1-MmCAR-ADH1t、FBA1t-npgA-pHpCAT1和pHpGAP-ScIDP2-GAPt。同源臂长度为500bp左右，位于各个基因表达盒的启动子或终止子，以防止整合过程发生基因突变影响基因的正常功能。实验结果如图10(a)～图10(c))所示。一方面，载体体内多片段重组过程所长出的转化子数量要显著少于基因组编辑过程。但是，3段、4段和5段之间的转化效率没有显著差异，这与发明人预期的片段数越多重组难度越大，转化子数量越少不相符。其原因可能是随着片段数量增加，各片段长度降低，较短的片段更容易进入细胞，从而弥补了数量增加带来的重组难度增加。另一方面，对于获得的转化子阳性率的分析。无论是3段、4段和5段，均能够实现大小为20kb的载体重组。但由于载体过大，整体的阳性率偏低，维持在5％～30％左右，且存在随着片段数量增加，阳性率呈现降低的趋势。总体来说，具有较高同源重组能力的汉逊酵母宿主菌株能够成功应用于载体的体内多片段组装，组装载体大小达到20kb左右，极大地简化了后续汉逊酵母游离载体表达***构建过程。这也是首次在汉逊酵母中成功实现载体的体内组装，更加丰富了我们构建的汉逊酵母作为底盘细胞的应用潜力。
(4)多片段体内定点重组
发明人构建了4个单独的基因表达盒，并将其分为1～4部分分别整合至菌株y34的POX1位点，以测试菌株体内进行多片段重组的能力(如图11所示)。如图12(a)所示，四个基因MmCAR、npgA、ADH5和FaCoAR分别含有完整的基因表达盒，包括启动子、基因和终止子三个部分。位于首位的两个表达盒还含有1kb长度的同源臂(靶向POX1位点)。除此之外，相邻的两个片段含有相同的启动子或终止子区域序列作为同源臂。实验结果和图12(b)所示。首先，转化效率并没有明显差别，整合一个表达盒的效率略高于其它；其次，转化子阳性率。与预期一致，随着整合的表达盒数量增加，阳性率急剧下降。当只整合一个表达盒时，阳性率与前期大片段整合相当，达到60～70％。而当同时整合四个表达盒并使其在细胞内进行自组装时，阳性率已经低于10％。但是，总体来说，利用发明人构建的具有高同源重组能力的汉逊酵母底盘细胞，能够实现四个基因表达盒一次性在同一位点实现体内自组装整合，长度达到15kb。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑***，其特征在于，所述多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑***包含以下组件：
(1)Cas9蛋白，所述Cas9蛋白整合于多形汉逊酵母基因组中；
(2)sgRNA表达载体；
所述sgRNA表达载体包括sgRNA的表达盒；
其中，sgRNA表达盒由RNA pol II型启动子和终止子以及相应的核酶识别序列HH和HDV组成。
2.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑***，其特征在于，所述sgRNA表达载体含有来源于乳酸克鲁维酵母的自主复制起始序列panARS。
3.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑***，其特征在于，所述sgRNA表达载体含有来源于汉逊酵母自身的URA3基因作为抗性基因和反向筛选标记。
4.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑***，其特征在于，所述sgRNA表达载体使用固定的N6序列。
5.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑***，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑***包括来源于酵母的单独或组合过表达的同源重组相关蛋白Rad51、Rad52和Sae2；
优选地，所述酵母包括酿酒酵母和汉逊酵母。
6.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑***，其特征在于，在所述多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑***中，基因KU80启动子以原位替换的方式替换为pHpMET3，以降低汉逊酵母非同源末端链接强度。
7.一种基因编辑方法，其特征在于，所述方法采用根据权利要求1至6中任一项所述的多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑***，并包括以下步骤：
(1)以所述sgRNA表达载体出发，构建靶向于目标供体的sgRNA表达载体；
(2)以重叠延伸PCR的方法构建基因敲除和表达的供体DNA片段，同源臂长度为200bp～1000bp；
(3)将sgRNA表达载体和供体DNA分子导入汉逊酵母细胞。
8.根据权利要求7所述的基因编辑方法，其特征在于，在步骤(3)之后，还包括以下步骤：
(4)验证正确的转化子置于含有5-氟乳清酸的培养基中培养，进行质粒丢失，质粒丢失后的重组汉逊酵母进行下一轮基因组编辑。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑***或根据权利要求7或8所述的基因编辑方法在基因无缝敲除、定点整合、体内载体多片段自组装或体内多片段定点组装中的至少一种中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在所述基因无缝敲除中，同源臂长度为200～1000bp；
在所述定点整合中，片段长度为5.5kb，同源臂长度为1000bp；
在所述体内载体多片段自组装中，载体长度为20kb，片段数量为3～5段；
在所述体内多片段定点组装中，片段全长为7.4kb～15.2kb，片段的数量为1～4段；
优选地，所述同源臂长度为500～1000bp，位于启动子或终止子区域。
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