CN113265364B - 一株昆虫病原线虫共生细菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株昆虫病原线虫共生细菌(Xenorhabdus budapestensis)XBD101菌株，所述XBD101菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC No:22056。所述XBD101株的发酵上清液对多种真菌和细菌有生长抑制作用，可用于新型生物农药的开发与应用。

Description

一株昆虫病原线虫共生细菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株昆虫病原线虫共生细菌及其应用。
背景技术
昆虫病原线虫共生菌是研究共生关系的一种模式生物，目前已成为生物制药研究领域的开发热点。昆虫病原线虫共生细菌是一种肠杆菌科的革兰氏阴性细菌，寄生于昆虫病原线虫肠道内，包括致病杆菌(Xenorhabdus)和发光杆菌(Photorhabdus)属，分别与斯氏线虫和异小杆线虫共生。
目前，从已知的致病杆菌中分离鉴定出多种生物活性成分，这些化合物结构新颖、生物活性高，具备开发新型生物农药的潜质，如杀虫、抗真菌、抗细菌、杀线虫，在农业领域具有极大应用前景。根据文献报道，致病杆菌主要具生物活性化合物种类如下：
(1)二硫吡咯类：该类物质是从嗜线虫致病杆菌中分离得到的，它对多种病原细菌特别是革兰氏阳性菌有很好的作用效果，主要抑制菌体RNA的合成从而影响蛋白质的合成。
(2)吲哚类衍生物：该类化合物对革兰氏阳性和阴性菌有较好的防治效果，而且对细菌生长有明显抑制作用。作用机制主要通过增加核苷酸ppGpp的合成，抑制革兰氏阴性、阳性菌RNA的合成。
(3)细菌素：细菌素抗菌谱较窄，通常仅抑制亲缘关系接近的菌株生长。一般条件下，在菌中表达量都很低。
(4)酰胺类化合物：从嗜线虫致病杆菌YL001菌株中分离得到环丁二内酰胺和乙二酰胺两种酰胺类化合物，对番茄灰霉病病菌菌丝生长有较好的抑制作用。
(5)水溶性苯并芘类(XCNs)：水溶性的异香豆素类化合物，是致病杆菌中最主要的抑菌化合物，对黄瓜疫霉、苎麻疫霉、辣椒疫霉等有较强的抑制作用。具有广泛的抗革兰氏阳性和阴性菌。
(6)肽类，肽类多数具有强碱性、热稳定性以及抗菌谱广等优点。在嗜线虫致病杆菌F1菌株中分离到由5个组分组成的富含赖氨酸的环脂肽家族(PAX)，它们不仅对植物和人的病原真菌有强烈的抑制活性，而且对细菌和酵母也具有一定的抑制作用，同时对仓鼠和昆虫细胞没有毒性。
发明内容
本发明提供一株具有生物农药开发潜质的昆虫病原线虫共生细菌XBD101,该菌株的发酵上清液对多种真菌和细菌有生长抑制作用，可用于新型生物农药的开发与应用。所述XBD101菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC No:22056。
所述菌株是发明人实验室从中国东北采集的土样中分离出来的拟双角斯氏线虫病原共生菌，经分离后，通过检测该菌株的16S rRNA gene进行菌种鉴定，使用的PCR扩增引物是：
上游引物：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；
下游引物：1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；
构建载体并转化至大肠杆菌，进行16s rDNA序列比对，结果如图1所示，从图1可以看出，本发明分离筛选得到的是一株昆虫病原线虫共生细菌Xenorhabdus budapestensis，命名为XBD101。
本发明得到的菌株XBD101可在任何已知的适合昆虫病原线虫共生细菌生长的培养基中发酵培养，得到其发酵代谢物(发酵液)，经沉淀分离后得到其发酵上清液。根据本发明的一种优选的实施方式，培养所述菌株的培养基为NBTA琼脂培养基(分离培养基)、LB培养基(种子培养基)、LB液体培养基(发酵培养基)等。
本发明还通过实验证明所述菌株具有优良的抑菌或杀虫作用，其发酵代谢产物(如发酵上清液)对多种真菌和细菌有生长抑制作用，可用于新型生物农药的开发与应用。应用时，可采用其发酵代谢物作为生物农药的活性成分，也可直接采用此活性菌株制作成活性菌剂使用。
微生物保藏说明
本发明提供的昆虫病原线虫共生菌(Xenorhabdus budapestensis)XBD101菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，菌株编号CGMCC No:22056。保藏时间：2021年3月23日。详见所附的微生物保藏证明材料。
附图说明
图1为XBD101菌株的16S rDNA鉴定图谱。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：
发明人通过多次分离筛选，从中国东北采集的土样中分离出一株拟双角斯氏线虫病原共生菌，命名为XBD101，原命名为C72，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC No:22056，经实验检测发现其代谢产物具有较强的杀虫或抑菌效果。
实施例1：菌种鉴定
XBD101是本实验室从中国东北采集的土样中分离出来的拟双角斯氏线虫病原共生菌，检测该菌株的16S rRNA gene进行菌种鉴定，使用的PCR扩增引物是：
上游引物：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；
下游引物：1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；
构建载体并转化至大肠杆菌，进行16s rDNA序列比对，结果如图1所示，从图1可以看出，本实施例分离筛选得到的是一株Xenorhabdus budapestensis，命名为XBD101。
实施例2：XBD101发酵液抑菌活性的测定
使用NBTA琼脂培养基(胰蛋白胨10g/L；牛肉粉3g/L；氯化钠5g/L；氯化三苯基四唑0.04g/L；溴百里酚兰0.025g/L，PH＝7.8)对XBD101划线，28℃静置培养48小时，可见蓝褐色光滑菌落。挑取单菌落至LB培养基(胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L)，28℃；200rpm培养14小时制成发酵种子液，以2％的接菌量将种子液接至含LB液体培养基的三角瓶中，用上述条件发酵48小时，高速离心取上清液，并用无菌滤器(0.22μm)过滤除菌，该无菌发酵上清液即为抑菌试验待测液。
1、对真菌的抑制活性鉴定
取1ml无菌发酵上清液与9ml融化的PDA琼脂培养基(马铃薯200g/L；葡萄糖20g/L；琼脂7.5g/L)混合均匀制成带毒培养基平板，空白对照组由LB培养基与PDA琼脂培养基混合制成。
取长势一致且大小均匀的真菌菌饼接至上述试验组和对照组的平板上，在25℃培养箱中静置培养5-8天，调查菌落直径。每个菌落用十字交叉法垂直测量直径各一次，取其平均值并计算菌丝生长抑制率，计算方法如下：
按公式(1)、(2)计算各靶标菌的菌丝生长抑制率，单位为百分率(％)，计算结果保留小数点后两位。
式(1)：D＝D1-D2
式中：D：菌落增长直径；D1：菌落直径；D2：菌饼直径。
式(2)：
Figure BDA0003151726300000051
式中：I：菌丝生长抑制率；D0：空白对照菌落增长直径；Dt：发酵液处理菌落增长直径。
2、对细菌的抑制活性鉴定
用NA固体培养基培养待测细菌12-16小时，将菌落刮下来后用灭菌水稀释为1×107个细胞/ml浓度的悬浮液。
在含有18mlNB液体培养基的三角瓶中加入10％的无菌发酵上清液(加入等量LB培养基为空白对照)并接种上述待测细菌悬浮液200μl，测定此时混合液在540nm波长下的吸光值即浑浊度，放入30℃的振荡培养箱中培养(160rpm/min)。
培养4～8小时，待测菌达到对数生长期时，测定并记录培养液的浑浊度，并按公式(3)计算细菌的生长抑制率，以百分数(％)表示，计算结果保留小数点后两位。
式(3)：
Figure BDA0003151726300000052
式中：P：生长抑制率；A0：空白对照浑浊度增加值；A1：药剂处理浑浊度增加值。
实验选择多种病原真、细菌，对其进行抑菌实验后结果如下表所示：
病原菌 抑制率
Rhizopus stolnifer ++++
Cochliobolus sativus ++++
Pectobacterium carotovora ++++
Xanthomonas oryzae ++++
Burkholderia glumae ++++
Acidovorax avenae +++
Streptomyces scabies +++
备注：抑制率：++++：90％-100％；+++：80％-89％；++：70％-79％；+：抑制60％-69％。
从上表可以看出，本发明提供的XBD101发酵液对多种病原真、细菌具有显著的抑制作用，抑制率均可以达到80％以上，十分有效。
通过上述实验证明，本发明提供的昆虫病原线虫共生细菌XBD101具有优良的抑菌和/或杀虫作用，其发酵代谢产物(如发酵上清液)对多种真菌和细菌有生长抑制作用，可用于新型生物农药的开发与应用。应用时，可采用其发酵代谢物作为生物农药的活性成分，也可直接采用此活性菌株制作成活性菌剂使用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (2)

1.昆虫病原线虫共生细菌Xenorhabdus budapestensis XBD101菌株发酵后得到的发酵产物用于抑制真菌和/或细菌生长，其中所述XBD101菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏编号CGMCC No:22056；所述真菌和/或细菌包括：Rhizopus stolnifer、Cochliobolus sativus、Pectobacterium carotovora 、 Xanthomonas oryzae、Burkholderia glumae、Acidovorax avenae、Streptomyces scabies。
2.昆虫病原线虫共生细菌Xenorhabdus budapestensis XBD101菌株发酵后得到的发酵产物在制备生物农药中的应用，其中所述XBD101菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏编号CGMCC No:22056。
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