CN113252637B - 拉曼光谱检测中的荧光背景抑制***及抑制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种拉曼光谱检测中的荧光背景抑制***及抑制方法。所述抑制***包括拉曼激光器和编码孔径光纤拉曼光谱分析模块；在所述拉曼激光器的激发光输出端连接有激发光纤，在激发光纤的传输光路中依次设置有激发光纤准直镜、激发光纤耦合镜和窄带滤光片；在所述编码孔径光纤拉曼光谱分析模块的信号输入端连接有编码孔径光纤阵列，所述编码孔径光纤阵列外接收集光纤，在所述收集光纤的传输光路中依次设置有收集光纤准直镜、收集光纤耦合镜和高通拉曼滤光片；所述激发光纤与所述收集光纤在自由端汇聚成束后集结成拉曼信号激发/收集光纤探头；所述拉曼信号激发/收集光纤探头中的激发光纤位于轴心位置，收集光纤以激发光纤为中心密集排布。
Description
技术领域
本发明涉及一种光谱检测技术，具体地说是一种拉曼光谱检测中的荧光背景抑制***及抑制方法。
背景技术
拉曼光谱技术具有非接触、无损、快速准确等优点，在纯定性分析、高精度定量分析和测定分子结构等方面具有很大的应用价值，其应用范围涉及化学、物理学、生物学、材料、医学、文物和宝石等多种领域。然而，拉曼散射光的光强较弱，这是其本身固有的缺点。一般来说，拉曼散射光的光强约为入射光光强的10-10，在拉曼光谱测量中，当用激光照射生物组织样品时，除了能激发出拉曼散射光外，还会同时激发出荧光，这种荧光会干扰拉曼光谱的辨析。尤其是在生物组织拉曼光谱测试中，对背景荧光的抑制效果的优劣，可直接影响生物组织成分分析评判的结果。
国内外学者提出了多种抑制荧光的方法和技术，时域抑制法，高频调制抑制法，移频激发差分拉曼光谱，光谱后处理中荧光背景去除法等。拉曼散射光的发生在时间上紧随激发光而产生，荧光的发射则在时间尺度上延后于拉曼散射光。时域抑制法利用克尔门控件或者光电倍增管、增强型CCD相机或单光子雪崩探测器(SPAD)等时间选通探测器实现荧光背景光的抑制。高频调制抑制法根据拉曼散射和荧光对高频信号的响应不同，通过对激发光高频率的调制与拉曼光谱信号的解调抑制荧光背景的影响。在一个相对较小的范围内，荧光光谱的分布特征几乎不会随着激发波的频率变化而产生较大的变化，拉曼光谱则紧密跟随激发光波的频率变化而表现出在以波长显示的拉曼谱的移动。因此，不同激发频率光所获得的光谱进行相减就可有效扣除基本相同的荧光背景，此类技术包括移频激发差分拉曼光谱(SERDS)，波长调制拉曼光谱法(WMRS)和差移拉曼光谱法(SSRS)等。移频激发差分拉曼光谱用两个波长相近的激发光激发，波长调制拉曼光谱法采用连续调制的激发波长与多通道锁定检测器，这两者都需要两个以上不同频率的激发光源。1998年Bell首次提出了SSRS方法，采用可微旋转位置的光栅，利用被测光谱落在检测单元空间上的细微的变化获得前光栅微转前后光谱的差分谱图，通过差分方法达到荧光背景抑制的目的。此种方法最大优点就是无需额外增加其它光学元件，***简便，但需要通过两次测量来实现。
发明内容
本发明的目的就是提供一种拉曼光谱检测中的荧光背景抑制***及抑制方法，以解决现有拉曼光谱检测中因荧光背景而导致分析结果的准确性降低的问题。
本发明的目的是这样实现的：一种拉曼光谱检测中的荧光背景抑制***，包括拉曼激光器和编码孔径光纤拉曼光谱分析模块；在所述拉曼激光器的激发光输出端连接有激发光纤，在激发光纤的传输光路中依次设置有激发光纤准直镜、激发光纤耦合镜和窄带滤光片；在所述编码孔径光纤拉曼光谱分析模块的信号输入端连接有编码孔径光纤阵列，所述编码孔径光纤阵列外接收集光纤，在所述收集光纤的传输光路中依次设置有收集光纤准直镜、收集光纤耦合镜和高通拉曼滤光片；所述激发光纤与所述收集光纤在自由端汇聚成束后，在自由端的端部集结成拉曼信号激发/收集光纤探头；所述拉曼信号激发/收集光纤探头中的激发光纤位于轴心位置，收集光纤以激发光纤为中心密集排布。
所述编码孔径光纤拉曼光谱分析模块包括：
准直镜，设置在所述编码孔径光纤阵列的出射光光路上，用于将编码孔径光纤阵列的输出光转换成平行光并以相同的入射角反射至光栅；
光栅，与所述准直镜斜向相对，用于在将准直镜反射的平行光反射到聚焦镜上的同时进行分光，以使不同波长的平行光经光栅反射后形成不同的衍射角；
聚焦镜，与所述光栅斜向相对，用于将经由光栅反射的并具有不同衍射角的平行光聚焦于面阵探测器上；以及
面阵探测器，设置在所述聚焦镜的焦平面上，用于接收聚焦镜聚焦后的光信号。
在所述面阵探测器的信号输出端设置有信号处理单元，用于对面阵探测器输出的拉曼光谱信号进行归一化处理。
所述编码孔径光纤阵列位于编码孔径光纤拉曼光谱分析模块中的所述准直镜的焦平面处。
所述编码孔径光纤阵列中设置有行、列方向数量相等的光纤，每根光纤连接所述收集光纤中的一个单根光纤。所述编码孔径光纤阵列中每列光纤采用不同的编码形式。
在拉曼光谱检测中，拉曼激光器发出激发光，通过激发光纤的传输，经过激发光纤准直镜的准直，经过窄带滤光片的滤光，经过激发光纤耦合镜的耦合滤波，随后进入拉曼激发/收集探头，激发光纤位于激发/收集探头的中心，拉曼信号收集光纤以激发光纤为中心密集排布，通过过收集光纤，随后依次经过收集光纤准直镜，高通拉曼滤光片，收集光纤耦合镜滤除瑞丽散射，样品反射，再通过收集光纤，通过编码孔径阵列光纤进入编码孔径拉曼光谱分析***。
所述编码孔径光谱分析***的编码光纤阵列位于准直镜的焦平面处，光线经准直镜后以一定角度入射至光栅，各列编码光纤相对光轴中心距离不同，经过准直镜后平行光束将发生一定角度偏移，导致到光栅的入射角度发生相对偏转，即光栅的入射角不同，从而获得多个具有光谱微偏移拉曼光谱信号。荧光信号相对“分子指纹”拉曼信号的带宽要宽出很多，几乎不受微小位移的影响。因此，多个微偏移信号可通过差分实现荧光背景抑制消除。
本发明还可这样实现：一种拉曼光谱检测中的荧光背景抑制方法，包括以下步骤：
a、设置本发明所述拉曼光谱检测中的荧光背景抑制***；
b、***开机后，将被测样品设置在与拉曼信号激发/收集光纤探头的出射光路相垂直的位置上；
c、控制拉曼激光器发出激发光，所述激发光在通过激发光纤传输的过程中，分别经过激发光纤准直镜的准直、经过激发光纤耦合镜的耦合滤波、经过窄带滤光片的滤光后，再经拉曼信号激发/收集光纤探头照射到被测样品上，在被测样品上产生拉曼光谱信号；
d、拉曼信号激发/收集光纤探头中的收集光纤收集被测样品上产生的拉曼光谱信号，所收集的拉曼光谱信号在收集光纤的传输过程中，分别经过收集光纤准直镜的准直、经过收集光纤耦合镜的耦合滤波、经过高通拉曼滤光片的滤光后，再经编码孔径光纤阵列入射到编码孔径光纤拉曼光谱分析模块；
e、编码孔径光纤拉曼光谱分析模块对各收集光纤所收集的拉曼光谱信号进行光谱分析，输出一组多条具有微小光谱偏移的拉曼光谱信号；
f、利用信号处理单元对多条具有微小光谱偏移的一组拉曼光谱信号进行归一化处理，得到各狭缝阵列对应的归一化光谱信号数据；
g、采用最小二乘曲线拟合差分算法和洛伦兹拟合差分处理算法，对所得到的各狭缝阵列对应的归一化光谱信号数据进行拉曼光谱荧光背景抑制处理，即获得高信噪比的拉曼光谱。
本发明采用同一激发波长进行拉曼激发，拉曼光谱分析模块采用编码孔径光谱分析模块，可同时多通道获取多条具有微小光谱偏移的拉曼光谱信号，利用荧光光谱与分子指纹拉曼光谱对光谱偏移敏感性的不同，进行信号数据处理，从而有效地消除了荧光背景的干扰，使得在拉曼差值光谱中获得高信噪比、可信度高的拉曼光谱信号。本发明荧光背景抑制方法的操作，只需单波长激发单次测量，其操作简单易行，所得结果可信度高。
附图说明
图1是本发明荧光背景抑制***的结构示意图。
图2是编码孔径光纤拉曼光谱分析模块的结构示意图。
图3是本发明荧光背景抑制方法的流程图。
具体实施方式
如图1所示，本发明荧光背景抑制***包括拉曼激光器1-2、激发光纤1-3、收集光纤1-11、拉曼信号激发/收集光纤探头1-7、编码孔径光纤阵列1-12以及编码孔径光纤拉曼光谱分析模块1-1等部分。激发光纤1-3连接在拉曼激光器1-2的激发光输出端，在激发光纤1-3的传输光路中依次设置有激发光纤准直镜1-4、窄带滤光片1-5和激发光纤耦合镜1-6。编码孔径光纤阵列1-12连接在编码孔径光纤拉曼光谱分析模块1-1的信号输入端，收集光纤1-11与编码孔径光纤阵列1-12相接。在编码孔径光纤阵列1-12中设置有行、列方向数量相等的光纤，每根光纤连接收集光纤1-11中的一个单根光纤。在收集光纤1-11的传输光路中依次设置有收集光纤准直镜1-8、高通拉曼滤光片1-9和收集光纤耦合镜1-10。激发光纤1-3与收集光纤1-11在自由端汇聚成束后，在自由端的端部集结成拉曼信号激发/收集光纤探头1-7。拉曼信号激发/收集光纤探头1-7中的激发光纤1-3位于轴心位置，收集光纤1-11以激发光纤1-3为中心密集排布。
如图2所示，编码孔径光纤拉曼光谱分析模块1-1包括准直镜2-1、光栅2-2、聚焦镜2-3和面阵探测器2-4。准直镜2-1设置在编码孔径光纤阵列1-12的出射光光路上，并使编码孔径光纤阵列1-12位于准直镜2-1的焦平面处。准直镜2-1用于将编码孔径光纤阵列1-12的输出光转换成平行光并以相同的入射角反射至光栅2-2。光栅2-2与准直镜2-1斜向相对，用于在将准直镜2-1反射的平行光反射到聚焦镜2-3上的同时进行分光，以使不同波长的平行光经光栅2-2反射后形成不同的衍射角。聚焦镜2-3与光栅2-2斜向相对，用于将经由光栅2-2反射的并具有不同衍射角的平行光聚焦于面阵探测器2-4上。面阵探测器2-4设置在聚焦镜2-3的焦平面上，用于接收聚焦镜2-3聚焦后的光信号。在面阵探测器2-4的信号输出端设置有信号处理单元，用于将由面阵探测器输出的拉曼光谱信号进行归一化处理。
编码孔径光纤阵列1-12作为编码孔径光纤拉曼光谱分析模块1-1的入射端，其光纤阵列中的每列光纤对应于编码孔径光纤拉曼光谱分析模块1-1的多个并排狭缝，每列光纤具有不同的编码形式，优选采用阿达玛编码形式。拉曼光谱信号通过阿达玛编码的编码孔径光纤阵列1-12进入编码孔径光纤拉曼光谱分析模块1-1，经过编码孔径光纤拉曼光谱分析模块1-1中的准直镜2-1、光栅2-2、聚焦镜2-3和面阵探测器2-4，获得载有各单元光纤光谱信息的原始拉曼光谱信号。依次对垂直于光栅分光的光谱维方向上的面阵探测器2-4的各列探测信号的进行阿达玛逆变换，解耦获得每列光纤的光谱分布信息。各列编码光纤相对光轴中心的距离不同，经过准直镜2-1的准直成为平行光束后，平行光束将发生一定角度的偏移，导致打到光栅2-2上的入射角度发生相对偏转，即光栅的入射角不同，因此可获得多个具有光谱微偏移的拉曼光谱信号。
本发明荧光背景抑制***中的拉曼激光器1-2发出激发光，在激发光纤1-3的传输过程中，经过激发光纤准直镜1-4的准直，经过窄带滤光片1-5的滤光，经过激发光纤耦合镜1-6的进一步耦合滤波，随后进入拉曼信号激发/收集光纤探头1-7。在拉曼信号激发/收集光纤探头1-7中，激发光纤1-3位于轴心位置，收集光纤1-11围绕激发光纤1-3紧密排列。各收集光纤1-11收集到的多个拉曼光谱信号，在收集光纤1-11的传输过程中，依次经过收集光纤准直镜1-8的准直，经过高通拉曼滤光片1-9的滤光，经过收集光纤耦合镜1-10的滤除瑞丽散射和样品反射后，再经收集光纤1-11传输到编码孔径光纤阵列1-12，并通过编码孔径光纤阵列1-12进入编码孔径光纤拉曼光谱分析模块1-1。编码孔径光纤阵列1-12将多个收集光纤进行分组，每列光纤为一组，对应某一光谱微偏移拉曼光谱信号，多列编码光纤阵列对应多个不同光谱偏移的收集拉曼光谱信号。
编码孔径拉曼光谱荧光背景抑制技术的工作原理为差移拉曼光谱分析技术，荧光信号相对“分子指纹”拉曼光谱信号的带宽会大很多，拉曼光谱分布受微小光谱位移的影响远远小于拉曼光谱信号，基于这一特性，通过多个微偏移信号的差分，即可进行荧光背景的抑制。而微偏移信号差分算法可采用最小二乘曲线拟合差分算法或洛伦兹拟合差分处理算法。
如图3所示，本发明荧光背景抑制方法是基于本发明荧光背景抑制***予以实现的，具体包括以下步骤：
步骤1，***开机，将被测样品设置在与拉曼信号激发/收集光纤探头1-7的出射光路相垂直的位置上。
步骤2，控制拉曼激光器1-2发出激发光，所发的激发光在通过激发光纤1-3传输的过程中，依次经过激发光纤准直镜1-4的准直、经过窄带滤光片1-5的滤光、经过激发光纤耦合镜1-6的耦合滤波后，最后通过拉曼信号激发/收集光纤探头1-7照射到被测样品上。
步骤3，拉曼信号激发/收集光纤探头1-7在照射被测样品的过程中，同时收集各收集光纤1-11的拉曼光谱信号S1，S2……Si，所收集的拉曼光谱信号在收集光纤1-11的传输过程中，依次经过收集光纤准直镜1-8的准直、经过高通拉曼滤光片1-9的滤光、经过收集光纤耦合镜1-10的耦合滤波后，再经编码孔径光纤阵列1-12入射到编码孔径光纤拉曼光谱分析模块1-1。
步骤4，编码孔径光纤拉曼光谱分析模块1-1对输入的拉曼光谱信号进行光谱分析，通过面阵探测器2-4输出一组多条具有微小光谱偏移的拉曼光谱信号Ri。
步骤5，对面阵探测器2-4输出的多条具有微小光谱偏移的各光纤阵列的拉曼光谱信号Ri，利用信号处理单元，采用归一化算法，进行归一化处理，得到各狭缝阵列对应的归一化拉曼光谱信号数据Yi。
步骤6，基于差移拉曼光谱荧光背景抑制原理，采用最小二乘曲线拟合差分算法和洛伦兹拟合差分处理算法等，对步骤5所得到的各狭缝阵列对应的归一化光谱信号数据Yi进行拉曼光谱荧光背景抑制处理，即获得高信噪比的拉曼光谱。
Claims (5)
1.一种拉曼光谱检测中的荧光背景抑制***，其特征是，包括拉曼激光器和编码孔径光纤拉曼光谱分析模块；在所述拉曼激光器的激发光输出端连接有激发光纤，在激发光纤的传输光路中依次设置有激发光纤准直镜、激发光纤耦合镜和窄带滤光片；在所述编码孔径光纤拉曼光谱分析模块的信号输入端连接有编码孔径光纤阵列，所述编码孔径光纤阵列外接收集光纤，在所述收集光纤的传输光路中依次设置有收集光纤准直镜、收集光纤耦合镜和高通拉曼滤光片；所述激发光纤的自由端与所述收集光纤的自由端汇聚成束后，在自由端的端部集结成拉曼信号激发/收集光纤探头；所述拉曼信号激发/收集光纤探头中的激发光纤位于轴心位置，收集光纤以激发光纤为中心密集排布；在所述编码孔径光纤阵列中设置有行、列方向数量相等的光纤，每根光纤连接所述收集光纤中的一个单根光纤。
2.根据权利要求1所述的拉曼光谱检测中的荧光背景抑制***，其特征是，所述编码孔径光纤拉曼光谱分析模块包括：
准直镜，设置在所述编码孔径光纤阵列的出射光光路上，用于将编码孔径光纤阵列的输出光转换成平行光并以相同的入射角反射至光栅；
光栅，与所述准直镜斜向相对，用于在将准直镜反射的平行光反射到聚焦镜上的同时进行分光，以使不同波长的平行光经光栅反射后形成不同的衍射角；
聚焦镜，与所述光栅斜向相对，用于将经由光栅反射的并具有不同衍射角的平行光聚焦于面阵探测器上；以及
面阵探测器，设置在所述聚焦镜的焦平面上，用于接收聚焦镜聚焦后的光信号。
3.根据权利要求2所述的拉曼光谱检测中的荧光背景抑制***，其特征是，在所述面阵探测器的信号输出端设置有信号处理单元，用于对面阵探测器输出的拉曼光谱信号进行归一化处理。
4.根据权利要求2或3所述的拉曼光谱检测中的荧光背景抑制***，其特征是，所述编码孔径光纤阵列位于编码孔径光纤拉曼光谱分析模块中的所述准直镜的焦平面处。
5.根据权利要求1所述的拉曼光谱检测中的荧光背景抑制***，其特征是，所述编码孔径光纤阵列中每列光纤采用不同的编码形式。
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