CN113249447A - 一种pd-l1表达水平检测的方法和试剂盒 - Google Patents
一种pd-l1表达水平检测的方法和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113249447A CN113249447A CN202110517370.2A CN202110517370A CN113249447A CN 113249447 A CN113249447 A CN 113249447A CN 202110517370 A CN202110517370 A CN 202110517370A CN 113249447 A CN113249447 A CN 113249447A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cdna
- rna
- immunotherapy
- internal reference
- mammal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 title claims abstract description 20
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 27
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims abstract description 49
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 34
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 29
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 45
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 45
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 42
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims description 29
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 29
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 28
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 28
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 21
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 18
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 10
- 239000012271 PD-L1 inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 229940121656 pd-l1 inhibitor Drugs 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 claims description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 claims description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 abstract description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 20
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 59
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 15
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 6
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 6
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 4
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 3
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 208000015778 Undifferentiated pleomorphic sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 208000037540 Alveolar soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 201000003076 Angiosarcoma Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 201000009047 Chordoma Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 208000007207 Epithelioid hemangioendothelioma Diseases 0.000 description 2
- 208000001258 Hemangiosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000006644 Malignant Fibrous Histiocytoma Diseases 0.000 description 2
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000031839 Peripheral nerve sheath tumour malignant Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 Polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 2
- 206010016629 fibroma Diseases 0.000 description 2
- 206010049444 fibromatosis Diseases 0.000 description 2
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 2
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 206010024627 liposarcoma Diseases 0.000 description 2
- 208000025278 malignant myoepithelioma Diseases 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 201000009020 malignant peripheral nerve sheath tumor Diseases 0.000 description 2
- 201000008806 mesenchymal cell neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000029974 neurofibrosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 208000006468 Adrenal Cortex Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 201000000153 Angiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 1
- 206010073140 Clear cell sarcoma of soft tissue Diseases 0.000 description 1
- 208000017815 Dendritic cell tumor Diseases 0.000 description 1
- 208000008743 Desmoplastic Small Round Cell Tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 201000005231 Epithelioid sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006168 Ewing Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 201000003364 Extraskeletal myxoid chondrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010053717 Fibrous histiocytoma Diseases 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 208000007569 Giant Cell Tumors Diseases 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010024612 Lipoma Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 208000032818 Microsatellite Instability Diseases 0.000 description 1
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000009287 Myoepithelioma Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000012269 PD-1/PD-L1 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108091007744 Programmed cell death receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000003721 Triple Negative Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- RJUXXNSHJWNJBM-UHFFFAOYSA-N [Cl-].[Cs+].[N-]=C=S.NC([NH3+])=N Chemical compound [Cl-].[Cs+].[N-]=C=S.NC([NH3+])=N RJUXXNSHJWNJBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 208000008524 alveolar soft part sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 208000020716 angioleiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 201000009613 breast lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 201000005217 chondroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 210000005266 circulating tumour cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000292 clear cell sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 201000002293 dendritic cell sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 208000010932 epithelial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 208000017319 fibrous hamartoma of infancy Diseases 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 208000007173 hereditary leiomyomatosis and renal cell cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003701 histiocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000000284 histiocytoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004276 hyalin Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000020122 intimal sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000010260 leiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 1
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Inorganic materials [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FLNGSZOQLNORPV-UHFFFAOYSA-M lithium;urea;chloride Chemical compound [Li+].[Cl-].NC(N)=O FLNGSZOQLNORPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000026535 luminal A breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000026534 luminal B breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 201000010893 malignant breast melanoma Diseases 0.000 description 1
- 201000010904 malignant hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 238000005360 mashing Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000000716 merkel cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000002464 muscle smooth vascular Anatomy 0.000 description 1
- 201000008405 myoepithelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000026226 myoepithelial tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 208000007538 neurilemmoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229940121653 pd-1/pd-l1 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 206010039667 schwannoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000017572 squamous cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 208000022679 triple-negative breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000037965 uterine sarcoma Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请公开了一种PD‑L1表达水平检测的方法和试剂盒。所述方法包括获取哺乳动物的体液样本；其中，所述体液样本中含有目标RNA和内参RNA，所述目标RNA源自于PD‑L1的基因；从所述体液样本中提取所述目标RNA和内参RNA；将所述目标RNA和内参RNA分别反转录为目标cDNA和内参cDNA；将所述目标cDNA和内参cDNA进行PCR扩增反应；根据扩增后目标cDNA的数量和内参cDNA的数量，确定所述哺乳动物中PD‑L1的表达水平。本申请的检测方法可以通过采集哺乳动物的体液样本进行PD‑L1表达水平检测，并进行PD‑L1免疫治疗预测，进而指导PD‑L1免疫治疗。
Description
本申请是针对申请日为2019年4月26日、申请号为201980001127.6、发明名称为“一种PD-L1表达水平检测的方法和试剂盒”的中国申请提出的分案申请。
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别涉及一种PD-L1表达水平检测的方法和试剂盒。
背景技术
目前，基于PD-L1(Programing Death-Ligand 1)免疫疗法的药物已经获得FDA批准和NCCN指南推荐，成为晚期非小细胞肺癌(NSCLC)一线治疗的选择。在基于PD-L1的免疫治疗中，PD-1/PD-L1抑制剂的疗效与PD-L1的表达水平密切相关。
目前监测PD-L1的表达水平，主要使用免疫组织化学方法。具体来说，是利用特异性抗体(如28-8、22C3、SP263、SP142)，通过杂交显色的方式来检测非小细胞肺癌组织标本中的PD-L1的表达水平。但是对于部分不能或很难获取肿瘤组织的患者，PD-L1的评估就变得十分困难。另外，目前的免疫组织化学法也面临一些问题，例如在检测技术方面，不同的检测抗体、平台以及不同阈值的设定对检测结果会有不同的影响；在生物学方面，由于肿瘤内和肿瘤间异质性，检测结果可能无法真实反映PD-L1的表达水平；在组织来源方面，对于细胞学标本、存档标本和新鲜标本，原发部位与转移灶中PD-L1表达水平会有差异。
以血液(或其他体液)为样本的液体活检技术能检测肿瘤细胞或转移灶细胞释放到血液中的循环肿瘤DNA片段，是肿瘤检测及辅助治疗的突破性技术，以非侵入性的方式获取样本，可以避免肿瘤细胞的异质性问题，同时还可以周期性的动态检测肿瘤细胞的变化。血液中的血小板和外泌体携带肿瘤细胞所表达的蛋白质和核酸均可用于癌症的诊断、复发检测及抗药性研究，同时血小板和外泌体数量较多，易于富集，携带的核酸有分泌小泡的保护免于核酸酶降解，在临床上有广泛的应用前景。
发明内容
基于此，本申请提供一种血浆PD-L1表达水平检测的方法和试剂盒。
本申请实施例之一提供一种PD-L1表达水平检测的方法。所述方法包括：获取哺乳动物的体液样本；其中，所述体液样本中含有目标RNA和内参RNA，所述目标RNA源自于PD-L1的基因；从所述体液样本中提取所述目标RNA和内参RNA；将所述目标RNA和内参RNA分别反转录为目标cDNA和内参cDNA；将所述目标cDNA和内参cDNA进行PCR扩增反应；根据扩增后目标cDNA的数量和内参cDNA的数量，确定所述哺乳动物中PD-L1的表达水平。
在一些实施例中，所述体液包括外周血、组织液、淋巴液或脑脊液。
在一些实施例中，所述内参RNA包括GAPDH、ACTB或18S的RNA。
在一些实施例中，所述提取目标RNA和内参RNA的步骤至少包括高温变性、萃取、沉淀、洗涤和溶解。
在一些实施例中，所述目标RNA反转录使用的特异性反转录引物包括：与SEQ IDNO.:1所示序列的相似度≥95％的核苷酸。
在一些实施例中，所述内参RNA反转录使用的特异性反转录引物包括：与SEQ IDNO.:2所示序列的相似度≥95％的核苷酸。
在一些实施例中，所述内参RNA反转录使用的特异性反转录引物包括：序列为SEQID NO.:1的核苷酸和序列为SEQ ID NO.:2的核苷酸。
在一些实施例中，将所述目标cDNA进行的PCR扩增反应为实时荧光定量PCR(Q-PCR)；所述目标cDNA进行扩增使用的Q-PCR特异性引物包括：与SEQ ID NO.:3所示序列的相似度≥95％的核苷酸；与SEQ ID NO.:4所示序列的相似度≥95％的核苷酸。
在一些实施例中，将所述内参cDNA进行的PCR扩增反应为实时荧光定量PCR(Q-PCR)；所述内参cDNA进行扩增使用的Q-PCR特异性引物为：与SEQ ID NO.:5所示序列的相似度≥95％的核苷酸；与SEQ ID NO.:6所示序列的相似度≥95％的核苷酸。
在一些实施例中，所述目标cDNA进行扩增使用的探针为：与SEQ ID NO.:7所示序列的相似度≥95％的核苷酸。
在一些实施例中，所述内参cDNA进行扩增使用的探针为：与SEQ ID NO.:8所示序列的相似度≥92％的核苷酸。
在一些实施例中，所述目标cDNA的数量和内参cDNA的数量表征为目标cDNA的CT值和内参cDNA的CT值，所述根据扩增后目标cDNA的数量和内参cDNA的数量，确定所述哺乳动物中PD-L1的表达水平包括根据扩增后目标cDNA的CT值和内参cDNA的CT值的比值确定所述哺乳动物中PD-L1的表达水平。
在一些实施例中，所述方法进一步包括根据扩增后目标cDNA的CT值和内参cDNA的CT值的比值，进行临床预测。
在一些实施例中，所述根据扩增后目标cDNA的CT值和内参cDNA的CT值的比值，进行临床预测包括：所述比值大于或等于第一阈值，预测所述哺乳动物进行PD-L1免疫治疗后获益较低；所述比值小于第一阈值，预测所述哺乳动物进行PD-L1免疫治疗后获益较高；其中，所述第一阈值由临床结果经数学模型处理后获得。
在一些实施例中，所述哺乳动物为人。
本申请实施例之一提供一种PD-L1表达水平检测的试剂盒。所述试剂盒包括一反转录体系，所述反转录体系被设置为用于将一哺乳动物体液样本中提取的包括目标RNA和内参RNA的RNA样本分别反转录为目标cDNA和内参cDNA。
在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括PCR扩增体系，所述PCR扩增体系被设置为用来在PCR扩增反应中扩增目标cDNA和内参cDNA，进而确定所述哺乳动物中PD-L1的表达水平。
在一些实施例中，所述反转录体系包括：
5×RT Buffer 4μL
引物终浓度 200nM
dNTP 1mM
super RT 200U
RNA 6μL
补DEPC水至 20μL。
在一些实施例中，所述PCR扩增体系包括：
10×PCR Buffer稀释为1×
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400nM
各探针 100-400nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5 mM
总体积20uL。
在一些实施例中，所述目标RNA反转录使用的特异性反转录引物包括：序列为SEQID NO.:1的核苷酸和序列为SEQ ID NO.:2的核苷酸。
在一些实施例中，将所述目标cDNA进行的PCR扩增反应为实时荧光定量PCR(Q-PCR)；所述目标cDNA进行扩增使用的Q-PCR特异性引物包括：序列为SEQ ID NO.:3的核苷酸和序列为SEQ ID NO.:4的核苷酸；或者序列为SEQ ID NO.:5的核苷酸和序列为SEQ IDNO.:6的核苷酸。
在一些实施例中，所述目标cDNA进行扩增使用的探针为：序列为SEQ ID NO.:7的核苷酸；或者序列为SEQ ID NO.:8的核苷酸。
附图说明
本申请将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，其中：
图1是根据本申请一些实施例所示的142例血液样本的CT比值分布图；
图2是根据本申请一些实施例所示的ROC曲线图；
图3是根据本申请一些实施例所示的PD-L1抑制剂治疗后无进展生存率与时间的关系图；
图4是根据本申请一些实施例所示的PCR扩增的荧光信号与循环阈值的曲线图；以及
图5是根据本申请又一实施例所示的PCR扩增的荧光信号与循环阈值的曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以便本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不对本发明构成限定。应当理解的是，对于本领域的技术人员来说，在了解本发明的原理后，可以在不背离该原理的情况下，进行各种形式和细节上的改变以实施本发明。
PD-1(Programmed Death 1)程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子，为免疫球蛋白超家族，是一个268氨基酸残基的膜蛋白。PD-L1是PD-1的配体，是肿瘤细胞表面表达的一种蛋白，与免疫***的抑制有关，可以传导抑制性的信号。PD-1和PD-L1一旦结合便会向T细胞传递一种负向调控信号，诱导T细胞进入静息状态，减低***CD8+T细胞的增生，让其无法识别癌细胞，并且使T细胞自身增殖减少或凋亡，有效解除机体的免疫反应，从而癌细胞可以肆无忌惮地生长。PD-L1免疫治疗的原理是：以PD-1或PD-L1为靶点设计合成出抗体制剂(人源性单克隆抗体制剂)，用来分别与PD-1或PD-L1蛋白结合，就能阻断原来两个蛋白的彼此连接，从而可以让T细胞重新对肿瘤细胞起到免疫作用。PD-L1免疫治疗效果与患者的PD-L1的表达程度相关。PD-L1表达旺盛，则PD-L1免疫治疗的效果越好。PD-L1表达越少，则PD-L1免疫治疗的效果越差。通过检测PD-L1的RNA反转录为cNDA后进行PCR扩增后的cDNA的数量，进一步根据内参RNA反转录的内参cDNA的数量对PD-L1的cDNA数量进行归一化，可以用来衡量PD-L1的表达程度，以此来预测患者经PD-L1免疫治疗后的效果。
在一些实施例中，癌症可以包括乳腺癌、三阴性***癌症、化生乳腺癌(MpBC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、人***瘤病毒(HPV)阳性HNSCC、HPV阴性/TP53突变HNSCC、转移性HNSCC、口咽HNSCC、非口咽HNSCC、黑色素瘤、管腔A乳腺癌、管腔B乳腺癌、HER2+***癌症、高微卫星不稳定性(MSI-H)结直肠癌、微卫星稳定结直肠癌(MSS)、非小细胞肺癌(NSCLC)、脊索瘤或肾上腺皮质癌。癌可以是乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、***、Merkel细胞、卵巢、肝脏、子宫内膜、膀胱、肾脏或癌症未知初级(CUP)。肉瘤可以是脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨骼外粘液样软骨肉瘤或子宫肉瘤。在一些实施方案中，肉瘤包含α肺泡软组织肉瘤(ASPS)、血管肉瘤、乳腺血管肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、透明细胞肉瘤、增生性小圆细胞瘤(DSRCT)、上皮样细胞血管内皮瘤(EHE)、上皮样肉瘤、子宫内膜间质肉瘤(ESS)、尤文肉瘤、纤维瘤病、纤维肉瘤、巨细胞瘤、平滑肌肉瘤(LMS)、子宫LMS、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤(MFH/UPS)、恶性周围神经鞘瘤(MPNST)、骨肉瘤、血管周围上皮样细胞瘤(PEComa)、横纹肌肉瘤、孤立性纤维瘤(SFT)、滑膜肉瘤、纤维粘液样肉瘤、婴儿期纤维性错构瘤、遗传性平滑肌瘤病、血管平滑肌脂肪瘤、血管肌瘤、非典型梭形细胞病变(纤维组织细胞分化)、软骨母细胞瘤、树突状细胞肉瘤、颗粒细胞瘤、高级粘液样肉瘤、高度肌上皮癌、透明变性成纤维细胞肉瘤、炎症肌纤维母细胞肉瘤、交叉树突状细胞瘤、内膜肉瘤、平滑肌瘤、***肉瘤病、恶性血管瘤、恶性肌上皮瘤、黑素细胞肿瘤、间充质肿瘤、肠系膜上皮瘤、转移性组织细胞样肿瘤、肌上皮瘤、粘液样肉瘤、粘液样基质、神经鞘瘤、叶状体、横纹肌样细胞、圆形细胞、未另行规定的肉瘤(NOS)、肉瘤间皮瘤、神经鞘瘤、纺锤体和圆形细胞肉瘤、或梭形细胞间充质肿瘤。
在一些实施例中，癌症可以包括以下一种或多种：黑色素瘤、肺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、胃癌、肾癌、结肠癌、食道癌、肝细胞癌、乳腺癌、淋巴瘤或白血病。
在一些实施例中，癌症可以包括以下一种或多种：肾癌、肺癌特别是非小细胞肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、间皮瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤。
本发明提供了PD-L1表达水平检测的方法和试剂盒，特别是使用哺乳动物的体液样本进行PD-L1表达水平检测的方法和试剂盒。进一步地，本发明提供了一种根据PD-L1表达水平预测癌症患者接受PD-1/PD-L1靶向治疗的效果的方法。
本发明的第一个方面提供了一种PD-L1表达水平检测的方法，所述检测方法使用哺乳动物的体液样本进行PD-L1表达水平的检测。所述检测方法使用PD-L1表达水平检测的试剂盒进行检测。该方法至少包括如下步骤：
步骤1：获取样本。
PD-L1可以包括PD-L1蛋白的氨基酸序列和/或PD-L1基因的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述样本可以包括组织样本或体液样本。在一些实施例中，体液样本可以包括外周血、组织液、淋巴液或脑脊液样本的一种或几种的组合。在一些实施例中，体液样本可以包括哺乳动物的血液样本、组织液样本或淋巴液样本。在一些实施例中，哺乳动物可以为人。体液样本中可以含有目标RNA和内参RNA，该目标RNA可以源自于PD-L1的基因。在一些实施例中，目标RNA可以由PD-L1的基因经转录得到。例如，PD-L1的基因可以为PD-L1的mRNA。该内参RNA可以是在细胞生长过程中或特定的环境下，表达水平恒定的基因，在检测蛋白的表达水平变化时用其作为参照物。在一些实施例中，内参RNA可以源自于GAPDH、ACTB或18S的基因。例如，内参RNA可以由GAPDH基因经转录得到。
步骤2：从体液样本中提取目标RNA和内参RNA。
提取RNA的方法可以包括异硫氰酸胍氯化铯超速离心法、盐酸胍-有机溶剂法、氯化锂-尿素法、热酚法、快速提取法、细胞质RNA提取法、酚-氯化锂法同时提取细胞RNA和DNA、一步快速热酚抽提法。在一些实施例中，通过提取RNA的方法可以在血液中提取RNA。在一些实施例中，提取目标RNA和内参RNA的步骤至少可以包括高温变性、萃取、沉淀、洗涤和溶解。在一些实施例中，目标RNA和内参RNA可以直接从体液样本中提取。不需要先从体液样本中提取肿瘤细胞(例如循环肿瘤细胞CTC)，再从肿瘤细胞中提取目标RNA和内参RNA。在一些实施例中，提取目标RNA和内参RNA的试剂盒的可以为如表1所示的试剂盒。
表1.RNA提取试剂盒
| 名称 | 规格 | 主要成分 |
| Buffer A | 40ml | Tris、NaCl、SDS |
| Buffer B | 15ml | 氯仿 |
| Buffer C | 15ml | 糖原、醋酸钠 |
| Buffer E | 30ml | 无水乙醇 |
| Buffer F | 30ml | 无水乙醇 |
| Buffer G | 15ml | H<sub>2</sub>O |
| T1离心管 | 50个 | 聚丙烯 |
| T2离心管 | 100个 | 聚丙烯 |
步骤3：将目标RNA和内参RNA分别反转录为目标cDNA和内参cDNA。
反转录可以是以目标基因和内参基因分别转录成的RNA为模板，通过反转录酶，合成互补的单链DNA(cDNA)。
在一些实施例中，目标RNA反转录使用的特异性反转录引物可以包括：与SEQ IDNO.:1所示序列的相似度≥95％的核苷酸。在一些实施例中，目标RNA反转录使用的特异性反转录引物可以包括：序列为SEQ ID NO.:1的核苷酸和序列为SEQ ID NO.:2的核苷酸。在一些实施例中，所述内参RNA反转录使用的特异性反转录引物可以包括：与SEQ ID NO.:2所示序列的相似度≥95％的核苷酸。在一些实施例中，所述内参RNA反转录使用的特异性反转录引物可以包括：序列为SEQ ID NO.:1的核苷酸和序列为SEQ ID NO.:2的核苷酸。
步骤4：将目标cDNA和内参cDNA进行PCR扩增反应。
将目标cDNA进行的PCR扩增反应为实时荧光定量PCR(Quantitative Real-timePCR，Q-PCR)。PCR扩增的基本原理是：以单链DNA(cDNA)为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在TaqDNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
在一些实施例中，目标cDNA进行扩增使用的Q-PCR特异性引物可以包括：与SEQ IDNO.:3所示序列的相似度≥95％的核苷酸；与SEQ ID NO.:4所示序列的相似度≥95％的核苷酸。在一些实施例中，目标cDNA进行扩增使用的Q-PCR特异性引物可以包括：序列为SEQID NO.:3的核苷酸和序列为SEQ ID NO.:4的核苷酸；或者序列为SEQ ID NO.:5的核苷酸和序列为SEQ ID NO.:6的核苷酸。
将所述内参cDNA进行的PCR扩增反应为实时荧光定量PCR(Q-PCR)。在一些实施例中，内参cDNA进行扩增使用的Q-PCR特异性引物可以包括：与SEQ ID NO.:5所示序列的相似度≥95％的核苷酸；与SEQ ID NO.:6所示序列的相似度≥95％的核苷酸。
在一些实施例中，目标cDNA进行扩增使用的探针可以包括：与SEQ ID NO.:7所示序列的相似度≥95％的核苷酸。在一些实施例中，目标cDNA进行扩增使用的探针可以包括：序列为SEQ ID NO.:7的核苷酸；或者序列为SEQ ID NO.:8的核苷酸。在一些实施例中，内参cDNA进行扩增使用的探针可以包括：与SEQ ID NO.:8所示序列的相似度≥92％的核苷酸。
步骤5：根据扩增后目标cDNA的数量和内参cDNA的数量，确定哺乳动物中PD-L1的表达水平。
在一些实施例中，目标cDNA的数量和内参cDNA的数量可以表征为目标cDNA的CT值(Cycle threshold，循环阈值)和内参cDNA的CT值。在实时荧光定量PCR技术中，CT值是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环阈值。在一些实施例中，根据扩增后目标cDNA的数量和内参cDNA的数量，确定哺乳动物中PD-L1的表达水平可以包括根据扩增后目标cDNA的CT值和内参cDNA的CT值的比值(以下简称CT值的比值或者CT比值)确定所述哺乳动物中PD-L1的表达水平。CT值的比值越高，所述哺乳动物中PD-L1的表达水平越低；CT值的比值越低，所述哺乳动物中PD-L1的表达水平越高。在一些实施例中，哺乳动物可以为人。
在一些实施例中，所述PD-L1表达水平检测的方法可以进一步包括根据扩增后目标cDNA的CT值和内参cDNA的CT值的比值，进行临床预测。在一些实施例中，所述比值大于或等于第一阈值，预测所述哺乳动物进行PD-L1免疫治疗后获益较低；所述比值小于第一阈值，预测所述哺乳动物进行PD-L1免疫治疗后获益较高；其中，所述第一阈值由临床结果经数学模型处理后获得。在一些实施例中，数学模型处理方法可以为通过R语言的ROC包绘制ROC曲线，从而得到第一阈值。在一些实施例中，第一阈值可以为3.0。
在一些实施例中，所述第一阈值是否选取合理可以由已有的临床病例(如，患者接受PD-L1免疫治疗后的实际效果)进行确认。例如，可以收集一定数量的接受过PD-L1免疫治疗的患者的体液样本。通过测量这些患者的体液样本经提取RNA、反转录和扩增处理后其中目标cDNA的CT值和内参cDNA的CT值的比值，通过所述第一阈值预测患者进行PD-L1免疫治疗后的获益情况，并结合患者在接受PD-L1免疫治疗后的实际效果(即，患者进行PD-L1免疫治疗后的获益情况)，确认所选取的第一阈值是否合理。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、提取所述目标RNA和内参RNA。
1.1将血液样本置于离心管(自备)中，1200rpm常温离心20分钟。
1.2取上层全部血浆于离心管(自备)中，抽取其中的1mL血浆于T1离心管中，剩余的血浆2100rpm常温离心20分钟。
1.3抽取上层血浆于-80℃保存或直接提取ctDNA，沉淀为血小板。
1.4用步骤1.2中的1mL血浆依次悬浮血小板。
1.5沸水孵育5分钟，冰上冰浴5分钟。
1.6短暂离心，保持含RNA的离心管置于冰上，捣碎，加入600ul Buffer A，涡旋震荡混匀，加入200ul Buffer B，涡旋震荡混匀，15000rpm 4℃离心20分钟。
1.7保持含RNA的离心管置于冰上，抽取上清置于T2离心管中(分装两管，每管约500ul)，加入50ul Buffer C和1mL无水乙醇，上下颠倒至混匀。置于-80℃，沉淀2小时。
1.8 15000rpm 4℃离心10分钟，弃上清。
1.9加入1mL Buffer E，涡旋震荡，使沉淀悬浮，15000rpm 4℃离心10分钟，弃上清。
1.10加入1mL Buffer F，涡旋震荡，使沉淀悬浮，15000rpm 4℃离心10分钟，弃上清。
1.11短暂离心(离心机升到最大转速停止)，吸弃残余液体，将离心管置于室温数分钟以彻底晾干。
1.12向每个离心管中加入10ul Buffer G，立即置于冰上，轻弹，短暂离心，保持RNA置于冰上。提取好的RNA应尽快进行反转录，防止RNA降解。
实施例2、将所述目标RNA和内参RNA分别反转录为目标cDNA和内参cDNA。
所述反转录体系如下：
5×RT Buffer 4μL
引物终浓度 200nM
dNTP 1mM
super RT 200U
RNA 6μL
补DEPC水至 20μL。
2.1取样本RNA 11.5μL，super RT反转录酶1μL，反转录引物1μL，dNTP混合物2μL，缓冲液4μL，RNA酶抑制剂0.5μL，加入无菌离心管中，混匀。
2.2启动PCR仪程序：42℃保温1个小时，70℃孵育10分钟；反应结束后，短暂离心，置于10℃冷却10分钟。
2.3反转录产物可直接用于后续PCR扩增反应。
实施例3、将所述目标cDNA和内参cDNA进行PCR扩增反应。
PCR扩增体系如下：
10×PCR Buffer稀释为1×
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400nM
各探针 100-400nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5 mM
总体积 20uL。
取缓冲液18μL，0.2μM的PCR特异引物和0.2μM的探针的混合物，反转录样本cDNA 1μL，Tac酶1μL，加入无菌离心管中，混匀。
所述的PCR扩增反应的条件如下：
实施例4、确定PD-L1的表达水平。
PCR扩增反应的阈值线设定在10000，分别计算出目标cDNA的CT值和内参cDNA的CT值，并计算两者的比值。
选取临床血液样本142例，年龄范围为15～89岁，中位年龄62岁。根据142例临床血液样本及所对应患者经PD-L1免疫治疗后治疗效果的特征(如，CT比值、患者经PD-L1免疫治疗后获益高低)，输入R语言的ROC包中绘制出ROC曲线，得到第一阈值。其中，患者经PD-L1免疫治疗后的获益高低可以根据患者经PD-L1免疫治疗后的生存时间提前进行划分和标记。例如，患者经PD-L1免疫治疗后的无进展生存时间为10.3个月，则将其标记为“收益较高”；患者经PD-L1免疫治疗后的无进展生存时间为6个月，则将其标记为“收益较低”，将标记好的样本作为绘制ROC曲线的特征。
图1是根据本申请一些实施例所示的142例血液样本的CT比值分布图。图2是根据本申请一些实施例所示的ROC曲线图。如图1所示，横坐标表示血液样本编号，纵坐标表示CT比值。根据图1中142例血液样本对应的特征(如，CT比值、患者经PD-L1免疫治疗后获益高低)，输入R语音的ROC包中，绘制出如图2所示的ROC(Receiver OperatingCharacteristic)曲线，得到相应的AUC(Area Under Curve)值。AUC值表示ROC曲线下的面积。如图2所示，ROC曲线的纵坐标为灵敏度，横坐标为1-特异性。灵敏度越高越好，而1-特异性越低越好，即ROC曲线越靠近左上角，AUC值越大，得到的阈值即为最佳阈值。如图2所示，ROC曲线的灵敏度取值范围为(6.5，1)，1-特异性取值范围为(0，0.7)，AUC值0.942，相应的第一阈值为3.0。即可以理解：CT比值大于或等于3.0，预测患者进行PD-L1免疫治疗后获益较低；CT比值小于3.0，预测患者进行PD-L1免疫治疗后获益较高。如图1所示，71例血液样本所检测出的CT比值小于3.0，71例血液样本所检测出的CT比值大于或等于3.0。
图3是根据本申请一些实施例所示的PD-L1抑制剂治疗后无进展生存率(Progression-free survival,PFS)与时间的关系图。将图1中CT比值小于3.0的71例血液样本分为3-1组，CT比值大于或等于3.0的71例血液样本分为3-2组，根据142例血液样本的CT比值及对应的患者经PD-L1免疫治疗的治疗效果(如，无进展生存时间)制作图3。如图3所示，横坐标表示经PD-L1免疫治疗后的时间，纵坐标表示142例血液样本对应的患者经PD-L1免疫治疗后的无进展生存率。如图3所示，在15个自然月内，3-1组的患者经PD-L1抑制剂治疗后，中位生存期大于15个月(15个月时无进展生存率为75％左右)，表明此部分患者经PD-L1免疫治疗获益较高，该部分患者对应的71例血液样本经PCR扩增反应的CT比值小于3.0；3-2组为患者经PD-L1抑制剂治疗后，中位生存期为6个月，在15个自然月时无进展生存率低至25％，表明此部分患者经PD-L1免疫治疗获益较低，该部分患者对应的71例血液样本经PCR扩增反应的CT比值大于或等于3.0。由此可见，根据142例临床血液样本及所对应患者经PD-L1免疫治疗后的效果，确定出的CT比值较为准确；进一步的，根据该CT比值可以进行临床预测。具体的，CT比值大于或等于3.0，预测患者进行PD-L1免疫治疗后获益较低；CT比值小于3.0，预测患者进行PD-L1免疫治疗后获益较高。
实施例5、临床预测结果检验。
运用本发明检验临床样本，利用本发明的PD-L1表达水平检测的方法和试剂盒检测该两例临床样本的PD-L1的基因表达。所述PD-L1表达水平检测的检测方法如步骤1～5所示，在此不进行赘述。分别选取PCR扩增的CT比值大于3.0和小于3.0的两组临床样本进行检验。
图4是根据本申请一些实施例所示的PCR扩增的荧光信号值与循环阈值的曲线图。图5是根据本申请又一实施例所示的PCR扩增的荧光信号值与循环阈值的曲线图。如图4-5所示，横坐标表示反应管所经历的循环阈值，纵坐标表示荧光信号值。如图4所示，曲线4-1表示内参cDNA扩增的荧光信号值与循环阈值的曲线，曲线4-2表示目标cDNA扩增的荧光信号值与循环阈值的曲线，当荧光信号阈值线设定在10000时，扩增后目标cDNA的CT值和内参cDNA的CT值的比值大于3.0。如图5所示，曲线5-1表示内参cDNA扩增的荧光信号值与循环阈值的曲线，曲线5-2表示目标cDNA扩增的荧光信号值与循环阈值的曲线，当荧光信号阈值线设定在10000时，扩增后目标cDNA的CT值和内参cDNA的CT值的比值小于3.0。曲线4-1和曲线5-1都为内参cDNA进行PCR扩增的曲线图。如图4所示，CT比值大于3.0，根据本发明预测所述哺乳动物进行PD-L1免疫治疗后获益较低；如图5所示，CT比值小于3.0，根据本发明预测所述哺乳动物进行PD-L1免疫治疗后获益较高。根据临床结果显示，图4所示临床样本所对应患者的无进展生存期为6个月，图5所示临床样本所对应患者的无进展生存期为10.3个月。由此可见，上述两例临床样本的预测结果和临床结果一致，进一步说明本发明能够较准确的预测哺乳动物进行PD-L1免疫治疗后获益情况。
本申请所披露的PD-L1表达水平检测的方法和试剂盒可能带来的有益效果包括但不限于：(1)以患者体液(例如，血液)为样本进行检测，取样过程更加方便，检测结果更加准确；(2)用PCR扩增后的CT比值来预测经PD-L1免疫治疗的效果，可以指导PD-L1免疫治疗。需要说明的是，不同实施例可能产生的有益效果不同，在不同的实施例里，可能产生的有益效果可以是以上任意一种或几种的组合，也可以是其他任何可能获得的有益效果。
本领域的技术人员应当理解，以上实施例仅为说明本发明，而不对本发明构成限制。凡在本发明的精神和原则内所作的任何修改、等同替换和变动等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 嘉兴允英医学检验有限公司
<120> 一种PD-L1表达水平检测的方法和试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agtgcagcca ggtctaattg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atacgaccaa atccgttgac t 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
catttgctga acgcatttac tg 22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gcattcaatt gtcatattgc tacc 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ctctgctcct cctgttcgac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
atggtgtctg agcgatgtgg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
caaggaccta tatgtggtag 20
<210> 8
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
cgtcgccagc cga 13
Claims (6)
1.一种PD-L1表达水平检测的试剂盒在对哺乳动物进行PD-L1免疫治疗后获益可能性预测中的用途，其特征在于，所述试剂盒包括：
反转录体系，所述反转录体系包括特异性反转录引物；所述特异性反转录引物包括序列为SEQ ID NO.:1的核苷酸和序列为SEQ ID NO.:2的核苷酸；
PCR扩增体系，所述PCR扩增体系用于实时荧光定量PCR(Q-PCR)，所述扩增体系包括Q-PCR特异性引物及探针；其中，所述Q-PCR特异性引物包括序列为SEQ ID NO.:3的核苷酸和序列为SEQ ID NO.:4的核苷酸，或者序列为SEQ ID NO.:5的核苷酸和序列为SEQ ID NO.:6的核苷酸；所述探针包括序列为SEQ ID NO.:7的核苷酸，或者序列为SEQ ID NO.:8的核苷酸；
所述用途包括：
使用所述反转录体系将一哺乳动物外周血样本中提取的包括目标RNA和内参RNA的RNA样本分别反转录为目标cDNA和内参cDNA；
使用所述PCR扩增体系扩增所述目标cDNA和所述内参cDNA；
根据扩增后目标cDNA的CT值和内参cDNA的CT值的比值确定所述哺乳动物中PD-L1的表达水平，其中所述目标cDNA的所述CT值表征所述目标cDNA的数量，所述内参cDNA的所述CT值表征所述内参cDNA的数量；
根据扩增后目标cDNA的CT值和内参cDNA的CT值的比值，预测哺乳动物进行PD-L1免疫治疗后获益可能性，其中，所述预测哺乳动物进行PD-L1免疫治疗后获益可能性包括：
所述比值大于或等于第一阈值，预测所述哺乳动物进行PD-L1免疫治疗后获益低，所述获益低是指在所述哺乳动物进行PD-L1免疫治疗后15个月时，其无进展生存率为25％，
所述比值小于所述第一阈值，预测所述哺乳动物进行PD-L1免疫治疗后获益高，所述获益高是指在所述哺乳动物进行PD-L1免疫治疗后15个月时，其无进展生存率为75％，
其中，所述第一阈值由临床结果经数学模型处理后获得，包括：
获取多例临床血液样本；
根据所述临床血液样本所对应的经PD-L1免疫治疗后的患者的无进展生存时间，标记所述临床血液样本的获益高低；
基于所述临床血液样本所对应的经PD-L1免疫治疗后的患者的所述比值和对应的所述获益高低的特征绘制ROC曲线；
基于AUC值最大的ROC曲线确定所述第一阈值，其中，所述AUC值最大的ROC曲线为灵敏度取值范围为(0.65,1)、1-特异性取值范围为(0,0.7)、AUC值为0.942的ROC曲线，所述第一阈值为3.0。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述内参RNA包括GAPDH、ACTB或18S的RNA。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述哺乳动物为人。
4.如权利要求1-3中任一项权利要求所述的用途，其特征在于，所述反转录体系包括：
5×RT Buffer 4μL
引物终浓度200nM
dNTP 1mM
super RT 200U
RNA 6μL
补DEPC水至20μL。
5.如权利要求1-3中任一项权利要求所述的用途，其特征在于，所述PCR扩增体系包括：
10×PCR Buffer稀释为1×
dNTP 0.2mM
模板2uL
各引物200-400nM
各探针100-400nM
热启动Taq酶1U
MgCL2 2-5mM
总体积20uL。
6.如权利要求1-3中任一项权利要求所述的用途，其特征在于，所述比值小于3.0的临床血液样本对应的患者经PD-L1抑制剂治疗后，中位生存期大于15个月；所述比值大于或等于3.0的临床血液样本对应的患者经PD-L1抑制剂治疗后，中位生存期为6个月。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110517370.2A CN113249447A (zh) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | 一种pd-l1表达水平检测的方法和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/CN2019/084550 WO2020215313A1 (zh) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | 一种pd-l1表达水平检测的方法和试剂盒 |
| CN201980001127.6A CN110268071A (zh) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | 一种pd-l1表达水平检测的方法和试剂盒 |
| CN202110517370.2A CN113249447A (zh) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | 一种pd-l1表达水平检测的方法和试剂盒 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201980001127.6A Division CN110268071A (zh) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | 一种pd-l1表达水平检测的方法和试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113249447A true CN113249447A (zh) | 2021-08-13 |
Family
ID=67912051
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110517370.2A Pending CN113249447A (zh) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | 一种pd-l1表达水平检测的方法和试剂盒 |
| CN201980001127.6A Pending CN110268071A (zh) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | 一种pd-l1表达水平检测的方法和试剂盒 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201980001127.6A Pending CN110268071A (zh) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | 一种pd-l1表达水平检测的方法和试剂盒 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN113249447A (zh) |
| WO (1) | WO2020215313A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110699435A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-01-17 | 宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司 | 一种用于pd-l1表达水平检测的试剂盒 |
| CN112725418A (zh) * | 2021-01-25 | 2021-04-30 | 深圳乐土生物科技有限公司 | 基于游离rna检测pd-l1表达量的方法及其试剂盒 |
| WO2023069604A1 (en) * | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for quantification of nucleic acid sequences using an internal quantitative standard |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106987631A (zh) * | 2017-04-01 | 2017-07-28 | 武汉赛云博生物科技有限公司 | 一种用于pd‑1/pd‑l1阻断治疗伴随诊断的免疫组测序技术 |
| CN107460239A (zh) * | 2017-07-23 | 2017-12-12 | 嘉兴允英医学检验有限公司 | 一种用于pd‑l1表达水平检测的试剂盒 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113444165A (zh) * | 2011-10-17 | 2021-09-28 | Io生物技术公司 | 基于pd-l1的免疫疗法 |
| US20180010191A1 (en) * | 2016-07-06 | 2018-01-11 | Genetics Development Corporation | Cutoff point delta ct method for genetic pcr testing in human cancer |
| CN106950371B (zh) * | 2017-02-17 | 2019-03-08 | 张灏 | Pd-l1、cdk5和ctla4中的至少一种在制备肿瘤诊断试剂盒中的用途 |
| CN107338305A (zh) * | 2017-07-23 | 2017-11-10 | 嘉兴允英医学检验有限公司 | 一种用于pd‑1表达水平检测的试剂盒 |
| CN109628596A (zh) * | 2019-01-18 | 2019-04-16 | 臻悦生物科技江苏有限公司 | Rna水平检测pd-1和pd-l1表达量的试剂盒及方法 |
-
2019
- 2019-04-26 CN CN202110517370.2A patent/CN113249447A/zh active Pending
- 2019-04-26 CN CN201980001127.6A patent/CN110268071A/zh active Pending
- 2019-04-26 WO PCT/CN2019/084550 patent/WO2020215313A1/zh active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106987631A (zh) * | 2017-04-01 | 2017-07-28 | 武汉赛云博生物科技有限公司 | 一种用于pd‑1/pd‑l1阻断治疗伴随诊断的免疫组测序技术 |
| CN107460239A (zh) * | 2017-07-23 | 2017-12-12 | 嘉兴允英医学检验有限公司 | 一种用于pd‑l1表达水平检测的试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 杨琳等: "肿瘤精准免疫诊断综合评估", 中国生物工程杂志, vol. 39, no. 2, pages 1 - 3 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110268071A (zh) | 2019-09-20 |
| WO2020215313A1 (zh) | 2020-10-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20070085275A (ko) | 멀티플 모드에 의한 멀티플렉스 반응 억제 방법 | |
| CN113249447A (zh) | 一种pd-l1表达水平检测的方法和试剂盒 | |
| Carlsen et al. | Cell-free plasma microRNA in pancreatic ductal adenocarcinoma and disease controls | |
| CN102242207B (zh) | 癌基因brafv600e突变检测的引物和探针 | |
| CA2948351A1 (en) | Biomarkers for response to pi3k inhibitors | |
| CN108342482B (zh) | 一种胶质母细胞瘤标记物及其应用、试剂盒 | |
| CN104328164A (zh) | 荧光探针杂交法检测人egfr基因突变试剂盒 | |
| CN110408703B (zh) | 结直肠癌miRNA标志物及其应用 | |
| CN103103251A (zh) | 荧光pcr毛细管电泳检测flt3-itd基因突变的试剂盒 | |
| JP6453781B2 (ja) | ヒトｐｉ３ｋｃａ（ｐｉｋ３ｃａ）遺伝子変異検出のための方法及び組成物 | |
| CN108753980B (zh) | 一种甲状腺微小***状癌的转移性筛查的筛查试剂盒 | |
| WO2022016425A1 (zh) | 一种预测癌症预后风险的方法 | |
| CN111518908B (zh) | 尿液***癌标志物组合及其在制备精准诊断试剂中的用途 | |
| CN113046437A (zh) | 一种检测met e14跳跃突变的方法 | |
| AU2018244758B2 (en) | Method and kit for diagnosing early stage pancreatic cancer | |
| CN110577999A (zh) | 一种cxcr4作为胃癌预后评估生物标志物的应用及诊断试剂盒 | |
| CN110951873A (zh) | 一种骨肉瘤标志物及其应用、试剂盒 | |
| KR20170009604A (ko) | Kras 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트 | |
| CN109182514B (zh) | 肺癌诊断或转移诊断标志物LncRNA Loc729658和试剂盒及其应用 | |
| CN111321224A (zh) | 一种用于诊断或辅助诊断胃癌的miRNA生物标志物组合及其试剂盒 | |
| CN113957145B (zh) | m6A相关lncRNA在预测小细胞肺癌预后和化疗反应的应用 | |
| CN107858427A (zh) | miR‑429在制备乳腺癌诊断和检测试剂盒中的应用 | |
| CN113699221B (zh) | HER2 mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测引物探针及其应用 | |
| CN108753961B (zh) | Braf v600e基因突变检测引物、方法及试剂盒 | |
| CN117305452B (zh) | 人SNRK mRNA在非小细胞肺癌诊断、靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |