CN113249413A - 一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法，属于生物技术领域。本发明公开的一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法，利用黑曲霉产葡萄糖酸钠后的发酵液经板框压缩后得到黑曲霉菌丝体，以葡萄糖为原料，菌丝体细胞壁破碎后释放出的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶加入到发酵罐中进行酶促反应生产葡萄糖酸钠。本发明方法既能保证将发酵后的废弃菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠，又能快速反应节约时间，同时提高生产效率、减少了商业化葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶使用量、降低生产成本。

Description

一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法。
背景技术
葡萄糖酸钠又名五羟基己酸钠，分子式为C6H11O7Na，具有无毒、热稳定性好等特点，在工业上用途十分广泛，可在建筑、纺织印染、金属表面处理和水处理等行业用作高效螯合剂、钢铁表面清洗剂、玻璃清洗剂、以及在混凝土行业用作高效缓凝剂等等。目前，葡萄糖酸钠的生产方法主要有微生物发酵法、电解法、催化氧化法、双酶法等方法，由于微生物发酵法的条件温和、节能明显、成本较低而被广泛采用。微生物发酵使用的菌种主要以黑曲霉菌株为主，该方法是以黑曲霉为发酵菌株、葡萄糖为原料利用黑曲霉产的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶将葡萄糖氧化脱氢转化为葡萄糖酸，同时通过流加氢氧化钠溶液中和葡萄糖酸维持一定的pH值而得到葡萄糖酸钠，在黑曲霉发酵过程中控制pH、温度、发酵罐转速、通气量、溶解氧浓度(DO)等参数指标。发酵结束后，发酵液经板框过滤后除去菌丝体得到发酵清液。而在葡萄糖酸钠生产过程中会产生大量的副产物-黑曲霉菌丝体，菌丝体的处理成为一大难题，目前生产企业主要以焚烧掩埋、空场堆放或用于动物饲料等方式，一方面污染环境，另一方面造成资源浪费。
因此，提供一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法，利用废弃的黑曲霉菌丝体生产葡萄糖酸钠，不仅充分利用了资源，降低了葡萄糖酸钠生产成本，同时保护环境、提高生态效益；实现了黑曲霉废菌丝体资源的循环、高效、绿色利用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法，产葡萄糖酸钠发酵后黑曲霉菌丝体的高效、绿色再利用，具体步骤如下：
(1)产葡萄糖酸钠后黑曲霉菌丝体的预处理
将黑曲霉产葡萄糖酸钠后的发酵液经板框压缩后得到黑曲霉菌丝体；将黑曲霉菌丝体洗涤、过滤，得到较为纯净的菌丝体；
(2)黑曲霉菌丝体中粗酶液的提取
将步骤(1)制得的菌丝体用水配成高浓度菌丝体液，利用高压均质机破碎菌丝体细胞壁，制得含有大量的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的粗酶液；
(3)发酵产葡萄糖酸钠
以葡萄糖为原料，将步骤(2)制得的粗酶液根据其酶活量大小加入到发酵罐中进行酶促反应，控制发酵操作条件(pH、罐压、温度、通气比等参数)进行发酵耗糖产葡萄糖酸钠，在发酵过程中根据酶活和葡萄糖含量实行补酶方式使发酵罐中葡萄糖基本耗尽，以溶解氧DO为发酵结束指标；具体操作如下：
①发酵罐中加入葡萄糖液，搅拌通风，流加氢氧化钠调节初始pH为6.0-6.5，此时糖浓度为32～35g/100mL；
②加入粗酶液进行发酵，粗酶液的加入量根据其酶活大小进行调节，使发酵罐初始葡萄糖氧化酶酶活在5000～6000U/mL；
③发酵过程中发酵操作参数：罐压0.12±0.02Mpa，反应罐内通气比为0.09-0.1vvm，循环水控制发酵罐温度38±2℃，发酵过程中通过流加30～35％氢氧化钠维持发酵pH为5.3～5.7，其中发酵0-3h通过降低空气流量，通气比为0.04-0.06vvm调节供氧水平，以免初始耗糖过快升温使酶失活，其他调控条件不变；
④发酵过程中检测葡萄糖含量及酶活变化，根据实际情况实行多次补酶至其发酵结束；若在发酵过程中葡萄糖未耗尽而葡萄糖氧化酶酶活低于1500U/mL或者耗糖速率低于1.0g/100mL/h时进行二次补加粗酶液，以保证耗糖速率，此时二次补加粗酶液的量根据发酵罐中葡萄糖含量确定，补加后发酵罐内的葡萄糖氧化酶酶活在2500～3500U/mL。
进一步，步骤(1)所述纯净的菌丝体为水洗至滤出液固形物含量至5％以下；优选地，水洗至滤出液固形物含量1％。
进一步，步骤(2)所述高浓度菌丝体液的浓度为20～25g/L。
进一步，步骤(2)所述高压均质机的压力范围为0～1000Bar。
进一步，步骤(2)所述破碎菌丝体细胞壁时，用循环冷却水控温在20±2℃。
进一步，步骤(2)利用高压均质机破碎菌丝体细胞壁1-3次，破碎率达到95％以上。
进一步，步骤(2)所述粗酶液中葡萄糖氧化酶酶活为7.5万-14万U/mL，过氧化氢酶酶活为3000～4200CIU/mL。
CIU来源于Q_320585HD 615-2017工业用过氧化氢酶诺维信过氧化氢酶50L最新(http://www.doc88.com/p-3069108994099.html)。
进一步，步骤(3)④所述发酵结束是指溶解氧浓度(DO)回升至90％以上。
产葡萄糖酸钠后黑曲霉废弃菌丝体再利用产葡萄糖酸钠，主要是高压均质从菌丝体中提取获得含有葡萄糖氧化酶和过氧化氢的粗酶液，并将其直接用于酶促反应发酵生产葡萄糖酸钠。黑曲霉菌丝体含有丰富的蛋白质、脂肪、纤维素、糖类等营养物质，而且还含有大量的甲壳素、细胞酶类物质等成分。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法，将黑曲霉发酵之后废弃的菌丝体重新利用高效生产葡萄糖酸钠，实现了菌丝体的综合利用；本发明方法从副产物黑曲霉菌丝体中提取过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶，提高其附加值；本发明从黑曲霉废弃菌丝体中提取到的粗酶液可直接用于葡萄糖酸钠的生产，提高葡萄酸钠的生产效率，节约酶法生产成本，提高经济效益；本发明方法在变废为宝的同时在一定程度上减少环境污染，保护生态环境。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法，具体步骤如下：
(1)将产葡萄糖酸钠后的黑曲霉菌丝体去离子水洗涤、过滤，至滤出液固形物含量为1％；
(2)将菌丝体用水重悬，配成20g/L菌液；用高压均质机(压力为800～900Bar)破碎菌丝体细胞壁2次，破碎率达97％，破碎时用循环冷却水控温在20±2℃，获得粗酶液，测其葡萄糖氧化酶酶活为12.13万U/mL，过氧化氢酶酶活为3800CIU/mL；
(3)在200m3的发酵罐中加入120m3的葡萄糖液(浓度为33.5g/100mL)、流加32％氢氧化钠调节pH＝6.3；
(4)根据粗酶液中葡萄糖氧化酶酶活大小确定其加入量，将粗酶液加入上述发酵罐中，发酵罐初始葡萄糖氧化酶酶活为5727U/mL，开始反应，流加32wt％的氢氧化钠控制反应液的pH维持在5.5，罐压控制在0.12MPa，发酵罐温度控制在38℃，控制风量维持通气比0.1vvm，其中0～3h通气比0.05vvm；
(5)当发酵罐内溶解氧DO回升至90％时，发酵结束，排出发酵液至储料罐；反应总耗时15小时。
发酵过程中各指标数据变化表1所示。
表1
Figure BDA0002575828210000041
实施例2
一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法，具体步骤如下：
(1)将产葡萄糖酸钠后的黑曲霉菌丝体去离子水洗涤、过滤，至滤出液固形物含量为1％；
(2)将菌丝体用水重悬，配成25g/L菌液；用高压均质机(压力为800～900Bar)破碎菌丝体细胞壁2次，破碎率达96％，破碎时用循环冷却水控温在20±2℃，获得粗酶液，测其葡萄糖氧化酶酶活为13.23万U/mL，过氧化氢酶酶活为3900CIU/mL；
(3)在200m3的发酵罐中加入120m3的葡萄糖液(浓度为35.0g/100mL)、流加32％氢氧化钠调节pH＝6.5；
(4)根据粗酶液中葡萄糖氧化酶酶活大小确定其加入量，将粗酶液加入上述发酵罐中，发酵罐初始葡萄糖氧化酶酶活为5827U/mL，开始反应，流加32wt％的氢氧化钠控制反应液的pH维持在5.5，罐压控制在0.12MPa，发酵罐温度控制在38℃，控制风量维持通气比0.1vvm，其中0～3h通气比0.05vvm；
(5)发酵8-10h时发酵耗糖明显变慢，此时葡萄糖含量为5.4g/100mL，故于10.5h进行二次补酶，补酶后操控条件不变；
(6)当发酵罐内溶解氧DO回升至90％时发酵结束，排出发酵液至储料罐，共发酵耗时13小时。
发酵过程中各指标数据变化如表2所示。
表2
Figure BDA0002575828210000051
本发明为黑曲霉废弃菌丝体的资源化利用提供一种方法，本发明回收再利用产葡萄糖酸钠的黑曲霉菌丝体，从中提取含有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的粗酶液直接用于酶促发酵生产葡萄糖酸钠，节约酶法发酵成本。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)产葡萄糖酸钠后黑曲霉菌丝体的预处理
将产葡萄糖酸钠后的黑曲霉菌丝体洗涤、过滤，得到纯净的菌丝体；
(2)黑曲霉菌丝体中粗酶液的提取
将步骤(1)制得的菌丝体用水配成高浓度菌丝体液，利用高压均质机破碎菌丝体细胞壁，制得含有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的粗酶液；
(3)发酵产葡萄糖酸钠
①发酵罐中加入葡萄糖液，搅拌通风，流加氢氧化钠调节初始pH为6.0-6.5，此时糖浓度为32～35g/100mL；
②加入粗酶液进行发酵，粗酶液的加入量根据其酶活大小进行调节，使发酵罐初始葡萄糖氧化酶酶活在5000～6000U/mL；
③发酵过程中发酵操作参数：罐压0.12±0.02Mpa，反应罐内通气比为0.09-0.1vvm，循环水控制发酵罐温度38±2℃，发酵过程中通过流加30～35％氢氧化钠维持发酵pH为5.3～5.7，其中发酵0-3h通过降低空气流量，通气比为0.04-0.06vvm调节供氧水平；
④发酵过程中检测葡萄糖含量及酶活变化，根据实际情况实行多次补酶至其发酵结束；若在发酵过程中葡萄糖未耗尽而葡萄糖氧化酶酶活低于1500U/mL或者耗糖速率低于1.0g/100mL/h时进行二次补加粗酶液，二次补加粗酶液的量根据发酵罐中葡萄糖含量确定，补加后发酵罐内的葡萄糖氧化酶酶活在2500～3500U/mL。
2.根据权利要求1所述的一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法，其特征在于，步骤(1)所述纯净的菌丝体为水洗至滤出液固形物含量至5％以下。
3.根据权利要求1所述的一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法，其特征在于，步骤(2)所述高浓度菌丝体液的浓度为20～25g/L。
4.根据权利要求1所述的一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法，其特征在于，步骤(2)所述高压均质机的压力范围为0～1000Bar。
5.根据权利要求1所述的一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法，其特征在于，步骤(2)所述破碎菌丝体细胞壁时，用循环冷却水控温在20±2℃。
6.根据权利要求1所述的一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法，其特征在于，步骤(2)利用高压均质机破碎菌丝体细胞壁1-3次，破碎率达到95％以上。
7.根据权利要求1所述的一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法，其特征在于，步骤(2)所述粗酶液中葡萄糖氧化酶酶活为7.5万-14万U/mL，过氧化氢酶酶活为3000～4200CIU/mL。
8.根据权利要求1所述的一种黑曲霉菌丝体再利用生产葡萄糖酸钠的方法，其特征在于，步骤(3)④所述发酵结束是指溶解氧浓度回升至90％以上。
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