CN113249358B - 一种利用离子液体调控溶菌酶晶型的方法 - Google Patents

一种利用离子液体调控溶菌酶晶型的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用离子液体调控溶菌酶晶型的方法，包括以下步骤：(1)将离子液体加入到缓冲液中，使离子液体的质量浓度为1％‑3％；(2)将溶菌酶加入到步骤(1)获得的液体中，搅拌得到悬浊液；(3)过滤步骤(2)获得的悬浊液得到溶菌酶饱和溶液；(4)将步骤(3)得到的溶菌酶饱和溶液降温至0‑5℃，期间维持搅拌1‑3h；(5)将步骤(4)得到的结晶悬浊液离心，弃掉上清液，取沉淀干燥，得不同晶型溶菌酶晶体，4℃低温保藏。本发明通过离子液体的种类和添加量实现对溶菌酶晶型的调控，过程控制容易实现，操作方便，结晶率高。

Description

一种利用离子液体调控溶菌酶晶型的方法
技术领域
本发明涉及溶菌酶的生产领域，特别是涉及一种利用离子液体调控溶菌酶晶型的方法。
背景技术
溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效。溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。溶菌酶还是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，可用作食品防腐剂。
蛋白质的结晶是一个复杂的物理化学过程，比一般小分子化合物的结晶要困难得多。影响蛋白质结晶过程的因素多，首先，蛋白质有多种复合状态，包括无定形态、油态、凝胶态及晶体；另外，添加剂作为另外一种影响蛋白质结晶的因素，可能通过影响蛋白质分子间的相互作用、热力学平衡、晶体的表面能及蛋白质结晶的成核过程而作用。晶体的晶型反映了其内部结构以及形成时的物化条件，因此，晶体的点阵类型、热力学性质、晶体生长动力学以及热量和质量传递等过程均会影响晶体的晶型。对晶体晶型的研究不仅可以帮助了解其生长过程，且在晶体培养、结构测定以及其品种鉴定等方面有重要的实际意义。多晶型现象，又被称为同质异晶现象，其表现为化学结构完全相同的物质在不同的结晶条件下生成具有不同空间点阵结构的晶体。蛋白质多晶型对于发现蛋白质新型药理作用具有非常重要的意义，在工业生产中，利用特定的多晶型调控方法实现蛋白质晶体多功能化是十分必要的。传统的晶型调控方法多通过结晶条件的改变来控制，如改变结晶温度，降温速率，过饱和度等。但是传统晶型调控方法制备的晶体晶型一致性欠佳，结晶率有待进一步提高，且固液分离不容易实现。
发明内容
本发明的目的是提供一种溶菌酶晶型调控的新方法，利用离子液体调控溶菌酶晶型，具有操作过程简单，容易控制，同时离子液体有助于提高结晶率，制备得到晶体不同的晶型一晶体颗粒完整，固液分离容易实现。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种利用离子液体调控溶菌酶晶型的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将离子液体加入到缓冲液中，使离子液体的质量浓度为1％-3％；
(2)将溶菌酶加入到步骤(1)获得的液体中，搅拌得到悬浊液；
(3)过滤步骤(2)获得的悬浊液得到溶菌酶饱和溶液；
(4)将步骤(3)得到的溶菌酶饱和溶液降温至0-5℃，期间维持搅拌1-3h，得到结晶悬浊液；
(5)将步骤(4)得到的结晶悬浊液离心，弃掉上清液，取沉淀干燥，得溶菌酶晶体。
进一步地，所述步骤(1)中离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([Emim]BF4)、1-乙基-3-甲基咪唑溴盐([Emim]Br)或1,3-二甲基咪唑碘盐([dmim]I)。
进一步地，所述步骤(1)中缓冲液为磷酸盐溶液，pH值为5.0-7.0磷酸盐质量浓度为2-7％，含0.1M(NH4)2SO4。
更进一步地，所述磷酸盐溶液为磷酸二氢钾或磷酸氢二钾。
进一步地，所述步骤(2)中搅拌是在20-30℃、200-400rpm的条件下搅拌20-50min。
进一步地，其特征在于：所述步骤(3)中过滤方式为通过砂芯漏斗减压过滤。
进一步地，所述步骤(4)中降温速率为5-10℃/h，搅拌速率为150-250rpm。
进一步地，所述步骤(5)中离心是在0-5℃、6000-10000r/min的条件下冷却离心10-15min。
进一步地，所述步骤(5)中干燥是在-55～-50℃的条件下真空冷冻干燥5-8h。
使用离子液体1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐或1-乙基-3-甲基咪唑溴盐制备的溶菌酶晶型为四方晶型，使用离子液体1,3-二甲基咪唑碘盐制备的溶菌酶晶型为单斜晶型。
本发明公开了以下技术效果：
(1)离子液体，是指在室温下呈液态的盐类化合物。离子液体具有蒸汽压低、熔点低、液程宽、易操作、可溶性好、稳定性高和可设计性等特性，已成为电化学、催化、有机合成中重要的反应介质，在化工分离中的应用近来也已引起广泛兴趣,体现出它在不同领域潜在的应用价值。
本发明创造性的将离子液体应用于溶菌酶结晶过程，所使用的离子液体为水溶性离子液体，添加量少，可降低溶菌酶分子成核固液表面张力及成核自由能变，促进溶菌酶分子在三维空间的组装，有利于提高溶菌酶结晶率、晶体粒度及分离纯化的效果。
(2)本发明充分利用离子液体对蛋白质分子组装的调控作用，实现不同晶型的调控，制备的溶菌酶晶体晶型一致性高，晶体颗粒完整，固液分离容易实现。
本发明通过离子液体的种类和添加量实现溶菌酶晶型的调控，过程控制容易实现，操作方便，结晶率高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1添加离子液体1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐结晶制备溶菌酶晶体的晶型图；
图2为实施例2添加离子液体1-乙基-3-甲基咪唑溴盐结晶制备溶菌酶晶体的晶型图；
图3为是实施例3添加离子液体1,3-二甲基咪唑碘盐结晶制备溶菌酶晶体的晶型图；
图4为实施例1添加离子液体1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐结晶制备溶菌酶晶体的X-射线衍射图谱；
图5为实施例2添加离子液体1-乙基-3-甲基咪唑溴盐结晶制备溶菌酶晶体的X-射线衍射图谱；
图6为实施例3添加离子液体1,3-二甲基咪唑碘盐结晶制备溶菌酶晶体的X-射线衍射图谱。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
一种利用离子液体调控溶菌酶晶型的方法，包括以下步骤：
(1)将水溶性咪唑基离子液体1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐[Emim]BF4加入到溶液I中，使水溶性咪唑基离子液体[Emim]BF4的质量浓度为1％，所述溶液I为pH值为5.0的、含质量浓度为2％的含0.1M(NH4)2SO4的磷酸二氢钾缓冲液；
(2)将过量的溶菌酶加入到步骤(1)获得的液体中，使所述溶菌酶在20℃、搅拌速率为200rpm下搅拌20min；
(3)将步骤(2)获得的悬浊液通过砂芯漏斗快速减压过滤，得到溶菌酶饱和溶液；
(4)将步骤(3)得到的溶菌酶饱和溶液以5℃/h的降温速率降温至0℃，期间维持搅拌150rpm，并维持1h养晶；
(5)将步骤(4)得到结晶悬浊液在0℃、6000r/min的离心机内冷却离心10min，弃上清液，取沉淀在-50℃条件下真空冷冻干燥5h，得到溶菌酶晶体。图1为本实施例制备溶菌酶晶体的晶型图，从图1可以看出得四方晶型溶菌酶晶体，图4为本实施例制备溶菌酶晶体的X-射线衍射图谱，XRD图谱中的衍射峰越尖锐，说明结晶越好，结晶率为98.5％，4℃低温保藏。
实施例2
一种利用离子液体调控溶菌酶晶型的方法，包括以下步骤：
(1)将水溶性咪唑基离子液体1-乙基-3-甲基咪唑溴盐[Emim]Br加入到溶液I中，使水溶性咪唑基离子液体[Emim]Br的质量浓度为3％，所述溶液I为pH值为6.0的、含质量浓度为5％的含0.1M(NH4)2SO4的磷酸氢二钾缓冲液；
(2)将过量的溶菌酶加入到步骤(1)获得的液体中，使所述溶菌酶在30℃、搅拌速率为250rpm下搅拌30min；
(3)将步骤(2)获得的悬浊液通过砂芯漏斗快速减压过滤，得到溶菌酶饱和溶液；
(4)将步骤(3)得到的溶菌酶饱和溶液以10℃/h的降温速率降温至5℃，期间维持搅拌250rpm，并维持3h养晶；
(5)将步骤(4)得到结晶悬浊液在5℃、10000r/min的离心机内冷却离心15min，弃上清液，取沉淀在-55℃真空冷冻干燥8h，得到溶菌酶晶体。图2为本实施例制备的溶菌酶晶体的晶型图，从图2可以看出得四方晶型溶菌酶晶体，图5为本实施例制备的溶菌酶晶体的X-射线衍射图谱，XRD图谱中的衍射峰越尖锐，说明结晶越好，结晶率为97.3％，4℃低温保藏。
实施例3
一种利用离子液体调控溶菌酶晶型的方法，包括以下步骤：
(1)将水溶性咪唑基离子液体1,3-二甲基咪唑碘盐[dmim]I加入到溶液I中，使水溶性咪唑基离子液体[dmim]I的质量浓度为1％，所述溶液I为pH值为5.0的、含质量浓度为2％的含0.1M(NH4)2SO4的磷酸二氢钾缓冲液；
(2)将过量的溶菌酶加入到步骤(1)获得的液体中，使所述溶菌酶在20℃、搅拌速率为200rpm下搅拌20min；
(3)将步骤(2)获得的悬浊液通过砂芯漏斗快速减压过滤，得到溶菌酶饱和溶液；
(4)将步骤(3)得到的溶菌酶饱和溶液以5℃/h的降温速率降温至0℃，期间维持搅拌150rpm，并维持1h养晶；
(5)将步骤(4)得到结晶悬浊液在0℃、6000r/min的离心机内冷却离心10min，弃上清液，取沉淀在-50℃真空冷冻干燥5h，得到溶菌酶晶体。图3为本实施例制备的溶菌酶晶体的晶型图，从图3可以看出得单斜晶型溶菌酶晶体，图6为本实施例制备的溶菌酶晶体的X-射线衍射图谱，XRD图谱中的衍射峰越尖锐，说明结晶越好，结晶率为97.6％，4℃低温保藏。
实施例4
一种利用离子液体调控溶菌酶晶型的方法，包括以下步骤：
(1)将水溶性咪唑基离子液体1,3-二甲基咪唑碘盐[dmim]I加入到溶液I中，使水溶性咪唑基离子液体[dmim]I的质量浓度为3％，所述溶液I为pH值为6.0的、含质量浓度为5％的含0.1M(NH4)2SO4的磷酸氢二钾缓冲液；
(2)将过量的溶菌酶加入到步骤(1)获得的液体中，使所述溶菌酶在30℃、搅拌速率为250rpm下搅拌30min；
(3)将步骤(2)获得的悬浊液通过砂芯漏斗快速减压过滤，得到溶菌酶饱和溶液；
(4)将步骤(3)得到的溶菌酶饱和溶液以10℃/h的降温速率降温至5℃，期间维持搅拌250rpm，并维持3h养晶；
(5)将步骤(4)得到结晶悬浊液在5℃、10000r/min的离心机内冷却离心15min，弃上清液，取沉淀在-55℃真空冷冻干燥8h，得单斜晶型溶菌酶晶体，结晶率为97.0％，4℃低温保藏。
对比例1
与实施例1的不同之处在于，水溶性咪唑基离子液体[Emim]BF4的质量浓度为7％，不能制备得到溶菌酶晶体。
对比例2
与实施例1的不同之处在于，选用的离子液体为N-丁基吡啶六氟磷酸盐，不能制备得到溶菌酶晶体。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种利用离子液体调控溶菌酶晶型的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将离子液体加入到缓冲液中，使离子液体的质量浓度为1％-3％；
(2)将溶菌酶加入到步骤(1)获得的液体中，搅拌得到悬浊液；
(3)过滤步骤(2)获得的悬浊液得到溶菌酶饱和溶液；
(4)将步骤(3)得到的溶菌酶饱和溶液降温至0-5℃，期间维持搅拌1-3h，得到结晶悬浊液；
(5)将步骤(4)得到的结晶悬浊液离心，弃掉上清液，取沉淀干燥，得溶菌酶晶体；
所述步骤(1)中离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐或1-乙基-3-甲基咪唑溴盐；
所述1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐的质量浓度为1%；
所述1-乙基-3-甲基咪唑溴盐的质量浓度为3%；
所述步骤(4)中降温速率为5-10℃/h，搅拌速率为150-250rpm；
所述步骤(1)中缓冲液为磷酸盐溶液，pH值为5.0-7.0磷酸盐质量浓度为2-7％，含0.1M(NH4)2SO4；
所述磷酸盐溶液为磷酸二氢钾或磷酸氢二钾；
所述步骤(2)中搅拌是在20-30℃、200-400rpm的条件下搅拌20-50min。
2.根据权利要求1所述的利用离子液体调控溶菌酶晶型的方法，其特征在于：所述步骤(3)中过滤方式为通过砂芯漏斗减压过滤。
3.根据权利要求1所述的利用离子液体调控溶菌酶晶型的方法，其特征在于：所述步骤(5)中离心是在0-5℃、6000-10000r/min的条件下冷却离心10-15min。
4.根据权利要求1所述的利用离子液体调控溶菌酶晶型的方法，其特征在于：所述步骤(5)中干燥是在-55～-50℃的条件下真空冷冻干燥5-8h。
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