CN113249322A - 一种dc细胞的培养液及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DC细胞的培养液及其培养方法，DC细胞的培养液根据DC细胞的生长情况按照贴壁细胞培养液、后续第一补加DC细胞培养液和后续第二补加DC细胞培养液分批加入；贴壁细胞培养液包括：无血清DC培养基、GM‑SCF、IL‑13；后续第一补加DC细胞培养液包括：无血清DC培养基、GM‑CSF、IL‑4、抗CD83抗体和浓度为1％的自体血清；后续第二补加DC细胞培养液包括：TNF‑a、维生素B12、烟酰胺；运用本发明的培养液和培养方法DC细胞培养成熟时间快，只需要3天即可成熟，且细胞数量、纯度高，DC细胞的抗原递呈能力强，具有优秀的抗肿瘤效果。

Description

一种DC细胞的培养液及其培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，特别是一种DC细胞的培养液及其培养方法。
背景技术
树突状细胞(Dendritic Cells，以下简称DC)，是一种巨噬细胞，同时也是功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)。DC细胞在人体内主要通过吞噬抗原体并将其一部分表达在DC细胞表面的MHC II分子上以激活辅助性T细胞以及B细胞。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(T cells)增殖的APC。现有DC细胞培养方法很多，现有技术一般采用GM-CSF、IL-4、TNF-a配合培养DC细胞，GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促进DC的存活；IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。TNF-a可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class IIcompartment)消失，但能够上调细胞表面MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80,CD86等)的表达，使未成熟DC分化为成熟DC(mature DC)。但是这样的培养液仍然存在DC细胞培养成熟时间慢，要7-14天左右才成熟，且细胞数量以及纯度低等问题；本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种DC细胞的培养液及其培养方法，运用本发明的培养液和培养方法DC细胞培养成熟时间快，只需要3天即可成熟，且细胞数量、纯度高，DC细胞的抗原递呈能力强，具有优秀的抗肿瘤效果。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种DC细胞的培养液，包括：贴壁细胞培养液、后续第一补加DC细胞培养液和后续第二补加DC细胞培养液；
贴壁细胞培养液包括：20ml的无血清DC培养基、9.4-9.9ul浓度为800U/ml的GM-SCF、6.3-6.9ul浓度为500U/ml的IL-13；
后续第一补加DC细胞培养液包括：15ml的无血清DC培养基、9.8-10.3ul浓度为800U/ml的GM-CSF、6.7-7.2ul浓度为500U/ml的IL-4、2.9-3.4ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体和0.13-0.17ml浓度为1％的自体血清；
后续第二补加DC细胞培养液包括：1.7-2.2ul 150U/mL TNF-a、0.9-1.4ul 250U/mL维生素B12、1.2-1.7ul 300U/mL烟酰胺。
前述的一种DC细胞的培养液，贴壁细胞培养液包括：20ml的ALyS505N-0培养液、9.7ul浓度为800U/ml的GM-SCF、6.6ul浓度为500U/ml的IL-13。
前述的一种DC细胞的培养液，贴壁细胞培养液还包括：50ul的200mM氨基酸。
前述的一种DC细胞的培养液，氨基酸包括：L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-门冬氨酸或L-苯丙氨酸中的一种或多种的组合。
前述的一种DC细胞的培养液，后续第一补加DC细胞培养液包括：15ml的无血清DC培养基、10.1ul浓度为800U/ml的GM-CSF、6.9ul浓度为500U/ml的IL-4、3.1ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体和0.15ml浓度为1％的自体血清。
前述的一种DC细胞的培养液，后续第二补加DC细胞培养液包括：1.9ul 150U/mLTNF-a、1.2ul 250U/mL维生素B12、1.5ul 300U/mL烟酰胺。
一种DC细胞的的培养方法，包括如下步骤：
步骤一，处理血浆得到白细胞；
步骤二，采用贴壁细胞培养液培养白细胞，培养2h后，移出悬浮液，留下贴壁细胞；
贴壁细胞培养液包括：20ml的无血清DC培养基、9.4-9.9ul浓度为800U/ml的GM-SCF、6.3-6.9ul浓度为500U/ml的IL-13；
步骤三，将后续第一补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养20h，36-38℃，3-8％CO2；
后续第一补加DC细胞培养液包括：15ml的无血清DC培养基、9.8-10.3ul浓度为800U/ml的GM-CSF、6.7-7.2ul浓度为500U/ml的IL-4、2.9-3.4ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体和0.13-0.17ml浓度为1％的自体血清；
步骤四，将后续第二补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养2天，36-38℃，3-8％CO2；
后续第二补加DC细胞培养液包括：1.7-2.2ul 150U/mL TNF-a、0.9-1.4ul 250U/mL维生素B12、1.2-1.7ul 300U/mL烟酰胺；
步骤四，收获DC细胞。
前述的一种DC细胞的的培养方法，步骤三中，在将后续第一补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶前先用生理盐水洗1-3遍贴壁细胞。
本发明的有益之处在于：
本发明方法的DC细胞培养成熟时间快，总的培养时间不到3天即可成熟，且细胞数量以及纯度高；
本发明根据DC细胞培养各个时段添加不同的细胞培养液，最大程度的优化培养，提高细胞数量以及纯度；
本发明发现TNF-a、维生素B12、烟酰胺在提高细胞数量和DC细胞的抗原递呈能力上都有协同作用，具有更好的抗肿瘤效果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种DC细胞的的培养方法，包括如下步骤：
步骤一，处理血浆得到白细胞；
步骤二，采用贴壁细胞培养液培养白细胞，培养2h后，移出悬浮液，留下贴壁细胞；
贴壁细胞培养液包括：20ml的无血清DC培养基、9.4-9.9ul浓度为800U/ml的GM-SCF、6.3-6.9ul浓度为500U/ml的IL-13；作为一种优选，贴壁细胞培养液还包括：50ul的200mM氨基酸；氨基酸的种类不受限制，只要是能够提供细胞营养的都可以用运用于本发明。氨基酸包括：L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-门冬氨酸或L-苯丙氨酸中的一种或多种的组合。作为一种优选，贴壁细胞培养液包括：20ml的ALyS505N-0培养液、9.7ul浓度为800U/ml的GM-SCF、6.6ul浓度为500U/ml的IL-13。
步骤三，先用生理盐水洗1-3遍贴壁细胞，再将后续第一补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养20h，36-38℃，3-8％CO2；
后续第一补加DC细胞培养液包括：15ml的无血清DC培养基、9.8-10.3ul浓度为800U/ml的GM-CSF、6.7-7.2ul浓度为500U/ml的IL-4、2.9-3.4ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体和0.13-0.17ml浓度为1％的自体血清；作为一种优选，后续第一补加DC细胞培养液包括：15ml的无血清DC培养基、10.1ul浓度为800U/ml的GM-CSF、6.9ul浓度为500U/ml的IL-4、3.1ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体和0.15ml浓度为1％的自体血清。
步骤四，将后续第二补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养2天，36-38℃，3-8％CO2；
后续第二补加DC细胞培养液包括：1.7-2.2ul 150U/mL TNF-a、0.9-1.4ul 250U/mL维生素B12、1.2-1.7ul 300U/mL烟酰胺；作为一种优选，后续第二补加DC细胞培养液包括：1.9ul 150U/mL TNF-a、1.2ul 250U/mL维生素B12、1.5ul 300U/mL烟酰胺。
步骤四，收获DC细胞
具体过程不受限制只要能够收获DC细胞的方法都在本发明的保护范围内。
以下用如下实施例制备出的样品进行效果验证：
实施例1：
步骤一，处理血浆得到白细胞；
1.确认血浆袋的吸取管密封。用两张不同的浸泡在70％乙醇的无菌室专用清洁纸擦拭吸取管和剪刀。
2.用镊子夹住吸取管，剪开管道前端并用镊子控制流速以转移血浆到50ml试管内。记录转移的血浆容量。
3.离心试管(400g，4℃)30分钟以移除血小板。
4.把上层液体倒入一个新的50ml试管。
5.把试管放入恒温水槽内(56℃)，培养30分钟。
6.离心式管(400g，4℃)60分钟以移除沉淀的纤维蛋白。
7.把上层液体(自体血清)倒入一个新的50ml试管。再试管上标记病人名字，制备日期，并冷藏(4℃)。
8.确认PBMC袋的吸取管密封。悬挂好PBMC袋。用两张不同的侵泡在70％乙醇的无菌室专用清洁纸擦拭吸取管和剪刀。
9.转移细胞到50ml试管中。记录转移的容量。
10.计算所需的50ml试管的数量，向所有试管中加入15ml淋巴细胞分离液1077；
11.准备足够的新50ml试管用以2倍稀释样本。向准备的所有50ml试管中倒入25mlhanks缓冲液。用10ml移液器转移25ml细胞悬浊液到各个试管中。向所有试管中各移入30ml稀释过的细胞悬液。
12.离心所有试管(400g，室温)40分钟。
13.吸取，弃用上层液体直到液面到底层白细胞的距离为1cm。
14.准备新的50ml试管。小心翼翼地用10ml移液器收集白细胞。
步骤二，采用贴壁细胞培养液培养白细胞，培养2h后，移出悬浮液，留下贴壁细胞；
贴壁细胞培养液包括：20ml的无血清DC培养基、9.4-9.9ul浓度为800U/ml的GM-SCF、6.3-6.9ul浓度为500U/ml的IL-13；
贴壁细胞培养液包括：20ml的ALyS505N-0培养液、9.4ul浓度为800U/ml的GM-SCF、6.9ul浓度为500U/ml的IL-13，50ul的200mM L-谷氨酰胺。
1.将每两个试管中的白细胞收集，移入一个新的50ml试管中。
2.准备T75细胞培养瓶(DC培养瓶)。标注日期。加10ml室温下的ALyS505N-0培养液、9.4ul浓度为800U/ml的GM-SCF、6.9ul浓度为500U/ml的IL-13到每个培养瓶中。
3.用10ml移液器向细胞试管中加入10ml ALyS505N-0。重新使细胞悬浮。加入1ml青链霉素双混合液，50ul的200mM L-谷氨酰胺。
4.向每个DC培养瓶里转移5ml细胞悬浊液。
5.扣上培养瓶盖子。慢慢的摇晃瓶子以使细胞悬液均匀。放进培养箱培养2小时(37℃，5％CO2)。
步骤三，先用生理盐水洗1-3遍贴壁细胞，再将后续第一补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养20h，36-38℃，3-8％CO2；
后续第一补加DC细胞培养液包括：15ml的无血清DC培养基、9.8-10.3ul浓度为800U/ml的GM-CSF、6.7-7.2ul浓度为500U/ml的IL-4、2.9-3.4ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体和0.13-0.17ml浓度为1％的自体血清；
后续第一补加DC细胞培养液包括：15ml的无血清DC培养基、9.8ul浓度为800U/ml的GM-CSF、7.2ul浓度为500U/ml的IL-4、2.9ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体和0.15ml浓度为1％的自体血清。
贴壁细胞培养的两个小时培养结束后，用显微镜确保细胞黏附在培养瓶的底部。
温柔的前后摇晃培养瓶10次使非贴壁的细胞悬浮，转移非贴壁细胞悬液到50ml试管中。
迅速的向每个DC培养瓶中加入后续第一补加DC细胞培养液，放入培养箱培养20h，36-38℃，3-8％CO2。
步骤四，将后续第二补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养2天，36-38℃，3-8％CO2；
后续第二补加DC细胞培养液包括：1.7-2.2ul 150U/mL TNF-a、0.9-1.4ul 250U/mL维生素B12、1.2-1.7ul 300U/mL烟酰胺；
后续第二补加DC细胞培养液包括：1.7ul 150U/mL TNF-a、1.4ul 250U/mL维生素B12、1.2ul 300U/mL烟酰胺。
待后续第一补加DC细胞培养液培养完成后，迅速的向每个DC培养瓶中加入后续第二补加DC细胞培养液，放入培养箱培养2天，36-38℃，3-8％CO2。
步骤四，收获DC细胞
1.确认收获的细胞培养瓶。
2.确保内毒素检测为阴性。
3.准备一个冰盒来暂存细胞，准备冰冷的RPMI1640。
4.加入15ml的缓冲液摇匀后将细胞悬液到50ml试管中。用10ml移液器转移10mlRPMI到培养瓶中，清洗培养瓶5次。转移细胞悬液到50ml试管中，放在冰上暂存。
5.当所有细胞都被收获到试管中以后，离心试管5分钟(400g，4℃)。离心结束后，吸取移除上层液体。用少量的RPMI 1640使50ml试管内细胞悬浮。转移所有试管中的细胞悬液到其中一个试管中，加入RPMI 1640直到50ml。取样本用于FACS检测。
6.计算DC细胞的数量以及存活率。
7.离心试管5分钟(1500rpm，4℃)
8.准备冷冻管在所有冷冻管上标记患者姓名，细胞名(DC)，细胞数量以及日期。
9.制备细胞冷冻液(CELL GRO DC培养液，20％自体血清，10％DMSO)暂存在冰上。
10.离心细胞试管5分钟(400g，4℃)离心结束后，倒出弃用上层液体到一个无菌的试管中。
11.执行无菌检测
12.暂存细胞在冰上。
13.向细胞试管中加入冷冻液，用移液器混匀。
14.冷冻保存。
实施例2：
步骤一，处理血浆得到白细胞；
与实施例1相同；
步骤二，采用贴壁细胞培养液培养白细胞，培养2h后，移出悬浮液，留下贴壁细胞；
贴壁细胞培养液包括：20ml的ALyS505N-0培养液、9.9ul浓度为800U/ml的GM-SCF、6.3ul浓度为500U/ml的IL-13，50ul的200mM L-谷氨酰胺。
除了贴壁细胞培养液不同，其他与实施例1相同；
步骤三，先用生理盐水洗1-3遍贴壁细胞，再将后续第一补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养20h，36-38℃，3-8％CO2；
后续第一补加DC细胞培养液包括：15ml的无血清DC培养基、10.3ul浓度为800U/ml的GM-CSF、6.7ul浓度为500U/ml的IL-4、3.4ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体和0.15ml浓度为1％的自体血清。
除了后续第一补加DC细胞培养液不同，其他与实施例1相同；
步骤四，将后续第二补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养2天，36-38℃，3-8％CO2；
后续第二补加DC细胞培养液包括：2.2ul 150U/mL TNF-a、0.9ul 250U/mL维生素B12、1.2ul 300U/mL烟酰胺。
除了后续第二补加DC细胞培养液不同，其他与实施例1相同；
步骤四，收获DC细胞
与实施例1相同。
实施例3：
步骤一，处理血浆得到白细胞；
与实施例1相同；
步骤二，采用贴壁细胞培养液培养白细胞，培养2h后，移出悬浮液，留下贴壁细胞；
贴壁细胞培养液包括：20ml的ALyS505N-0培养液、9.7ul浓度为800U/ml的GM-SCF、6.6ul浓度为500U/ml的IL-13。
除了贴壁细胞培养液不同，其他与实施例1相同；
步骤三，先用生理盐水洗1-3遍贴壁细胞，再将后续第一补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养20h，36-38℃，3-8％CO2；
后续第一补加DC细胞培养液包括：15ml的无血清DC培养基、10.1ul浓度为800U/ml的GM-CSF、6.9ul浓度为500U/ml的IL-4、3.1ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体和0.15ml浓度为1％的自体血清。
除了后续第一补加DC细胞培养液不同，其他与实施例1相同；
步骤四，将后续第二补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养2天，36-38℃，3-8％CO2；
后续第二补加DC细胞培养液包括：1.9ul 150U/mL TNF-a、1.2ul 250U/mL维生素B12、1.5ul 300U/mL烟酰胺。
除了后续第二补加DC细胞培养液不同，其他与实施例1相同；
步骤四，收获DC细胞
与实施例1相同。
对比实施例1：其他都与实施例3相同，后续补加DC细胞培养液没有分两次加入，一次性加入。
步骤一，处理血浆得到白细胞；
与实施例1相同；
步骤二，采用贴壁细胞培养液培养白细胞，培养2h后，移出悬浮液，留下贴壁细胞；
贴壁细胞培养液包括：20ml的ALyS505N-0培养液、9.7ul浓度为800U/ml的GM-SCF、6.6ul浓度为500U/ml的IL-13。
除了贴壁细胞培养液不同，其他与实施例1相同；
步骤三，先用生理盐水洗1-3遍贴壁细胞，再将后续补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养3天，36-38℃，3-8％CO2；
后续补加DC细胞培养液包括：15ml的无血清DC培养基、10.1ul浓度为800U/ml的GM-CSF、6.9ul浓度为500U/ml的IL-4、3.1ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体和0.15ml浓度为1％的自体血清，1.9ul 150U/mL TNF-a、1.2ul 250U/mL维生素B12、1.5ul 300U/mL烟酰胺。
除了后续第一补加DC细胞培养液不同，其他与实施例1相同；
步骤三，收获DC细胞
与实施例1相同。
对比实施例2：其他都与实施例3相同，后续第二补加DC细胞培养液的配方不同，缺少维生素B12。
步骤一，处理血浆得到白细胞；
与实施例1相同；
步骤二，采用贴壁细胞培养液培养白细胞，培养2h后，移出悬浮液，留下贴壁细胞；
贴壁细胞培养液包括：20ml的ALyS505N-0培养液、9.7ul浓度为800U/ml的GM-SCF、6.6ul浓度为500U/ml的IL-13。
除了贴壁细胞培养液不同，其他与实施例1相同；
步骤三，先用生理盐水洗1-3遍贴壁细胞，再将后续第一补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养20h，36-38℃，3-8％CO2；
后续第一补加DC细胞培养液包括：15ml的无血清DC培养基、10.1ul浓度为800U/ml的GM-CSF、6.9ul浓度为500U/ml的IL-4、3.1ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体和0.15ml浓度为1％的自体血清。
除了后续第一补加DC细胞培养液不同，其他与实施例1相同；
步骤四，将后续第二补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养2天，36-38℃，3-8％CO2；
后续第二补加DC细胞培养液包括：1.9ul 150U/mL TNF-a、1.5ul 300U/mL烟酰胺。
除了后续第二补加DC细胞培养液不同，其他与实施例1相同；
步骤四，收获DC细胞
与实施例1相同。
对比实施例3：其他都与实施例3相同，后续第二补加DC细胞培养液的配方不同，缺少烟酰胺。
步骤一，处理血浆得到白细胞；
与实施例1相同；
步骤二，采用贴壁细胞培养液培养白细胞，培养2h后，移出悬浮液，留下贴壁细胞；
贴壁细胞培养液包括：20ml的ALyS505N-0培养液、9.7ul浓度为800U/ml的GM-SCF、6.6ul浓度为500U/ml的IL-13。
除了贴壁细胞培养液不同，其他与实施例1相同；
步骤三，先用生理盐水洗1-3遍贴壁细胞，再将后续第一补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养20h，36-38℃，3-8％CO2；
后续第一补加DC细胞培养液包括：15ml的无血清DC培养基、10.1ul浓度为800U/ml的GM-CSF、6.9ul浓度为500U/ml的IL-4、3.1ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体和0.15ml浓度为1％的自体血清。
除了后续第一补加DC细胞培养液不同，其他与实施例1相同；
步骤四，将后续第二补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养2天，36-38℃，3-8％CO2；
后续第二补加DC细胞培养液包括：1.9ul 150U/mL TNF-a、1.2ul 250U/mL维生素B12。
除了后续第二补加DC细胞培养液不同，其他与实施例1相同；
步骤四，收获DC细胞
与实施例1相同。
试验一：每个实施例的样品用两袋不同病人血浆检测的细胞数量，分别采用A血浆、B血浆表示，见表1。
表1细胞数量检测表
A血浆细胞数 B血浆细胞数
实施例1 2.14x10^7/ml 2.07x10^7/ml
实施例2 2.08x10^7/ml 2.10x10^7/ml
实施例3 2.19x10^7/ml 2.18x10^7/ml
对比实施例1 1.74x10^7/ml 1.78x10^7/ml
对比实施例2 1.32x10^7/ml 1.35x10^7/ml
对比实施例3 1.40x10^7/ml 1.42x10^7/ml
由表1的结果可知，采用本发明所述方法其细胞数量以及纯度比常规方法明显要高很多；且将培养液分批加入能够增加细胞数量和纯度；TNF-a与维生素B12、烟酰胺在提高细胞数量上有协同作用。
试验二：FACS流式细胞仪鉴定，每个实施例的样品用两袋不同病人血浆检测的细胞数量，分别采用实施例N-A、实施例N-B血浆表示，见表2。
表2FACS流式细胞仪鉴定结果
Figure BDA0003071780890000091
由表2的结果可知：本发明的抗原递呈能力效果明显高于常规方法，且培养液分批加入对抗原递呈能力具有一定的增益效果；NF-a、维生素B12、烟酰胺在DC细胞的抗原递呈能力上都有协同作用，特别是HLA-DR和CD86具有特别优异的促进作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种DC细胞的培养液，其特征在于，包括：贴壁细胞培养液、后续第一补加DC细胞培养液和后续第二补加DC细胞培养液；
所述贴壁细胞培养液包括：20ml的无血清DC培养基、9.4-9.9ul浓度为800U/ml的GM-SCF、6.3-6.9ul浓度为500U/ml的IL-13；
所述后续第一补加DC细胞培养液包括：15ml的无血清DC培养基、9.8-10.3ul浓度为800U/ml的GM-CSF、6.7-7.2ul浓度为500U/ml的IL-4、2.9-3.4ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体和0.13-0.17ml浓度为1％的自体血清；
所述后续第二补加DC细胞培养液包括：1.7-2.2ul 150U/mL TNF-a、0.9-1.4ul 250U/mL维生素B12、1.2-1.7ul 300U/mL烟酰胺。
2.根据权利要求1所述的一种DC细胞的培养液，其特征在于，所述贴壁细胞培养液包括：20ml的ALyS505N-0培养液、9.7ul浓度为800U/ml的GM-SCF、6.6ul浓度为500U/ml的IL-13。
3.根据权利要求1或2所述的一种DC细胞的培养液，其特征在于，所述贴壁细胞培养液还包括：50ul的200mM氨基酸。
4.根据权利要求3所述的一种DC细胞的培养液，其特征在于，氨基酸包括：L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-门冬氨酸或L-苯丙氨酸中的一种或多种的组合。
5.根据权利要求1所述的一种DC细胞的培养液，其特征在于，所述后续第一补加DC细胞培养液包括：15ml的无血清DC培养基、10.1ul浓度为800U/ml的GM-CSF、6.9ul浓度为500U/ml的IL-4、3.1ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体和0.15ml浓度为1％的自体血清。
6.根据权利要求1所述的一种DC细胞的培养液，其特征在于，所述后续第二补加DC细胞培养液包括：1.9ul 150U/mL TNF-a、1.2ul 250U/mL维生素B12、1.5ul 300U/mL烟酰胺。
7.一种DC细胞的的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，处理血浆得到白细胞；
步骤二，采用贴壁细胞培养液培养白细胞，培养2h后，移出悬浮液，留下贴壁细胞；
所述贴壁细胞培养液包括：20ml的无血清DC培养基、9.4-9.9ul浓度为800U/ml的GM-SCF、6.3-6.9ul浓度为500U/ml的IL-13；
步骤三，将后续第一补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养20h，36-38℃，3-8％CO2；
所述后续第一补加DC细胞培养液包括：15ml的无血清DC培养基、9.8-10.3ul浓度为800U/ml的GM-CSF、6.7-7.2ul浓度为500U/ml的IL-4、2.9-3.4ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体和0.13-0.17ml浓度为1％的自体血清；
步骤四，将后续第二补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶中，培养2天，36-38℃，3-8％CO2；
所述后续第二补加DC细胞培养液包括：1.7-2.2ul 150U/mL TNF-a、0.9-1.4ul 250U/mL维生素B12、1.2-1.7ul 300U/mL烟酰胺；
步骤四，收获DC细胞。
8.根据权利要求7所述的一种DC细胞的的培养方法，其特征在于，步骤三中，在将后续第一补加DC细胞培养液加入有贴壁细胞的培养瓶前先用生理盐水洗1-3遍贴壁细胞。
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