CN113248575B - 一种针对SARS-CoV-2的重组蛋白疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及SARS‑CoV‑2重组蛋白疫苗的目的氨基酸序列、所述重组蛋白疫苗的目的基因序列、包含所述目的基因序列的真核细胞表达载体、表达所述目的氨基酸序列的细胞以及包含所述目的氨基酸序列的重组蛋白疫苗。本发明提供的重组蛋白疫苗能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,且可以快速制备,适用于新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的预防。
Description
技术领域
本发明涉及流行病预防及疫苗生产领域,具体涉及一种针对 SARS-CoV-2的重组蛋白疫苗及其制备方法。
背景技术
新型冠状病毒是一种以前尚未在人类中发现的新型冠状病毒。国际病毒分类委员会于2020年2月将新型冠状病毒的正式分类名确定为严重急性呼吸综合征冠状病毒2,英文缩写SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)。WHO于2020年2月将由新型冠状病毒SARS-CoV-2引发的疾病命名为2019冠状病毒病,英文缩写 COVID-19(Corona Virus Disease 2019)。
因为人群中缺少对新型冠状病毒SARS-CoV-2的免疫力,并且经呼吸道飞沫传播,也可通过接触和粪-口传播,所以人群普遍易感,且目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。
冠状病毒属于套氏病毒目,冠状病毒科,冠状病毒属,是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链RNA的病毒,是自然界中广泛存在的一大类病毒,引起的疾病患者表现为从普通感冒到严重肺部感染等不同的临床症状,例如中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸道综合症(SARS)。SARS-CoV-2与SARS-CoV同属于冠状病毒β家族。鉴于新型冠状病毒SARS-CoV-2在全球范围内的传播,现亟需开发能够有效预防引起新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的疫苗,用于有效防止新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起的肺炎,甚至是严重呼吸道感染在世界范围内的蔓延。
目前应用于人体的预防病毒感染的疫苗主要包括采用病毒经减毒后制备的减毒活疫苗,如水痘减毒活疫苗、麻疹减毒活疫苗等;以及灭活全病毒颗粒疫苗,如肠道病毒EV71型灭活疫苗、甲型肝炎疫苗等。然而,减毒疫苗要费很长时间使病毒繁殖许多代,然后逐渐减除病毒的大部分活性,难以满足急性传染病的预防需要。灭活疫苗则在免疫病理方面存在许多难以解决的问题,例如有些灭活病毒进入人体会在病毒入侵时加重病情。
重组蛋白疫苗是将病毒的目的抗原基因构建在表达载体上,再转化到细菌、酵母、哺乳动物或昆虫细胞中,在一定的诱导条件下,表达出大量的抗原蛋白,通过纯化后制备的疫苗。重组蛋白疫苗能够诱导机体产生体液免疫和细胞免疫,并且可以快速制备,适用于新型冠状病毒的预防。
发明内容
SARS-CoV-2编码的蛋白包括RNA聚合酶蛋白、纤突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。其中,纤突蛋白(Spike蛋白,下文简称S蛋白)为糖蛋白。该蛋白既是诱导保护性免疫应答的决定因素,又是与宿主细胞血管紧张素转换酶2(angiotensin-convertingenzyme 2,ACE2)受体结合的部位。且在小鼠和非洲绿猴中,S蛋白已被证实可诱导血清中和抗体产生,后者具有中和SARS-CoV的作用。另外,S蛋白可诱导CD4+和CD8+T细胞应答。因此,本发明选择S蛋白作为靶标进行SARS-CoV-2重组蛋白疫苗的研发。
本发明的第一目的是提供针对SARS-CoV-2重组蛋白疫苗的目的氨基酸序列,包括含有SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5中的一个或多个氨基酸序列,或与其相似度为90%以上的氨基酸序列。
上述氨基酸序列参见本发明的序列表,具体如下表1所示。
表1:目的氨基酸序列
本发明将Sars-CoV和SARS-CoV-2各自的S蛋白的氨基酸序列进行比对,并选择保守性较高的序列作为重组蛋白疫苗的目标氨基酸序列。这些序列虽然长短不一,但是覆盖了Spike蛋白与ACE2 受体结合的部位以及主要的蛋白表面抗原决定簇。
本发明的第二目的是提供所述重组蛋白疫苗的目的基因序列,其包括编码SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5中的一个或多个氨基酸序列或与其相似度为90%以上的氨基酸序列的DNA序列。
作为本发明的一种优选方案,所述目的基因序列是经过密码子优化后的DNA序列。
本发明的第三目的是提供包含所述重组蛋白疫苗目的基因序列的真核细胞表达载体。其是将所述目的基因序列***到真核细胞表达载体中构建而成。
所述真核细胞表达载体优选为可以用于人的表达载体。
作为本发明的一种优选方案,所述真核细胞表达载体为 pCHO1.0载体。所述pCHO1.0载体的示意图如图1所示。
本发明的第四目的是提供表达所述目的氨基酸序列的细胞,所述细胞中外源转入了包含所述目的基因序列的真核细胞表达载体。
作为本发明的一种优选方案,所述细胞为CHO细胞。CHO细胞(Chinese hamsterovary cell)是1957年从中国地鼠卵巢细胞得到。该细胞是上皮样细胞,通常贴壁生长,也可悬浮生长,被广泛地用于表达重组DNA的蛋白。
在选用CHO细胞进行抗原表达的情况下,本发明优选将所述目的基因序列经过CHO细胞密码子优化后克隆到所述真核细胞表达载体中,再转入CHO细胞中。
本发明的第五目的是提供针对SARS-CoV-2的重组蛋白疫苗,其包含SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5中的一个或多个氨基酸序列,或与其相似度为90%以上的氨基酸序列。
作为本发明的一种优选方案,所述重组蛋白疫苗中抗原有效成分的含量为20~200μg/剂。具体而言,所述重组蛋白疫苗中抗原有效成分的含量可以为25μg/剂,50μg/剂,100μg/剂或200μg/剂。在本发明的一些具体实施方式中,所述抗原有效成分的含量是指疫苗产品中疫苗原液的含量。
本发明提供的疫苗中还可以含有免疫佐剂。所述免疫佐剂可以选用无机佐剂,如氢氧化铝佐剂等。所述免疫佐剂还可以选用有机佐剂,如脂多糖、细胞因子等。
作为本发明的一种优选方案,所述重组蛋白疫苗中含有 50~200μg/剂的氢氧化铝佐剂。具体而言,所述重组蛋白疫苗中氢氧化铝佐剂的含量可以为50μg/剂,100μg/剂或200μg/剂。
本发明提供的疫苗优选为液体疫苗,可以采用多种剂型形式。具体而言,所述重组蛋白疫苗可以是肌肉内液体注射剂、静脉内液体注射剂、鼻腔内液体注射剂、皮内液体注射剂或皮下液体注射剂。在实际应用时,可以根据转染效率、局部免疫监视等临床需要进行调整和选择,如选择单一的剂型进行注射免疫,或者选择多种混合剂型进行注射免疫。
本发明的第六目的是提供所述重组蛋白疫苗的制备方法,包括如下步骤:将包含所述目的基因序列的真核细胞表达载体转入细胞中表达,取上清液纯化,得疫苗原液。
作为本发明的一种优选方案,所述细胞为CHO细胞。在选用 CHO细胞进行抗原表达的情况下,本发明优选将所述目的基因序列经过CHO细胞密码子优化后克隆到所述真核细胞表达载体中,再转入CHO细胞中。
所述纯化可采用本领域常规的疫苗原液纯化方法。
作为本发明的一种优选方案,所述纯化包括:将所述上清液进行超滤浓缩后,进行分子筛和阴离子交换两步层析,所得层析液经滤膜过滤之后,即为疫苗原液。所述滤膜优选为0.22μm滤膜。
作为本发明的一种优选方案,所述方法还包括:将所述疫苗原液配制成疫苗。所述疫苗原液的用量优选为20~200μg/剂。具体而言,所述重组蛋白疫苗中疫苗原液的含量可以为25μg/剂,50μg/剂, 100μg/剂或200μg/剂。
本发明的第七目的是提供所述氨基酸序列、所述基因序列、所述真核细胞表达载体、所述细胞、所述重组蛋白疫苗或所述方法制备而成的重组蛋白疫苗在制备用于预防新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起的疾病的药物中的应用。所述疾病即为世界卫生组织命名的2019 冠状病毒病,英文缩写COVID-19。
优选地,所述疾病为新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起的肺炎,严重急性呼吸道感染,肠道疾病,心脏衰竭,肾衰竭或严重急性呼吸道综合征。
本发明提供的氨基酸序列为冠状病毒β家族较为保守的序列,且这些序列均能与ACE2结合,是引起免疫反应的重要抗原决定簇,既可以预防2003Sars-CoV引起的疾病,也能够预防SARS-CoV-2引起的疾病,能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。且本发明提供的重组蛋白疫苗可以快速制备,适用于新型冠状病毒SARS-CoV-2的预防。
附图说明
图1为pCHO1.0载体示意图。
图2为血清中特异性表达S蛋白细胞因子的结果示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了SARS-CoV-2重组蛋白疫苗原液的制备方法,具体为:
(1)将编码SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5的基因序列分别进行CHO细胞密码子优化后,***到pCHO1.0载体上,转化到CHO 细胞,进行蛋白的重组表达;
(2)取细胞培养的上清液,进行超滤浓缩后,进行分子筛和阴离子交换两步层析,所得层析液经0.22μm滤膜过滤,得疫苗原液。
实施例2
本实施例提供了一种SARS-CoV-2重组蛋白疫苗,该疫苗为液体疫苗,其中含有实施例1提供的疫苗原液25μg/剂以及氢氧化铝佐剂 50μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200201。
实施例3
本实施例提供了一种SARS-CoV-2重组蛋白疫苗,该疫苗为液体疫苗,其中含有实施例1提供的疫苗原液50μg/剂以及氢氧化铝佐剂 50μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200202。
实施例4
本实施例提供了一种SARS-CoV-2重组蛋白疫苗,该疫苗为液体疫苗,其中含有实施例1提供的疫苗原液100μg/剂以及氢氧化铝佐剂50μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200203。
实施例5
本实施例提供了一种SARS-CoV-2重组蛋白疫苗,该疫苗为液体疫苗,其中含有实施例1提供的疫苗原液200μg/剂以及氢氧化铝佐剂 50μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200204。
实施例6
本实施例提供了一种SARS-CoV-2重组蛋白疫苗,该疫苗为液体疫苗,其中含有实施例1提供的疫苗原液25μg/剂以及氢氧化铝佐剂200μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200205。
实施例7
本实施例提供了一种SARS-CoV-2重组蛋白疫苗,该疫苗为液体疫苗,其中含有实施例1提供的疫苗原液50μg/剂以及氢氧化铝佐剂 200μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200206。
实施例8
本实施例提供了一种SARS-CoV-2重组蛋白疫苗,该疫苗为液体疫苗,其中含有实施例1提供的疫苗原液100μg/剂以及氢氧化铝佐剂 200μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200207。
实施例9
本实施例提供了一种SARS-CoV-2重组蛋白疫苗,该疫苗为液体疫苗,其中含有实施例1提供的疫苗原液200μg/剂以及氢氧化铝佐剂 200μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200208。
实施例10:疫苗免疫小鼠效果
将实施例2~9提供的8组疫苗分别做1:4、1:16、1:64稀释,接种BALB/c小鼠,每组10只,按照0,7天免疫,每只腹腔注射一个剂量,第1次免疫后4周采血,检测中和抗体。中和抗体效价GMT 大于8的视为阳性,视为有保护效果。结果如表2所示。
表2:SARS-CoV-2疫苗免疫BALB/c小鼠的中和效价
结果显示,上述不同有效成分和佐剂含量的SARS-CoV-2疫苗免疫BALB/c小鼠,均能产生足够高的中和抗体效价。佐剂含量高的疫苗免疫原性相对高于含量低的同样有效成份的疫苗。本发明提供疫苗均能诱导BALB/c小鼠产生有保护能力的中和抗体。
实施例11:疫苗免豚鼠效果
将实施例2、5、6、9提供的4组疫苗分别接种豚鼠,每组4只,每只肌肉注射1.0ml(2个剂量),按照0,7天免疫,28天采血的免疫程序,检测血清中和抗体效价。结果如表3所示。
表3:SARS-CoV-2疫苗免疫豚鼠的中和效价
疫苗编号 | 中和抗体效价(GMT) |
20200201 | 128 |
20200204 | 812 |
20200205 | 256 |
20200208 | 3072 |
结果显示,不同批次SARS-CoV-2疫苗免疫豚鼠,能够产生不同水平的中和抗体效价。本发明提供的疫苗均能诱导豚鼠产生良好的中和抗体。
实施例12:细胞因子检测
将编号为20200201、20200202、20200203和20200204的疫苗按照0、7天免疫,28天采血的程序分别免疫BALB/c小鼠,采集细胞上清进行细胞免疫检测。采用细胞内细胞因子染色法和流式细胞法检测血清中特异性表达S蛋白细胞因子的CD4+T细胞,结果如图 2所示。
结果显示,20200201、20200202、20200203和20200204均能诱导机体产生细胞免疫。虽然有效成份含量高的疫苗能产生更高水平的细胞免疫,但是在本发明提供的抗原含量范围内的疫苗均能引起良好的细胞免疫。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京科兴中维生物技术有限公司
<120> 一种针对2019-nCoV的重组蛋白疫苗及其制备方法
<130> RYP2010570.4UC
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 198
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
1 5 10 15
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
20 25 30
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
35 40 45
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
65 70 75 80
Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
85 90 95
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
100 105 110
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
115 120 125
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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210 215 220
Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr
225 230 235 240
Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr
245 250 255
Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr
260 265 270
Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val
275 280 285
Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr
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Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly
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Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
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Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
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<213> SARS-CoV-2
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1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro
1205 1210
Claims (22)
1.SARS-CoV-2重组蛋白疫苗的目的氨基酸序列,其特征在于,如SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4、SEQ5所示的氨基酸序列中的任意一种。
2.SARS-CoV-2重组蛋白疫苗的目的基因序列,其特征在于,编码SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4、SEQ5所示的氨基酸序列的DNA序列中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的目的基因序列,其特征在于,所述目的基因序列是经过密码子优化后的DNA序列。
4.包含权利要求2或3所述目的基因序列的真核细胞表达载体。
5.根据权利要求4所述的真核细胞表达载体,其特征在于,所述真核细胞表达载体为用于人的表达载体。
6.根据权利要求4所述的真核细胞表达载体,其特征在于,所述真核细胞表达载体为pCHO1.0载体。
7.表达权利要求1所述氨基酸序列的细胞,所述细胞中外源转入了权利要求4~6任意一项所述真核细胞表达载体。
8.根据权利要求7所述的细胞,其特征在于,所述细胞为CHO细胞。
9.针对SARS-CoV-2的重组蛋白疫苗,其包含SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4、SEQ5所示的氨基酸序列中的任意一种。
10.根据权利要求9所述的重组蛋白疫苗,其特征在于,所述重组蛋白疫苗中抗原有效成分的含量为20~200 μg/剂。
11.根据权利要求9所述的重组蛋白疫苗,其特征在于,所述疫苗中还含有免疫佐剂。
12.根据权利要求11所述的重组蛋白疫苗,其特征在于,所述免疫佐剂为氢氧化铝佐剂。
13.根据权利要求12所述的重组蛋白疫苗,其特征在于,所述疫苗中含有50~200μg/剂的氢氧化铝佐剂。
14.根据权利要求9~13任意一项所述的重组蛋白疫苗,其特征在于,所述疫苗为液体疫苗。
15.根据权利要求14所述的重组蛋白疫苗,其特征在于,所述疫苗为肌肉内液体注射剂、静脉内液体注射剂、鼻腔内液体注射剂、皮内液体注射剂或皮下液体注射剂。
16.预防冠状病毒的重组蛋白疫苗的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:将权利要求4~6任意一项所述真核细胞表达载体转入细胞中表达,取上清液纯化,得疫苗原液。
17.根据权利要求16所述的制备方法,其特征在于,所述细胞为CHO细胞。
18.根据权利要求16所述的制备方法,其特征在于,所述纯化包括:将所述上清液进行超滤浓缩后,进行分子筛和阴离子交换两步层析,所得层析液经滤膜过滤。
19.根据权利要求16所述的制备方法,其特征在于,所述方法还包括:将所述疫苗原液配制成疫苗。
20.根据权利要求19所述的制备方法,其特征在于,将所述疫苗原液按照20~200 μg/剂的用量配制成疫苗。
21.权利要求1所述氨基酸序列、权利要求2或3所述基因序列、权利要求4~6任意一项所述真核细胞表达载体、权利要求7或8所述细胞、权利要求9~15任意一项所述重组蛋白疫苗或权利要求16~20任意一项所述方法制备而成的重组蛋白疫苗在制备用于预防新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起的疾病的药物中的应用。
22.根据权利要求21所述的应用,其特征在于,所述疾病为新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起的肺炎、严重急性呼吸道感染、肠道疾病、心脏衰竭、肾衰竭或严重急性呼吸道综合征。
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