CN113244296B - 一种药物挥发油组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种药物挥发油组合物及其制备方法和应用,属于药物制剂技术领域。该药物挥发油组合物原料包括以下重量份的组分:苍术挥发油6‑15份、藿香挥发油1‑10份、艾叶挥发油6份、互叶白千层挥发油1‑15份、丁香挥发油2‑6份和肉桂挥发油2‑6份。将上述6种挥发油按照重量配比混合,即可制备得到本发明的药物挥发油组合物,该药物挥发油组合物配伍科学,具有协同增效的功效,具有明显的抑菌、抗病毒和抗炎作用,无明显的毒副反应和药物耐受性,能够为解决抗生素的耐药性问题提供思路。
Description
技术领域
本发明涉及药物制剂技术领域,特别是涉及一种药物挥发油组合物及其制备方法和应用。
背景技术
细菌是所有生物中数量最多的一类,对人类的健康有着极大的影响。据估计,人体内及表皮上的细菌细胞总数约是人体细胞总数的十倍。细菌可以通过各种方式,如接触、消化道、呼吸道、昆虫叮咬等在正常人体间传播疾病,具有较强的传染性,对社会危害极大。目前,最有效的抑菌手段是使用各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物,但使用抗生素带来的最大问题就是其耐药性的问题。
近五年数据显示,欧盟每年有25000人因抗生素耐药死亡,且治疗耐药菌相关疾病的费用高达15亿欧元;2017年美国疾控中心估计每年有200万人感染耐药菌。即使耐药性是一种天然的生物现象,但耐药性增加源于两个主要因素:(1)不正确地使用抗生素或使用无效的方法限制使用抗生素可导致新的耐药性产生;(2)全球旅游、食物、动物、肥料、泥浆及其他副产品贸易可增加耐药性的环境传播。2016年FDA报告应用于食用动物的医学抗生素超过50%。中国科学院数据显示,我国2013年使用的16.2万吨抗生素中,兽用52%,人用48%,一年超过5万吨抗生素排放进入水土环境中,限制抗生素滥用已刻不容缓。
中草药是祖国医学的瑰宝,我国人民有悠久的使用中草药的历史。通常,中草药抑菌具有安全性高、毒副作用小、不易产生抗药性等优点。
病毒是一种非细胞生命形态,它由一个核酸长链和蛋白质外壳构成,病毒增值只在活细胞内进行。病毒所引起的传染性疾病一直严重威胁着人类健康和公共安全,流感、艾滋病、麻疹、风疹、天花流行性腮腺炎、风疹、麻疹、水痘、呼吸道病毒感染、病毒性肝炎、脊髓灰质炎、其他肠道病毒感染、流行性乙型脑炎、流行性出血热等病毒性疾病,严重者可引发大规模死亡。
针对病毒性疾病,目前最有效的方法是疫苗防治,但病毒种属多,血清型多,为疫苗的应用带来一定的困难,且病毒表面抗原能经常不断地发生变异,使本来有效的病毒疫苗很快失效,现在临床一线使用的抗流感药物也出现了各种耐药毒株。而且,这些药物多通过抑制病毒表面受体起到治疗作用,对病毒引起的长期自身免疫性炎症损伤没有明显的治疗作用。
而中药在抗病毒方面具有独特优势,一是部分药物能增强机体免疫功能,阻止病毒进入细胞组织;二是在抗病毒同时,许多药物兼有解热、抗炎等作用,对病毒引起的感染具有多重作用,如缩短发热的时间、控制炎症的扩散、促进炎症的吸收等,即多途径、多方位起作用;三是毒副作用较小,一般很少伤害正常组织细胞。
中药的抗病毒机理包括:(1)直接抗病毒作用,包括对病毒侵入细胞前的杀灭作用、阻止病毒对细胞吸附和穿入的作用、抑制病毒自我复制过程的作用和阻止病毒由感染细胞向未感染细胞的侵染作用。(2)间接抗病毒作用,由于病毒感染机体后,必须寄生在机体细胞才能生存,因此调动机体的免疫防御***发挥抗病毒作用尤为重要,这也正符合中医理论的“正气存内,邪不可干”的基本思想。包括促进免疫器官发育、增加吞噬细胞的吞噬能力、增强自然杀伤细胞的活力、增强机体的体液免疫和细胞免疫。
近些年来,随着药学研究的不断深入与扩大,证实一些中药具有较强的抗病毒活性的有效成分主要包括生物碱、黄酮、有机酸、挥发油、多糖类等。研究发现,包括金丝桃属、缬草属、夏枯草属、石薷香、桑叶、大蒜、蜘蛛香、连翘、鱼腥草、姜黄、广藿香、金银花、苍苓等挥发油对病毒都有明显的抑制和杀灭作用。其机理主要是利用挥发油穿透细胞的特性,利用透入细胞的化学物质在细胞内对胞内病毒进行抑制和清除。
但目前存在的问题是,单味中药挥发油的效果较为单一,如苍术、香薷文献报告多集中于抗病毒活性,茶树油、肉桂、丁香则偏重于抑菌、抗炎活性,而虽然将单味中药挥发油进行复配,理论上会使药物成分更加多元,能够通过多机制发挥功效,但该效果的实现需要建立在科学配伍的基础之上,而目前的复方挥发油组合物由于配伍不合理,使得杀菌、抗病毒、抗炎的综合效果较差。因此,提供一种杀菌、抗病毒、抗炎综合效果优异的药物挥发油组合物显得极为必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种药物挥发油组合物及其制备方法和应用,以解决上述现有技术存在的问题,实现挥发油优异的杀菌、抗病毒、抗炎综合效果。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明的技术方案之一是提供一种药物挥发油组合物,原料包括以下重量份的组分:
苍术挥发油6-15份、藿香挥发油1-10份、艾叶挥发油6份、互叶白千层挥发油1-15份、丁香挥发油2-6份和肉桂挥发油2-6份。
进一步地,原料包括以下重量份的组分:苍术挥发油15份、藿香挥发油10份、艾叶挥发油6份、互叶白千层挥发油1份、丁香挥发油2份和肉桂挥发油2份。
进一步地,原料包括以下重量份的组分:苍术挥发油为6份、藿香挥发油6份、艾叶挥发油6份、互叶白千层挥发油6份、丁香挥发油6份和肉桂挥发油6份。
进一步地,原料包括以下重量份的组分:苍术挥发油为10份、藿香挥发油1份、艾叶挥发油6份、互叶白千层挥发油15份、丁香挥发油2份和肉桂挥发油2份。
苍术:为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea(Thunb.)DC.或北苍术Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的干燥根茎。主要分布于我国东北、华北、安徽、江苏、河南、陕西、湖北等地,为我国传统药材,药用资源十分丰富。苍术始载于《神农本草经》,列为上品。性温,味苦,辛烈,入脾、胃经,具祛风除湿,健脾明目等功效。现代研究表明,苍术的药用成分主要是挥发油类,挥发油中主要成分为苍术素、β-桉叶醇、苍术酮、茅术醇等,具有重要的药理作用。药理学研究表明苍术具有保肝、抗菌抗病毒、抗炎、抗肿瘤及保护消化***、神经***、心血管***等作用。北苍术75%乙醇提取物能显著抑制角叉菜胶致小鼠足肿胀,对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的增加有明显抑制作用,显示出良好的抗炎活性。苍术醇提物能显著抑制肉豆蔻酸佛波酯加钙离子载体诱导的人肥大细胞中TNF、IL-6、IL-8等炎性细胞因子的表达以及NF-κB的活性,进而减缓肥大细胞介导的炎症反应。体外抑菌试验表明苍术萃取提取液对15种真菌具有不同的抑制活性,对铜绿假单胞菌R质粒具有消除作用,可作为一种安全的质粒消除剂。苍术酮对H3N2、H5N1流感病毒和乙型流感病毒均有抑制作用,而苍术素及苍术水提液则未显示出抗病毒活性。
藿香:为唇形科植物广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.的干燥地上部分,始载于东杨孚的《异物志》。原产于东南亚地区,我国引种栽培历史悠久,可追溯到梁代或以前,现主要分布于海南和广东两省。广藿香具有芳香化浊、开胃止呕、发表解暑之功,常用于治疗湿浊中阻、寒湿闭暑、脘痞呕吐、腹痛吐泻、鼻渊头痛等疾病。广藿香中目前已发现了90多个化合物,包括黄酮类、萜类(倍半萜、二萜、三萜)、苯丙素、甾体、生物碱等多种类型。广藿香挥发油被认为是广藿香的主要药用成分,有抗病原微生物、杀虫、抗炎、镇痛、解热及免疫调节等生物活性。主要成分为广藿香醇、广藿香酮、刺蕊草烯、α-愈创木烯、δ-愈创木烯、α-广藿香烯、β-广藿香烯等。广藿香叶挥发油能降低炎症组织和血清中***素E2和NO的含量,并能减少血液中脂质过氧化产物丙二醛的堆积,缩短炎症过程;广藿香油能够抑制以血管扩张、组织液渗出、水肿为主的急性炎症及以组织增生为主的慢性炎症症状。大量试验研究表明,广藿香对羊毛状小孢子菌、白色念珠菌、石膏样小孢子菌、申克孢子丝菌、新型隐球菌等多种真菌有明显的抑制作用,对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、绿脓杆菌、肠炎球菌、产气杆菌均有抑制作用。广藿香醇体外抗病毒实验显示,其能抑制流感病毒、腺病毒和柯萨奇病毒所致的细胞病变,结果表明,广藿香醇具有抑制这3种呼吸道病毒增殖的作用。
艾叶:为菊科蒿属艾Artemisia argyi Levi.Et Vant.的干燥叶,在我国分布广泛,有着悠久的应用历史。其味辛、苦,性温;有小毒;归肝、脾、肾经,中医临床上主要用于治疗少腹冷痛、寒凝经脉、宫冷***、胎动不安、吐血、衄血、脓血痢,外治皮肤瘙痒等病证。现代研究表明,其具有多种药理活性,包括抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等作用。艾叶化学成分主要包括挥发油、黄酮类、鞣质类和多糖等,其中挥发油类是从艾叶提取物中分离得到的主要活性部位。挥发油的化学成分目前已鉴定出180种化合物,其中90余种为常见活性成分,主要为醚类、醇类、倍半萜类、酯类、单萜类、酮类和芳香族化合物,具有广谱抗菌性、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、镇痛、平喘、免疫调节等功能。研究发现艾叶挥发油能减轻二甲苯所致的小鼠耳肿胀,大鼠足肿胀率,抑制毛细血管通透性增加。其抗炎机理可能与剂量依赖性抑制炎症介质,如一氧化氮(NO),***素(PGE)2,活性氧(ROS);同时抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子,如肿瘤坏死因子(TNF),白细胞介素(IL-6,IL-10),干扰素(IFN)-β,单核细胞趋化蛋白(MCP-1)的产生,抑制STAT1中的酪氨酸酶(TYR)701,STAT3中的TYR705和上游JAK2的磷酸化,且不影响JAK,STAT蛋白总水平等作用相关。艾叶挥发油可与受试菌细胞表面结合,破坏细胞壁结构从而起到抑菌作用,研究发现艾叶挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、大肠埃希菌、变形杆菌、肠炎沙门菌、酵母菌、黑曲霉菌和链球菌均显示出良好的抑菌作用。用水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油的抑菌效果明显高于超临界CO2提取法。据报道,艾叶挥发油对呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(IFV)以及乙肝病毒(HBV)亦有较好的抑制作用。
互叶白千层:为桃金娘科白千层属互叶白千层Melaleuca alternifolia(Maiden&Betche)Cheel的枝叶,原产于澳大利亚的新南威尔士州和新西兰的部分地区。20世纪90年代,我国广东、广西、海南、福建、云南等地成功引种并形成了一定的种植规模,广西的钦州、邕宁等地均有种植加工基地,资源十分丰富。目前,对互叶白千层化学成分的研究大多集中在其挥发性的精油成分,互叶白千层精油又称为茶树油,枝叶、花及果实中精油主成分相近,主要有松油烯-4-醇、1,8-桉叶素、γ-松油烯、α-松油烯、异松油烯等。互叶白千层油具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等诸多药理活性。茶树油有良好的抗菌作用,具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点,对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌等均有显著的抗菌作用。其机制在于茶树油破坏了细菌的细胞膜,导致细胞内电子密度物质损失,从而改变细胞形态。互叶白千层油还具有抗流感病毒作用,其抗病毒机制可能与其可阻止病毒进入宿主细胞有关。互叶白千层油可通过干扰病毒脱壳,起到抑制流感病毒A/PR/8亚型H1N1的作用,其主成分松油烯-4-醇、异松油烯、α-松油烯发挥了重要作用。茶树油在体外实验中显示出良好的抗炎活性,通过抑制过氧化物生成和调控细胞因子TNF-α、IL-1β、PEG2等的分泌而起到抗炎作用;进一步深入研究发现,茶树油及其主要成分松油烯-4-醇在NF-κB、p38和ERK/MAPK通路中抑制了细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10的分泌,从而对细胞产生有效的保护作用。
丁香:为桃金娘科蒲桃属植物丁香Ewgewia caryophyllata Thunb.的干燥花蕾,丁香入药最早见于南朝齐梁陶弘景的《名医别录》,书中称之为鸡舌香。味辛、性温,归脾、胃、肺、肾经,具有温中降逆,补肾助阳的功效。丁香原产于马来群岛及非洲,近代以来广西、广东、海南等地均有栽培。丁香挥发油是丁香的主要化学成分,具有抗菌、消炎、镇痛以及对消化***的保护作用。丁香挥发油成分已有报道的有320余种,主要包括丁香酚、乙酸丁香酚酯、β-石竹烯、α-蒎烯、乙酰基丁香酚、α-萜品烯、α-石竹烯等,其生物活性包括抗菌、抗真菌、抗炎及耐药性。丁香挥发油对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、青霉菌、黑曲霉菌、汉逊氏酵母菌等均有较强的抗菌功效,对急性菌痢、肠炎、上呼吸道感染、咽喉肿痛以及急慢性扁桃体炎等细菌感染性疾病有较好疗效。有研究表明,丁香挥发油及丁香酚对8种幽门螺杆菌有抑制效果,而丁香提取挥发油后的水提取物则无抑菌作用。
肉桂:肉桂为樟科樟属植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥树皮,始载于《神农本草经》,列为上品。肉桂原产于斯里兰卡,主要分布于东南亚等热带及亚热带地区。在我国主产于广东省、广西壮族自治区、海南省、云南省等地。性辛、甘、大热,归肾、脾、心、肝经,具有补火助阳、引火归元、散寒止痛、温通经脉之功效。现代药理学研究表明,肉桂具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗癌、降血糖等生物活性。肉桂含肉桂醛等挥发性成分以及多糖、二萜、多酚、黄酮等非挥发性成分。在肉桂挥发性成分中,肉桂醛含量可达70%以上,此外,还含有乙酸肉桂酯、香豆素、苯甲醛等含量相对较多的物质。研究表明,肉桂的乙醇提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、青霉菌、啤酒酵母均有较强的抑制作用,可能是通过增强耐药性菌株对抗生素的敏感性而起到抗菌作用。肉桂挥发油能够降低角叉菜胶诱导的小鼠足跖皮肤组织中的细胞因子TNF-α、IL-1、NO、PGE2的水平,以及COX-2和iNOS的表达。肉桂醛及其衍生物均有类似的抗炎活性,主要通过抑制NO的生成而发挥抗炎作用。
苍术挥发油的制备方法为:
取苍术药材适量,粉碎,过二号筛,加6倍量水,浸泡1h,按照2015版《中国药典》四部2204挥发油测定法项下的甲法提取4h,得苍术挥发油。
丁香挥发油的制备方法为:
取丁香药材适量,粉碎过二号筛,加20倍量水,浸泡1h,水蒸气蒸馏提取6h,采用***从收集液中萃取出丁香油,用无水硫酸钠干燥后,常温挥去***,获得丁香挥发油。
互叶白千层挥发油(茶树油)的制备方法为:
将互叶白千层枝叶用剪刀剪成长约40~60mm,在室温条件下将其表面的水分自然蒸干至恒重。运用《中国药典》附录2204中挥发油测定法甲法进行水蒸气蒸馏提取6h,向得到的挥发油中加入无水硫酸镁,以除去全部的水分,得到互叶白千层挥发油(茶树油)。
茶树油的最佳工艺为料液比1:20,浸泡6h,提取6h。
艾叶挥发油的制备方法为:
将艾叶药材粉碎过二号筛,后用挥发油提取器按2015年版《中国药典》四部2204挥发油测定法项下甲法操作提取挥发油,经无水硫酸钠干燥后得到有特殊浓香气味的艾叶挥发油。
肉桂挥发油的制备方法为:
肉桂药材粉碎过二号筛,浸泡1h,加6倍量水,水蒸气蒸馏提取5h,得肉桂挥发油。
藿香挥发油的制备方法为:
称取干燥的广藿香地上部分,粉碎过60目筛,经水蒸气蒸馏法提取粗挥发油,粗挥发油经***萃取3次,萃取液用无水硫酸钠干燥,常温挥去***,得具有芳香气味的黄色藿香挥发油。
本发明的技术方案之二是提供一种上述药物挥发油组合物的制备方法,包括以下步骤:
将原料按照重量配比混合,即得所述药物挥发油组合物。
本发明的技术方案之三是提供一种药物制剂,包含有效量的上述药物组合物。
本发明所述“有效量”是指根据本发明的试剂的以下量,其需要显示出可测量的治疗或预防效果。
进一步地,包括药学上可接受的载体。
所述载体为稀释剂、润滑剂、缓冲剂、崩解剂、矫味剂、表面活性剂或粘合剂中的一种或多种。
可以广泛使用本领域公知的各种载体。例如稀释剂与吸收剂,如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等;湿润剂与粘合剂,如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、***胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等;崩解剂,例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等;崩解抑制剂,例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等;吸收促进剂,例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等;润滑剂,例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。其它载体如聚丙烯酸树脂类、脂质体,水溶性载体如PEG4000和PEG6000、PVP等。
也可以向组合物中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
进一步地,所述药物制剂的剂型包括胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉剂、混悬剂、乳剂、栓剂、软膏、霜剂、缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及微粒。
本发明的药物组合物或药物制剂可以非肠道、透皮、鼻内或直肠内施用。
对于局部施用,可以将本发明的化合物制备成软膏和霜剂的形式。
本发明的技术方案之三是提供上述药物挥发油组合物或上述药物制剂在抑菌、消毒、抗炎方面的应用。
本发明的药物挥发油组合物和药物制剂还可用于空气、物体和人体表面的消毒等。
本发明公开了以下技术效果:
本发明首先采用水蒸气蒸馏法提取苍术挥发油、藿香挥发油、艾叶挥发油、互叶白千层挥发油、丁香挥发油和肉桂挥发油,然后将上述6种挥发油按照一定比例混合,制备得到本发明的药物挥发油组合物,该药物挥发油组合物的制备方法简单,且配伍科学,组分间具有协同增效的功效,具有明显的抑菌、抗病毒和抗炎作用,无明显的毒副反应和药物耐受性,能够为解决抗生素的耐药性问题提供思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为受试物A1抑制流感病毒产生的CPE;
图2为受试物A2抑制流感病毒产生的CPE;
图3为受试物A3抑制流感病毒产生的CPE。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
本发明中所述的“份”如无特别说明,均按重量份计。
若非特别说明,以下采用的药材均满足《中华人民共和国药典》2010年版第1部的规定,各种试剂、药用辅料均为市售品,符合相关的国家标准。
一、本发明实施例的实验材料
1.本发明实施例所用中草药如下:
苍术:产地:内蒙古;生产批号:1806001;生产日期:2018年6月29日生产;生产企业:安国市昌达中药材饮片有限公司;
藿香:产地:广东;生产批号:1906001;生产日期:2019年6月15日生产;生产企业:安国市昌达中药材饮片有限公司;
艾叶:产地:河北;生产批号:1907001;生产日期:2019年7月17日生产;生产企业:安国市昌达中药材饮片有限公司;
互叶白千层:产地:广西;2019年2月采集于广西北流大里镇;
丁香:产地:四川;生产批号:1804001;生产日期:2018年4月26日;生产企业:安国市昌达中药材饮片有限公司;
肉桂:产地:广西;生产批号:1801001;生产日期:2018年1月6日;生产企业:安国市昌达中药材饮片有限公司。
2、本发明所用实验动物:
品种:小鼠;品系:ICR
级别:SPF级(Specefic Pathogen Free,无特定病原体)
来源:购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证编号:SCXK(京)2016-0006,合格证号:110011201108760783。
性别:雌性;体重:20-22g
3、动物房:
试验期间动物饲养于中国中医科学院中药研究所动物房,实验设施许可证SYXK(京)2019-0003。
设施管理遵循中华人民共和国国家标准GB 14925-2010《实验动物环境及设施》。
4、喂养条件:
采用人工光照12小时明暗周期,环境温度维持在20-26℃,湿度在40%-70%,每小时换气次数≥15次。动物饲养于聚碳酸酯小鼠饲养笼,每笼饲养同剂量组的5只同性别小鼠。每2天更换一次清洁动物笼和垫料。
5、饲料及其提供单位:
使用SPF大小鼠维持饲料,由北京市科澳协力饲料有限公司提供,饲料生产企业审查合格证号:京饲证(2014)06054,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2019-0003。
6、饮用水:纯净水,动物可自由摄取,每周3次更换水瓶和饮用水。
7、菌株、病毒株和细胞:
(1)细菌:
大肠杆菌8099。以上菌种代数为第4代。取菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物(18-24h),用5mL 0.03mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗下菌苔,使菌悬浮均匀后用PBS稀释至所需浓度。
沙门菌,临床分离株104。从﹣80℃冰箱中取出冷冻保存的沙门菌株,将其接种至TSB肉汤培养基中,置于37℃摇床中增菌培养16~18h。第二天用无菌接种环蘸取增菌后的沙门菌在选择性培养基XLT4平板上进行三区划线。沙门菌在XLT4培养基的菌落形态为中间黑色、周围带有透明晕环,挑单克隆在XLT4培养基上划线纯化3~4代。
多重耐药沙门菌:临床分离株169。其培养和纯化方法同上。
(2)病毒株:
H1N1 Influenza(A/Weiss/43),购于中国典型培养物保藏中心;
H1N1 Influenza(A/Virginia/ATCC2/2009),购于美国ATCC。
(3)细胞:
犬肾上皮细胞(MDCK),购于中科院上海细胞库。MDCK细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液常规培养至30代以上。
二、各组分挥发油的提取工艺
1.苍术油:
取苍术药材10kg,粉碎,过二号筛,加6倍量水,浸泡1h,按照2015版《中国药典》四部2204挥发油测定法项下的甲法提取4h,得苍术挥发油55mL。
2.丁香油:
取丁香药材1kg,粉碎过二号筛,加20倍量水,浸泡1h,水蒸气蒸馏提取6h,采用***从收集液中萃取出丁香油,用无水硫酸钠干燥后,常温挥去***,获得丁香挥发油100mL。
3.茶树油:
广西横县茶树枝叶2kg用剪刀剪成长约40~60mm,在室温条件下将其表面的水分自然蒸干至恒重。加20倍量水,浸泡6h,运用《中国药典》附录2204中挥发油测定法甲法进行水蒸气蒸馏提取挥发油,向得到的茶树油中加入无水硫酸镁,以除去全部的水分,得茶树油46mL。
4.艾叶油:
将艾叶药材5kg,粉碎过二号筛,后用挥发油提取器按2015年版《中国药典》四部2204挥发油测定法项下甲法操作提取挥发油,经无水硫酸钠干燥后得到有特殊浓香气味的挥发油55mL。
5.肉桂油:
肉桂药材1kg粉碎过二号筛,浸泡1h,加6倍量水,水蒸气蒸馏提取5h,得挥发油31mL。
6.广藿香油:
称取广藿香4kg药材,粉碎过二号筛,经水蒸气蒸馏法提取粗挥发油,粗挥发油经***萃取3次,萃取液用无水硫酸钠干燥,常温挥去***,得具有芳香气味的黄色挥发油40mL。
三、本发明挥发油组合物及各挥发油组分
实施例1
取苍术挥发油15mL、藿香挥发油10mL、艾叶挥发油6mL、互叶白千层挥发油(茶树油)1mL、丁香挥发油2mL和肉桂挥发油2mL,将上述6种挥发油提取物充分混匀,制成36mL挥发油混合液,备用,作为实验部分的受试物A1。
实施例2
取苍术挥发油6mL、藿香挥发油6mL、艾叶挥发油6mL、白千层挥发油(茶树油)6mL、丁香挥发油6mL和肉桂挥发油6mL,将上述6种挥发油提取物充分混匀,制成36mL挥发油混合液,备用,作为实验部分的受试物A2。
实施例3
取苍术挥发油10mL、藿香挥发油1mL、艾叶挥发油6mL、互叶白千层挥发油(茶树油)15mL、丁香挥发油2mL和肉桂挥发油2mL,将上述6种挥发油提取物充分混匀,制成36mL挥发油混合液,备用,作为实验部分的受试物A3。
实施例4
苍术挥发油原液,备用,作为实验部分的受试物A4。
实施例5
藿香挥发油原液,备用,作为实验部分的受试物A5。
实施例6
艾叶挥发油原液,备用,作为实验部分的受试物A6。
实施例7
白千层挥发油(茶树油)原液,备用,作为实验部分的受试物A7。
实施例8
丁香挥发油原液,备用,作为实验部分的受试物A8。
实施例9
肉桂挥发油原液,备用,作为实验部分的受试物A9。
四、本发明的药物组合物和组合物中的各挥发油组分对沙门菌的抑菌作用
A.实验方法
1.最小抑菌浓度(MIC)
采用CLSI推荐的微量肉汤稀释法测定沙门菌分离株对抗菌药物的敏感性。
复苏后的沙门菌104、169接种于MH肉汤中进行增菌,培养10h时开始试验,用MH肉汤稀释到5×105CFU/mL。抗菌药物用MH肉汤稀释至待测浓度。按1:1加入菌液和药物工作液,设置阳性(含相同菌落数的MH肉汤)、阴性对照(无菌MH肉汤)。为保证实验准确性,抗菌药物浓度均由高到低进行添加,以大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株,每种药物3个平行。用手快速轻轻的晃动,以确保充分混匀,37℃培养16~18h。
如果混合液呈浑浊状则有细菌生长,反之则没有。判定时先进行质控菌的判定,质控菌在推荐的范围之内再判定沙门菌分离株的判定。以每种药物无细菌生长的最小浓度作为沙门菌分离株对该抗菌药物的最小抑菌浓度。具体判定标准见表1。
表1抗菌药物母液浓度和判定标准
2.抑菌率
受试物对致病菌的抑菌率试验采用平板计数方法。将沙门菌(104)单菌落接种于MH肉汤中进行增菌,培养10h开始试验,试验前用MH肉汤将沙门菌液稀释至每管5×105CFU/mL。分别将挥发油受试物加至每管菌液中,将离心管放置于37℃摇床中震荡培养,选取震荡培养的0h、2h、6h时间点将每管菌液稀释至10-3、10-4。分别取上述10μL菌液均匀涂布于TSA平板上,设置阳性对照(含相同菌落数的MH肉汤)、阴性对照(无菌MH肉汤),每种药物2个平行。将平板置于37℃培养箱中培养24h后结果计数,2个平行板的细菌平均值作为该药物该时间点的菌落数,与阳性板菌落数比较计算每种挥发油的抑(杀)菌率。
抑(杀)菌率(%)=(阳性板菌落数-给药组菌落数)/阳性板菌落数×100%
B、实验结果
1.最小抑菌浓度(MIC)
1.1对沙门菌临床分离株104的最小抑菌浓度
试验结果表明,质控菌25922在控,庆大霉素MIC为0.5ug/mL,庆大霉素对104沙门菌的MIC为1ug/mL,以上结果均符合CLSI的判定标准(见表1),结果见表2。苍术、藿香、艾叶、互叶白千层、丁香和肉桂挥发油对沙门菌的抑菌效果:丁香、肉桂>藿香、茶树油,50%浓度的丁香、肉桂与100%浓度的藿香、茶树油抑菌效果相当,而苍术和艾叶未见对沙门菌的抑制作用。藿香、茶树油在A1、A2、A3中的占比分别为30.6%、33.3%和44.4%,按不同比例配比的3种中药挥发油复方A1、A2、A3在低于上述两种挥发油单用的浓度(100%),即可发挥同等的抑菌作用。丁香、肉桂在A2中的占比为33.3%,同样在较低的浓度即有抑菌作用,且在更低的受试物浓度(25%)时,A2仍具有显著的抑菌效果,显示出一定的协同增效作用,结果见表3。
表2庆大霉素对沙门菌104的最小抑菌浓度
注:()内为庆大霉素的浓度。
表3 A1-A9对沙门菌104的最小抑菌浓度试验(%)
注:“-”为阴性,未见菌落;“+”为阳性,有细菌生长。
1.2对多重耐药沙门菌临床分离株169的最小抑菌浓度
试验结果表明,质控菌25922在控,庆大霉素MIC为0.5ug/mL,符合CLSI的判定标准;庆大霉素对沙门菌169在64ug/mL仍无效,依据CLSI判定标准,表现为耐药,结果见表4。苍术、藿香、艾叶、互叶白千层、丁香和肉桂挥发油对沙门菌的抑菌效果:丁香、肉桂、藿香、茶树油对多重耐药沙门菌169有效,而苍术和艾叶未见抑制作用。上述有效的4种中药挥发油在A1、A2、A3中的占比分别为41.7%、66.7%和55.5%,中药挥发油复方A2在低于上述4种挥发油单用的浓度(100%),即可发挥同等的抑菌作用,结果见表5。
表4庆大霉素对沙门菌169的最小抑菌浓度
表5 A1-A9对沙门菌169的最小抑菌浓度试验(%)
2.抑菌率
对有抑菌作用的藿香、互叶白千层、丁香、肉桂挥发油和按不同比例配比的3种中药挥发油复方A1、A2、A3进行进一步的抑菌试验。结果表明,对沙门菌的抑菌效果丁香、肉桂>茶树油>藿香,在相同作用时间点(0h)、相同菌液浓度(10-3稀释)的条件下,丁香、肉桂的抑菌率为100%,茶树油为88.5%;而藿香在作用6h,菌液浓度低于上述菌液浓度10倍(10-4稀释)的条件下,其抑菌率为80.0%,该结果和MIC的试验结果基本一致。按占比计算,A2、A3在低于上述挥发油单用的浓度,即可发挥同等的抑(杀)菌作用,A1、A2、A3的抑(杀)菌起效时间远远短于藿香的起效时间(6h),体现了快速杀菌的效果。结果见表6。
表6受试物对沙门菌的抑菌率试验(%)
五、本发明的药物组合物对大肠杆菌的杀菌作用
A.试验方法
1.中和剂鉴定试验
以含0.5%卵磷脂,0.25%甘氨酸,0.1%硫代硫酸钠,1%吐温80的PBS溶液为中和剂,以样品A1、A2、A3为原液,依据GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录C3中C3.1中和剂鉴定试验进行试验,试验菌为大肠杆菌。试验分组为:(1)染菌样片+5mL PBS,(2)染菌样片+5mL中和剂,(3)染菌对照片+5mL中和剂,(4)样片+5mL中和剂+染菌对照片,(5)染菌对照片+5mL PBS,(6)(7)(8)分别为同批次PBS、中和剂和培养基。样品A1、A2、A3原液,分别作用1min。试验重复3次。3次重复试验证明,A1、A2、A3第1组平均生长菌落数分别为72、0、0CFU/片,第2组平均生长菌落数分别为1.6×103、21、15CFU/片,第3、4、5组平均生长菌落数相近,三组间误差率分别为3.33%、3.14%和4.86%,第6、7、8组均无菌生长。结果见表7-9。3次重复试验表明,中和剂鉴定试验符合要求,可继续进行下一步的抑菌试验。
表7 A1中和剂鉴定试验结果
注:阴性对照无菌生长。
表8 A2中和剂鉴定试验结果
注:阴性对照无菌生长。
表9 A3中和剂鉴定试验结果
注:阴性对照无菌生长。
B、抑菌实验
选择沙门菌抑菌实验中效果更好的3种中药挥发油复方样品A1、A2、A3进行如下试验。将试验菌24h斜面培养物用PBS洗下,制成菌悬液。取被试样片(2×3cm)和对照样片各4片,分成4组置于4个灭菌培养皿内。取上述菌悬液,分别在每个被试样片和对照样片上滴加100uL,均匀涂布,开始计时,作用2、5、10、20min,用无菌镊分别将样片投入含5mL中和剂的试管内,充分混匀,做适当稀释,然后取其中2-3个稀释度,分别吸取0.5mL,置于两个平皿,用预先放置至40-45℃的营养琼脂培养基15mL做倾注,转动平皿,使其充分均匀,琼脂凝固后翻转平板,35℃±2℃培养48h,做活菌菌落计数。试验重复3次,按下列公式计算杀菌率%。
杀菌率%=(对照样品平均菌落数-被试样品平均菌落数)/对照样品平均菌落数×100%
C、实验结果
经3次重复试验证明,A1、A2、A3样品原液,作用2min,对大肠杆菌的平均杀菌率分别为97.45%、>99.99%、>99.99%,作用5min,对大肠杆菌的平均杀菌率分别为98.86%、>99.99%、>99.99%,作用10min,对大肠杆菌的平均杀菌率分别为99.93%、>99.99%、>99.99%,作用20min,对大肠杆菌的平均杀菌率均>99.99%。结果见表10。
表10本发明的药物组合物对大肠杆菌的杀菌试验结果
六、本发明的药物组合物对流感病毒的抗病毒作用
A、试验方法
1)细胞毒性测定
将1×105个/mL的MDCK细胞悬液接种到96孔板中,每孔100μL,在细胞培养箱中培养24h;用细胞维持液对用DMSO配制的50%浓度的A1、A2、A3(以下简称母液)进行倍比稀释,浓度为1.0000%、0.5000%、0.2500%、0.1250%、0.0625%、0.0313%、0.0156%、0.0078%和0.0039%,同时设置空白对照组;将96孔板中的培养基去掉,用无菌PBS洗三次,最后一次清洗时去掉多余的PBS,再分别加入不同浓度的A1、A2、A3,每孔200μL,每个浓度6个副孔;空白对照组每孔加入200μL细胞维持液,继续培养72h;每日观察细胞状态,72h后,在避光条件下每孔加入20μL的MTT溶液,在培养箱中继续孵育2~4h后,轻轻吸出培养液,每孔加150μL的DMSO,在摇床上混匀10min后在490nm波长下测定吸光度值;计算细胞存活率%。进一步通过SPSS计算受试物的半数中毒浓度(CC50)。
细胞存活率=(A1、A2、A3给药组OD490 nm/正常组OD490 nm)×100%
2)受试物抗流感病毒活性的测定
将1×105个/mL的细胞悬液接种到96孔板中,每孔100μL,在细胞培养箱中培养24h;将96孔板从培养箱中拿出,去掉培养板内的培养基,用配制好的PBS清洗细胞,每孔加入100μL的100TCID50病毒液感染,正常对照组加入不含病毒的病毒吸附液,最后将96孔板置于培养箱中孵育2h;用病毒维持液将受试物的母液进行倍比稀释,浓度为0.1250%、0.0625%、0.0313%、0.0156%、0.0078%、0.0039%、0.0020%和0.0010%;吸附完成后,去掉培养板中的病毒吸附液,PBS洗两次,每孔加200μL的含有不同浓度的A1、A2、A3的稀释液,病毒组和正常对照组加入200μL的病毒维持液,每组6个复孔,每日观察病变状态,继续培养72h;72h后,在避光条件下每孔加入20μL的MTT溶液,在培养箱中孵育2~4h后,去掉培养液,每孔加150μL的DMSO,测定490nm下的OD值;计算病毒抑制率%。进一步通过SPSS计算受试物的半数有效浓度(EC50)和治疗指数。
病毒的抑制率=(A1、A2、A3给药组OD490 nm-病毒组OD490 nm)/(正常组OD490nm-病毒组OD490 nm)×100%
治疗指数SI=CC50/EC50
3)受试物对流感病毒灭活相关实验(TCID50)
在96孔板中接种MDCK细胞,每孔1×104个,在细胞培养箱中培养24h;将10μL的母液与90μL的无血清培养基混匀(受试品稀释度为20倍),吸取稀释后的受试品50μL与等体积的病毒液混匀,室温放置10min,对照为无血清培养基与病毒液混匀,室温放置10min;用病毒吸附液对上述反应后的液体进行稀释,10-1、10-2、10-3、10-4……10-8,共8个浓度梯度;从细胞培养箱中取出96孔板,在超净工作台中去掉板内的培养基,用PBS清洗细胞,100μL/孔洗三次,然后将稀释好的病毒液加到96孔板中,每个稀释度加6个孔、每孔100μL,正常对照组每孔加100μL的病毒吸附液,将96孔板放在37℃的培养箱中吸附2h;2h后,去掉病毒吸附液,PBS洗三次,在96孔板内加入病毒维持液,每孔200μL,继续培养72h,观察病变程度,以病变程度大于50%作为病变孔,病变程度低于50%为非病变孔,根据Reed-Muench公式计算病毒TCID50。通过计算受试品组A1、A2、A3与对照组的TCID50的差异,来检测受试品对流感病毒活性的影响。
B、实验结果
受试物A1、A2、A3对流感病毒Weiss株均有一定的抗病毒活性,其中A1的抗病毒效果优于阳性药利巴韦林,治疗指数为22.21,其同时对奥司他韦耐药株也有一定的抗病毒作用,治疗指数为3.46。受试物稀释20倍,在室温与病毒作用10min,A1可使病毒H1N1Influenza(A/Weiss/43)滴度下降两个梯度,A1作用后病毒TCID50为10-5/100μL,而病毒对照的TCID50为10-7/100μL。结果见表11和图1-3,其中图1-3中照片的显微镜放大倍数为200倍(20×10)。
图1为受试物A1抑制流感病毒产生的CPE;
图2为受试物A2抑制流感病毒产生的CPE;
图3为受试物A3抑制流感病毒产生的CPE。
表11本发明的药物组合物对流感病毒的抗病毒作用
七、本发明的药物组合物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀作用的研究
试验方法
ICR小鼠,雌性。以人用脱毛膏对小鼠背部皮肤脱毛,脱毛面积为2×3cm,脱毛时间约为每只1分钟,之后用温水擦拭,充分暴露皮肤。于脱毛后第二天,按体重随机分组,分为正常对照组,模型组,阳性药丁酸氢化可的松乳膏,A1、A2、A3组,共6组,每组9-10只。各组按照相应剂量1次/日经皮给予受试物,A1、A2、A3组背部皮肤涂抹用甘油配制的50%浓度的A1、A2、A3约0.2mL,给药面积均约为2×3cm;阳性药组背部皮肤涂抹等面积的丁酸氢化可的松乳膏约50mg,正常对照组及模型组涂抹等面积的甘油,约0.2mL/只,连续给药6d。
末次给药后60min,除正常对照组外,其余各组小鼠右耳双面均涂抹20uL二甲苯以造成小鼠耳廓肿胀,正常对照组小鼠右耳耳廓涂抹等体积生理盐水。于涂抹二甲苯(正常对照组涂抹生理盐水)后1h,所有动物脱颈椎处死。沿耳廓基线剪下双耳,并采用直径为6mm的不锈钢打孔器,在双耳对称处打取耳片并称重,按下列公式计算计算肿胀度和各组小鼠耳肿胀抑制率。
肿胀度(g)=右耳重量-左耳重量。
肿胀度抑制率(%)=(肿胀度模型组-肿胀度药物组)/肿胀度模型组×100%
统计分析
各组试验数据均以均数±标准差表示,用student's TTEST进行正常对照组与模型组,模型组与各给药组的组间比较,均以P<0.05作为有统计学显著性差异的标准。
试验结果
A1、A2、A3组对二甲苯导致的小鼠耳廓肿胀均有一定程度的抑制作用,抑制率分别为54.0%、19.0%和20.0%,其中,A1组小鼠耳肿胀度与模型组比较有统计学显著性差异(P<0.05),能明显降低耳肿胀度。阳性药组对二甲苯所致耳肿胀亦有明显的减轻作用,抑制率为52.1%(P<0.05)。结果见表12。
注:与正常对照组比较###P<0.001;与模型组比较*P<0.05。
由上述实验可以看出,本发明的药物组合物对沙门菌的不耐药临床分离株、耐药临床分离株、大肠杆菌杀菌作用的研究结果显示,本发明的药物组合物有明确的杀菌作用,3种药物组合相比而言,杀菌效果A2优于A1和A3,对耐药株有效,且优于单一使用的挥发油。
对有良好抑菌效果的3种药物组合进行的进一步的抗流感病毒活性试验表明,3种药物组合相比而言,A1的抗病毒效果优于A2和A3,且优于阳性药利巴韦林,能明显降低流感病毒H1N1 Influenza(A/Weiss/43)的滴度,同时对奥司他韦耐药株也有一定的抗病毒作用。
进一步的抗炎试验表明,本发明的药物组合物预防性给药6天,对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀有明显的抑制作用,3种药物组合相比而言,A1的抗炎作用与阳性药丁酸氢化可的松乳膏相当,优于A2和A3,提示本发明的药物组合物能明显抑制急性炎症引起的肿胀。
实验结果提示,本发明的药物组合物具有明显的杀菌、抗病毒、抗炎作用,起效浓度低、时间快,效果优于单一使用的挥发油,且无明显的毒副反应。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (2)
1.一种药物挥发油组合物,其特征在于,原料由以下重量份的组分组成:
苍术挥发油15份、藿香挥发油10份、艾叶挥发油6份、互叶白千层挥发油1份、丁香挥发油2份和肉桂挥发油2份;
所述苍术挥发油的制备方法为:取苍术药材粉碎,过二号筛,加6倍量水,浸泡1h,按照2015版《中国药典》四部2204挥发油测定法项下的甲法提取4h,得苍术挥发油;
所述丁香挥发油的制备方法为:取丁香药材粉碎过二号筛,加20倍量水,浸泡1h,水蒸气蒸馏提取6h,采用***从收集液中萃取出丁香油,用无水硫酸钠干燥后,常温挥去***,获得丁香挥发油;
所述互叶白千层挥发油的制备方法为:将互叶白千层枝叶用剪刀剪成长约40~60mm,在室温条件下将其表面的水分自然蒸干至恒重,运用《中国药典》附录2204中挥发油测定法甲法进行水蒸气蒸馏提取6h,向得到的挥发油中加入无水硫酸镁,以除去全部的水分,得到互叶白千层挥发油;
所述艾叶挥发油的制备方法为:将艾叶药材粉碎过二号筛,后用挥发油提取器按2015年版《中国药典》四部2204挥发油测定法项下甲法操作提取挥发油,经无水硫酸钠干燥后得到艾叶挥发油;
所述肉桂挥发油的制备方法为:肉桂药材粉碎过二号筛,浸泡1h,加6倍量水,水蒸气蒸馏提取5h,得肉桂挥发油;
所述藿香挥发油的制备方法为:称取干燥的广藿香地上部分,粉碎过60目筛,经水蒸气蒸馏法提取粗挥发油,粗挥发油经***萃取3次,萃取液用无水硫酸钠干燥,常温挥去***,得藿香挥发油;
所述药物挥发油组合物的制备方法包括以下步骤:
将原料按照重量配比混合,即得所述药物挥发油组合物;
所述药物挥发油组合物用于抑菌、消毒或抗炎。
2.一种药物制剂,其特征在于,包含有效量的权利要求1所述的药物组合物;所述药物制剂用于抑菌、消毒或抗炎,包括药学上可接受的载体;
所述药物制剂的剂型包括胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉剂、混悬剂、乳剂、栓剂、软膏及霜剂。
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