CN113244174B - 一种负载黑色素瘤化疗药物的纳米脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种负载黑色素瘤化疗药物的纳米脂质体及其制备方法。本发明以神经酰胺接枝透明质酸HA‑CE,联合方格星虫多肽修饰纳米脂质体,制备柔性纳米脂质体,包裹黑色素瘤化疗药物后,可有效提高黑色素瘤化疗药物的透皮吸收效果,达到黑色素瘤化疗药物经皮给药的目的,提高黑色素瘤化疗药物的药效,避免了黑色素瘤化疗药物口服给药造成的肝损伤、肾损伤等副作用,也为靶向皮下治疗黑色素瘤提供了一种新型纳米脂质体药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,更具体地,涉及一种负载黑色素瘤化疗药物的纳米脂质体及其制备方法。
背景技术
黑色素瘤,通常是指恶性黑色素瘤,是黑色素细胞来源的一种高度恶性的肿瘤,简称恶黑,多发生于皮肤,也可见于黏膜和内脏,约占全部肿瘤的3%。皮肤恶性黑色素瘤占皮肤恶性肿瘤的第三位(约占6.8%~20%)。好发于成人,皮肤白皙的白种人发病率高,而深色皮肤的亚洲人和非洲人发病率较低,极少见于儿童。部分患者有家族性多发现象。恶性黑色素瘤可由先天性或获得性良性黑素细胞痣演变而成,或由发育不良性痣恶变而来,也可以是新发生。近年来,恶性黑色素瘤的发生率和死亡率逐年升高,与其他实体瘤相比,其致死年龄更低。恶性黑色素瘤除早期手术切除外,缺乏特效治疗,预后差。因此,恶性黑色素瘤的早期诊断和治疗极其重要。
黑色素瘤化疗类药物,如威罗非尼和达卡巴嗪是FDA新批准的用于黑色素瘤化疗的分子靶向性药物,能显著提高黑色素瘤对药物的响应率。目前黑色素瘤化疗类药物主要通过口服的方式输送至体内,但是口服常常会造成血管、肝肾以及神经***的毒性等副作用等,且治疗效果不显著。在临床上,黑色素瘤通常位于皮下,且皮肤是最广泛的药物传递界面,因此通过皮肤输送黑色素瘤化疗类药物是最直接、无创的输送方式。但黑色素瘤化疗类药物水溶性极差,加之皮肤的屏障作用,黑色素瘤化疗类药物的透皮吸收效果不佳。
目前将化疗类药物制成脂质体,在黑色素瘤等瘤体表面涂抹使用,使其渗入瘤体内,可增强药物疗效和降低药物毒副作用,有研究制备盐酸米托蒽酯脂质体进行皮肤局部给药可实现皮肤靶向治疗恶性皮肤黑色素瘤【陈彤,侯世祥,孙毅毅,郑瑀.盐酸米托蒽醌脂质体制备及其经皮吸收分布规律的研究[J].四川大学学报(医学版),2006(06):934-937.】。脂质体是一种有前景的药物载体,具有良好的生物相容性、可溶性、稳定性和细胞摄取能力,且制备载药脂质体可增强黑色素瘤化疗类药物溶解性、克服皮肤屏障、增强药物透皮吸收效率的作用。由此,开发更多新型负载黑色素瘤化疗药物的纳米脂质体用于靶向皮下治疗黑色素瘤具有相当的必要性。
发明内容
本发明针对现有负载黑色素瘤化疗药物的纳米脂质体种类的不足,旨在提供一种新型负载黑色素瘤化疗药物的纳米脂质体及其制备方法。得到的纳米脂质体可解决黑色素瘤化疗类药物溶解性差,透皮吸收效率低的问题,通过纳米脂质体缓释技术及透皮吸收,从而达到黑色素瘤化疗药物经皮给药的目的。避免了黑色素瘤化疗药物口服给药造成的肝损伤、肾损伤等问题,同时提高黑色素瘤化疗药物的药效。
本发明的首要目的是提供一种负载黑色素瘤化疗药物的纳米脂质体的制备方法。
本发明的再一目的是提供上述方法制备得到的负载黑色素瘤化疗药物的纳米脂质体。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明首先提供了一种负载黑色素瘤化疗药物的纳米脂质体的制备方法,包括如下步骤:
S1.HA-TBA的制备:将透明质酸和正四丁基氢氧化铵加入到水中混合反应,冷冻干燥得到HA-TBA;
S2.DS-Y30连接剂的制备:将DS-ceramide Y30、三乙胺加入到4-氯甲基苯甲酰氯-四氢呋喃混合液中进行水浴反应,经浓缩、结晶得到DS-Y30连接剂;
S3.HA-CE的制备:将HA-TBA、DS-Y30连接剂溶于四氢呋喃-乙腈混合液中进行水浴反应,除杂质、有机溶剂后即得到HA-CE;
S4.将卵磷脂、胆酸钠、胆固醇、黑色素瘤化疗药物、HA-CE、方格星虫多肽分散于甲醇-三氯甲烷混合液中得到分散液;
S5.去除步骤S4分散液中的甲醇和三氯甲烷得到磷脂薄膜,再将PBS缓冲液加入磷脂薄膜中,水化2~5h;
S6.对水化后的溶液采用细胞粉碎超声仪超声、离心、过滤,即得到负载黑色素瘤化疗药物的纳米脂质体;
其中,步骤S3所述HA-TBA、DS-Y30连接剂、四氢呋喃-乙腈混合液的用量比为8~15mmol:0.4~1mmol:40mL;所述四氢呋喃-乙腈混合液中四氢呋喃和乙腈的体积比为4~5:1;
步骤S4所述卵磷脂、胆酸钠、胆固醇、黑色素瘤化疗药物、HA-CE、方格星虫多肽的质量比为128:18~20:30~32:5:4:4~6;
所述黑色素瘤化疗药物为威罗非尼或达卡巴嗪。
本发明上述方法中,透明质酸是一种阴离子、非硫酸盐的糖胺聚糖,广泛分布于***、上皮组织和神经组织中,易被透明质酸酶降解,具有优异的生物相容性和生物降解性,广泛用于多种药物的输送,有研究表明,透明质酸可与肿瘤细胞中过表达的CD44受体结合。神经酰胺DS-ceramide Y30由鞘氨醇和脂肪酸组成,是一种已知的细胞信号分子,可参与调解细胞的分化、增殖、程序性死亡和凋亡等。方格星虫多肽是从方格星虫体壁中提取分离的,具有优异的抗肿瘤、降血压、抗病毒等活性。本发明以神经酰胺接枝透明质酸HA-CE,联合方格星虫多肽修饰纳米脂质体,制备柔性纳米脂质体,包裹黑色素瘤化疗药物后,可有效提高黑色素瘤化疗药物的透皮吸收效果,减少这类药物口服造成的副作用。
在其中一些优选实施例中,步骤S1所述透明质酸、正四丁基氢氧化铵、水的用量比为12mmol:6~12mmol:40~50mL,见实施例1~3。
在其中一些优选实施例中,步骤S1所述反应为搅拌反应40~50min,见实施例1~3。
在其中一些优选实施例中,步骤S2所述DS-ceramide Y30、三乙胺、4-氯甲基苯甲酰氯-四氢呋喃混合液的用量比为8~10mmol:9~12mmol:22~25mL,所述4-氯甲基苯甲酰氯-四氢呋喃混合液中4-氯甲基苯甲酰氯和四氢呋喃的体积比为10~15:10~15,见实施例1~3。
在其中一些优选实施例中,步骤S2所述水浴反应为在温度50~70℃的水浴中搅拌反应5~8h,见实施例1~3。
在其中一些优选实施例中,步骤S3所述水浴反应为在40~60℃水浴中搅拌反应4~6h,见实施例1~3。
在其中一些优选实施例中,步骤S3所述除杂质、有机溶剂为通过透析过滤除杂质,旋转蒸发除有机溶剂,见实施例1~3。
在其中一些优选实施例中,步骤S5所述去除甲醇和三氯甲烷为采用旋转蒸发仪去除分散液中的甲醇和三氯甲烷,见实施例1~3。
在其中一些优选实施例中,步骤S4所述甲醇-三氯甲烷混合液中甲醇和三氯甲烷的体积比为1~2:1,见实施例1~3。
在其中一些优选实施例中,步骤S6所述超声为在50~70W的功率下超声20~30min;所述离心为在10000~12000rpm离心10~20min;所述过滤为采用0.22μm微孔膜过滤,见实施例1~3。
本发明上述方法制备得到的负载黑色素瘤化疗药物的纳米脂质体可有效促进黑色素瘤化疗药物的透皮吸收,从而达到黑色素瘤化疗药物经皮给药的目的。避免了黑色素瘤化疗药物口服给药造成的肝损伤、肾损伤等问题,提高了黑色素瘤化疗药物的药效。
因此,本发明还请求保护上述方法制备得到的负载黑色素瘤化疗药物的纳米脂质体。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明以神经酰胺接枝透明质酸HA-CE,联合方格星虫多肽修饰纳米脂质体,制备柔性纳米脂质体,包裹黑色素瘤化疗药物后,可有效提高黑色素瘤化疗药物的透皮吸收效果,达到黑色素瘤化疗药物经皮给药的目的,提高黑色素瘤化疗药物的药效,避免了黑色素瘤化疗药物口服给药造成的肝损伤、肾损伤等副作用,也为靶向皮下治疗黑色素瘤提供了一种新型纳米脂质体药物。
附图说明
图1是载药柔性纳米脂质体的TEM图;
图2是透明质酸(a)、DS-ceramide Y30(b)、神经酰胺接枝透明质酸HA-CE(c)的红外光谱图;
图3是透明质酸(a)、DS-ceramide Y30(b)、神经酰胺接枝透明质酸HA-CE(c)的1HNMR图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明,本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
DS-ceramide Y30神经酰胺、威罗非尼、达卡巴嗪购于麦克林。
方格星虫多肽的制备方法为:
(1)木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶按质量比为1:1混合得到复合酶,将复合酶按3000U/g方格星虫体腔臂浆加入到方格星虫体腔臂浆中进行酶解;
(2)将所得到的酶解产物经1kDa的超滤膜过滤,既可获得<1kDa的方格星虫多肽;
其中,所述方格星虫体腔臂浆为取料液比为1:4(g/mL)的方格星虫体腔臂加水打浆而成;所述酶解条件:酶解pH为7,酶解温度为56℃,酶解时间为5h。
实施例1负载威罗非尼的纳米脂质体
(1)将12.00mmol的透明质酸和9.00mmol的正四丁基氢氧化铵加入40mL蒸馏水搅拌40min,随后冷冻干燥,得到正四丁基氢氧化铵活化透明质酸(HA-TBA)。
(2)将8.00mmol DS-ceramide Y30神经酰胺、9.00mmol的三乙胺加入15mL8mmol的4-氯甲基苯甲酰氯和10ml四氢呋喃(THF)的混合液中,在60℃水浴中搅拌7h,经浓缩再结晶得到DS-Y30连接剂。
(3)将8.00mmol的HA-TBA和0.40mmol的DS-Y30连接剂溶于40mL四氢呋喃和乙腈(体积比为4:1)的混合物中,在40℃水浴中搅拌6h,透析过滤除杂质,旋转蒸发除去有机溶剂,得到神经酰胺透明质酸接枝物(HA-CE)。
(4)将卵磷脂、胆酸钠、胆固醇、威罗非尼、HA-CE、方格星虫多肽按质量比为128:20:32:5:4:6均匀分散于体积比为1:1的甲醇和三氯甲烷溶液中,分散30min后,用旋转蒸发仪除去混合溶液中的甲醇和三氯甲烷溶液得到磷脂薄膜。再加入4mL的PBS缓冲液于磷脂薄膜中,并将其置于旋转蒸发仪上水化3h。
(5)水化后的溶液用细胞粉碎超声仪在50W的功率下超声30min。将超声后的溶液用11000rpm离心15min后,用0.22μm微孔膜过滤,得到分散均匀的神经酰胺透明质酸方格星虫多肽修饰的威罗非尼柔性纳米脂质体S1。
得到的载药柔性纳米脂质体的TEM图如图1所示。
图2是透明质酸(a)、DS-ceramide Y30(b)、神经酰胺接枝透明质酸HA-CE(c)的红外光谱图,从HA-CE的红外光谱图中可以看出,在3324.26cm-1处出现透明质酸内氢键形成的糖羟基伸缩振动;在2920.96cm-1附近出现DS-ceramide Y30的亚甲基的伸缩振动;1611.71cm-1附近是仲酰胺的伸缩振动,相比于DS-ceramide Y30、透明质酸的仲酰胺的伸缩振动,HA-CE在合成过程中发生了红移;FTIR分析证明HA-CE成功合成。
图3是透明质酸(HA)(a)、DS-ceramide Y30(CE)(b)、神经酰胺接枝透明质酸HA-CE(c)的1H NMR图。2.5ppm属于CE的特征质子峰;3.2ppm为HA特征质子峰。在透明质酸神经酰胺接枝物(HA-CE)的核磁共振1H谱中,同时在2.5ppm和3.2ppm处出现特征峰,以上结果表明透明质酸和神经酰胺接枝成功。
实施例2负载威罗非尼的纳米脂质体
(1)将12.00mmol的透明质酸和12.00mmol的正四丁基氢氧化铵加入50mL蒸馏水搅拌50min,随后冷冻干燥,得到正四丁基氢氧化铵活化透明质酸(HA-TBA)。
(2)将8.00mmol DS-ceramide Y30神经酰胺、12.00mmol的三乙胺加入10mL9mmol的4-氯甲基苯甲酰氯和15ml四氢呋喃(THF)的混合液中,在50℃水浴中搅拌8h,经浓缩再结晶得到DS-Y30连接剂。
(3)将15.00mmol的HA-TBA和1.00mmol的DS-Y30连接剂溶于40mL四氢呋喃和乙腈(体积比为5:1)的混合物中,在60℃水浴中搅拌4h,透析过滤除杂质,旋转蒸发除去有机溶剂,得到神经酰胺透明质酸接枝物(HA-CE)。
(4)将卵磷脂、胆酸钠、胆固醇、威罗非尼、HA-CE、方格星虫多肽按质量比为128:20:32:5:4:6均匀分散于体积比为2:1的甲醇和三氯甲烷溶液中,分散30min后,用旋转蒸发仪除去混合溶液中的甲醇和三氯甲烷溶液得到磷脂薄膜。再加入4mL的PBS缓冲液于磷脂薄膜中,并将其置于旋转蒸发仪上水化3h。
(5)水化后的溶液用细胞粉碎超声仪在70W的功率下超声20min。将超声后的溶液用12000rpm离心10min后,用0.22μm微孔膜过滤,得到分散均匀的神经酰胺透明质酸方格星虫多肽修饰的威罗非尼柔性纳米脂质体S2。
实施例3负载达卡巴嗪的纳米脂质体
(1)将12.00mmol的透明质酸和6.00mmol的正四丁基氢氧化铵加入40mL蒸馏水搅拌40min,随后冷冻干燥,得到正四丁基氢氧化铵活化透明质酸(HA-TBA)。
(2)将10.00mmol DS-ceramide Y30神经酰胺、12.00mmol的三乙胺加入12mL8.00mmol的4-氯甲基苯甲酰氯和10ml四氢呋喃(THF)的混合液中,在70℃水浴中搅拌5h,经浓缩再结晶得到DS-Y30连接剂。
(3)将8.00mmol的HA-TBA和0.80mmol的DS-Y30连接剂溶于40mL四氢呋喃和乙腈(体积比为5:1)的混合物中,在40℃水浴中搅拌6h,透析过滤除杂质,旋转蒸发除去有机溶剂,得到神经酰胺透明质酸接枝物(HA-CE)。
(4)将卵磷脂、胆酸钠、胆固醇、达卡巴嗪、HA-CE、方格星虫多肽按质量比为128:18:30:5:4:4均匀分散于体积比为1:1的甲醇和三氯甲烷溶液中,分散30min后,用旋转蒸发仪除去混合溶液中的甲醇和三氯甲烷溶液得到磷脂薄膜。再加入4mL的PBS缓冲液于磷脂薄膜中,并将其置于旋转蒸发仪上水化3h。
(5)水化后的溶液用细胞粉碎超声仪在70W的功率下超声20min。将超声后的溶液用10000rpm离心20min后,用0.22μm微孔膜过滤,得到分散均匀的神经酰胺透明质酸方格星虫多肽修饰的达卡巴嗪柔性纳米脂质体S3。
对比例1
与实施例1的方案区别在于,第(3)步中,将5.00mmol的HA-TBA和0.40mmol的DS-Y30连接剂溶于40mL四氢呋喃和乙腈(体积比为4:1)的混合物中。其他同实施例1,得到威罗非尼柔性纳米脂质体S-D1。
对比例2
与实施例1的方案区别在于,第(3)步中,将20.00mmol的HA-TBA和0.40mmol的DS-Y30连接剂溶于50mL四氢呋喃和乙腈(体积比为4:1)的混合物中。其他同实施例1,得到威罗非尼柔性纳米脂质体S-D2。
对比例3
与实施例1的方案区别在于,第(4)步中,卵磷脂、胆酸钠、胆固醇、威罗非尼、HA-CE、方格星虫多肽的质量比为128:20:32:5:4:2。其他同实施例1,得到威罗非尼柔性纳米脂质体S-D3。
对比例4
与实施例1的方案区别在于,第(4)步中,卵磷脂、胆酸钠、胆固醇、威罗非尼、HA-CE、方格星虫多肽的质量比为128:20:32:5:4:10。其他同实施例1,得到威罗非尼柔性纳米脂质体S-D4。
对比例5
与实施例1的方案区别在于,第(4)步中,不添加方格星虫多肽,其他同实施例1,得到威罗非尼柔性纳米脂质体S-D5。
实验例1
对实施例1-3和对比例1-5制备的载药柔性纳米脂质体S1、S2、S3、S-D1、S-D2、S-D3、S-D4、S-D5进行平均粒径、分散系数、Zeta电势、包封率和载药量的测定,结果如下表1所示:
表1
从表1的结果可看出,S1、S2、S3的平均粒径在200nm左右,分散系数较小,说明其粒径较均匀,另外S1、S2、S3的包封率都在68%以上,载药量大于24%;而对比例中S-D1、S-D2、S-D3、S-D4、S-D5分散系数较大,粒径不均匀,其包封率和载药量也较低。由此可以看出,按照本发明方法制备的柔性纳米脂质体粒径较均匀,包封率和载药量较高。
实验例2纳米脂质体和单独的黑色素瘤化疗药物水溶性比较
1、实验方法
对实施例1-3和对比例1-5制备的载药柔性纳米脂质体S1、S2、S3、S-D1、S-D2、S-D3、S-D4、S-D5,以及威罗非尼、达卡巴嗪进行水溶性比较。
具体方法为:将100mg上述样品分别加到5mL水中,并在25℃温度下搅拌过夜,然后将混悬液于10000×g离心力下离心10min,弃上清,得到的残余固体用丙酮洗涤三次,然后在真空干燥箱中干燥24h,最后称重,试验平行做三次。溶解度(mg/mL)如下按公式计算:
其中W是真空干燥的残余固体的重量(mg)。
2、实验结果
各样品在蒸馏水中的溶解度如表2所示。从表2的结果可以看出,S1、S2、S3在蒸馏水中具有良好的溶解性(>20mg/mL),其溶解度都比S-D1、S-D2、S-D3、S-D4、S-D5的好,而威罗非尼和达卡巴嗪在水溶液中几乎不溶。由此可看出,按照本发明方法制备的柔性纳米脂质体可显著提高黑色素瘤化疗药物在水中的溶解性。
实验例3透皮吸收效果测试
1、实验方法
对实施例1-3和对比例1-5制备的载药柔性纳米脂质体S1、S2、S3、S-D1、S-D2、S-D3、S-D4、S-D5,以及威罗非尼、达卡巴嗪进行透皮吸收效果的测试。
具体方法为:取颈椎脱臼处死并剃毛后的6只ICR小鼠背部中心区域全层皮肤约3.5cm2,用预冷生理盐水清洗后立即取出,用滤纸拭干用于实验。采用药物透皮扩散试验仪进行体外透皮实验。按皮肤角质层向上夹紧皮肤,向供给室内加入0.16g样品,接收室加满6.90mL生理盐水使皮肤的真皮层完全浸没(不能有气泡),开启磁力搅拌器(500rpm),并将水温设置为37.0±0.1℃。在预设的时间点(1、2、4、8、12、24h),从接收室中取出0.20mL生理盐水,同时补充等量生理盐水。将取出的生理盐水用无水乙醇稀释至1.00mL,采用紫外分光光度法在250nm处检测黑色素瘤化疗药物的含量,平行3次实验。根据测定的黑色素瘤化疗浓度,按如下公式计算皮肤单位面积累积渗透量Q:
其中,Q为累积渗透量,μg/cm2;S为有效扩散面积(2.80cm2),cm2,V为接收室中生理盐水的体积,6.9mL;C1为第一次取样时接收液中药物的浓度,μg/mL;Cn为该次取样时接收液中药物浓度,μg/mL。
按如下公式计算累积渗透率:
2、实验结果
从表3的结果可看出,S1、S2、S3滞留率明显低于S-D1、S-D2、S-D3、S-D4、S-D5,累计渗透率都在50%以上,高于于S-D1、S-D2、S-D3、S-D4、S-D5;而威罗非尼和达卡巴嗪滞留率在90%左右,累计渗透率极低。由此可以看出,本发明方法制备的柔性纳米脂质体可显著提高黑色素瘤化疗药物透皮吸收效果。
显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种负载黑色素瘤化疗药物的纳米脂质体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1.HA-TBA的制备:将透明质酸和正四丁基氢氧化铵加入到水中混合搅拌反应40~50min,冷冻干燥得到HA-TBA;所述透明质酸、正四丁基氢氧化铵、水的用量比为12mmol:6~12mmol:40~50mL;
S2.DS-Y30连接剂的制备:将DS-ceramide Y30、三乙胺加入到4-氯甲基苯甲酰氯-四氢呋喃混合液中进行水浴反应,在温度50~70℃的水浴中搅拌反应5~8h,经浓缩、结晶得到DS-Y30连接剂;所述DS-ceramide Y30、三乙胺、4-氯甲基苯甲酰氯-四氢呋喃混合液的用量比为8~10mmol:9~12mmol:22~25mL,所述4-氯甲基苯甲酰氯-四氢呋喃混合液中4-氯甲基苯甲酰氯和四氢呋喃的体积比为10~15:10~15;
S3.HA-CE的制备:将HA-TBA、DS-Y30连接剂溶于四氢呋喃-乙腈混合液中进行水浴反应,在40~60℃水浴中搅拌反应4~6h,除杂质、有机溶剂后即得到HA-CE;
S4.将卵磷脂、胆酸钠、胆固醇、黑色素瘤化疗药物、HA-CE、方格星虫多肽分散于甲醇-三氯甲烷混合液中得到分散液;
S5.去除步骤S4分散液中的甲醇和三氯甲烷得到磷脂薄膜,再将PBS缓冲液加入磷脂薄膜中,水化3h;
S6.对水化后的溶液采用细胞粉碎超声仪超声、离心、过滤,即得到负载黑色素瘤化疗药物的纳米脂质体;超声为在50~70W的功率下超声20~30min;所述离心为在10000~12000rpm离心10~20min;所述过滤为采用0.22μm微孔膜过滤;
其中,步骤S3所述HA-TBA、DS-Y30连接剂、四氢呋喃-乙腈混合液的用量比为8~15mmol:0.4~1mmol:40mL;所述四氢呋喃-乙腈混合液中四氢呋喃和乙腈的体积比为4~5:1;步骤S4所述卵磷脂、胆酸钠、胆固醇、黑色素瘤化疗药物、HA-CE、方格星虫多肽的质量比为128:18~20:30~32:5:4:4~6;所述黑色素瘤化疗药物为威罗非尼或达卡巴嗪;所述甲醇-三氯甲烷混合液中甲醇和三氯甲烷的体积比为1~2:1。
2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤S3所述除杂质、有机溶剂为通过透析过滤除杂质,旋转蒸发除有机溶剂;步骤S5所述去除甲醇和三氯甲烷为采用旋转蒸发仪去除分散液中的甲醇和三氯甲烷。
3.权利要求1或2所述方法制备得到的负载黑色素瘤化疗药物的纳米脂质体。
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