CN113234671A - 全反式维甲酸的新应用 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物技术领域，尤其涉及全反式维甲酸的新应用。本申请公开了全反式维甲酸的新应用，全反式维甲酸能抑制肿瘤相关的间充质干细胞诱导的巨噬细胞招募的趋化因子的表达，又能抑制肿瘤相关的间充质干细胞对肿瘤生长的促进作用，还能通过抑制肿瘤相关的间充质干细胞的NF‑κB信号通路的活化来降低巨噬细胞招募的趋化因子的表达，可用于制备抗肿瘤间充质干细胞。本申请有效解决现有技术中间充质干细胞对实体肿瘤生长具有促进作用限制其应用的技术问题。
Description
技术领域
本申请属于生物技术领域，尤其涉及全反式维甲酸的新应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)因具有多向分化潜能，免疫调控以及促进组织修复再生等功能，在现代生物医学领域得到了广泛的应用。然而，有不少研究发现，MSC作为肿瘤微环境的组成部分，在实体肿瘤发生发展的过程中起到了促进作用，这种MSC被称为肿瘤相关的间充质干细胞(Tumor-associated mesenchymal stem cell,TA-MSC)。
虽然目前体外制备的MSC常作为生物疗法治疗自身免疾病或研究组织损伤后修复，但是其促进肿瘤发生发展的特性仍无法规避。对于肿瘤患者，由于MSC对实体肿瘤生长具有促进作用，MSC的生物治疗便受到了限制。现有的体外培养条件无法消除MSC肿瘤促进的特性。
发明内容
有鉴于此，本申请公开了全反式维甲酸((all-trans-retinoicacid，ATRA)的新应用，ATRA能抑制TA-MSC诱导的巨噬细胞招募的趋化因子的表达，又能抑制TA-MSC对肿瘤生长的促进作用，还能通过抑制TA-MSC的NF-κB信号通路的活化来降低巨噬细胞招募的趋化因子的表达，可用于制备抗肿瘤间充质干细胞。
本申请第一方面公开了全反式维甲酸在抑制肿瘤相关的间充质干细胞促进肿瘤生长中的应用。
本申请第二方面公开了全反式维甲酸在降低肿瘤相关的间充质干细胞表达巨噬细胞招募的趋化因子中的应用。
本申请第三方面公开了全反式维甲酸在抑制肿瘤相关的间充质干细胞的NF-κB信号通路的活化中的应用。
另一实施例中，所述全反式维甲酸添加的终浓度为90～120nM。
另一实施例中，所述全反式维甲酸添加的终浓度为100nM。
本申请第四方面提供了一种制备抗肿瘤间充质干细胞的培养基，包括：
全反式维甲酸和充质干细胞基础培养基。
另一实施例中，所述全反式维甲酸在所述培养基的终浓度为90～120nM。
另一实施例中，所述全反式维甲酸在所述培养基的终浓度为100nM。
具体的，所述充质干细胞基础培养基为现有常规的培养充质干细胞的培养基。
另一实施例中，所述充质干细胞基础培养基包括含有胎牛血清的低糖DMEM培养基。
本申请第五方面公开了一种抗肿瘤间充质干细胞的制备方法，包括：
将取出组织或器官分离处理得到的间充质干细胞进行原代培养；
待所述间充质干细胞贴壁后，在间充质干细胞基础培养基中添加IL-17和IFNγ刺激后，待所述间充质干细胞转化为肿瘤相关的间充质干细胞，再在所述肿瘤相关的间充质干细胞的培养基中添加全反式维甲酸继续培养，制得抗肿瘤间充质干细胞。
具体的，将取出组织或器官分离处理得到的间充质干细胞进行原代培养；待细胞聚合度达到70％-80％时，在间充质干细胞基础培养基中添加IL-17和IFNγ刺激后，待所述间充质干细胞转化为肿瘤相关的间充质干细胞，再在所述肿瘤相关的间充质干细胞的培养基中添加全反式维甲酸继续培养，制得抗肿瘤间充质干细胞。
另一实施例中，所述全反式维甲酸在所述肿瘤相关的间充质干细胞的培养基中的终浓度为90～120nM。
另一实施例中，所述全反式维甲酸在所述肿瘤相关的间充质干细胞的培养基中的终浓度为100nM。
另一实施例中，所述继续培养的时间为5～7h。
另一实施例中，所述继续培养的时间为6h。
本申请公开了ATRA的新应用，ATRA是人和动物体内维生素A的代谢产物。从本申请的实验数据可知，通过在体外模拟TA-MSC的培养体系中加入ATRA，发现ATRA在消除MSC肿瘤促进的特性上起到了关键作用，ATRA可抑制TA-MSC诱导的巨噬细胞招募的趋化因子的表达；ATRA可抑制TA-MSC对肿瘤生长的促进作用；ATRA通过抑制TA-MSC的NF-κB信号通路的活化来降低巨噬细胞招募的趋化因子的表达。本申请还提供了采用ATRA制备抗肿瘤间充质干细胞的培养基和抗肿瘤间充质干细胞的制备方法。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请实施例中经IL-17、IFNγ和ATRA作用的MSC其巨噬细胞招募的趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL20相对表达量检测结果；
图2为本申请实施例中经IL-17、IFNγ和ATRA作用的MSC与黑色素瘤细胞共移植后黑色素瘤的重量测量结果；
图3为本申请实施例中经IL-17、IFNγ和ATRA作用的MSC与黑色素瘤细胞共移植后黑色素瘤的体积测量结果；
图4为本申请实施例中经IL-17、IFNγ和ATRA作用的MSC与黑色素瘤细胞共移植后外周血髓系细胞的统计结果；
图5为本申请实施例中经IL-17、IFNγ和ATRA作用的MSC与黑色素瘤细胞共移植后肿瘤浸润的髓系细胞的统计结果；
图6为本申请实施例中经ATRA预处理的MSC在IL-17不同时间的刺激下NF-κB信号通路的活化情况；
图7为本申请实施例中经IL-17、IFNγ、ATRA和BetA作用的MSC其巨噬细胞招募的趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL20相对表达量检测结果。
具体实施方式
本申请提供了全反式维甲酸的新应用，用于解决现有技术中MSC对实体肿瘤生长具有促进作用限制其应用的技术缺陷。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
其中，以下实施例所用试剂或原料均为市售或自制；
以下实施例采用IL-17和IFNγ构建TA-MSC；IL-17和IFNγ是肿瘤微环境中常见的炎症因子，能够使得肿瘤浸润的MSC转变为TA-MSC，从而促进肿瘤生长。
本申请实施例中的nM为nmol/L、μM为μmol/L。
实施例1
本申请实施例提供了巨噬细胞招募的趋化因子表达水平的检测，包括：
1、本实施例采用从骨髓中分离C57小鼠骨髓原代MSC的方法，按照2×105/孔的细胞量接种于12孔板中进行体外培养，待细胞聚合度达到70％-80％左右时，便可进行下一步实验。本实施例设计了6个组，分别为在培养液中加入等体积的PBS、100nMATRA、50ng/mlIL-17、10ng/ml IFNγ、50ng/ml IL-17+10ng/ml IFNγ、50ng/ml IL-17+10ng/ml IFNγ+100nM ATRA，培养6小时。然后，采用Trizol及氯仿抽提细胞总RNA并利用实时荧光定量PCR检测巨噬细胞招募的趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL20等基因的表达水平。
本实施例采用的培养基为含有20％胎牛血清的低糖的DMEM培养基，培养条件为37℃恒温，低氧5％O2培养箱培养。
本实施例的RNA提取采用TAKARA公司的RNA提取试剂盒，具体的提取方法参考试剂盒使用说明书，在此不累述。实时荧光定量PCR检测也采用TAKARA公司的造血干细胞支持因子检测试剂盒，具体反应体系、反应条件参考试剂盒使用说明书，在此不累述。
2、本实施例分别针对巨噬细胞招募的趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL20，设计并合成了特异性检测引物进行实时荧光定量PCR，引物序列如表1所示。
表1巨噬细胞招募的趋化因子特异性检测引物
表1中，“F”表示上游引物，“R”表示下游引物，“CCL2 F”和“CCL2 R”分别表示CCL2基因的上游引物和下游引物，其余类似。
抽提细胞RNA：用500μL的Trizol充***解细胞后，加入100μL氯仿剧烈震荡，充分分层后，于冷离心机中最大转速离心15分钟，取上清，向上清中并加入等量的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟，然后最大转速离心10分钟，弃上清，用DEPC水稀释的70％乙醇洗涤，充分晾干，用DEPC水溶解RNA。
逆转录：用TAKARA(RR036A)逆转录试剂盒进行反转录，反转录250ngRNA，并用双蒸水稀释至100uL进行后续定量PCR。
荧光定量PCR：采用翊圣2×SYBR及BioRad CFX96 Touch荧光定量PCR仪进行定量PCR实验。PCR反应体系：4.8uL逆转录模板、0.2uL上下游引物混合物、5uL2×SYBRmix；其中，上下游引物混合物中上游引物和下游引物的浓度均为10mmol/L。
PCR反应程序：95℃预变性1min，然后进入40个循环：95℃5s、60℃30s，并于60℃收集荧光，循环结束后，95℃15s、60℃15s、95℃15s。
本实施例用ATRA、IL-17、IFNγ、IFNγ+IL-17+ATRA，处理MSC 6小时，其中ATRA终浓度为100nM，IL-17的终浓度为50ng/ml、IFNγ终浓度为10ng/ml。然后通过定量PCR的方法检测巨噬细胞招募的趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL20的mRNA表达水平的变化。
实验结果如图1所示。由左至右为CCL2、CCL5、CCL7、CCL20的mRNA相对表达量分析结果；各图由左至右的6个柱依序表示PBS处理的对照实验(即“Ctrl”)、ATRA处理6h实验组(即“RA”)、IL-17处理6h实验组(即“IL-17”)、IFNγ处理6h实验组(即“IFNγ”)、IFNγ+IL-17处理6h实验组(即“IFNγ+IL-17”)、IFNγ+IL-17+RA处理6h实验组(即“IFNγ+IL-17+RA”)。
结果显示，IFNγ+IL-17处理6小时后，可以显著的诱导CCL2、CCL5、CCL7、CCL20的表达，与TA-MSC表型相符。但IFNγ+IL-17+RA处理6小时后的这些趋化因子的表达水平却大大降低，说明ATRA能够抑制IL-17和IFNγ模拟的TA-MSC的巨噬细胞招募的趋化因子的表达。
实施例2
本申请实施例提供了不同方法处理MSC后与肿瘤细胞共移植试验，方法包括：
本实施例采用体外培养的原代MSC，培养到细胞聚合度达到90％左右时，用胰酶把MSC消化下来，按照1×105细胞量的MSC与2.5×105的黑色素瘤细胞B16-F0混合均匀，通过皮下注射的方式移植到野生型C57BL/6受体小鼠。分别于移植后的第0天、第3天、第6天、第9天、第12天测量肿瘤的大小。移植后的第12天，处死受体小鼠，取出瘤子称量重量并且采用流式细胞仪检测肿瘤浸润的髓系细胞以及外周血髓系细胞的数量。
本实施例待肿瘤移植后的第12天，处死受体小鼠取肿瘤和外周血。外周血经过裂解红细胞后获得单细胞悬液，进行流式抗体染色。肿瘤先用PBS洗涤，用剪刀剪成碎片后置于70μm的过滤器中进行研磨，获得单细胞悬液。采用Percoll分层液法分离髓系细胞，将已制备的单细胞悬液轻轻叠加在Percoll液面上，低速离心后可见液体分层，吸取中间的单个核细胞层后进行流式抗体染色。细胞采用anti-CD11b、anti-Gr-1、anti-Ly6C以及anti-F4/80抗体在冰上孵育1小时后进行流式细胞仪的检测。
本实施例对比了分别用等量的PBS、100nMATRA，50ng/ml IL-17，10ng/ml IFNγ，50ng/ml IL-17+10ng/ml IFNγ，50ng/ml IL-17+10ng/ml IFNγ+100nM ATRA处理12h的MSC与没有经过任何处理的MSC对黑色素瘤细胞B16-F0生长促进的效果，其中ATRA终浓度为100nM，IL-17终浓度为50ng/ml，IFNγ终浓度为10ng/ml。取黑色素瘤细胞B16F0与预处理过的野生型小鼠MSC共移植到C57BL/6受体小鼠，于移植后第3、6、9、12天测量肿瘤的体积，于移植后12天取出肿瘤测量重量，并分离肿瘤浸润的髓系细胞统计数量以及取外周血检测髓系细胞的数量。结果如图2～图5所示。
黑色素瘤的肿瘤质量测量结果如图2所示。由左至右的6个柱依序表示B16F0与PBS处理MSC的共移植对照组(即“B16F0+BM-MSC”)、B16F0与ATRA预处理12h的MSC的共移植实验组(即“B16F0+RApreBM-MSC”)、B16F0与IL-17预处理12h的MSC的共移植实验组(即“B16F0+IL-17preBM-MSC”)、B16F0与IFNγ预处理12h的MSC的共移植实验组(即“B16F0+IFNγpreBM-MSC”)、B16F0与IL-17+IFNγ预处理12h的MSC的共移植实验组(即“B16F0+IL-17-IFNγpreBM-MSC”)、B16F0与IL-17+IFNγ+ATRA预处理12h的MSC的共移植实验组(即“B16F0+IL-17-IFNγ-RApreBM-MSC”)。结果显示，IL-17和IFNγ模拟的TA-MSC对黑色素瘤生长有明显的促进作用，肿瘤重量最重。而ATRA能显著抑制TA-MSC对黑色素瘤促进生长的作用，表现为肿瘤重量下降。
黑色素瘤的肿瘤大小测量结果如图3所示，分组与图2一致。结果显示，IL-17和IFNγ模拟的TA-MSC对黑色素瘤生长有明显的促进作用，肿瘤体积在移植后第6、9、12天都是最大的。而ATRA能显著抑制TA-MSC对黑色素瘤促进生长的作用，表现为肿瘤体积减小。
黑色素瘤移植后外周血和肿瘤浸润的髓系细胞的统计结果如图4、5所示，分组与图2一致。结果显示，黑色素瘤细胞B16F0与IL-17和IFNγ模拟的TA-MSC共移植后，在外周血中髓系细胞数量增加，包括巨噬细胞、单核细胞以及中性粒细胞。在肿瘤浸润的细胞中，髓系细胞数量增加，包括巨噬细胞、单核细胞以及髓系来源的抑制细胞(Myeloid derivedsuppressive cell,MDSC)。
研究表明，髓系细胞尤其是巨噬细胞，对肿瘤的生长促进发挥着关键作用。而当黑色素瘤细胞B16F0与ATRA处理过的IL-17和IFNγ模拟的TA-MSC共移植后，外周血和肿瘤细胞浸润的髓系细胞数量减少显著。这说明ATRA抑制了IL-17和IFNγ模拟的TA-MSC对髓系细胞的招募，而髓系细胞的招募聚集对肿瘤的生长促进发挥着重要作用。
综上，ATRA抑制了IL-17和IFNγ模拟的TA-MSC对肿瘤生长的促进作用
实施例3
本申请实施例提供了采用ATRA处理受IL-17刺激MSC后NF-κB信号通路变化，方法包括：
本实施例采用从骨髓中分离C57小鼠骨髓原代MSC的方法，按照5×105/孔的细胞量接种于6孔板中进行体外培养，待细胞聚合度达到70％-80％左右时，便可进行下一步实验。本实施例设计了8个组，分别为在用等体积的PBS无ATRA预处理下采用50ng/ml IL-17刺激0、15、30、60min，以及在100nM ATRA预处理6h后采用50ng/ml IL-17刺激0、15、30、60min。本实施例对比了各组NF-κB pP65，NF-κB P65，IκBα，pIκBα等蛋白质的表达情况。
将收集的MSC细胞用冰冷的PBS洗涤，用溶解缓冲液(0.5％TritonX-100,20mMHepes pH7.4,150mM氯化钠,12.5mMβ-磷酸甘油,1.5mM氯化镁,2mM EGTA)在冰上裂解15分钟。溶解缓冲液中包含蛋白酶抑制剂：Na3V04(SO)，NaF和PMSF。样品煮沸10分钟待蛋白变性后，加至在10％SDS-PAGE凝胶上进行电泳。将电泳好的蛋白转移到硝基纤维素印迹膜上。待转移后，把印迹膜置于TBST(150mM NaCl,50mM Tris-HCl pH 7.5,0.05％Tween20)中清洗。室温下把膜至于在溶解于TBST的5％脱脂奶粉中孵育1小时进行封闭。印迹膜于一抗在4℃孵育过夜，于二抗在室温下孵育1小时后，用化学发光试剂进行显影。
本实施例分为两组，一组用100nM ATRA预处理MSC 6小时，另一组用等体积的PBS预处理MSC 6小时，再分别用50ng/ml IL-17刺激MSC 0、15、30、60分钟。
结果如图6所示。随着IL-17刺激时间延长，P65和IκBα蛋白磷酸化水平增加，而其本底量无明显改变，说明IL-17可活化NF-κB信号通路。但是当经过ATRA预处理后，P65和IκBα蛋白磷酸化水平减弱，说明ATRA抑制了IL-17对NF-κB信号通路的活化。
本实施例采用从骨髓中分离C57小鼠骨髓原代MSC的方法，按照5×105/孔的细胞量接种于6孔板中进行体外培养，待细胞聚合度达到70％-80％左右时，便可进行下一步实验。本实施例分别为采用等体积的PBS、IL-17、IFNγ、IFNγ+IL-17、IFNγ+IL-17+ATRA、IFNγ+IL-17+ATRA+BetA，分别处理MSC 6小时，其中ATRA终浓度为100nM、IL-17的终浓度为50ng/ml、IFNγ终浓度为10ng/ml、桦木酸(Betulinic acid,BetA)10ug/ml。BetA为NF-κB信号通路激动剂。然后通过定量PCR的方法检测巨噬细胞招募的趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL20的mRNA表达水平的变化。
实验结果如图7所示。由左至右为CCL2、CCL5、CCL7、CCL20的mRNA相对表达量分析结果；各图由左至右的6个柱依序表示PBS处理的对照实验(即“Ctrl”)、IL-17处理6h实验组(即“IL-17”)、IFNγ处理6h实验组(即“IFNγ”)、IFNγ+IL-17处理6h实验组(即“IFNγ+IL-17”)、IFNγ+IL-17+RA处理6h实验组(即“IFNγ+IL-17+RA”)、IFNγ+IL-17+RA+BetA处理6h实验组(即“IFNγ+IL-17+RA+BetA”)。
结果显示，加入NF-κB信号通路激动剂BetA后，可以改善ATRA对IFNγ+IL-17模拟的TA-MSC诱导巨噬细胞招募的趋化因子的抑制作用。这说明ATRA通过抑制TA-MSC的NF-κB信号通路的活化来降低巨噬细胞招募的趋化因子的表达。
以上结果说明，在体外模拟TA-MSC的培养体系中加入ATRA，可通过抑制NF-κB信号通路的活化，从而抑制巨噬细胞招募的趋化因子的表达，抑制其对肿瘤生长的促进作用。
以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
Claims (10)
1.全反式维甲酸在抑制肿瘤相关的间充质干细胞促进肿瘤生长中的应用。
2.全反式维甲酸在降低肿瘤相关的间充质干细胞表达巨噬细胞招募的趋化因子中的应用。
3.全反式维甲酸在抑制肿瘤相关的间充质干细胞的NF-κB信号通路的活化中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述全反式维甲酸添加的终浓度为90～120nM。
5.一种制备抗肿瘤间充质干细胞的培养基，其特征在于，包括：
全反式维甲酸和充质干细胞基础培养基。
6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述全反式维甲酸在所述培养基的终浓度为90～120nM。
7.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述充质干细胞基础培养基包括含有胎牛血清的低糖DMEM培养基。
8.一种抗肿瘤间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括：
将取出组织或器官分离处理得到的间充质干细胞进行原代培养；
待所述间充质干细胞贴壁后，在间充质干细胞基础培养基中添加IL-17和IFNγ刺激后，待所述间充质干细胞转化为肿瘤相关的间充质干细胞，再在所述肿瘤相关的间充质干细胞的培养基中添加全反式维甲酸继续培养，制得抗肿瘤间充质干细胞。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述全反式维甲酸在所述肿瘤相关的间充质干细胞的培养基中的终浓度为90～120nM。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述继续培养的时间为5～7h。
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