CN113234014B - 一种检测氨肽酶n的聚集诱导发射荧光探针及其制备 - Google Patents
一种检测氨肽酶n的聚集诱导发射荧光探针及其制备 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113234014B CN113234014B CN202110452636.XA CN202110452636A CN113234014B CN 113234014 B CN113234014 B CN 113234014B CN 202110452636 A CN202110452636 A CN 202110452636A CN 113234014 B CN113234014 B CN 113234014B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- compound
- solution
- dissolved
- probe
- aminopeptidase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 title claims abstract description 47
- QZDDFQLIQRYMBV-UHFFFAOYSA-N 2-[3-nitro-2-(2-nitrophenyl)-4-oxochromen-8-yl]acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(C(C=2[N+]([O-])=O)=O)=C1OC=2C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O QZDDFQLIQRYMBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 19
- 108010049990 CD13 Antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 39
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 claims description 9
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 9
- SMUQFGGVLNAIOZ-UHFFFAOYSA-N quinaldine Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C)=CC=C21 SMUQFGGVLNAIOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 9
- RGHHSNMVTDWUBI-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzaldehyde Chemical compound OC1=CC=C(C=O)C=C1 RGHHSNMVTDWUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 claims description 8
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- QVHJQCGUWFKTSE-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)OC(C)(C)C QVHJQCGUWFKTSE-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 5
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 5
- AXKGIPZJYUNAIW-UHFFFAOYSA-N (4-aminophenyl)methanol Chemical compound NC1=CC=C(CO)C=C1 AXKGIPZJYUNAIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007821 HATU Substances 0.000 claims description 4
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CUONGYYJJVDODC-UHFFFAOYSA-N malononitrile Chemical compound N#CCC#N CUONGYYJJVDODC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005457 ice water Substances 0.000 claims description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 3
- QDRKDTQENPPHOJ-UHFFFAOYSA-N sodium ethoxide Chemical compound [Na+].CC[O-] QDRKDTQENPPHOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Substances [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910020667 PBr3 Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 abstract description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 abstract description 3
- NTVVLLHKCZJVKS-UHFFFAOYSA-N 2-quinolin-2-ylpropanedinitrile Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C(C#N)C#N)=CC=C21 NTVVLLHKCZJVKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 125000001980 alanyl group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 101150058497 ANPEP gene Proteins 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 2
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 2
- 101710107035 Gamma-glutamyltranspeptidase Proteins 0.000 description 2
- 101710173228 Glutathione hydrolase proenzyme Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000004459 Nitroreductase Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 102000006640 gamma-Glutamyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 108020001162 nitroreductase Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- WDBQJSCPCGTAFG-QHCPKHFHSA-N 4,4-difluoro-N-[(1S)-3-[4-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)piperidin-1-yl]-1-pyridin-3-ylpropyl]cyclohexane-1-carboxamide Chemical compound FC1(CCC(CC1)C(=O)N[C@@H](CCN1CCC(CC1)N1C(=NN=C1C)C(C)C)C=1C=NC=CC=1)F WDBQJSCPCGTAFG-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- BWGRDBSNKQABCB-UHFFFAOYSA-N 4,4-difluoro-N-[3-[3-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)-8-azabicyclo[3.2.1]octan-8-yl]-1-thiophen-2-ylpropyl]cyclohexane-1-carboxamide Chemical compound CC(C)C1=NN=C(C)N1C1CC2CCC(C1)N2CCC(NC(=O)C1CCC(F)(F)CC1)C1=CC=CS1 BWGRDBSNKQABCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021592 Copper(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108010004098 Leucyl aminopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102000002704 Leucyl aminopeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- LFZAGIJXANFPFN-UHFFFAOYSA-N N-[3-[4-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)piperidin-1-yl]-1-thiophen-2-ylpropyl]acetamide Chemical compound C(C)(C)C1=NN=C(N1C1CCN(CC1)CCC(C=1SC=CC=1)NC(C)=O)C LFZAGIJXANFPFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100016586 Natronomonas pharaonis hcy gene Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- OKJPEAGHQZHRQV-UHFFFAOYSA-N Triiodomethane Natural products IC(I)I OKJPEAGHQZHRQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008832 photodamage Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
- C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D215/12—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
- C07D215/14—Radicals substituted by oxygen atoms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
- C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
- C09K2211/1007—Non-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
- C09K2211/1014—Carbocyclic compounds bridged by heteroatoms, e.g. N, P, Si or B
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
- C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
- C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测氨肽酶N的聚集诱导发射荧光探针及其制备方法，所述的探针化合物结构如式Ⅰ所示。该探针分子由三个主要部分组成：基于喹啉‑丙二腈的聚集诱导发射荧光团，可自我裂解的连接基团和氨肽酶N（APN）特异性识别基团。当探针化合物N‑末端丙氨酰位点被APN准确水解为氨基后，暴露出的氨基作为供电子基团，促进了共轭体系的电子推拉效应，从而增强了荧光。优势在于，该探针响应速度快，灵敏度高，斯托克位移大，发射波长较长，当溶液浓度越高时，荧光发射越强，有效避免了聚集诱导荧光猝灭的问题。
Description
技术领域
本发明涉及小分子荧光探针原位检测活性酶在细胞中的位置和表达水平，更具体地说是一种基于聚集诱导发射的荧光探针对内源性氨肽酶N含量的精确检测，属于荧光探针技术领域。
背景技术
氨基肽酶N（APN/CD13），称为膜结合锌离子依赖性II型金属蛋白酶，可以降解蛋白多肽链N端的中性或碱性氨基酸。APN相应地参与了体内许多重要的生理和病理过程，例如信号转导，免疫调节，生物活性肽的水解以及冠状病毒的入侵过程。许多研究表明，与正常细胞相比，APN在大多数肿瘤细胞的表面高度表达，同时APN在恶性肿瘤的生长，侵袭，转移和血管生成中起着至关重要的作用。因此，APN具有成为肿瘤细胞生物标志物的潜力，开发一种可追踪体内APN活性的有效方法具有重大医学意义。
近年来，小分子荧光成像技术引起了人们极大的兴趣，荧光成像在快速检测、高选择性、高灵敏度、出色的时间、空间分辨率和良好的生物相容性等方面具有明显的优势。到目前为止，已经报道了一些荧光探针来监测和可视化细胞中的APN。然而，目前常规的荧光探针大多都具有平面结构的疏水特征。此类探针在浓溶液或聚集状态下会出现聚集引起的荧光猝灭问题(ACQ)，这导致它们的发射减弱甚至猝灭。与普通的ACQ染料相反，聚集诱导发射(AIE)荧光染料具有可旋转的结构或扭曲的螺旋桨形构象，由于分子内运动的限制，这些染料可以产生高荧光发射。特别是，当溶液浓度越高时，它们的荧光发射越强。因此，AIE荧光团是检测生物体中APN的理想候选物。此外，发射波长较长(>600纳米)的探针具有很小的光损伤和更深组织穿透能力，可以最大限度地减少背景荧光所产生的不必要影响。然而，据我们所知，一种可激活的长发射波长检测APN的基于聚集诱导发射荧光探针几乎没有报道。
本发明公开了一种检测氨肽酶N的聚集诱导发射荧光探针及其制备方法，所述的探针化合物结构如式Ⅰ所示。该探针分子由三个主要部分组成：基于喹啉-丙二腈的聚集诱导发射荧光团，可自我裂解的连接基团和氨肽酶N（APN）特异性识别基团。当探针化合物N-末端丙氨酰位点被APN准确水解为氨基后，暴露出的氨基作为供电子基团，促进了共轭体系的电子推拉效应，从而增强了荧光。优势在于，该探针响应速度快，灵敏度高，斯托克位移大，发射波长较长，当溶液浓度越高时，荧光发射越强，有效避免了聚集诱导荧光猝灭的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题：一是提供一种检测氨肽酶N的聚集诱导发射荧光探针及其制备方法，所述探针化合物具有对癌细胞和组织内源性APN进行聚集诱导荧光原位成像的优点。二是提供一种荧光诊断试剂对过表达APN的肝癌细胞和正常细胞进行有效，准确的区分。三是提供一种灵敏度高、选择性好的荧光探针，可以改善探针组织穿透深度浅、背景荧光高的缺陷。
为了解决上述技术问题，采取的技术方案如下：
本发明提供一种检测氨肽酶N的聚集诱导发射荧光探针，具有如下分子结构式：
化合物MQ-N
本发明还提供一种检测氨肽酶N的聚集诱导发射荧光探针的制备方法，步骤包括：
（1）(a)在N2气氛下将2-甲基喹啉（1 eq）和碘甲烷（2.5-3 eq）溶解在乙腈中，并将反应液回流10-15小时，减压浓缩得到化合物1；(b)将化合物1（1 eq）和丙二腈（2.5-3 eq）溶于无水乙醇中，在0°C下不断搅拌，加入乙醇钠后反应5-8小时，将混合物倒入冰水中，调节pH（7.5-8.5）后，将产生的沉淀物过滤，得到化合物2；(c)将化合物2（1 eq）和对羟基苯甲醛（1.2-1.8 eq）溶解在的乙腈中，然后将哌嗪加入到该溶液中，将混合物在N2气氛下回流8-12小时，柱纯化（二氯甲烷/石油醚）得到化合物3；
（2）(d)在0°C下，将Boc-L-丙氨酸（1 eq），HATU（1-1.2 eq）和DIPEA（2-3 eq）溶于无水二氯甲烷溶液中，在室温下搅拌0.5-1.5小时，在反应混合物中加入对氨基苯甲醇（1-1.2 eq），并在室温下进一步搅拌24-30小时，柱纯化（二氯甲烷/甲醇）得到化合物4；(e)将化合物4（1 eq）溶解于无水四氢呋喃中，并在0°C下加入PBr3（1.2-1.6 eq），将混合物搅拌2-5小时，柱纯化（石油醚/乙酸乙酯）得到化合物5；
（3）(f)将化合物3（1 eq）和化合物5（1.1-1.2 eq）溶解无水DMF溶液中，然后加入K2CO3，并在120°C下搅拌6-8小时，柱纯化（石油醚/乙酸乙酯）得到化合物MQ-N。
本发明的优点:
本发明的荧光探针分子，具有聚集诱导荧光发射的性质，可以有效降低背景荧光对检测信号的干扰，提高活体成像中的组织穿透深度。
本发明的荧光探针分子，对氨肽酶N的响应速度非常快，在20分钟内即可完全响应，可以应用于快速检测复杂样品中的酶含量。
本发明的荧光探针分子，具有良好的灵敏度和选择性，荧光信号仅在氨肽酶N存在的条件下发生，其它常见的无机盐、氨基酸、生物酶等均无法使探针溶液产生荧光光谱的变化。
因此，本发明为非侵入性监控活体内亮氨酸氨肽酶活性的变化提供了一种可靠的手段。在生物分析检测领域具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
一种检测氨肽酶N的聚集诱导发射荧光探针的制备方法，步骤包括：
1）化合物1的合成：
在N2气氛下将2-甲基喹啉（1.79 g，12.5 mmol）和碘甲烷（5.50 g，35 mmol）溶解在乙腈（25 mL）中，并将反应液回流10小时，减压蒸发除溶剂，得到化合物1，产率75％。
化合物2的合成：
将化合物1（1.74 g，6 mmol）和丙二腈（1.20 g，18 mmol）溶于无水乙醇（15 mL）中，在0°C下不断搅拌，加入乙醇钠后反应6小时，将混合物倒入冰水中，调节pH为8后，将产生的沉淀物过滤，用水洗涤并真空干燥，得到化合物2，产率85％。
化合物3的合成：
将化合物2（1.40 g，7.5 mmol）和对羟基苯甲醛（1.65 g，13.5 mmol）溶解在的乙腈（30 mL）中，然后将哌嗪加入到该溶液中，将混合物在N2气氛下回流12小时，减压蒸发除溶剂，柱纯化（二氯甲烷/石油醚=2/1）得到化合物3，产率65％。
2）化合物4的合成：
在0°C下，将Boc-L-丙氨酸（0.17 g，0.9 mmol），HATU（0.42 g，1.1 mmol）和DIPEA（0.37 mL，2.3 mmol）溶于无水二氯甲烷溶液（30 mL）中，在室温下搅拌1.2小时，在反应混合物中加入对氨基苯甲醇（0.14 g，1.1 mmol），并在室温下进一步搅拌25小时，减压蒸发除溶剂，柱纯化（二氯甲烷/甲醇=20/1）得到化合物4，产率70％。
化合物5的合成：
(e)将化合物4（0.59 g，2 mmol）溶解于无水四氢呋喃（10 mL）中，并在0°C下加入PBr3（0.23 mL，2.4 mmol），将混合物搅拌3小时，减压蒸发除溶剂，柱纯化（石油醚/乙酸乙酯=9/1）得到化合物5，产率40％。
3）化合物MQ-N的合成：
将化合物3（0.37 g，1.1 mmol）和化合物5（0.43 g，1.2 mmol）溶解无水DMF溶液（5mL）中，然后加入K2CO3，并在120°C下搅拌7小时，减压蒸发除溶剂，柱纯化（石油醚/乙酸乙酯=10/1）得到化合物MQ-N，产率65％。
实施例2
探针MQ-N吸收光谱和荧光光谱的测量
取实施例1合成的MQ-N于试管中，制备探针MQ-N在DMSO中的储备液（1.0 mM）。在蒸馏水中制备NaCl，KCl，CaCl2，ZnCl2，MgCl2，CuCl2，H2O2，NaClO，葡萄糖，GSH，Cys，Hcy，碱性磷酸酶，γ-谷氨酰转肽酶，硝基还原酶，羧酸酯酶等原液。以上储备液均用磷酸盐缓冲液将最终体积调节至5 mL。对于光谱实验，将MQ-N储备溶液与一定量的分析物在pH=7.4下在石英比色皿中孵育30分钟后，取3 mL反应溶液转移至1 cm石英皿中，将激发设置为480 nm，发射波长为500-700 nm。同时，制备没有氨肽酶N的对照组，并在相同条件下进行比较。MQ-N在350 nm和425 nm附近显示出双吸收峰，向胶束探针中添加APN后，以350 nm为中心的吸收峰减弱，随后在425 nm处的峰显著增加。然后评估探针MQ-N在不同浓度的APN处理下的特性，随着APN的增加，荧光强度在630 nm处逐渐增加。实验数据表明，MQ-N对APN具有相当高的灵敏度，并且可以定量检测APN浓度。
实施例3
评估不同pH值、温度对探针MQ-N荧光的影响
取实施例2中MQ-N储备溶液（10 μM），探针在pH范围为4.0-8.0和温度范围为23-40°C时几乎是无荧光的，这表明探针具有很高的稳定性。与氨肽酶N反应后，尽管最大荧光强度出现在6.0-7.4的pH范围内，但探针在整个测试的pH范围中都产生了显着的荧光响应。另一方面，反应溶液的最强荧光出现在约37°C时，这与酶通常在37°C下具有最大活性的事实相符。结果表明探针MQ-N在正常生理条件下具有良好的功能。
实施例4
探针MQ-N对APN的特异性检测
取实施例2中MQ-N储备溶液（10 μM），测试了探针对APN的荧光响应以及一些潜在的干扰物，例如一些可能与探针或APN形成复合物的金属离子（Na+，K+，Ca2+，Zn2+，Mg2+和Cu2 +），可能会氧化探针的活性氧（NO2 -，NO，HNO，1O2，H2O2，ClO-，TBHP，·OH和O2 -），生物分子（GSH，Hcy和Cys）和APN相关的酶（碱性磷酸酶，γ-谷氨酰转肽酶，硝化还原酶，羧酸酯酶，β-半乳糖苷酶等）。当APN加入MQ-N溶液中后，在630 nm处的荧光强度明显增强，但是其他物质未能引起明显的荧光变化。随后对APN和其他干扰物质进行进一步的竞争性实验，结果表明APN诱导的荧光响应不受其他干扰的影响。因此，探针MQ-N在各种竞争性分析物中对APN具有优越的选择性。
实施例5
MQ-N对癌细胞的毒性及内源性APN的测定
通过使用线粒体脱氢酶将MTT还原的方法来测试细胞活力。将HepG-2细胞以1×105细胞/ mL的密度接种在96孔微孔板中，其中含有LBS的培养基。细胞附着24小时后，然后将板用PBS洗涤，将细胞在含有0、1、2、5和10 μM探针MQ-N的培养基中培养24小时。同时，设置未与探针MQ-N培养的细胞用作对照。将MTT（10 μL，5 mg/mL）注入每个孔中，并将板在5％CO2湿润的培养箱中孵育4小时。然后除去培养基，利用酶标仪于490 nm下测定溶液的光密度，评估细胞活力。当用不同浓度MQ-N处理细胞24小时后，仍有90％以上的细胞存活，证明了探针对细胞具有低毒性。随后，通过共聚焦荧光显微镜评估了MQ-N在追踪癌细胞和正常细胞中内源性APN能力。在MQ-N（5μM）和37°C的5％CO2中对细胞进行0.5小时预处理，正常细胞中几乎没有荧光。相比之下，在探针与癌细胞孵育后，红色荧光信号急剧增加。因此，这些数据表明，探针MQ-N表现出良好的膜通透性，可以有效区分癌细胞和正常细胞。
上述仅为本发明的优选具体实施方式，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
Claims (4)
1.一种检测氨肽酶N的聚集诱导发射荧光探针的制备方法，其特征在于，所述化合物结构如式Ⅰ所示：
式Ⅰ；
该方法的制备步骤如下：
（1）(a)在N2气氛下将2-甲基喹啉和碘甲烷溶解在乙腈中，并将反应液回流10-15小时，减压浓缩得到化合物1；(b)将化合物1和丙二腈溶于无水乙醇中，在0°C下不断搅拌，加入乙醇钠后反应5-8小时，将混合物倒入冰水中，调节pH后，将产生的沉淀物过滤，得到化合物2；(c)将化合物2和对羟基苯甲醛溶解在的乙腈中，然后将哌嗪加入到该溶液中，将混合物在N2气氛下回流8-12小时，柱纯化得到化合物3；
（2）(d)在0°C下，将Boc-L-丙氨酸，HATU和DIPEA溶于无水二氯甲烷溶液中，在室温下搅拌0.5-1.5小时，在反应混合物中加入对氨基苯甲醇，并在室温下进一步搅拌24-30小时，柱纯化得到化合物4；(e)将化合物4溶解于无水四氢呋喃中，并在0°C下加入PBr3，将混合物搅拌2-5小时，柱纯化得到化合物5；
（3）(f)将化合物3和化合物5溶解无水DMF溶液中，然后加入K2CO3，并在120°C下搅拌6-8小时，柱纯化得到化合物MQ-N
2.根据权利要求1所述的一种检测氨肽酶N的聚集诱导发射荧光探针的制备方法，其特征在于：所述的步骤（1）(a)中2-甲基喹啉和碘甲烷摩尔比范围为1：（2.5～3）；2-甲基喹啉溶于乙腈溶液的摩尔浓度范围为0.35～0.55 mol·L-1；(b)中化合物1和丙二腈摩尔比范围为1：（2.5～3）；化合物1溶于乙醇溶液的摩尔浓度范围为0.3～0.45 mol·L-1；调节pH范围为7.5～8.5；(c)中化合物2和对羟基苯甲醛摩尔比范围为1：（1.2～1.8）；化合物2溶于乙腈溶液的摩尔浓度范围为0.2～0.35 mol·L-1；柱纯化中二氯甲烷和石油醚体积比为（2～1）：1。
3. 根据权利要求1所述的一种检测氨肽酶N的聚集诱导发射荧光探针的制备方法，其特征在于：所述的步骤（2）(d)中Boc-L-丙氨酸，对氨基苯甲醇，HATU和DIPEA摩尔比范围为1：（1～1.2）：（1～1.2）：（2～3）；Boc-L-丙氨酸溶于无水二氯甲烷溶液的摩尔浓度范围为0.025～0.035 mol·L-1；柱纯化中二氯甲烷和甲醇体积比为（20～15）：1；(e)中化合物4和PBr3摩尔比范围为1：（1.2～1.6）；化合物4溶于无水四氢呋喃溶液摩尔浓度范围为0.2～0.26 mol·L-1；柱纯化中石油醚和乙酸乙酯体积比为（10～5）：1。
4. 根据权利要求1所述的一种检测氨肽酶N的聚集诱导发射荧光探针的制备方法，其特征在于：所述的步骤（3）(f)中化合物3和化合物5摩尔比范围为1：（1.1～1.2）；化合物3溶于无水DMF溶液摩尔浓度范围为0.2～0.24 mol·L-1；柱纯化中石油醚和乙酸乙酯体积比为（10～6）：1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110452636.XA CN113234014B (zh) | 2021-04-26 | 2021-04-26 | 一种检测氨肽酶n的聚集诱导发射荧光探针及其制备 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110452636.XA CN113234014B (zh) | 2021-04-26 | 2021-04-26 | 一种检测氨肽酶n的聚集诱导发射荧光探针及其制备 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113234014A CN113234014A (zh) | 2021-08-10 |
| CN113234014B true CN113234014B (zh) | 2022-04-26 |
Family
ID=77129241
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110452636.XA Expired - Fee Related CN113234014B (zh) | 2021-04-26 | 2021-04-26 | 一种检测氨肽酶n的聚集诱导发射荧光探针及其制备 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113234014B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115109079B (zh) * | 2022-06-21 | 2023-07-04 | 南京工业大学 | 聚氨酯降解酶特异性荧光探针、其制备方法及应用 |
| CN116987131B (zh) * | 2022-12-08 | 2024-05-28 | 中国科学院昆明动物研究所 | 一种靶向衰老细胞的近红外生物探针及其制备方法与用途 |
| CN116693610B (zh) * | 2023-06-16 | 2024-05-03 | 安阳师范学院 | 用于测定多肽连接酶的探针分子、测定转肽酶a的方法及应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107011324A (zh) * | 2016-01-28 | 2017-08-04 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 二肽基肽酶iv酶近红外荧光探针底物及其制备方法与应用 |
| CN110330505B (zh) * | 2019-07-30 | 2021-07-09 | 济南大学 | 一种用于氨肽酶n检测的双光子比率型荧光探针化合物及其制备方法 |
-
2021
- 2021-04-26 CN CN202110452636.XA patent/CN113234014B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113234014A (zh) | 2021-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113234014B (zh) | 一种检测氨肽酶n的聚集诱导发射荧光探针及其制备 | |
| CN110283583B (zh) | γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针及其应用 | |
| CN106749034B (zh) | 对亚硫酸氢根和次氯酸根双响应比率型荧光标记试剂及其合成方法和应用 | |
| CN114478473B (zh) | 一种亮氨酸氨基肽酶化学发光检测试剂的合成及应用 | |
| Liu et al. | Development of a mitochondria targetable ratiometric time-gated luminescence probe for biothiols based on lanthanide complexes | |
| Han et al. | Rational design of a lysosomal-targeted ratiometric two-photon fluorescent probe for imaging hydrogen polysulfides in live cells | |
| US8968997B2 (en) | Benzoxazole-based fluorescent metal ion indicators | |
| CN1715919A (zh) | 细胞锌离子检测用的氟硼染料荧光探针 | |
| CN112794857B (zh) | 一种可用于亚铁离子检测的荧光探针及制备和应用 | |
| CN113061109B (zh) | 吗啉-吡啶-部花菁衍生物荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN113637048B (zh) | 一种γ-谷氨酰转肽酶的双光子荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN110218215B (zh) | 一种双光子比率型荧光探针在检测单胺氧化酶b中的应用 | |
| CN110330505B (zh) | 一种用于氨肽酶n检测的双光子比率型荧光探针化合物及其制备方法 | |
| CN114195839A (zh) | 用于葡萄糖醛酸酶检测的溶酶体靶向荧光探针及其制备 | |
| CN111635385B (zh) | 一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN109369565A (zh) | 一种苯并噻唑衍生物及其制备方法和应用 | |
| CN114605376A (zh) | 一种检测半胱氨酸和粘度的双功能荧光探针及其制备 | |
| Li et al. | A novel dual-capability naphthalimide-based fluorescent probe for Fe 3+ ion detection and lysosomal tracking in living cells | |
| CN113025313A (zh) | 吗啉-吡啶-部花菁衍生物作为硫化氢荧光探针的应用 | |
| CN115745991B (zh) | 一种靶向溶酶体的检测so2衍生物或粘度比率荧光探针及其应用 | |
| KR102089393B1 (ko) | 미토콘드리아 내 nad(p)h 검출을 위한 형광 프로브 및 이를 이용한 검출방법 | |
| CN116462639B (zh) | 一种特异性识别丙氨酸氨基肽酶的荧光探针及制备方法和应用 | |
| CN114507204B (zh) | 一种高尔基体靶向超氧阴离子荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN113173952B (zh) | 用于药物释放监测的邻二硫醇反应性治疗探针及制备 | |
| KR102598150B1 (ko) | 신규한 페닐알라닌 유도체 화합물 및 이의 구리(Cu2+) 이온 검출 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20220426 |