CN113227149A - 抗tm4sf4抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的特异性结合四跨膜蛋白超家族成员4(Transmembrane 4 Superfamily Member 4，TM4SF4)的抗体或其抗原结合片段。这些抗体或其抗原结合片段表现出癌细胞的增殖抑制活性，从而有效地预防或治疗癌症，并且降低癌干细胞的自我更新能力，以便甚至在常规抗癌治疗中的预后差的癌症治疗中有效使用。

Description

抗TM4SF4抗体及其用途
技术领域
本发明涉及特异性结合四跨膜蛋白超家族成员4(TM4SF4)的抗体或其抗原结合片段，以及包括其的用于预防或治疗癌症的组合物。
背景技术
已经报道四跨膜蛋白超家族成员4(Transmembrane 4 Superfamily Member 4，TM4SF4)是一种类型的四跨膜(tetraspanin)蛋白，并且该类的其它蛋白质TM4SF1和TM4SF5在许多肿瘤中表达上调、并且参与上皮-间充质细胞转移和细胞迁移，已经进行了许多与癌细胞相关的研究。据报道TM4SF4参与癌细胞中细胞的凋亡、分化和侵入能力。然而，关于癌干细胞的特征，尚不知道，并且尚未进行其研究。最近，本发明的研究人员报道TM4SF4蛋白促进人肺癌细胞中的癌干细胞生长、自我更新(Self-renewal)能力和转移/侵入。此外，研究人员已经提示TM4SF4促进IGF1Rβ/AKT/NFκB或JAK2(或FAK)/STAT3在癌症发生中作为重要的信号传导***的激活，并通过由此被促进的细胞因子的分泌来增强癌干细胞的特征，从而使肿瘤更恶性(Choi SI et al.,Oncotarget.2014；5(20):9823-9837、Choi SI etal.,Oncotarget.2017；8(60):101284-101297)。
抗体由于其对靶抗原的高结合特异性和在人体中的稳定性，已被用作治疗剂。特别是，基于抗体工程技术的发展，具有抗癌功能的抗体被改进为人源化抗体、单链抗体、双抗体和药物融合抗体，以大大提高癌症治疗的功效，并且已经被利用。然而，由于癌症特征的多样性和通过表达新抗原诱导对治疗的抗性，在相关领域中用于靶向癌细胞的抗原类型的限制被指出，并且研究继续寻找新的癌症特异性抗原并获得针对该抗原的抗体。
特别是，对于对现有癌症治疗中使用的靶向药物或放射疗法显示出抗性并复发的癌症来说，已经报道了癌干细胞的特征被重要地应用，因此，发现可以用于靶向癌干细胞的抗原和确保特异的抗体，其重要性正在被放大。
在这种技术背景下，发明人已进行了许多努力以开发靶向癌干细胞的新抗体，结果开发了以高亲和力结合TM4SF4的新抗TM4SF4抗体，发现该新抗体不仅显著抑制包括癌干细胞在内的肿瘤细胞的增殖，而且具有优异的抗癌效果，从而完成了本发明。
发明内容
【技术问题】
因此，本发明的一个目的是提供特异性结合四跨膜蛋白超家族成员4(Transmembrane 4 Superfamily Member 4，TM4SF4)的抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一个目的是提供编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包括所述核酸分子的表达载体、包括所述表达载体的宿主细胞和用于产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养所述宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测TM4SF4的包括所述抗体或其抗原结合片段的组合物、包括其的检测试剂盒，以及使用其检测TM4SF4抗原的方法。
本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗癌症的药物组合物，包括所述抗体或其抗原结合片段；用于抑制癌干细胞生长的组合物；以及用于辅助化学辐射治疗的组合物。
【技术方案】
为了实现这些目的，本发明的一个方面提供了特异性结合四跨膜蛋白超家族成员4(Transmembrane 4Superfamily Member 4，TM4SF4)的抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一方面提供了编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
本发明的另一方面提供了包括所述核酸分子的表达载体。
本发明的另一方面提供了包括所述表达载体的宿主细胞。
本发明的另一方面提供了用于产生抗体或其抗原结合片段的方法，包括培养宿主细胞。
本发明的再一方面提供了用于检测TM4SF4的组合物和试剂盒，包括所述抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一方面提供检测TM4SF4抗原的方法，包括使抗体或其抗原结合片段与预期包括TM4SF4抗原的待检测样品接触。
本发明的另一方面提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包括(a)治疗有效剂量的抗体或其抗原结合片段；和(b)药学上可接受的载体。
本发明的另一方面提供了一种抑制癌干细胞生长的组合物。
本发明的另一方面提供了一种用于辅助化学放射疗法的组合物，其包括抗体或其抗原结合片段。
【有益效果】
本发明的特异性结合TM4SF4的抗体或其抗原结合片段具有新序列，并表现出优异的癌细胞增殖抑制活性，从而有效地预防或治疗疾病如癌症。
此外，可以通过降低癌干细胞的自我更新能力、侵入能力和迁移能力来抑制癌干细胞的生长，从而有效地治疗对现有抗癌治疗方法有抗性的癌症。
此外，将现有的抗癌剂或放射疗法组合治疗以进一步提高抗癌活性，可以显著减少抗癌剂的使用以减少由使用抗癌剂引起的副作用，并且作为能够显著改善化学放射疗法对由于对常规放射疗法的抗性而不易治疗的受试者的效果的技术，其对于治疗具有常规抗癌治疗的不良预后的癌症是有用的。
因此，本发明的新的抗体或其抗原结合片段可有效地用于开发靶向TM4SF4的新抗体药物。
附图说明
图1显示了TM4SF4蛋白中本发明的抗体或其抗原结合片段特异性结合的表位区域：所述表位区域代表TM4SF4蛋白暴露在细胞膜外区域126至140位的15mer肽；G代表糖基化位点；C代表形成二硫键的半胱氨酸。
图2显示了通过从杂交瘤细胞培养液中纯化五种新抗体ECL-2B7、ECL-4C1、ECL-8E2、ECL-8E5和ECL-12A8来确认纯度的结果。从每种抗体的重链IgG-HC和轻链IgG-LC分别在55kDa和26kDa的位置上被鉴定的事实，可以确认新抗体是IgG型抗体，未还原的IgG鉴定为位于170kDa以上的条带(IgG)，并且牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)是用于比较蛋白量的对照组。
图3通过进行针对TM4SF4(126-140)-BSA抗原的ELISA，显示了本发明的新抗体的抗原应答性。以500-4ng/孔的水平包被抗原，并在X轴上所示的范围(200至0.8ng/孔)内处理抗体。所有五种抗体对肽抗原(A到E)都表现出高应答性。特别地，当使用100ng/孔的肽包被的抗原通过ELISA来比较结果时，可以看出抗体2B7、4Cl和12A8显示高抗原亲和力(F)。
图4显示了通过使用分子间相互作用分析(Biocore)确定制备的抗体是否特异性结合TM4SF4蛋白，从而确认本发明新抗体的抗原应答性的结果。使用抗体ECL-2B7、ECL-4C1和ECL-12A8，观察到对各浓度的特异性结合值的变化显着移动，并且确认测得的结合值高。可以观察到，图形增加的结合时间随时间而增加，并且当结合在480秒时被抑制时，结合能力降低，这是在分子间相互作用分析中显示的具有高结合能力的抗体的典型形式。
图5显示了通过免疫沉淀分析，确定制备的抗体是否特异性结合TM4SF4蛋白，从而确认本发明新抗体的抗原应答性的结果。图5A显示了使用新抗体或小鼠抗GAPDH抗体作为对照组抗体，在HEK293T细胞中表达FLAG表达载体或FLAG-TM4SF4表达载体，并通过Western印迹检测具有抗FLAG抗体的免疫沉淀物，获得的免疫沉淀细胞裂解物(样品1和2)的结果。图5B显示了用抗小鼠抗体HRP验证免疫沉淀物的抗体剂量以验证是否已将相同量的抗体加入免疫沉淀实验的结果。
图6显示了进行免疫荧光分析以验证本发明的新抗体是否特异性结合靶抗原的结果。图6A显示了验证新抗体与HEK293T细胞表面表达的EGFP-TM4SF4结合的结果，图6B显示了验证新抗体与A549细胞表面存在的TM4SF4特异性结合的结果。特别是，当siRNA抑制TM4SF4抗原的表达时，确认抗体反应消失，再次验证到新抗体特异性结合TM4SF4抗原。
图7是表示确认本发明的新型抗体对癌干细胞的自我更新能力的抑制效果的图。ECL-2B7和ECL-4C1作为新抗体使用，对照组(con)使用Sigma的抗TM4SF4抗体。左侧是用光学显微镜观察癌干细胞的形成球的能力，右侧是显示形成的球的直径长度的图。
图8显示了确认本发明的新型抗体对癌细胞的迁移能力和侵入能力的抑制效果。ECL-2B7和ECL-4C1作为新抗体使用，对照组(con)使用Sigma的抗TM4SF4抗体。左侧是通过染色观察迁移细胞和侵入细胞，右侧是显示相对于对照组的相对迁移能力和侵入能力的图。在迁移(migration)实验中，进行三重复实验共4次，在侵入(invation)实验中，进行三重复实验3次。
图9显示了确认本发明的新抗体改善癌细胞辐射敏感性的作用。用抗体ECL-2B7、ECL-4C1和ECL-12A8处理A549细胞(A)和Huh7细胞(B)，然后用6Gy辐射以确认细胞的集落形成减少。
图10显示了通过Western印迹确认新型抗体的机制。使用ECL-2B7、ECL-4C1、ECL-8E2和ECL-12A8作为抗体，使用A549细胞作为癌细胞。当处理每种抗体时，观察到作为癌干细胞标记蛋白的ALDH1A1、ALDH1A3和CD44减少，而参与癌干细胞自我更新的β-连环蛋白(β-catenin)和Oct4减少。此外，确认了当处理每种抗体时，已知为涉及标记和自我更新能力调节剂的信号传导途径的IGF1β和PI3K-AKT信号传导途径，被减少，因此本发明的新抗体是抑制IFG1Rβ和PI3K-AKT信号传导途径来调节癌干细胞。
图11显示了进行肺癌异种移植试验(Xenograft assay)动物实验以验证本发明的新抗体的抗癌作用的结果。当癌组织的大小为30mm3或更大(A、B)或200mm3或更大(C、D)时，将抗体直接注射到癌组织中。在两个实验中，以相同的方式每次注射13μg抗体/受试者，共注射6次(B和D中的箭头所示日期)，并以2至3天的间隔测量癌组织的大小。
图12显示了进行RT-PCR和克隆以对本发明的新抗体的互补决定区(complementarity determining region，CDR)进行测序的结果：使用含有限制酶序列的引物，通过RT-PCR扩增ECL-2B7抗体的IgG1亚型重链基因和κ轻链基因(A)，和ECL-4C1抗体的IgG2A亚型重链基因和κ轻链基因(B)，并克隆到载体中。克隆到载体中的序列通过限制性酶的切割来再次确认，然后在抗体基因位点上进行核苷酸测序。用EcoRI和SalI切割每种抗体的重链基因，用HindIII和SalI切割轻链基因，以在琼脂糖凝胶上鉴定。黑色箭头：切割后的载体(V)，箭头：切割的***基因(C，D)。
图13a显示了新抗体ECL-2B7重链可变区的核苷酸序列和蛋白序列的分析结果。通过Kabat编号排列根据抗体结构的抗原识别决定区，并在序列中表示为CDR1、2和3。
图13B显示了新抗体ECL-2B7轻链可变区的核苷酸序列和蛋白序列的分析结果。通过Kabat编号排列根据抗体结构的抗原识别决定区，并在序列中表示为CDR1、2和3。
图14a显示了新抗体ECL-4C1重链可变区的核苷酸序列和蛋白序列的分析结果。通过Kabat编号排列根据抗体结构的抗原识别决定区，并在序列中表示为CDR1、2和3。
图14b显示了新抗体ECL-4C1轻链可变区的核苷酸序列和蛋白序列的分析结果。通过Kabat编号排列根据抗体结构的抗原识别决定区，并在序列中表示为CDR1、2和3。
图15显示了通过集落形成能力观察本发明的新抗体杀伤癌细胞的效果的结果。使用肺癌细胞系(H1299)、肝癌细胞系(Huh7)、乳腺癌细胞系(MCF7和MDA-MB 231)和胰腺癌细胞系(MIA Paca-2)，在每个细胞中分别用5μg的ECL-2B7抗TM4SF4抗体(实验组)和小鼠IgG(对照组)处理，然后确认细胞的集落形成能力。可以观察到，在所用的所有细胞系中集落形成的程度降低，这表明本发明的抗体不仅可以应用于肺癌细胞，而且可以应用于肝癌细胞、乳腺癌细胞和胰腺癌细胞。
具体实施方式
以下，将详细描述本发明。
一方面，本发明提供了特异性结合四跨膜蛋白超家族成员4(Transmembrane4Superfamily Member 4，TM4SF4)的抗体或其抗原结合片段。
在本发明中，术语“抗体”是指作为特异性识别抗原的受体的蛋白质分子，包括对特定抗原具有免疫应答性的免疫球蛋白分子，例如，可以包括所有单克隆抗体、多克隆抗体、全长抗体(full-length antibody)和抗体片段。此外，术语“抗体”可以包括二价或双特异性分子(例如双特异性抗体)、双抗体(diabody)、三抗体或四抗体。
在本发明中，术语“单克隆抗体”指从基本上相同的抗体组获得的单分子组成的抗体分子，并且这样的单克隆抗体表现出针对特定表位的单结合特异性和亲和力。在本发明中，术语“全长抗体”是具有两条全长轻链和两条全长重链的结构，并且每条轻链通过二硫键与重链连接。重链恒定区具有γ、μ、α、δ和ε类型，以及γ1、γ2、γ3和γ4，α1和α2子类型。轻链可变区具有κ和λ类型。IgG亚型(subtype)，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在本发明中，术语“片段”、“抗体片段”和“抗原结合片段”可互换使用，是指本发明抗体的保留抗体的抗原结合功能的任何片段。示例性的抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双抗体、三链抗体、四链抗体、含有足以结合多肽的特异性抗原的一个或多个免疫球蛋白片段的多肽等，但不限于此。
Fab具有，具有轻链和重链可变区、轻链恒定区和重链第一恒定区(CH1结构域)，并具有一个抗原结合位点，的结构。抗体分子的抗原结合片段或抗体片段是指具有抗原结合功能的片段，并且Fab′具有包括在重链CH1结构域的C端的一个或多个半胱氨酸残基的铰链区(hinge region)，其不同于Fab。当Fab′铰链区中的半胱氨酸残基形成二硫键时，产生F(ab′)2抗体。Fv是指仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。双链Fv(two-chainFv)具有通过非共价键连接的重链可变区和轻链可变区，单链Fv(single-chain Fv)通常可以形成例如双链Fv的二聚体样结构，因为重链可变区和单链可变区通过肽接头共价连接或直接连接在C端。虽然不限于此，但这些抗体片段可以用蛋白水解酶获得[例如，用木瓜蛋白酶限制性切割整个抗体以获得Fab，并用胃蛋白酶切割以获得F(ab′)2片段]，或可以经基因重组技术产生。
在本发明中，术语“表位”(epitope)是指抗原上，免疫球蛋白和抗体或其抗原结合片段被特异性识别和结合的特异性位点。表位可以由连续氨基酸形成，或者由通过蛋白质的三级折叠而平行排列的不连续氨基酸形成。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供了在表位区域中结合TM4SF4蛋白的抗体或其抗原结合片段，在所述表位区域中，膜蛋白TM4SF4存在于暴露于细胞外的区域中。
表位区域可以是，例如，在从参考TM4SF4抗原(SEQ ID NO:1)的N端起的，位置4至33的GGCARCLGGTLIPLAFFGFLANILLFFPGG(SEQ ID NO:23)、位置53至67的LGSGVLMIFPALVFL(SEQ ID NO:24)、位置71至80的NNDCCGCCGN(SEQ ID NO:25)、位置92至112的STIFAVVGFLGAGYSFIISAI(SEQ ID NO:26)、位置116至122的KGPKCLM(SEQ ID NO:27)、位置127至133的YPWGFHD(SEQ ID NO:28)和位置146至198的CREPLNVVPWNLTLFSILLVVGGIQMVLCAIQVVNGLLGTLCGDCQCCGCCGG(SEQ ID NO:29)。更特别地，所述表位区域可以是在从参考TM4SF4抗原(SEQ ID NO:1)的N端起的，位置126至140的TWGYPFHDGDYLNDE(SEQ ID NO:2)。
此外，即使SEQ ID NO:2中描述的表位区域在本发明的抗体或其抗原结合片段结合的TM4SF4的抗原序列中包括一些突变(取代、添加或缺失)，或者结合位点或序列略微不同于以TM4SF4的片段、前体或亚型形式存在的结合抗原，本领域技术人员可基于参考TM4SF4抗原的表位序列信息清楚地指定本发明的抗原或其抗原结合片段结合的位置和序列。
在本发明的一个具体实施方案中，在TM4SF4的抗原结构中，选择由202个氨基酸组成的膜蛋白作为产生抗体的表位区域，该膜蛋白是暴露于细胞外的预期具有高抗体诱导能力且不具有糖基化或二硫键的位点(图1)。
作为本发明的另一个实施方案，所述抗体可以是(a)包括具有包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1、包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2和包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H3，的重链可变区，及具有包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L1、包括SEQID NO:7的氨基酸序列的CDR-L2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L3，的轻链可变区，的抗体；或(b)包括具有包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1、包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2和包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3，的重链可变区，及区具有包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1、包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2和包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3，的轻链可变区，的抗体。
在本发明中，术语“重链”可以包括全长重链及其片段，所述片段包括可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3，所述可变区结构域VH包括具有足以赋予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。另外，在本发明中，术语“轻链”包括全长轻链和其片段，所述片段包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL，所述可变区结构域VL包括具有足够的可变区序列以赋予抗原特异性的氨基酸序列。
在本发明中，抗体可以包括所有由小鼠产生的小鼠抗体，和通过取代、添加和/或缺失亲本抗体的部分氨基酸序列以便改善抗体的亲和性和免疫性而获得的变体。变体不限于此，但其实例可以包括嵌合抗体、人源化抗体、亲和力优化抗体等。变体一般是指在靶向相同表位的条件下，包括与亲本抗体相同的CDR，或突变(取代、添加或缺失)部分亲本抗体CDR氨基酸序列，的抗体。本领域技术人员可以适当地调整这些变体，以便在维持与相同表位的结合能力的范围内改善抗体的亲和性和免疫性。
即，本发明的抗体或其抗原结合片段不仅可包括本文所述的抗TM4SF4抗体的序列，还可包括在可特异性识别TM4SF4的范围内的其生物学等同物。例如，可对抗体的氨基酸序列进行额外的改变以进一步改善抗体的结合亲和性和/或其它生物学特性。这些修饰包括，例如，抗体的氨基酸序列残基的缺失、***和/或取代。这些氨基酸变体是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如疏水性、亲水性、电荷、大小等而制备的。通过分析氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型，可以看出精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似的大小；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可以是生物功能等同物。
在本发明中，术语“嵌合抗体”是通过重组小鼠抗体的可变区和人抗体的恒定区获得的抗体，以及与小鼠抗体相比具有大大改善的免疫应答的抗体。
在本发明中，术语“人源化抗体”是指其中源自非人物种的抗体的蛋白质序列被修饰为与在人中天然产生的抗体变体相似的抗体。例如，人源化抗体可以通过将小鼠来源的CDR与人抗体来源的FR重组以产生人源化可变区，然后将产生的人源化可变区与优选人抗体的恒定区重组来制备。然而，如果只进行CDR移植，则人源化抗体的亲和性降低。因此，认为影响CDR三维结构的几个重要FR氨基酸残基与小鼠抗体的那些残基密切相关，以至于增加到与小鼠抗体的原始亲和力相同的水平。
在本发明中，术语“亲和力优化的抗体”是指其中特定抗体的CDR序列的一部分被取代、添加或缺失的变体，并且是指在结合与特定抗体相同的抗原表位的同时具有改善的对抗原的结合亲和力的抗体。具体地，本发明的亲和力优化的抗体指，结合与(a)包括具有包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1、包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2和包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H3，的重链可变区，及具有包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L1、包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L3，的轻链可变区，的抗体；或(b)包括具有包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1、包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2和包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3，的重链可变区，及包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1、包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2和包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3，的轻链可变区，的抗体相同的表位的抗体变体。本领域技术人员可以基于特定的轻链和重链CDR序列，使用已知技术制备亲和力优化的抗体。
在本发明的另一个实施方案中，所述抗体可以具有包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区；以及包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实例中，所述抗体可以是具有由SEQ ID NO:17的核苷酸序列编码的重链可变区；以及由SEQ ID NO:18的核苷酸序列编码的轻链可变区，但不限于此。
此外，所述抗体可以是具有包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链可变区；以及包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实例中，所述抗体可以是具有由SEQID NO:21的核苷酸序列编码的重链可变区；以及由SEQ ID NO:22的核苷酸序列编码的轻链可变区，但不限于此。
在本发明的一个具体实施方案中，从使用人TM4SF4蛋白作为抗原的小鼠获得杂交瘤细胞组，并由此通过ELISA试验使用TM4SF4蛋白作为抗原进行筛选，以选择特异性结合TM4SF4的抗TM4SF4抗体。
在另一个方面，本发明提供了编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包括所述核酸分子的表达载体、其中引入了所述表达载体的宿主细胞、以及使用所述宿主细胞产生抗体或其抗原结合片段的方法。
在本说明书中，术语“核酸分子”具有全面包含DNA和RNA分子的含义，并且作为核酸分子中的基本结构单元的核苷酸不仅是天然核苷酸，更是具有修饰的糖或碱基部分的类似物(analogue)。编码本发明的重链和轻链可变区的核酸分子的序列可以被修饰，并且所述修饰包括核苷酸的添加、缺失、或者非保守性或保守性取代。
本发明的核酸分子被解释为包括与所述核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列。在本发明中，基本同一性是指当将本发明的核苷酸序列比对以尽可能对应于任何其它序列，并使用本领域常用的算法分析比对的序列时，表现出至少80％的同源性，具体地至少90％的同源性，更具体地至少95％的同源性的核苷酸序列。
在本说明书中，作为在宿主细胞中表达靶基因的手段的术语“载体”包括质粒载体；cozmid载体；以及病毒载体，例如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺伴随病毒载体等，并且具体地，可以是质粒载体，但不限于此。
在本发明的载体中，编码重链可变区的核酸分子和编码轻链可变区的核酸分子可以与启动子可操作地连接。
在本发明中，术语“可操作地连接”是指核酸表达调节序列(例如，启动子、信号序列或转录调节因子结合位点的阵列)与另一核酸序列之间的功能性连接(operativelylinked)，并且因此，所述调节序列调节所述另一核酸序列的转录和/或翻译。
本发明的重组载体***可以通过本领域已知的各种方法构建。
本发明的载体通常可以构建为用于克隆的载体或用于表达的载体。此外，本发明的载体可以使用原核或真核细胞作为宿主构建。
例如，当本发明的载体是表达载体并且原核细胞用作宿主时，载体通常包括能够促进转录的强启动子(例如tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子和T7启动子等)、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。当大肠杆菌(例如HB101、BL21、DH5α等)用作宿主细胞时，大肠杆菌色氨酸生物合成途径的启动子和操纵基因位点(Yanofsky,C,J Bacteriol,(1984)158:1018-1024)和噬菌体λ的左面启动子(pLλ启动子，Herskowitz,I and Hagen,D,Ann Rev Genet,(1980)14:399-445)可用作调控位点。当芽孢杆菌属细菌用作宿主细胞时，苏云金芽孢杆菌毒素蛋白基因的启动子(Appl Environ Microbiol(1998)64:3932-3938；Mol Gen Genet(1996)250:734-741)或任何在芽孢杆菌属细菌中表达的启动子，也可以用作调控位点。
另一方面，本发明的重组载体可以通过操作本领域常用的质粒(例如pCL、pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列和pUC19等)、噬菌体(例如λgt4·λB、λ-Charon、λΔz1和M13等)或病毒(例如SV40等)来制备。
另一方面，当本发明的载体是表达载体并且真核细胞用作宿主时，载体可以使用衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属阳离子启动子、β肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子和人肌肉肌酸启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒75K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、HSV tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV LTR启动子、莫洛尼病毒Epstein-Barr病毒(EBV)启动子和劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子)，并且通常具有聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。具体地说，本发明的重组载体包括CMV启动子。
本发明的重组载体可以与其它序列融合以促进从其表达的抗体的纯化。待融合的序列包括，例如，谷胱甘肽-S-转移酶(Pharmacia，USA)，麦芽糖结合蛋白(NEB，USA)，FLAG(IBI，USA)，6×His(六组氨酸(hexahistidine)；Quiagen，USA)等。另外，由于本发明的载体表达的蛋白质是抗体，因此表达的抗体可以容易地通过蛋白A柱等纯化，而不需要额外的纯化序列。
另一方面，本发明的重组载体包括本领域常用的作为选择标记的抗生素抗性基因，并且可以包括对例如氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素的抗性基因。
表达本发明抗体的载体可以是轻链和重链同时在一个载体中表达的载体***，或者是轻链和重链分别在不同的载体中表达的***。在后一种情况下，可以将两种载体引入宿主细胞，例如，通过共转化(co-transformation)或靶向转化(targetedtransformation)。共转化是将编码轻链和重链的各载体DNA同时导入宿主细胞，然后选择表达轻链和重链两者的细胞的方法。靶向转化是选择用含有轻链(或重链)的载体转化的细胞，再用含有重链(或轻链)的载体转化所选择的细胞，以最终选择表达轻链和重链两者的细胞的方法。
本领域已知的能够稳定和连续地克隆和表达本发明载体的任何宿主细胞都可以用作宿主细胞。例如，宿主细胞可以包括芽孢杆菌属菌株如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，以及原核宿主细胞如链霉菌(Streptomyces)、假单胞菌(Pseudomonas)(例如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、奇异变形菌(Proteus mirabilis)或葡萄球菌(Staphylococcus)(例如肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus))，但不限于此。
载体的合适真核宿主细胞可以使用真菌如曲霉属物种(Aspergillus species)，酵母如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)，其它低等真核细胞，高等真核细胞如昆虫来源的细胞，和来自植物或哺乳动物的细胞。
具体地，宿主细胞可以是COS7细胞(猴肾细胞(monkey kidney cells))、NSO细胞、SP2/0、中国仓鼠卵巢(CHO:Chinese hamster ovary)细胞、W138、幼仓鼠肾(BHK:babyhamster kidney)细胞、MDCK、骨髓瘤细胞系、HuT 78细胞或293细胞，但不限于此。
在本发明中，“转化”和/或“转染”到宿主细胞中包括将核酸导入生物体、细胞、组织或器官的任何方法，并且可以通过根据宿主细胞选择合适的标准技术来进行，如本领域已知的。这种方法包括电穿孔(electroporation)、原生质融合、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、使用碳化硅纤维搅拌、农杆菌介导的转化、PEG、硫酸葡聚糖、脂质转染胺和干燥/抑制介导的转化方法等，但不限于此。
在本发明中，使用宿主细胞产生抗体或其抗原结合片段的方法可以包括以下步骤：(a)培养用本发明的重组载体转化的宿主细胞；和(b)在所述宿主细胞中表达抗TM4SF4抗体或其抗原结合片段。
在抗体生产中，可以根据本领域已知的合适培养基和培养条件培养转化的宿主细胞。培养过程可以根据所选菌株由本领域技术人员容易地调整和使用。根据细胞生长方法，细胞培养物分为悬浮培养和粘附培养，根据培养方法，分为分批、补料分批和连续培养方法。培养所用的培养基需要充分满足特定菌株的要求。
在动物细胞培养中，培养基含有多种碳源、氮源和微量元素成分。可用的碳源的实例可包括碳水化合物类如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素，油脂类如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油，脂肪酸类如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇类如甘油和乙醇，有机酸类如醋酸，这些碳源可以单独使用，也可以组合使用。
可用于本发明的氮源的实例可包括有机氮源如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米沉淀液体(CSL)和大豆粉；以及无机氮源如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，这些氮源可以单独使用或组合使用。在培养基中，可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐作为磷酸盐源。此外，可以包括金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。此外，可以包括氨基酸、维生素、合适的前体等。
在培养过程中，通过适当的方法将化合物如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸加入培养液中以调节培养基的pH。另外，在培养过程中，通过使用消泡剂如脂肪酸多斜酯可以抑制气泡的产生。另外，为了维持培养液的有氧状态，向培养液中注入氧气或含氧气体(例如空气)。培养液的温度通常为20℃至45℃，优选为25℃至40℃。
所述生产方法还可包括(c)回收在宿主细胞中表达的抗TM4SF4抗体或其抗原结合片段。通过培养转化的宿主细胞获得的抗体可以以非纯化状态使用，或者可以使用各种常规方法如透析、盐析和层析进一步纯化和以高纯度使用。在这些方法中，使用层析的方法是最常用的，并且柱的类型和顺序可以根据抗体的特性、培养方法等选自离子交换层析、大小排阻层析和亲和层析。
在另一个方面，本发明提供了用于检测TM4SF4的包括所述抗体或其抗原结合片段的组合物、包括其的检测试剂盒和使用其检测TM4SF4抗原的方法。
通过将特异性结合TM4SF4的抗体或其抗原结合片段与待检测样品接触，形成抗原-抗体复合物，所述用于检测TM4SF4的组合物和包括其的试剂盒可有效地检测TM4SF4。
本文所用的术语“抗原-抗体复合物”是指TM4SF4与识别TM4SF4的抗体的偶联物，用于确认样品中肿瘤或癌细胞表达TM4SF4。
使用检测TM4SF4的组合物和包括该组合物的试剂盒定量TM4SF4抗原的方法可通过确认抗原-抗体复合物的形成来进行。抗原-抗体复合物的形成可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹(Western blotting)、免疫荧光(Immunofluorescence)、免疫组织化学染色(Immunohistochemistry staining)、流式细胞术(Flow cytometry)、免疫细胞化学(Immunocytochemistry)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀测定(ImmunoprecipitationAssay)、免疫扩散测定(Immunodiffusion assay)、补体结合测定(Complement FixationAssay)、蛋白芯片(Protein Chip)等来确认，但不限于此。ELISA包括各种ELISA方法，例如使用识别附着于固体支持物的抗原的标记抗体的直接ELISA、使用识别附着于固体支持物的抗原的抗体的复合物中的捕获抗体的标记二抗的间接ELISA、使用识别抗体和附着于固体支持物的抗原的复合物中的抗原的另一种标记抗体的直接夹心ELISA、和使用与识别抗体和附着于固体支持物的抗原的复合物中的抗原的另一种抗体反应后的抗体的标记二抗的间接夹心ELISA等。
能够定性或定量测定抗原-抗体复合物的形成的标记包括酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒(microparticle)、氧化还原分子和放射性同位素，但不限于此。
酶包括β葡糖醛酸糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和GDPase、RNase、葡萄糖氧化酶和萤光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、磷酸丙酮酸脱羧酶、β-内酰胺酶等，但不限于此。
在另一方面，本发明提供了用于预防或治疗癌症的组合物，其包括所述抗体或其抗原结合片段。
所述抗体及其抗原结合片段如上所述。
由于本发明的抗体或其抗原结合片段以高亲和力结合TM4SF4以抑制癌细胞生长，因此该抗体可单独或与常规药学上可接受的载体组合用于治疗、预防和诊断过度增殖性疾病如癌症。
作为应用于本发明的组合物的疾病的癌症可以具体地为肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、三联乳腺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、***癌、子宫内膜癌、唾液腺癌或甲状腺癌，并且更具体地，肺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、胃癌、胰腺癌和脑癌，但不限于此。在本发明中，所述癌症可以特别是由TM4SF4的过表达、扩增、突变或激活引起的癌症，但不限于此。即，由于包括本发明的抗体或其抗原结合片段的组合物对所有癌症具有增殖抑制作用，而与TM4SF4的异常表达或突变无关，因此本发明的药物用途不受TM4SF4的表达方面或突变的限制。
该组合物可以是药物组合物、准药物组合物或保健食品组合物的形式。
本发明的用于预防或治疗癌症的组合物可以进一步包括药学上可接受的载体。“药学上可接受的”是指待施用(处方)的靶标没有超过适应性的毒性而不抑制活性成分的活性，并且“载体”被定义为促进化合物加入到细胞或组织中的化合物。
本发明的药物组合物可以单独给药或与任何方便的载体等组合给药，并且这样的剂型可以是单一剂型或重复剂型。药物组合物可以是固体制剂或液体制剂。固体制剂包括粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、栓剂等，但不限于此。固体制剂可以包括载体、调味剂、粘合剂、防腐剂、崩解剂、润滑剂、填充剂等，但不限于此。液体制剂包括溶液如水和丙二醇溶液、悬浮液、乳液等，但不限于此，并且可以通过加入合适的着色剂、调味剂、稳定剂、粘性剂等制备。例如，可以通过简单地混合作为本发明活性成分的多不饱和脂肪酸的三羟基衍生物和合适的药学上可接受的载体如乳糖、淀粉和微晶纤维素，来制备粉末。可以通过将本发明的多不饱和脂肪酸的三羟基衍生物、合适的药学上可接受的载体和合适的药学上可接受的粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基纤维素混合，然后使用溶剂如水、乙醇和异丙醇的湿法制粒法或使用压缩力的干法制粒法，来制备颗粒。此外，可以通过将颗粒与合适的药学上可接受的润滑剂如硬脂酸镁混合，然后使用压片机将混合物压片，来制备片剂。
药物组合物可以根据待治疗的疾病和受试者的状况与口服剂、注射剂(例如，肌内注射、腹膜内注射、静脉内注射、输液(infusion)、皮下注射、植入)、吸入剂、鼻注射剂、***剂、直肠剂、舌下剂、透皮剂、局部剂等一起施用，但不限于此。根据给药途径，药物组合物可以配制成合适的剂量单位形式，包括药学上可接受的载体、添加剂和媒介物，它们是常用的并且无毒的。
药物组合物可以以约0.0001mg/kg至约10g/kg和约0.001mg/kg至约1g/kg的日剂量施用。然而，剂量可以根据混合物的纯化程度、患者的状况(年龄、性别、体重等)、待治疗的状况的严重程度等而变化。如果需要，为了方便起见，总的日剂量可以分开并在一天中给药几次。
此外，本发明提供了用于抑制癌干细胞生长的组合物，包括所述抗体或其抗原结合片段。
在本发明中，“癌干细胞(cancer stem cell，CSC)”是指具有分化成各种癌细胞的能力的未分化细胞。癌干细胞存在于约1–2％的恶性肿瘤组织中，并且具有自我复制能力和多能性，这是正常干细胞的特征，但是由于细胞***的激活和自我分化成恶性肿瘤细胞，其自我调节功能异常以增加细胞的数量。由于癌干细胞的特性，已知普通的癌症细胞通过抗癌治疗被去除，但是癌干细胞存活，并且癌症的复发和转移由一些存活的癌干细胞引起。
具体而言，本发明的癌干细胞可以是其中癌干细胞标记物之一的醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)蛋白过表达或蛋白活性为阳性的癌症细胞。
在本发明中，确认了所述抗体或其抗原结合片段选择性抑制癌干细胞，并且特别地，杀死含有对抗癌治疗具有高抗性的癌干细胞的癌细胞群，从而获得优异的抗癌效果。本发明的抗体或其抗原结合片段可以通过降低癌干细胞的自我更新能力、侵入能力和迁移能力来抑制癌干细胞的生长。抗体或其抗原结合片段不限于此，而是可以用于预防或治疗具有癌干细胞特征的癌症。
由于具有癌干细胞特性的癌症对现有的抗癌治疗显示出抗性并且预后差，因此需要对癌症应用与现有抗癌治疗不同的治疗。例如，即使在患有相同癌的患者中，如果癌对应于癌干细胞比例高的情况，则患者将不能用现有的已知抗癌治疗例如施用抗癌剂或放射疗法获得癌症治疗效果。因此，即使是相同种类的癌症，当癌症病灶部位的细胞中癌干细胞的比例高时，应用不同于现有抗癌治疗的新治疗也是非常重要的。
在本发明中，“具有癌干细胞特性的癌症”是指在构成癌症的细胞群中具有高比例的癌干细胞的癌症。考虑到一般癌细胞中的癌干细胞的比例为约1％以上且小于5％，例如，在构成癌症的细胞群中的癌干细胞的比例为5％以上、10％以上、30％以上、50％以上和70％以上的情况可以定义为“具有癌干细胞的特征的癌症”，并且如上所述，其特征可以在于，所述癌症由于对现有的抗癌治疗的抗性，具有差的抗癌治疗预后。
具体地，在本发明中，“具有癌干细胞特征的癌症”可以是过表达ALDH1的癌症。过表达ALDH1的癌症可以是表达ALDH1的癌症或具有比普通癌症相对更高比例的具有阳性活性的癌干细胞的癌症。
具体地，所述“过表达ALDH1的癌症”可以是选自肺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、胃癌、胰腺癌和脑癌中的至少一种，但不限于此。
癌症的预防或治疗可以是在癌症治疗期间或之后通过降低癌干细胞的更新能力、生长能力、侵入能力和迁移能力来预防或治疗癌症化学抗性、癌症复发或癌症转移。
在另一个方面，本发明提供了用于辅助化学放射疗法的组合物，其包括作为活性成分的所述抗体或其抗原结合片段。
本发明的组合物包括所述抗体或其抗原结合片段作为活性成分，用于改善癌症相关细胞的辐射敏感性。所述抗体及其抗原结合片段的细节如上所述。
本发明的癌相关细胞是构成癌的细胞，其特征在于，与正常细胞相比，形状不均匀、无限增殖、与周围细胞的结合强度弱。具体地，所述癌症相关细胞可以是癌细胞或癌干细胞，并且具体地，是癌干细胞。
癌干细胞可以是具有分化成各种癌细胞能力的未分化细胞，具体地，可以是表达ALDH1或具有阳性活性的癌细胞。在本发明中，癌干细胞可以具有即使通过放射线照射也不抑制细胞增殖、不降低自我更新能力、不抑制迁移和侵入能力的特征。
另外，癌相关细胞可能对放射线敏感性低，即对放射线疗法的抗性高，并且基本上对放射线不敏感，因此通过照射进行抗癌治疗可能是不可行的。
抗癌可以是抑制癌相关细胞的增殖、抑制转移和侵入，并通过辐射、外科手术和化学疗法诱导细胞死亡。在本发明中，可以将所述抗体或其抗原结合片段与照射组合施用来抗癌。因此，当抗体或抗原结合片段与照射组合施用时，通过抗体或抗原结合片段提升癌症相关细胞的辐射敏感性，从而通过照射使抗癌治疗效果最大化，并进一步防止癌症的复发和转移。
以下，通过实施例和实验例对本发明进行详细说明。
但是，以下的实施例和实验例仅是对本发明的说明，本发明的内容并不限于以下的实施例和实验例。
【实施例1】
针对TM4SF4抗原的人单克隆抗体的产生
〈1-1〉用于制备人TM4SF4膜蛋白抗原特异性抗体的选择或表位序列
为了制备能够抑制TM4SF4抗原介导的与癌干细胞特征相关的信号***的TM4SF4特异性应答抗体，在由202个氨基酸组成的膜蛋白TM4SF4抗原的结构中，选择暴露于细胞外，并期待具有高抗体诱导能力，的位点。
首先，通过蛋白质测序确认膜蛋白TM4SF4包括暴露于细胞外部的两个环结构(氨基酸序列31至45和115至158)。其中，确认了124位和156位氨基酸天冬酰胺是糖基化位点，120位和146位氨基酸半胱氨酸之间形成二硫键(图1)。接着，使用抗原性预测程序分析TM4SF4蛋白序列。用Kolaskar和Tongaonkar方法分析整个序列的抗原性，结果预测第4至33、53至67、71至80、92至112、127至133和146至198位的序列为高抗原性位点(表1)。
【表1】
起始位置 序列分析 端部位置 SEQ ID NO
4 GGCARCLGGTLIPLAFFGFLANILLFFPGG 33 23
53 LGSGVLMIFPALVFL 67 24
71 NNDCCGCCGN 80 25
92 STIFAVVGFLGAGYSFIISAI 112 26
116 KGPKCLM 122 27
127 WGYPFHD 133 28
146 CREPLNVVPWNLTLFSILLVVGGIQMVLCAIQVVNGLLGTLCGDCQCCGCCGG 198 29
总之，在本发明中，选择具有高抗原性且没有糖基化或二硫键的位点(即由第126至140位的氨基酸序列组成的“TWGYPFHDGDYLNDE”)作为产生抗体的抗原表位(图1A)。
〈1-2〉产生抗TM4SF4抗体的B细胞杂交瘤克隆的选择
合成了序列中半胱氨酸被加到所选抗原序列的氨基末端的肽“CTWGYPFHDGDYLNDE”，并使用磺基-SMCC将其与牛血清白蛋白(BSA)偶联。根据一般的免疫方法，将制备的抗原三次注射到4只小鼠中，并通过ELISA确认血液中的抗原特异性应答抗体是否由于免疫作用而增加。最后一次免疫后，收集确认产生抗体的小鼠脾细胞(splenocyte)，将其与小鼠骨髓瘤(myeloma)细胞融合，获得产生抗体的B细胞杂交瘤细胞。获得使用HAT选择培养基成功融合的多个B细胞杂交瘤以培养融合细胞系，并且在根据杂交瘤细胞选择的一般方案培养细胞的同时通过ELISA在细胞培养液中检测抗原特异性抗体。在ELISA中，用免疫用的抗原肽结合物BSA和作为对照组的BSA作为包被抗原(100ng/孔)。
结果，选择了五种产生抗TM4SF4抗体的B细胞杂交瘤克隆ECL-2B7、ECL-4C1、ECL-8E2、ECL-8E5和ECL-12A8，其对TM4SF4肽缀合物BSA的应答显著高于对BSA的应答(表2)。
【表2】
Figure GDA0003106050760000101
Figure GDA0003106050760000111
通过进行三次有限稀释(limiting dilution)的细胞克隆选择来鉴定抗体产生细胞，并通过同型试剂盒验证由细胞产生的抗体球蛋白亚型是IgG1、IgG2a、IgG2b等，并由κ型轻链组成(表3)。
【表3】
2B7 4C1 8E2 8E5 12A8
IgG1 1.688 0.213 1.995 0.130 0.063
IgG2a 0.049 2.652 0.067 2.511 0.053
IgG2b 0.054 0.072 0.151 0.154 2.357
IgG3 0.050 0.049 0.051 0.054 0.055
IgA 0.045 0.050 0.048 0.051 0.051
IgM 0.049 0.044 0.051 0.047 0.052
κ 0.556 1.286 0.532 1.133 0.895
λ 0.075 0.073 0.067 0.065 0.078
〈1-3〉新抗体的纯化
为了验证新抗体的体外/体内功效，大量培养B细胞杂交瘤克隆如ECL-2B7，并从培养液中纯化抗体。
具体来说，为了纯化新抗体，将各B细胞杂交瘤在含有10％牛血清的DMEM培养基中培养3至4天，并准备充分产生并分泌抗体，收集细胞培养液并用于抗体纯化。将收集的细胞培养液用50％浓度的亚硫酸铵处理，10,000×g离心30分钟以沉淀抗体，然后溶解在磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline，PBS，pH 7.4)中。由于确认抗体的同种型分别是IgG1、IgG2a和IgG2b，因此根据使用了使用对抗体具有高亲和力的蛋白G-琼脂糖的产物的方案纯化抗体。纯化的抗体通过Bradford法和ELISA法定量，纯度通过SDS-PAGE确认。
结果，通过亲和层析以约99％的高纯度纯化抗体，在200mL细胞培养液中获得每种抗体约1mg。在55kDa和26kDa的位置鉴定每种抗体的重链(IgG-HC)和轻链(IgG-LC)以鉴定IgG型抗体，通过位于170kDa以上的条带(IgG)鉴定未还原的IgG。
【实施例2】
新型抗TM4SF4抗体的抗原特异性应答性的确认
〈2-1〉通过酶联免疫吸附测定(ELISA)验证新抗体的抗原特异性反应
为了确认新抗体的抗原特异性应答性，在TM4SF4蛋白的细胞外大环域(ExtraCellular Large loop domain:ECL)中使用与一些肽序列的位置126至140的氨基酸结合的牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)抗原(TM4SF4-肽-BSA)。还通过ELISA使用免疫原(immunogen)测量了新抗体的抗原亲和力，并选择了具有优异抗原结合能力的抗体。
具体地，为了确认对TM4SF4-肽-BSA抗原的抗体应答性，将抗原稀释在PBS中，分配在96孔Maxisorp ELISA板(Nunc)上，并诱导粘附以制备用抗原包被的板。从500ng/孔开始依序用1/5稀释抗原，将100μL稀释的抗原加入到板的各个孔中，诱导抗原在4℃包被在板孔表面16小时或更长。在抗原包被后，用每孔300μL洗涤液TBST(含有0.1％(v/v)Tween-20的TBS)洗涤板两次，以除去未包被的残留抗原，并加入300μL脱脂乳溶液(5％(w/v)脱脂乳(skim milk)/TBST)作为封闭液，在室温下反应2小时，以封闭抗原包被后的剩余部分。新的抗TM4SF4抗体通过从封闭溶液中从200ng/孔的浓度开始依序用1/3稀释来制备，将100μL/孔的稀释抗体加入到封闭的板中，然后在37℃以50rpm的速度搅拌2小时以诱导抗原/抗体结合。反应后，除去溶液，用300μL/孔的洗涤液洗涤板5次，以除去未与抗原结合的抗体，通过将小鼠抗IgG-HRP(Cell Signaling Technology公司)作为以1:2500的比例稀释于封闭缓冲液中的二抗处理，来检测与抗原结合的抗体。将该二抗在37℃、50rpm下搅拌90分钟后，用洗涤液洗涤6次以除去未与抗TM4SF4抗体结合的二抗，并以TMB溶液(Thermo Scientific公司)为HRP的底物进行显色反应，再通过测定450nm的吸光度定量抗原抗体应答。
结果，确认了实施例1中制备的本发明的五种抗TM4SF4抗体ECL-2B7、ECL-4C1、ECL-8E2、ECL-8E5和ECL-12A8对肽抗原都具有优异的抗原结合能力。其中确认了，抗体ECL-2B7、ECL-4C1和ECL-12A8表现出特别高的抗原亲和性(图3)。
〈2-2〉通过表面等离子体共振(SPR)验证新抗体的分子间相互作用
为了确认新抗体的抗原特异性应答性，将实施例2-1中使用的TM4SF4-肽-BSA(生物素-GSAGGSTWGYPFHDGDYLNDE)用作抗原，处理抗体ECL-2B7、ECL-4C1和ECL-12A8以测量抗原特异性应答。
具体而言，为了确认各抗体对TM4SF4-肽-BSA抗原的抗体应答性，使用1M NaCl和50mM NaOH试剂除去传感器芯片(sensor chip)上存在的表面蛋白。为了找到生物素-肽(配体)的最佳固定(immobilization)条件，尝试将配体的浓度固定(immobilization)到10pM至100nM。固定后，抗体ECL-2B7、ECL-4C1和ECL-12A8以32nM的浓度流动，以确认与抗原的结合，并重复再生(regeneration)，以试图稳定基线。在一个小时或更长时间后，基于稳定的基线分析ECL-2B7、ECL-4C1和ECL-12A8分析物。
结果，观察到图形增加的结合时间随时间而增加，并且确认当在480秒时抑制结合时，结合能力降低。
由此可见，抗体ECL-2B7、ECL-4C1和ECL-12A8是对肽抗原具有高结合能力的抗体。
〈2-3〉免疫沉淀后通过Western印迹法(Immunoprecipitation/Western Blotting)验证新抗体的抗原特异性应答
为了将对TM4SF4肽抗原显示高响应性的新型抗体用于细胞靶向，对细胞中表达的TM4SF4抗原的三级结构的响应性需要是高的。为了确认这一点，确认了新抗体针对细胞中表达的TM4SF4蛋白抗原的特异性应答。制备标记了FLAG表位的TM4SF4蛋白表达载体(pFLAG-TM4SF4)，并在HEK293T细胞中表达。用新的抗TM4SF4抗体对这些细胞裂解物进行免疫沉淀，在Western印迹后检测FLAG标记物以确认用新抗体免疫沉淀的抗原是TM4SF4。
具体而言，使用人肺癌细胞A549细胞的cDNA作为模板DNA，通过PCR反应制备TM4SF4蛋白的完整基因序列，并使用EcoRI/BamHI限制性酶序列克隆到p3xFLAG-CMVTM-7.1载体(Sigma-Aldrich)中，以构建其中TM4SF4蛋白在细胞的N端表达三个FLAG标签的载体(3xFLAG-TM4SF4载体：pFLAG-TM4SF4)。通过基因转染(gene transfection)将pFLAG-TM4SF4的细胞内表达诱导到人胚胎肾细胞(人胚胎肾293T，Human Embryonic Kidney293T，HEK293T)中。首先，在100mm细胞培养板中，在含有5％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，培养6×105/孔的HEK293T细胞16小时，以制备用于表达3xFLAG-TM4SF4蛋白的细胞。除去制备的细胞的培养液，在1mL DMEM(5％FBS)培养液中混合36μg的3xFLAG-TM4SF4载体pFLAG-TM4SF4和等量的聚乙烯亚胺(PEI，Polysciences Co.,Ltd.)，在室温下反应15分钟。然后，在含有9mL的培养液的细胞中处理该混合物，以进行基因转染。15小时后，除去细胞培养液，在含有10％FBS的DMEM培养液中再次培养48小时，诱导3xFLAG-TM4SF4蛋白的表达，通过免疫沉淀和Western印迹确认了对新抗体的特异性应答。将基因转染的细胞溶解在RIPA缓冲液(1％NP40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、磷酸酶抑制剂(phosphatase inhibitors)、前酶抑制剂(pretease inhibitors)/PBS)中，在21振幅下超声处理5秒，然后在4℃下以13,000rpm离心，获得细胞蛋白质溶液。通过Bradford法进行蛋白质定量，将500μg蛋白质与5μg新抗体或对照组抗体小鼠抗GAPDH抗体在4℃混合16小时以诱导抗体和蛋白质的抗原/抗体结合，加入30μL蛋白G珠并再次反应4小时以将抗体结合至珠。为了除去非特异性蛋白质，用RIPA缓冲液洗涤珠子6次，然后加入含有还原剂的SDS样品缓冲液并在95℃煮沸，在12％SDS-PAGE凝胶上展开蛋白质。将显色的蛋白质转移到PVDF膜(membrane)上，用含有5％(w/v)脱脂乳的TBST(Tris缓冲盐水，0.1％吐温20)封闭液在室温下将完成蛋白质转移的膜封闭1小时，将稀释在封闭液中的抗FLAG抗体(Cell Signalling Technology)在室温下处理2小时，然后用TBST搅拌洗涤8次5分钟，以除去非特异性抗体。用二抗(兔抗IgG-HRP)处理与3xFLAG-TM4SF4蛋白结合的抗FLAG抗体，然后通过增强化学发光(enhancedchemiluminescence，ECL)方法检测。
结果，预测的3xFLAG-TM4SF4蛋白分子量为24.8kDa，确认了对表达3xFLAG或3xFLAG-TM4SF4蛋白的细胞裂解物(图5A中1和2行的输入样品)的抗FLAG抗体应答。结果，在26至30kDa的位置上确认了特异性反应，甚至在34kDa和95kDa或更高的分子量位置上也确认了特异性反应。已经确认了TM4SF4蛋白质具有四跨膜蛋白性质，其使用半胱氨酸残基与周围蛋白质形成共价键。确定高分子量蛋白质中的FLAG标记与对照的FLAG标记不同的原因是TM4SF4蛋白质通过半胱氨酸残基形成偶联物。确认了用于免疫沉淀的新抗体在用对照p3xFLAG-CMV-7.1载体(pFLAG)基因转染的细胞裂解物(样品1)中不免疫沉淀FLAG标记的蛋白质，而在用3xFLAG-TM4SF4载体(pFLAG-TM4SF4)基因转染的细胞裂解物(样品2)中，通过免疫沉淀在26kDa或更高的位置处特异性地检测到3xFLAG-TM4SF4。结果，确认了抗TM4SF4的新抗体在细胞中表达的特异性应答(图5A)。另外，在确认了26kDa的3xFLAG-TM4SF4样品中，确认了通过免疫沉淀也检测到分子量为95kDa或更高的蛋白质，并且确认了这些样品是TM4SF4蛋白的多重缀合物。在FLAG-TM4SF4中在26kDa以下鉴定的蛋白质条带的情况下，即使在免疫沉淀过程中用用作阴性对照免疫沉淀抗体的小鼠抗GAPDH抗体(msIgG)处理的样品中也检测到蛋白质，因此，确定为抗FLAG抗体的非特异性结合(图5A，抗FLAG抗原)。免疫沉淀期间所用的所有抗体都是小鼠来源的抗体，并通过在PVDF膜上处理小鼠抗IgG-HRP进行检测，结果确认了在免疫沉淀期间使用了相同量的抗体(图5B)。
〈2-4〉通过免疫荧光(Immunofluorescence)验证新抗体的细胞表面抗原特异性反 应
为了确认新抗体是否可特异性识别细胞表面表达的TM4SF4，通过免疫荧光分析(Immunofluorescence)验证了与细胞表面表达的TM4SF4的结合能力。
具体地，为了确定TM4SF4的细胞内表达位置，用绿色荧光蛋白EGFP(增强型绿色荧光蛋白，Enhanced green fluorescent protein)标记TM4SF4的N端，以便TM4SF4在细胞中表达时显示绿色荧光，从而制备转基因载体。TM4SF4蛋白的全部基因序列以人肺癌细胞A549细胞的cDNA为模板DNA，通过PCR制备，并使用EcoRI/BamHI限制性酶序列克隆到pEGFP-C2载体(Clonetech公司)中，构建了TM4SF4蛋白在细胞中N端带有EGFP标签表达的载体(EGFP-TM4SF4载体)。EGFP-TM4SF4的细胞内表达通过基因转染诱导进入人胚肾细胞(人胚肾293T，HEK293T)。首先，在带有盖玻片的细胞培养6孔板中，在含有5％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，培养1×105/孔的HEK293T细胞16小时，以制备用于表达EGFP-TM4SF4蛋白的细胞。除去制备的细胞的培养液，在400μL的DMEM(5％FBS)培养液中混合6μg EGFP-TM4SF4载体和等量的聚乙烯亚胺(PEI，Polysciences Co.,Ltd.)，在室温下反应15分钟。然后，在含有1.6mL的培养液的细胞中处理该混合物，以进行基因转染。15小时后，除去细胞培养液，在含有10％FBS的DMEM培养液中再次培养48小时，诱导EGFP-TM4SF4蛋白的表达，通过免疫荧光分析确认新抗体和表达细胞的TM4SF4之间的应答。免疫荧光分析的过程如下。诱导EGFP-TM4SF4蛋白质表达后，完全去除板的培养液，将含有2％低聚甲醛的培养液在室温下预处理2分钟，然后将混合在PBS中的2％低聚甲醛固定液在室温下搅拌15分钟以固定细胞(固定)。在细胞固定过程之后，用含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗涤溶液洗涤细胞三次，共5分钟，以除去剩余的固定剂，并且为了防止抗体的非特异性结合，用封闭溶液(1％BSA/PBS)封闭细胞30分钟。将新抗体以50μg/mL的浓度在封闭溶液中稀释，并在室温下处理1小时以诱导抗体-抗原结合，然后用洗涤溶液洗涤三次，5分钟以除去未与抗原结合的残留抗体。用在封闭溶液中以1:1000的比例稀释的小鼠抗IgG-罗丹明(RDM)二抗处理抗原结合的抗体1小时，并处理洗涤溶液三次，持续5分钟，然后用DAPI溶液染色细胞核5分钟，并用共焦激光扫描显微镜确认。测量EGFP的绿色荧光以确认EGFP-TM4SF4的表达，测量若丹明的红色荧光以确认抗体应答位点。
此外，当通过siRNA处理TM4SF4过表达的肺癌细胞A549来抑制TM4SF4的表达时，确认了新的抗体应答降低。TM4SF4特异性siRNA[有义，5′-gcc ucu caa ugu ggu ucc cuggaa u-3′(SEQ ID NO:30)；反义，5′-auu cca ggg aac cac auu gag agg c-3′(SEQ IDNO:31)]或对照组StealthRNAiTMNegative Control Medium GC(Invitrogen)使用
Figure GDA0003106050760000141
RNAiMAXreagent(Invitrogen)转移到A549细胞中并收集48小时，然后将1×105个细胞在用盖玻片制备的培养皿中培养24小时。除去培养细胞的培养液后，如上所述用低聚甲醛溶液固定细胞，使新抗体反应。用在封闭液中以1:1000的比例稀释的小鼠抗IgG-FITC二抗处理抗原结合的抗体1小时，并将洗涤液处理三次，每次5分钟，然后用DAPI溶液将细胞核染色5分钟，并用荧光显微镜确认。
结果，如图6A所示，确认了EGFP-TM4SF4蛋白质当在HEK293细胞中表达时通过表达的绿色EGFP信号定位于细胞表面，并确认了通过罗丹明的红色荧光信号检测的新抗体-抗原应答在包括细胞表面的细胞内。另外，当红色和绿色的两个信号合并(merge)时，确认两个信号存在于相同位置，并且在细胞膜上存在微黄色位点。
由此验证了所有五种新抗体都与位于细胞表面的TM4SF4蛋白结合，并确认其中ECL-2B7、ECL-4C1和ECL-12A8的响应度较高。A549细胞是TM4SF4高表达的细胞，并且确认了新抗体ECL-2B7、ECL-4C1和ECL-12A8的细胞表面应答高(图6B)。然而，当通过处理si-TM4SF4抑制TM4SF4的表达时，不能确认抗体应答，从而再次确认新抗体的抗原特异性应答。
【实施例3】
抗TM4SF4抗体对癌干细胞生长抑制作用的确认
进行球体形成试验(Sphere forming essay)和侵入(Invasion assay)及迁移试验(Migration assay)以确认具有确认的TM4SF4抗原应答特异性的新抗体抑制癌干细胞特征的作用。
〈3-1〉癌干细胞的分离和培养
具体来说，人肺癌细胞系A549细胞在37℃加湿5％CO2培养，细胞在补充10％胎牛血清和链霉素(100g/ml)的RPMI中培养。在这些细胞中，分离A549-ALDH1+癌干细胞并用于随后的实验。
〈3-2〉确认了新抗体对癌干细胞的自我更新能力的抑制效果
在含有DMEM-F12(Invitrogen)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF：20ng/mL)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，20ng/mL)和2％B27无血清补充物(1:50)的癌干细胞可接受培养基中培养A549-ALDH1+癌干细胞。细胞培养箱使用超低附着96孔板(康宁公司)。在培养箱的每孔加入1～2个细胞并稳定24小时后，在细胞培养液中分别以3μg/mL的浓度处理Sigma Co,Ltd的新抗体或抗TM4SF4抗体。处理后，将细胞在37℃的5％CO2培养箱中培养，10天后，使用显微镜确认形成的癌干细胞的球体的数目和大小。
结果如图7所示，确认了当处理本发明的新抗体时，与用已知抗体处理的情况相比，形成的球体的数目和大小显着降低。
从上述结果可以看出，通过抑制癌干细胞的细胞膜中存在的TM4SF4，可以有效地抑制癌干细胞形成球体的能力，结果可以看出癌干细胞的自我更新能力受到抑制。
〈3-3〉通过新型抗体确认抑制癌细胞侵入(invasion)和迁移(migration)能力的 效果
将A549细胞(5×104细胞/孔)悬浮于0.2ml无血清RPMI培养基中。对于侵入分析，将细胞分配到具有8μm孔径的预先用10mg/ml基质胶包被的跨孔室(Transwell chamber)的上孔中。将制备的上孔(upper well)置于充满0.8ml含血清RPMI培养基的下孔室中，并在37℃培养48小时，然后将转移到上滤器之外的侵入细胞染色并分析。在移动分析中，使用了其中基质胶未包被在侵入实验中使用的***物(insert)上的室。将抗体加入上孔中，同时将细胞以3μg/mL的浓度分配。
结果如图8所示，确认了当处理本发明的新抗体时，发生迁移和侵入的癌干细胞的数目与处理已知抗体的情况相比显著减少。
由此可见，本发明的新抗体可有效抑制癌细胞的侵入和迁移能力。
【实施例4】
抗TM4SF4抗体抑制癌细胞放射抗性的效果的确认
A549细胞和Huh7细胞分别以1×103细胞/皿包被在35mm皿上。24小时后，用浓度分别为3μg/ml的新抗体ECL-2B7、ECL-4C1和ECL-12A8或Sigma公司的抗TM4SF4抗体处理细胞培养液。处理后，将细胞在37℃的5％CO2培养箱中培养7天。将除去培养液的板用0.5％结晶紫试剂染色10分钟，用PBS洗涤数次，并在显微镜下确认。为了确认照射灵敏度，使用60Coγ射线源用6Gy的总照射剂量(剂量率(dose rate)：x/小时)照射A549细胞并涂布在板上，然后在24小时后用抗体处理。
结果如图9所示，确认了用本发明的新抗体处理后存活的细胞集落显着小于用已知抗体处理后存活的细胞集落。此外，确认了不仅在肺癌细胞中而且在肝癌细胞中也显示类似的效果。
由此可见，本发明的新抗体可用作提高放射治疗效果的方法，并且可用作不仅提高肺癌细胞中的放射治疗效果而且提高肝癌细胞中的放射治疗效果的方法。
【实施例5】
与抗TM4SF4抗体诱导癌细胞死亡相关的细胞内信号传导过程的确认
为了验证本发明新抗体的参与诱导癌细胞死亡的细胞内信号传导过程，确认了TM4SF4相关信号传导过程，并检查了TM4SF4相关信号传导过程是否受抗体影响。
具体地，如在先前的研究结果中所确认的，通过关于TM4SF4表达所增加的信号传导过程的产物的IGF1、IL1β和骨桥蛋白(Osteopontin)的表达是否被新抗体的处理所抑制的Western印迹，确认了蛋白质的表达。对于Western印迹实验，收集每个细胞，每次加入50μL蛋白裂解溶液，在4℃反应30分钟，然后用4℃离心机以13000RPM分离沉淀和上清液。使用蛋白质测定试剂盒(Sigma)将上清液上样于SDS-PAGE凝胶上，每种蛋白40μg。然后，将加载在SDS-PAGE凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并与BSA缓冲液在室温下反应30分钟以防止其它抗体结合，在一抗TM4SF4、ALDH1A1、ALDH1A3(Abcam)、β-连环蛋白、CD133、Oct4(Millipore)和CD44和β-肌动蛋白(Cell Signaling)以1:1000稀释的PBS缓冲液中反应4小时，然后在二抗抗兔或抗小鼠Igs-HRP(Cell Signaling)以1:10000稀释的PBS缓冲液中再次反应1小时。然后，用PBS洗涤硝酸纤维素膜5次，然后与ECL检测溶液反应，然后暴露于膜。
结果，如图10所示，观察到在抗体处理后，当用抗TM4SF4抗体处理时癌干细胞的标记蛋白ALDH1A1、ALDH1A3和CD44减少，并且参与癌干细胞自我更新的β-连环蛋白和Oct4的表达也减少。此外，观察到在涉及癌症恶性化的信号传导机制中，涉及IGF1Rβ信号传导机制。发现癌干细胞的恶性识别通过IGF1Rβ信号调节。由此可见，本发明的新型抗体的肿瘤抑制效果和放射敏感性改善效果是通过杀死癌干细胞、抑制自我更新能力和抑制侵入和迁移能力而实现的。
【实施例6】
用于确认新抗体对癌细胞杀伤作用的小鼠异种移植试验(Xenograft assay)
为了验证新抗体在体内条件下的癌细胞杀伤效力，在小鼠中形成肺癌细胞异种移植物(Xenograft)，并注射新抗体以验证癌细胞的生长抑制/或死亡。
具体地，用于形成肺癌异种移植物的小鼠是Balb/c裸鼠，在6周龄，在右后肢皮下注射1×106细胞/小鼠的A549细胞。注射后，当癌组织的大小生长到100mm3时，将TM4SF4抗体直接注射到癌组织中，以2至3天的间隔测量癌组织的大小。注射的抗体注射总计每只小鼠80μg，以2至3天的间隔分成6次每次注射13.333mg/小鼠。整个实验进行至注射癌细胞后第49天。通过用癌组织的直径，计算短轴2×(长轴/2)，来计算癌组织大小。
根据癌组织大小改变抗体施用的时间，进行了两个实验。在第一个实验中，在注射癌细胞4周后，当癌组织的大小为30mm3或更大时开始施用抗体。
结果，施用抗体的组中的癌组织的生长受到抑制，并且癌组织的大小不再增加(图11A和11B)。在第二个实验中，在注射癌细胞5周后，当癌组织的大小为200mm3或更大时开始施用抗体。此时，还观察到在注射抗体组中癌细胞的生长受到抑制。然而，确认了癌细胞大小保持不变，并且在停止抗体注射后癌大小略微增加，结果，确定了当抗体用作抗癌剂时，肿瘤大小和能够使效果最大化的抗体的量之间存在相关性(图11C和11D)。在第三个实验中，将抗TM4SF4抗体注射入血管而不是直接注射入癌症以观察癌组织大小的变化。结果，可以获得与上述实验相似的结果(图11E和11F)。
【实施例7】
新型单克隆抗体ECL-2B7和ECL-4C1抗体基因的克隆和核苷酸测序
通过测定与新抗体的抗原的互补性结合区(CDR)发现抗体特异性。为了确定对应于新抗体CDR区的蛋白质序列，克隆抗体基因并确定CDR区的核苷酸序列。
具体地，通过离心收集5×106个活跃的杂交瘤ECL-2B7或ECL-4C1细胞克隆，并根据提供商的方案用RNAiso plus reagent(TaKaRa，Otsu，Japan)提取总RNA。通过测定OD260值定量得到的总RNA。将总RNA加入PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa)中，制备逆转录酶链式反应混合物，并合成cDNA。
为了克隆抗体基因，修饰并使用已知的PCR引物(Wang,et al 2000,J.Immunol.Methods 233:167)。为了用合成的cDNA进行重链克隆，通过加入10pmole的寡核苷酸制备PCR混合物，所述寡核苷酸是核苷酸序列5′-GGA GTC GAC ATA GAC AGA TGG GGGTGT CGT TTT GGC-3′(IgG1亚型恒定区)或5′-GGA GTC GAC CTT GAC CAG GCA TCC TAGAGT CA-3′(IgG2a亚型恒定区)作为与IgG1亚型抗体ECL-2B7和IgG2a亚型抗体ECL-4C1中每一种的恒定区相对应的PCR引物、以及是核苷酸序列5′MH1 5′-ctt ccg gaa ttc SAR GTNMAG CTG SAG SAG TC-3′和5′MH2-5′-ctt ccg gaa ttc SAR GTN MAG CTG SAG SAG SAGSAG TCW GG-3′作为与重链抗体可变区的N末端相对应的引物。对于轻链克隆，分别使用寡核苷酸5′-ggt gtc gac GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC-3′作为对应于κ链恒定区的引物、以及5′MK 5′-cgg aag ctt GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA-3′作为对应于κ链可变区N端的引物。为了有效地克隆PCR产物，在轻链的情况下，将SalI限制酶位点给予至3′引物末端，将HindIII限制酶位点给予至5′引物。在重链的情况下，将EcoRI给予至5′引物，将SalI限制酶位点给予至3′引物。将重链和轻链反应溶液分别混合后，在95℃下反应1分钟，在40℃下反应1分钟，在72℃下反应1分钟，进行30次。为了克隆扩增的ECL-2B7和ECL-4C1基因，PCR产物首先用EcoRI和SalI处理重链，用HindIII和SalI处理轻链，然后在1.0％(w/v)琼脂糖凝胶上展开。然后，用FavorPrep GELTM PCR Purification Kit(中国台湾地区Favorgen公司)分离对应于约400bp和390bp的DNA。用EcoRI和SalI处理用作克隆重链基因的载体的pBluescript KS+，用HindIII和SalI处理作为轻链基因克隆载体的pBluescript KS+，然后用FavorPrep GELTM PCR Purification Kit分离(图12C和12D)。用T4 DNA连接酶(美国NewEngland Biolab公司)连接这两种DNA，并通过CaCl2法转化到大肠杆菌DH5α中。选择在重链的情况下具有约400bp大小的DNA***片段的克隆，和在轻链的情况下具有约390bp大小的大肠杆菌克隆。
为了抗体基因的DNA测序分析，将几个克隆在含有100μg/ml氨苄青霉素的3ml LB培养基中培养过夜，然后使用DNA-Spin plasmid mini prep kit(韩国Intron公司)分离质粒DNA，通过核苷酸测序(Nucleotide sequencing)(韩国Bionics公司)确认每个DNA***物的核苷酸序列。
结果，作为单克隆抗体ECL-2B7和ECL-4C1基因扩增的结果，可以在估计为对应于重链恒定区的DNA片段的对应于约400bp的位置和估计为对应于轻链恒定区的DNA片段的对应于约390bp的位置获得扩增的DNA(图12A和12B)。克隆DNA后，获得分析DNA***片段的核苷酸序列的结果(图12C和12D)，将重链和轻链DNA的核苷酸序列翻译成氨基酸，然后通过Kabat编号根据抗体结构排列抗原识别确定位点，在序列中指出CDR1、2和3。抗体序列比较分析的结果是，抗体ECL-2B7和ECL-4C1的重链属于IIIC亚组，其轻链属于V亚组(图13和14)。
【实施例8】
通过比较集落形成能力验证对其他癌的扩展性
为了确认新型抗体对各种癌细胞的恶性化的抑制程度，进行了细胞的集落形成能力的比较实验。
具体地，对于集落形成试验(Colony forming assay)，在35mm培养皿上以1×103细胞/皿包被肺癌细胞H1299、肝癌细胞Huh7、乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB 231以及胰腺癌细胞MIA-Paca-2。24小时后，在细胞培养液中分别以5μg/ml的浓度处理新抗体ECL-2B7。处理后，将细胞在37℃的5％CO2培养箱中培养7天。将除去培养液的板用0.5％结晶紫试剂染色10分钟，用PBS洗涤数次，并在显微镜下确认。
结果确认，当用本发明的新抗体处理时，不仅肺癌细胞，而且肝癌细胞和乳腺癌细胞的集落形成程度也降低(图15)。
由此可见，通过使用TM4SF4抗原特异性结合新抗体，可提出用于各种癌症的抗癌治疗技术。
<110> 韩国原子力研究所（Korea Atomic Energy Research Institute）
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<160> 31
<170> PatentIn 3.0
<210> 1
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> TM4SF4
<400> 1
Met Cys Thr Gly Gly Cys Ala Arg Cys Leu Gly Gly Thr Leu Ile Pro
1 5 10 15
Leu Ala Phe Phe Gly Phe Leu Ala Asn Ile Leu Leu Phe Phe Pro Gly
20 25 30
Gly Lys Val Ile Asp Asp Asn Asp His Leu Ser Gln Glu Ile Trp Phe
35 40 45
Phe Gly Gly Ile Leu Gly Ser Gly Val Leu Met Ile Phe Pro Ala Leu
50 55 60
Val Phe Leu Gly Leu Lys Asn Asn Asp Cys Cys Gly Cys Cys Gly Asn
65 70 75 80
Glu Gly Cys Gly Lys Arg Phe Ala Met Phe Thr Ser Thr Ile Phe Ala
85 90 95
Val Val Gly Phe Leu Gly Ala Gly Tyr Ser Phe Ile Ile Ser Ala Ile
100 105 110
Ser Ile Asn Lys Gly Pro Lys Cys Leu Met Ala Asn Ser Thr Trp Gly
115 120 125
Tyr Pro Phe His Asp Gly Asp Tyr Leu Asn Asp Glu Ala Leu Trp Asn
130 135 140
Lys Cys Arg Glu Pro Leu Asn Val Val Pro Trp Asn Leu Thr Leu Phe
145 150 155 160
Ser Ile Leu Leu Val Val Gly Gly Ile Gln Met Val Leu Cys Ala Ile
165 170 175
Gln Val Val Asn Gly Leu Leu Gly Thr Leu Cys Gly Asp Cys Gln Cys
180 185 190
Cys Gly Cys Cys Gly Gly Asp Gly Pro Val
195 200
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 表位
<400> 2
Thr Trp Gly Tyr Pro Phe His Asp Gly Asp Tyr Leu Asn Asp Glu
1 5 10 15
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-2B7 CDR-H1
<400> 3
Thr Tyr Gly Ile Gly Val Ser
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-2B7 CDR-H2
<400> 4
His Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-2B7 CDR-H3
<400> 5
Lys Glu Gly Ser Ser Ala Pro Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-2B7 CDR-L1
<400> 6
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-2B7 CDR-L2
<400> 7
Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-2B7 CDR-L3
<400> 8
Gln Gln His Tyr Arg Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-4C1 CDR-H1
<400> 9
Thr Tyr Gly Leu Gly Val Gly
1 5
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-4C1 CDR-H2
<400> 10
His Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-4C1 CDR-H3
<400> 11
Lys Glu Gly Thr Ser Ala Pro Phe Ala Phe
1 5 10
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-4C1 CDR-L1
<400> 12
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Gly Ser Asn Gln Lys Gln Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-4C1 CDR-L2
<400> 13
Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-4C1 CDR-L3
<400> 14
Gln Gln His Tyr Arg Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-2B7 重链可变区
<400> 15
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Lys Glu Gly Ser Ser Ala Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 16
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-2B7 κ 链可变区
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Met Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Arg Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 17
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-2B7 重链可变区
<400> 17
gaggtgaagc tggaggagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttatggta taggagtaag ctggattcgt 120
cagccttctg ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtggaatga taataagtac 180
tataacacag ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctccaa caaccaggta 240
ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaaag 300
gagggcagct cggccccctt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360
<210> 18
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-2B7 κ 链可变区
<400> 18
gatattgtga tgacccagtc tccatcctcc ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagcctttta aatagtagca atcaaaagaa ctatttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaacttctga tatactttgc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactcttacc 240
atcagcagta tgcaggctga agacctggca gattacttct gtcagcaaca ttatagaact 300
cctccgacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaac gg 342
<210> 19
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-4C1 重链可变区
<400> 19
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Leu Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Lys Glu Gly Thr Ser Ala Pro Phe Ala Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 20
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-4C1 κ 链可变区
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Gly
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Gln Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Arg Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 21
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-4C1 重链可变区
<400> 21
gaagttaagc tggaggagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgacc acttatggtt taggagtagg ctggattcgt 120
cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtggaatga taataagtat 180
tataacacag ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctccaa caatcaggta 240
ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaaag 300
gagggcacct cggccccctt tgctttctgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360
<210> 22
<211> 341
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> ECL-4C1 κ 链可变区
<400> 22
gatattgtga tgacccagtc tccatcctcc ctggctatgt cagtcggaca gagggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagcctttta aatggtagca atcaaaagaa ctatttggcc 120
tggttccagc agaaaccagg acagtctcct aaacttctgg tatactttgc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactcttacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gattacttct gtcagcaaca ttataggact 300
cctccgacgt tcggtggagg caccaagctg gaaataaacg g 341
<210> 23
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 表位
<400> 23
Gly Gly Cys Ala Arg Cys Leu Gly Gly Thr Leu Ile Pro Leu Ala Phe
1 5 10 15
Phe Gly Phe Leu Ala Asn Ile Leu Leu Phe Phe Pro Gly Gly
20 25 30
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 表位
<400> 24
Leu Gly Ser Gly Val Leu Met Ile Phe Pro Ala Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 表位
<400> 25
Asn Asn Asp Cys Cys Gly Cys Cys Gly Asn
1 5 10
<210> 26
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 表位
<400> 26
Ser Thr Ile Phe Ala Val Val Gly Phe Leu Gly Ala Gly Tyr Ser Phe
1 5 10 15
Ile Ile Ser Ala Ile
20
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 表位
<400> 27
Trp Gly Tyr Pro Phe His Asp
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 表位
<400> 28
Lys Gly Pro Lys Cys Leu Met
1 5
<210> 29
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 表位
<400> 29
Cys Arg Glu Pro Leu Asn Val Val Pro Trp Asn Leu Thr Leu Phe Ser
1 5 10 15
Ile Leu Leu Val Val Gly Gly Ile Gln Met Val Leu Cys Ala Ile Gln
20 25 30
Val Val Asn Gly Leu Leu Gly Thr Leu Cys Gly Asp Cys Gln Cys Cys
35 40 45
Gly Cys Cys Gly Gly
50
<210> 30
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> TM4SF4 siRNA- 有义
<400> 30
gccucucaau gugguucccu ggaau 25
<210> 31
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> TM4SF4 siRNA- 反义
<400> 31
auuccaggga accacauuga gaggc 25

Claims (18)

1.一种特异性结合四跨膜蛋白超家族成员4(Transmembrane 4 Superfamily Member4，TM4SF4)的抗体或其抗原结合片段，其中
所述抗体与包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的表位区域结合。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是
(a)包括具有包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1、包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2和包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H3，的重链可变区，及具有包括SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR-L1、包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L3，的轻链可变区，的抗体；或
(b)包括具有包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1、包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2和包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3，的重链可变区，及具有包括SEQID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1、包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2和包括SEQ IDNO:14的氨基酸序列的CDR-L3，的轻链可变区，的抗体。
3.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括，包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区；以及包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区。
4.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括，包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链可变区；以及包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。
5.如权利要求1至4任一所述的抗体或其抗原结合片段，其中
所述抗原结合片段是Fab、F(ab′)2或Fv。
6.一种核酸分子，编码如权利要求1至4任一所述的抗体或其抗原结合片段。
7.一种表达载体，包括权利要求6所述的核酸分子。
8.一种宿主细胞，包括权利要求7所述的表达载体。
9.一种用于产生抗体或其抗原结合片段的方法，包括培养权利要求8所述的宿主细胞。
10.一种用于检测TM4SF4的组合物，包括权利要求1至4任一所述的抗体或其抗原结合片段。
11.一种用于检测TM4SF4的试剂盒，包括权利要求10所述的用于检测TM4SF4的组合物。
12.一种用于检测TM4SF4抗原的方法，包括使权利要求1至4任一所述的抗体或其抗原结合片段与预期包括TM4SF4抗原的待检测样品接触。
13.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，包括(a)治疗有效剂量的如权利要求1至4任一所述的抗体或其抗原结合片段；以及(b)药学上可接受的载体。
14.如权利要求13所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其中所述的预防或治疗癌症是在癌症治疗期间或之后预防或治疗癌症化学抗性、癌症复发或癌症转移。
15.如权利要求13所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其中所述癌症是选自由肺癌、胃癌、卵巢癌、***、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、肝癌、头颈癌、膀胱癌、***癌、血癌、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、恶性淋巴瘤、胸腺癌、骨肉瘤、纤维化肿瘤和脑癌所组成的群组中的至少一种。
16.一种用于抑制癌干细胞生长的组合物，包括如权利要求1至4任一所述的抗体或其抗原结合片段。
17.一种用于辅助化学放射疗法的组合物，包括如权利要求1至4任一所述的抗体或其抗原结合片段。
18.如权利要求17所述的用于辅助化学辐射疗法的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段增强包括癌干细胞的癌细胞对辐射的敏感性。
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