CN113226335B - 靶向肿瘤抗原、TGF-β、和免疫检查点的组合型TCR-T细胞疗法 - Google Patents

靶向肿瘤抗原、TGF-β、和免疫检查点的组合型TCR-T细胞疗法 Download PDF

Info

Publication number
CN113226335B
CN113226335B CN201980081064.XA CN201980081064A CN113226335B CN 113226335 B CN113226335 B CN 113226335B CN 201980081064 A CN201980081064 A CN 201980081064A CN 113226335 B CN113226335 B CN 113226335B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
tcr
seq
cells
engineered
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201980081064.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN113226335A (zh
Inventor
李思
保罗·布莱森
P·亚历山大
陈锐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tiankeya Biotechnology Co ltd
Guangdong Tiankeya Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Tiankeya Biotechnology Co ltd
Guangdong Tiankeya Biomedical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tiankeya Biotechnology Co ltd, Guangdong Tiankeya Biomedical Technology Co ltd filed Critical Tiankeya Biotechnology Co ltd
Publication of CN113226335A publication Critical patent/CN113226335A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113226335B publication Critical patent/CN113226335B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4635—Cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4636—Immune checkpoint inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46443—Growth factors
    • A61K39/464434—Transforming growth factor [TGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本公开针对基因工程化TCR‑T细胞来识别肿瘤抗原并同时分泌阻断免疫检查点分子和TGFβ的结合蛋白。这些工程化T细胞表现出更强抗肿瘤应答和降低的T细胞耗竭。其中，本公开提供针对HPV‑或EBV‑阳性癌症等的免疫疗法。

Description

靶向肿瘤抗原、TGF-β、和免疫检查点的组合型TCR-T细胞疗法
优先权声明
本申请要求2018年12月6日提交的美国临时申请No.62/776,012的权益。前述文献的完整内容通过引用的方式结合在此。
技术领域
本公开大体上涉及工程化细胞及其组合物，具体地，含有基因工程化T细胞受体(TCR)、TGF-β受体(例如，TGF-βtrap)和检查点抑制剂(CPI)的T细胞。本文还公开了使用组合物来治疗癌症的方法。
背景技术
在扩增感染的B细胞中，Epstein-Barr病毒(EBV)安装基因表达程序，即"生长"或"潜伏III期(latency III)"程序。该类型的潜伏在体外EBV诱导的淋巴样干细胞系(LCL)中、在移植后淋巴组织增生性疾病(Brink AA,1997,J Clin Pathol 50:911–918.)中、以及在原发性和持续性EBV感染期间在淋巴器官中的EBV感染的B细胞中发现，在此该程序被认为通过感染细胞的增殖而导致EBV负载的放大(Young LS,2004,Nat Rev Cancer 4:757–768；Hochberg D,2004,Proc Natl Acad Sci U S A 101:239–244)。几种免疫原性EBV抗原、潜伏膜蛋白(LMP1、LMP2A、LMP2B)和Epstein-Barr核抗原(EBNA1、-2、-3A、-3B、-3C、-LP)在潜伏III期EBV感染的B细胞中表达。在患有鼻咽癌(Mutirangura等人,Clin Cancer Res.4:665-9(1998)；Lo等人,Cancer Res.59:1188-91(1999))、某些淋巴瘤(Lei等人,Br JHaematol.111:239-46(2000)；Gallagher等人,Int J Cancer.84:442-8(1999)；Dronet等人,J Med Viral.57:383-9(1999))、乳腺癌(Bonnet,M.等人,J.Natl.Cancer Inst.,91:1376-1381(1999))、和肝细胞癌(Sugawara,Y.等人,Virology,256:196-202(1999))的患者中发现Epstein-Barr病毒(EBV)DNA。
作为癌症的免疫疗法的一种形式的过继细胞转移(ACT)，已证明在治疗恶性血液病和恶性黑色素瘤方面取得显著成功。ACT的一种形式，使用表达嵌合抗原受体(CAR)的基因修饰的T细胞来特异性靶向例如CD19或GD2等肿瘤-相关-抗原(TAA)，已在治疗例如B细胞恶性肿瘤等疾病的临床试验中显示出令人鼓舞的结果。
尽管有记录表明CAR-T细胞疗法在患有恶性血液病的患者中的成功，在实体瘤中仅观察到些微响应。这些可以部分地归因于免疫抑制性肿瘤微环境的建立。这样的环境涉及由T细胞中的、与肿瘤细胞中其同源配体反应的抑制性受体(IR)的表达的增加所介导的几种固有抑制途径的上调(Ping Y,等人,Protein Cell 2018,9(3):254–266)。另外，不同于天然存在的T细胞受体(TCR)，CAR可直接地和选择性地以主要独立于组织相容性类别(MHC)的方式识别细胞表面TAA。TAA的高密度可影响CAR-T细胞的实体瘤穿透。然而，由于癌细胞表面缺少靶向MHC依赖性抗原，具有模仿天然TCR的基因工程化TCR的T细胞可比CAR-T细胞更深地穿透。TCR可在MHC的情况下识别细胞内或细胞外抗原。当设计TCR以靶向肿瘤时，选择靶向细胞内肿瘤抗原可为有利的。(Fesnak AD,等人Nat Rev Cancer.2016Aug 23；16(9):566–581.)
迄今为止，已在T细胞中表征了几种IR，例如CTLA-4、T细胞Ig黏蛋白-3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、和程序性死亡-1(PD-1)。这些分子在慢性疾病和癌症中在T细胞的持续活化后上调，并且它们促进T细胞功能障碍和耗竭，因此导致肿瘤免疫监视逃逸。与其他IR不同，PD-1在T细胞激活后不久被上调，这反过来通过与其两个配体：PD-L1或PD-L2的一者相互作用来抑制T细胞效应子功能。PD-L1在T细胞、B细胞、巨噬细胞、和树突细胞(DC)表面为组成型表达。其也在各种实体瘤中显示出大量表达。与此相反，PD-L1在正常组织中的表达是检测不到的。由于其在免疫抑制中的关键作用，PD-1是近期研究的重点，旨在中和其对T细胞的负面作用并增强抗肿瘤应答。临床研究已表明PD-1阻断显著介导结肠直肠癌、肾癌和肺癌及黑色素瘤中的肿瘤消退。(Chae YK,等人,J Immunother Cancer.2018；6:39；Le DT,等人N Engl J Med 2015；372:2509–20。)
TGFβ配体及其受体均已作为治疗靶而被广泛研究。存在三种配体同种型，TGFβ1、2和3，其全部作为同源二聚体(homodimer)存在。也存在三种TGFβ受体(TGFβR)，其被称为TGFβR I、II和III型(López-Casillas等人,J.Cell Biol.1994；124:557-68)。TGFβRI是信号传导链并且不结合配体。TGFβRII以高亲和性结合配体TGFβ1和3，但不结合TGFβ2。TGFβRII/TGFβ复合物招募TGFβRI来形成信号传导复合物(Won等人,Cancer Res.1999:59:1273-7)。TGFβRIII是结合至其信号传导受体的TGFβ的阳性调节因子并且以高亲和性结合全部3种TGFβ同种型。在细胞表面上，TGFβ/TGFβRIII复合物结合TGFβRII，然后招募TGFβRI，其取代TGFβRIII来形成信号传导复合物。
尽管3种不同的TGFβ同种型全部通过相同受体发出信号，它们已知在体内具有差异表达模式和非重叠功能。3种不同的TGFβ同种型敲除小鼠具有不同的表型，表明许多非补偿的功能(Bujak等人,Cardiovasc Res.2007:74:184-95)。因此，分别考虑到TGFβ1和TGFβ2在肿瘤微环境和心脏生理学中的主要作用，中和TGFβ1但不中和TGFβ2的治疗剂通过在不损害抗肿瘤活性的情况下最小化心脏毒性来提供最佳治疗指数。
尽管迄今为止，免疫检查点抑制剂的临床活动前景广阔，通过提高治疗功效或降低毒性的一者或两者来增加治疗指数仍是抗癌免疫疗法的发展中的主要目标。
发明内容
本公开提供工程化T细胞，其包括：编码抗LMP2 TCR的核酸，其中抗LMP2 TCR是与肿瘤中LMP2特异性结合的基因工程化T细胞受体(TCR)。
在本发明的一方面中，抗LMP2 TCR包括分别地以下基序序列：氨基酸SEQ ID NO:1的α链CDR1(位置27-32)、CDR2(位置50-56)、CDR3(位置90-101)和氨基酸SEQ ID NO:2的β链CDR1(位置27-31)、CDR2(位置49-54)、CDR3(位置92-106)。在另一个实施方案中，抗LMP2TCR包括SEQ ID NO:1的α链可变结构域和SEQ ID NO:2的β链可变结构域。在更多的实施方案中，编码基因工程化TCR的核酸包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中记载的序列。
在本发明的另一方面中，所述抗LMP2 TCR包括分别地氨基酸SEQ ID NO:5的α链CDR1(位置25-30)、CDR2(位置48-54)、CDR3(位置89-100)和氨基酸SEQ ID NO:6的β链CDR1(位置25-29)、CDR2(位置47-52)、CDR3(位置91-103)。在更多实施方案中，所述抗LMP2 TCR包括SEQ ID NO:5的α链可变结构域和SEQ ID NO:6的β链可变结构域。在优选实施方案中，编码基因工程化TCR的核酸包括SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中记载的序列。
在本发明的另一方面中，所述抗LMP2 TCR包括分别地氨基酸SEQ ID NO:9的α链CDR1(位置32-37)、CDR2(位置55-61)、CDR3(位置96-108)和氨基酸SEQ ID NO:10的β链CDR1(位置25-29)、CDR2(位置47-52)、CDR3(位置90-105)。在更多实施方案中，所述抗LMP2 TCR包括SEQ ID NO:9的α链可变结构域和SEQ ID NO:10的β链可变结构域。在优选实施方案中，编码基因工程化TCR的核酸包括SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中记载的序列。
在本发明的另一方面中，抗LMP2 TCR为组成型表达。
在本发明的另一方面中，所述工程化T细胞进一步包括降低肿瘤中抑制性受体的功能或表达的抑制性蛋白。
在一些实施方案中，所述抑制性蛋白为免疫检查点抑制剂。
在一些实施方案中，所述抑制性蛋白阻断程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，其中所述蛋白为单链抗体(scFv)。在优选实施方案中，所述抑制性蛋白为组成型表达。
在本发明的一方面中，提供了含有上文提及的工程化T细胞和药学上可接受的运载体(carrier)的药物组合物。并且，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，其中所述癌症为鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、或胃癌。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的包括化学疗法或放射疗法的现有疗法。在一些实施方案中，所述细胞和现有疗法顺序或同时施用。
本发明还提供了一种工程化T细胞，其包括：核酸，其编码(a)与肿瘤中抗原特异性结合的基因工程化T细胞受体；(b)降低肿瘤中免疫检查点的功能或表达的抑制性蛋白；和(c)与转化生长因子β(TGF-β)家族的成员结合的蛋白。这些工程化T细胞表现出降低的T细胞耗竭；因此它们具有诱导更强抗肿瘤应答的能力。靶向的转化生长因子β(TGF-β)可以是TGF-β1、2或3。
在本发明的一方面中，所述免疫检查点包括PD1、PD-L1和CTLA-4中的一种或多种。在一些实施方案中，所述抑制性蛋白阻断程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，其中所述蛋白为单链抗体(scFv)。
在本发明的一方面中，所述肿瘤抗原为人***瘤病毒(HPV)或Epstein-Barr病毒(EBV)抗原。在一些实施方案中，所述基因工程化T细胞受体为抗LMP2 TCR。在一些实施方案中，所述抗LMP2 TCR含有选自由SEQ ID NO:1、5或9组成的组的α链可变结构域和选自由SEQID NO:2、6或10组成的组的β链可变结构域。在一些实施方案中，编码抗LMP2 TCR的核酸含有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，编码抗LMP2 TCR的核酸含有SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，编码抗LMP2 TCR的核酸含有SEQ ID NO:11和SEQID NO:12。在一些实施方案中，所述基因工程化T细胞受体为抗E6或抗E7 TCR。
在本发明的另一方面中，所述基因工程化TCR为组成型表达。
在本发明的另一方面中，靶向转化生长因子β家族的成员的结合蛋白包含人TGFβRII的片段。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含TGFβRII的胞外结构域(ECD)(SEQ IDNO:13)。
在本发明的一方面中，所述抑制性蛋白和/或TGFβ结合蛋白为组成型表达。
本发明进一步提供含有上文提及的核酸的载体，其包括(a)编码与肿瘤中的抗原特异性结合的基因工程化T细胞受体的核酸；(b)编码降低肿瘤中免疫检查点的功能或表达的抑制性蛋白的核酸；和(c)编码与转化生长因子β(TGF-β)家族的成员结合的蛋白的核酸，其中所述载体优选逆转录病毒载体。
在本发明的一方面中，提供含有上文提及的工程化T细胞和药学上可接受的运载体的药物组合物。并且，提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，其中所述癌症主要为病毒相关的恶性肿瘤。
在一些实施方案中，所述癌症为HPV或EBV阳性癌症。在一些实施方案中，EBV相关癌症可为但不限于鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、或胃癌。在一些实施方案中，HPV相关癌症可为但不限于子宫颈、***、口咽、或生殖器官癌。
在本发明的一方面中，所述肿瘤为病毒相关的肿瘤或与病毒致癌基因相关的肿瘤。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的包括化学疗法或放射疗法的现有疗法。在一些实施方案中，所述细胞和现有疗法顺序或同时施用。
在本发明的另一方面中，一种产生基因工程化T细胞的方法，其包括引入含有3种转基因的载体(vector)：(1)与肿瘤中的抗原特异性结合的基因工程化T细胞受体的α链，(2)同一TCR的β链，和(3)用GS接头连接的新型免疫检查点抑制剂(ICI)的重链和轻链的可变区，其通过可变重链的C-末端处的柔性接头肽融合至TCRβRII的胞外结构域的配体结合序列，其中所述载体包括但不限于逆转录病毒载体。在更多实施方案中，3种转基因由2A序列连接。在一些实施方案中，基因工程化TCR进一步包括信号肽序列。
在一方面中，本公开涉及T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包括含有可变α(Va)区的α链和含有可变β(Vb)区的β链。
在一些实施方案中，本文提供TCR或抗原结合片段：
(1)Va区，其包括分别含有SEQ ID NO:1的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)、和互补决定区3(CDR3)的CDR1、CDR2、和CDR3，和Vb区，其包括分别含有SEQ ID NO:2的CDR1、CDR2、和CDR3的CDR1、CDR2、和CDR3；
(2)Va区，其包括分别含有SEQ ID NO:5的CDR1、CDR2、和CDR3的CDR1、CDR2、和CDR3，和Vb区，其包括分别含有SEQ ID NO:6的CDR1、CDR2、和CDR3的CDR1、CDR2、和CDR3；或
(3)Va区，其包括分别含有SEQ ID NO:9的CDR1、CDR2、和CDR3的CDR1、CDR2、和CDR3，和Vb区，其包括分别含有SEQ ID NO:10的CDR1、CDR2、和CDR3的CDR1、CDR2、和CDR3。
在一些实施方案中，本文提供TCR或抗原结合片段：
(1)Va区，其包括分别含有SEQ ID NO:17-19的氨基酸的CDR1、CDR2、和CDR3，和Vb区，其包括分别含有SEQ ID NO:20-22的氨基酸的CDR1、CDR2、和CDR3；
(2)Va区，其包括分别含有SEQ ID NO:23-25的氨基酸的CDR1、CDR2、和CDR3，和Vb区，其包括分别含有SEQ ID NO:26-28的氨基酸的CDR1、CDR2、和CDR3；或
(3)Va区，其包括分别含有SEQ ID NO:29-31的氨基酸的CDR1、CDR2、和CDR3，和Vb区，其包括分别含有位置25-29处的氨基酸、SEQ ID NO:32-34的氨基酸的CDR1、CDR2、和CD3。
在一些实施方案中，本文提供TCR或抗原结合片段：
Va区，其包括SEQ ID NOs:1、5、或9任意者中记载的氨基酸序列、或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列；和
Vb区，其包括SEQ ID NOs:2、6、或10任意者中记载的氨基酸序列、或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供TCR或抗原结合片段，所述TCR或其抗原结合片段结合或识别LMP2的肽表位(LLWTLVVLL)(SEQ ID NO:16)。
在一些实施方案中，本文提供TCR或抗原结合片段，当在T细胞表面表达时，所述TCR或其抗原结合片段针对靶癌细胞刺激细胞毒活性，任选地在一些实施方案中，所述靶癌细胞含有EBV DNA序列或表达LMP2。
在一方面中，本公开涉及含有编码本文所述TCR或其抗原结合片段的核酸的载体。
在一些实施方案中，所述载体为表达载体、病毒载体、逆转录病毒载体、或慢病毒载体。
在一方面中，本公开涉及含有本文所述载体的工程化细胞。
在一方面中，本公开涉及含有本文所述TCR或其抗原结合片段的工程化细胞。
在一些实施方案中，所述TCR或其抗原结合片段与细胞异源。
在一些实施方案中，所述工程化细胞为细胞系。在一些实施方案中，所述工程化细胞为获得自受试者(例如，人受试者)的原代细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞为T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞为CD8+。在一些实施方案中，所述T细胞为CD4+。
在一方面中，本公开涉及产生工程化细胞的方法，其包括体外或离体地将本文所述载体引入至细胞中。
在一些实施方案中，所述载体为病毒载体并且通过转导进行引入。
在一方面中，本公开涉及治疗疾病或病症的方法，其包括向患有EBV相关的疾病或病症的受试者施用本文所述的工程化细胞。
在一些实施方案中，所述EBV相关的疾病或病症为癌症。
在一方面中，本公开涉及治疗受试者中肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用：(a)工程化T细胞，其包括：编码与肿瘤中的抗原特异性结合的TCR或其抗原结合片段的核酸；和(b)与转化生长因子β家族(TGF-β)的成员结合的检查点抑制剂或蛋白的一者或两者。
在一方面，本公开涉及治疗受试者中肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用：工程化T细胞，其包括：核酸，其编码(a)与肿瘤中的抗原特异性结合的TCR或其抗原结合片段；和(b)靶向检查点抑制剂和转化生长因子β家族(TGF-β)的成员的双功能trap蛋白。
在一些实施方案中，所述肿瘤为EBV诱导的肿瘤或HPV诱导的肿瘤。
除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属技术领域常规技术人员通常所理解的相同的意义。本文描述用于本发明的方法和材料；另外，也可以使用本领域公知的合适的方法和材料。所述材料、方法、和实施例仅为说明性的而不意于限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目、和其他参考文献，其全部内容通过引用结合在此。在发生冲突的情况下，本说明书，包括定义，将占主导。
本发明的其他特征和优点将从以下详细描述和附图、以及从权利要求书中显而易见。
附图说明
参考附图说明示例性实施方案。其旨在将本文所公开的实施方案和附图视为说明性的而非限制性的。
图1A是显示MP71逆转录病毒载体构建体的示意图。P2A编码2A自裂解肽；Va编码人抗LMP2 TCR的α链的可变区；Vb编码人抗LMP2 TCR的β链；Ca编码TCRα链的恒定区；Cb编码TCRβ链的恒定区；HGH\SS和HGH\SS\2为信号肽(分别为SEQ ID NO:14和15)。Ψ表示病毒RNA上的包装序列。
图1B是显示MP71逆转录病毒载体构建体的示意图。P2A和T2A编码2A自裂解肽；Va编码基因工程化人TCR的α链的可变区；Vb编码基因工程化人TCR的β链；Ca编码TCRα链的恒定区；Cb编码TCRβ链的恒定区；HGH\SS和HGH\SS\2为信号肽(分别为SEQ ID NO:14和15)；ICI-ScFv编码由GS接头连接的免疫检查点抑制剂(ICI)的重链和轻链的可变区；TGFβRII编码TGFβRII的胞外结构域的配体结合序列；接头是可变重链的C-末端处的柔性接头肽。
图2A显示L201 TCR的α链可变结构域氨基酸序列。
图2B显示L201 TCR的β链可变结构域氨基酸序列。
图3A显示编码L201 TCRα链可变结构域的DNA序列。
图3B显示编码L201 TCRβ链可变结构域的DNA序列。
图4A显示L202 TCR的α链可变结构域氨基酸序列。
图4B显示L202 TCR的β链可变结构域氨基酸序列。
图5A显示编码L202 TCRα链可变结构域的DNA序列。
图5B显示编码L202 TCRβ链可变结构域的DNA序列。
图6A显示L203 TCR的α链可变结构域氨基酸序列。
图6B显示L203 TCR的β链可变结构域氨基酸序列。
图7A显示编码L203 TCRα链可变结构域的DNA序列。
图7B显示编码L203 TCRβ链可变结构域的DNA序列。
图8显示HGH\SS信号肽的氨基酸序列和HGH\SS\2信号肽的氨基酸序列。
图9是一组显示用L201、L202和L203构建体转导的人T细胞的TCR表达的流式细胞术结果的图，其中同时染色CD3、CD4和CD8并且使用可行的CD3+淋巴细胞门控策略(viableCD3+lymphocyte gating strategy)。NT是非转导对照。TCR表达由小鼠TCRβ染色来表示。
图10是一组显示抗原特异性刺激的TCR-T细胞的流式细胞术结果的图，其中染色CD3、CD8和细胞内IFN-γ。L201、L202和L203构建体用于转导细胞。NT为非转导对照。
图11A是显示含有抗LMP2 TCR L201的TCR-T细胞的激活曲线的图。TCR-T细胞与EBV肽脉冲的(peptide-pulsed)APC以1:1效靶比(effector-to-target ratio)共培养，并且通过流式细胞术测量表达细胞内IFN-γ的T细胞的百分比(Y-轴)。确定半最大有效浓度(EC50)。
图11B是显示含有抗LMP2 TCR L202的TCR-T细胞的激活曲线的图。所述TCR-T细胞与EBV肽脉冲的APC以1:1效靶比共培养，并且通过流式细胞术测量表达细胞内IFN-γ的T细胞的百分比(Y-轴)。确定半最大有效浓度(EC50)。
图11C是显示含有抗LMP2 TCR L203的TCR-T细胞的激活曲线的图。所述TCR-T细胞与EBV肽脉冲的APC以1:1效靶比共培养，并且通过流式细胞术测量表达细胞内IFN-γ的T细胞的百分比(Y-轴)。确定半最大有效浓度(EC50)。
图12是显示抗原特异性刺激下的TCR-T细胞的长期IFN-γ产生的直方图。将人T细胞转导以表达L201 TCR(TCR转导的)或未转导(作为阴性对照)，与EBV肽脉冲的APC以1:0、1:1或3:1效靶(E:T)比共培养，并且使用人IFN-γELISA试剂盒来测量IFN-γ产生。
图13A是显示由L201 TCR-T细胞对靶细胞的特异性杀伤百分比的直方图。EBV肽脉冲的APC与L201 TCR-T细胞以1:1或3:1效靶比共培养，并且通过测量APC的细胞死亡来确定TCR-T细胞的细胞毒性。转导人T细胞来表达L201 TCR(TCR转导的)或未转导(作为阴性对照)。
图13B是显示L202 TCR-T细胞对靶细胞的特异性杀伤百分比和E:T比的关系的图。靶和非靶细胞(以1:1比混合)与L202 TCR-T细胞以指定效靶比共培养，并且通过测量靶细胞的细胞凋亡来确定TCR-T细胞的细胞毒性。
图14是一组显示用E6、E6.αPD1-TGFβRII、E6.αPDL1-TGFβRII、E6.HAC-TGFβRII或E6.αgp120-TGFβRII构建体转导的人T细胞的TCR表达的流式细胞术结果的图，其中同时染色CD3、CD4和CD8，并且使用可行CD3+淋巴细胞门控策略。NT为非转导对照。通过小鼠TCRβ染色来表示TCR表达。通过将矩形盒中的信号除以总信号来定义TCR百分比。E6是指抗E6 TCR。αPD1-TGFβRII是指融合蛋白，其中人TGFβRII(TGFβTrap)的胞外结构域连接至抗PD-1单链Fv(scFV)的C-末端。αPDL1-TGFβRII是指融合蛋白，其中TGFβTrap连接至抗PD-L1 scFV的C-末端。HAC-TGFβRII是指融合蛋白，其中TGFβTrap连接至称为HAC的PD-L1-结合蛋白的C-末端。αgp120-TGFβRII是指融合蛋白对照，其中TGFβTrap连接至抗gp120 scFV的C-末端。
图15A是显示在抗原特异性刺激下表达细胞内IFN-γ的TCR-T细胞的百分比(Y-轴)的直方图。NT是非转导对照。使用表达E6、E6.αPD1-TGFβRII、E6.αPDL1-TGFβRII、E6.HAC-TGFβRII或E6.αgp120-TGFβRII TCR的TCR-T细胞。肽脉冲的A562-A2细胞与TCR-T细胞以1:1效靶比共培养，并且通过流式细胞术测量表达细胞内IFN-γ的TCR-T细胞的百分比(Y-轴)。
图15B是显示转导以表达E6、E6.αPD1-TGFβRII、E6.αPDL1-TGFβRII、E6.HAC-TGFβRII或E6.αgp120-TGFβRII TCR的TCR-T细胞的IFN-γ产生水平的直方图。NT为非转导对照。Ca Ski E6/E7细胞与TCR-T细胞以1:0、1:1或3:1效靶比共培养，并且使用人IFN-γELISA试剂盒来测量上清液中的IFN-γ产生。
图16是显示转导以表达E6、E6.αPD1-TGFβRII、E6.αPDL1-TGFβRII、E6.HAC-TGFβRII或E6.αgp120-TGFβRII TCR的TCR-T细胞对靶细胞的特异性杀伤百分比的直方图。NT为非转导对照。Ca Ski肿瘤细胞与TCR-T细胞以1:1效靶比共培养，并且通过测量靶细胞的细胞死亡来确定TCR-T细胞的细胞毒性。
图17是一组显示分泌的scFv-TGFβRII对TGFβ的结合曲线的图。由转导以表达E6、E6.αPD1-TGFβRII、E6.αPDL1-TGFβRII、E6.HAC-TGFβRII或E6.αgp120-TGFβRII TCR的293T细胞产生所述分泌的scFv-TGFβRII。通过ELISA确定结合活性。
图18是显示人Ca Ski细胞中的TGFβ表达的直方图。CM为培养基。
图19是显示抗原特异性刺激下的TCR-T细胞增殖的直方图。通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)阴性群来确定增殖。NT为非转导对照。转导TCR-T细胞来表达E6、E6.αPD1-TGFβRII、E6.αPDL1-TGFβRII、E6.HAC-TGFβRII或E6.αgp120-TGFβRII TCR。
图20是一组显示用LMP2.αPD1-TGFβRII、LMP2.αPDL1-TGFβRII、LMP2.HAC-TGFβRII或LMP2.αgp120-TGFβRII TCR构建体转导的人细胞中的TCR表达的流式细胞术结果的图。
图21是一组显示抗原特异性刺激的TCR-T细胞的流式细胞术结果的图，其中染色CD3、CD8和细胞内IFN-γ。L201-PD1trap(L201.αPD1-TGFβRII)、L201-PDL1trap(L201.αPDL1-TGFβRII)、L201-HACtrap(L201.HAC-TGFβRII)、和L201-gp210trap(L201.αgp120-TGFβRII)是用于转导细胞的构建体。NT为非转导对照。
图22A是显示抗原特异性刺激下的表达细胞内IFN-γ的TCR-T细胞的百分比(Y-轴)的直方图。NT为非转导对照。使用表达L201-PD1trap(L201.αPD1-TGFβRII)、L201-PDL1trap(L201.αPDL1-TGFβRII)、L201-HACtrap(L201.HAC-TGFβRII)、或L201-gp210trap(L201.αgp120-TGFβRII)TCR的TCR-T细胞。肽脉冲的A562-A2细胞与TCR-T细胞以1:1效靶比共培养，并且通过流式细胞术测量表达细胞内IFN-γ的TCR-T细胞的百分比(Y-轴)。
图22B是显示转导以表达L201-PD1trap(L201.αPD1-TGFβRII)、L201-PDL1trap(L201.αPDL1-TGFβRII)、L201-HACtrap(L201.HAC-TGFβRII)、或L201-gp210trap(L201.αgp120-TGFβRII)TCR的TCR-T细胞的IFN-γ产生水平的直方图。NT为非转导对照。Ca SkiE6/E7细胞与TCR-T细胞以1:0、1:2、1:1或3:1效靶比共培养，并且使用人IFN-γELISA试剂盒测量上清液中的IFN-γ产生。
图23是显示L201-trap TCR-T细胞对靶细胞的特异性杀伤百分比和E:T比的关系的图。靶细胞与转导以表达L201-PD1trap(L201.αPD1-TGFβRII)、L201-PDL1trap(L201.αPDL1-TGFβRII)、L201-HACtrap(L201.HAC-TGFβRII)、或L201-gp210trap(L201.αgp120-TGFβRII)TCR的TCR-T细胞以指定的效靶(E:T)比共培养，并且通过测量靶细胞的细胞死亡来确定TCR-T细胞的细胞毒性。
图24A是显示在用L202 TCR-T细胞或未转导细胞处理后，小鼠中个体黑色素瘤肿瘤体积的图。
图24B是显示在用L202 TCR-T细胞或未转导细胞处理后，小鼠中平均黑色素瘤肿瘤体积的图。
图24C是显示指定组中的动物的肿瘤体积倍数变化(第20天/第0天)的图。
图24D是显示在L202 TCR-T细胞或未转导细胞施用后，在指定天数的平均动物重量的图。
图25显示3种T细胞受体的CDR序列。
图26提供本公开中描述的序列。
具体实施方式
结合***、组成、和方法来描述和说明以下实施方案及其方面，所述***、组成、和方法意在示例和说明，并不意在限制范围。
定义
如本文所使用的术语“包括”或“包含”是指有利于实施方案的组合物、方法、及其各自的组分(一种或多种)，也可包含未指定的元素，无论有用与否。通常本领域技术人员应理解的是，本文中所使用的术语通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“具有至少”，术语“含有”应解释为“含有但不限于”等)。
除非另外指出，否则在描述本申请的特定实施方案的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一”和“一个”和“所述”以及类似说法可被解释为涵盖单数和复数两者。本文中列举的数值的范围仅旨在用作分别指代落入该范围的各个单独值的简写方法。除非在本文中另外指出，各个单独值如在本文中单独引用一样并入说明书。除非在本文中另外指出或上下文明显矛盾，否则本文所述的全部方法可以任何合适的顺序进行。关于本文特定实施方案提供的任何和全部实施例、或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本申请而不造成另外要求的本申请的范围的限制。缩写“e.g.”衍生自拉丁文的例如，并且在本文中用于表示非限定性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如”同义。说明书中的任何语言不应被解释为表示对本申请的实施非要求的要素。
如本文所使用的，术语“约”是指例如量、时间段等的可测值，并且包括从该指定值±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或±0.1％的变量。
如本文所使用的，术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白或具有在本文中被称为“Fc片段”或“Fc结构域”的Fc(可结晶片段)区或Fc区的FcRn结合片段的单克隆或多克隆抗原结合片段。抗原结合片段可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解来产生。抗原结合片段包括，尤其，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb、和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、嵌合抗体、双体抗体(diabodies)和含有足以赋予多肽特异性抗原结合的免疫球蛋白的至少一部分的多肽。Fc结构域包括有助于两类或三类抗体的两条重链的部分。Fc结构域可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促(例如，木瓜蛋白酶裂解)或化学裂解来产生。
本文使用的术语“抗体片段”是指包括完整抗体的仅一部分的蛋白质片段，通常包括完整抗体的抗原结合位点，并因此保留结合抗原的能力。本定义包括的抗体片段的实例包括：(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1结构域；(ii)Fab'片段，其中Fab片段在CH1结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1结构域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CH1结构域并且在CH1结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有抗体的单臂的VL和VH结构域；(vi)dAb片段(Ward等人,Nature 341,544-546(1989))，其由VH结构域组成；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab')2片段，其为含有由铰链区处的二硫桥连接的两个Fab'片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如，单链Fv；scFv)(Bird等人,Science 242:423-426(1988)；和Huston等人,PNAS(USA)85:5879-5883(1988))；(x)具有两个抗原结合位点的“双体抗体”，其包括与同一多肽链中轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(参见，例如，EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；(xi)“线性抗体”，其包括与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区的一对串联Fd段(VH-CH1-VH-CH1)(Zapata等人ProteinEng.8(10):1057-1062(1995)；和U.S.Pat.No.5,641,870)。
本文所使用的“单链可变片段”、“单链抗体可变片段”或“scFv”抗体指的是含有由接头肽连接的仅重(VH)链和轻(VL)链的可变区的抗体的形式。scFv可作为单链多肽表达。scFv保留其衍生自的完整抗体的特异性。轻链和重链可为任何顺序，例如VH-接头-VL或VL-接头-VH，只要保留scFv对靶抗原的特异性即可。
术语“结合蛋白”是指天然蛋白结合结构域(例如细胞因子、细胞因子受体)、抗体片段(例如Fab、scFv、双体抗体、可变结构域衍生结合子(variable domain derivedbinder)、VHH纳米抗体)、替代支架衍生蛋白质结合结构域(例如Fn3变体、锚蛋白重复变体、centyrin变体、高亲和性多聚体、亲合体)或任何识别特异性抗原的蛋白。
如本文所使用的，术语“抗原”是指如果由MHC分子呈递，则可被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。如本文所使用的，“抗原”也包括由T细胞受体识别的T细胞表位。该识别导致T细胞以及其后例如T细胞的增殖、细胞因子分泌等的效应子机制的激活。抗原还可被免疫***识别和/或可以诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B淋巴细胞和/或T淋巴细胞的激活。
如本文所使用的，术语“HPV抗原”是指衍生自人***瘤病毒(HPV)的多肽分子，优选地，其中所述HPV选自HPV1、HPV2、HPV3、HPV4、HPV6、HPV10、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV27、HPV28、HPV29、HPV30、HPV31、HPV33、HPV34、HPV35、HPV39、HPV40、HPV41、HPV42、HPV43、HPV45、HPV49、HPV51、HPV52、HPV54、HPV55、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59、HPV68、HPV69。更优选地，所述HPV选自高风险HPV，例如，HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV69。在一些实施方案中，所述HPV多肽分子选自E6和E7。
如本文所使用的，术语“EBV抗原”是指衍生自Epstein-Barr病毒(EBV)的多肽分子。EBV抗原包括但不限于潜伏膜蛋白(LMP1、LMP2A、和LMP2B)以及Epstein-Barr核抗原(EBNA1、-2、-3A、-3B、-3C、-LP)。
如本文所使用的，术语“外周血细胞亚型”是指通常在外周血中发现的细胞类型，包括但不限于嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、T细胞、单核细胞、K细胞、粒细胞、和B细胞。
如本文所使用的，术语“T细胞”包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。术语T细胞也包括T辅助1型T细胞和T辅助2型T细胞。T细胞表达识别靶细胞表面上特异性抗原部分的细胞表面受体。细胞表面受体可为野生型或重组T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、或可以识别与靶细胞相关的抗原部分的任何其他表面受体。通常，TCR具有两种蛋白链(α-和β-链)，其结合由某些细胞表面的MHC蛋白呈递的特异性肽。在靶细胞表面表达MHC分子的背景下，TCR识别肽。TCR还识别直接在癌细胞表面上呈递的癌抗原。
本文所使用的“基因修饰的细胞”、“重定向细胞”、“工程化细胞”、“基因工程化细胞”或“修饰的细胞”是指表达基因工程化抗原受体和检查点抑制剂的细胞。在一些实施方案中，基因修饰的细胞包括编码基因工程化TCR的载体和编码一种或多种检查点抑制剂的载体。在一些实施方案中，基因修饰的细胞包括编码基因工程化TCR和一种或多种检查点抑制剂的载体。在一个实施方案中，基因修饰的细胞为T淋巴细胞(T细胞)。在一个实施方案中，基因修饰的细胞为自然杀伤(NK)细胞。
如本文所使用的，术语“基因工程化”或“基因修饰的”是指细胞的核酸序列的修饰，包括但不限于删除编码或非编码区或其部分、或***编码区或其部分。
如本文所使用的，术语“载体”、“克隆载体”或“表达载体”是指一种运载体(vehicle)，通过其可将多核苷酸序列(例如，外源基因)引入至宿主细胞中，以便转化宿主并促进引入的序列的表达(例如转录和翻译)。载体包括质粒、噬菌体、病毒等。载体的最普遍的类型是"质粒"，其是指闭合的环状双链DNA环，其中可连接含有目标基因的另外的DNA段。载体的另一种类型为病毒载体，其中将待运输的核酸构建体连接至病毒基因组中。病毒载体可在它们被引入的宿主细胞中自主复制、或可将它们自身整合至宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体可指导与其可操作连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为"重组表达载体"或简称为"表达载体"。应注意的是，本发明旨在包括具有同等功能的其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所使用的，术语“逆转录病毒载体”或“重组逆转录病毒载体”是指核酸构建体，其携带、并且在某些实施方案中、可以指导目标核酸分子的表达。逆转录病毒以RNA形式存在于其病毒荚膜(viral capsule)中，并且当其在宿主细胞中复制时立即形成双链DNA。类似地，逆转录病毒载体以RNA和双链DNA形式存在，两者形式都包括在术语"逆转录病毒载体"和"重组逆转录病毒载体"中。术语"逆转录病毒载体"和"重组逆转录病毒载体"也包括含有重组DNA片段的DNA形式和含有重组RNA片段的RNA形式。载体可包括至少一个转录启动子/增强子、或控制基因表达的其他元件。这样的载体还可包括包装信号(packagingsignal)、长末端重复序列(LTR)或其部分、和适合于所使用的逆转录病毒的正链和负链引物结合位点(如果逆转录病毒载体中尚不存在这些)。任选地，载体还可包括指导多腺苷酸化的信号，可选标记例如氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、TK、潮霉素抗性、腐草霉素抗性、组氨醇抗性、或DHFR，以及一个或多个限制性位点和翻译终止序列。举例来说，这样的载体可包括5'LTR、前导序列、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点、3'LTR或其部分。
如本文所使用的，“接头”(L)或“接头结构域”或“接头区”是指约1至100氨基酸长度的寡-或多肽区，其将本发明的TCR的任何结构域/区域连接在一起。接头可由如甘氨酸和丝氨酸等柔性残基组成，使得相邻蛋白结构域相对于彼此自由移动。当期望确保两个相邻结构域彼此不发生空间干扰时，可以使用更长的接头。接头可以是可切割的或非可切割的。可切割接头的实例包括2A接头(例如T2A)、2A样接头或其功能等同物或其组合。在一些实施方案中，接头包括匹克纳病毒2A样接头、猪捷申病毒的CHYSEL序列(P2A)、明脉扁刺蛾病毒(T2A)或其组合、变体和功能等同物。在其他实施方案中，接头序列可包括Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly(2A)–Pro(2B)基序，导致2A甘氨酸和2B脯氨酸之间的裂解。其他接头对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以与本发明的替代实施方案结合使用。
术语“药物制剂”是指其形式允许其含有的有效成分的生物活性为有效的、并且其不含有对被施用该制剂的受试者为不可接受的毒性的其他组分的制剂。
“药学上可接受的运载体”是指药物制剂中有效成分以外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的运载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
如本文所使用的，“受试者”为哺乳动物，例如人或其他动物，并且通常为人。在一些实施方案中，对其施用细胞、细胞群、或组合物的例如患者等的受试者为哺乳动物，通常为灵长目动物，例如人类。在一些实施方案中，灵长目动物为猴或者猿。受试者可为雄性或雌性并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿(infant)、少年、青年、成年、和老年受试者。在一些实施方案中，受试者为非灵长目哺乳动物，例如啮齿动物。
术语“对照”是指适合于提供与试验样品中的表达产物的比较的任何参考标准。
如本文所使用的，术语“抑制”是指例如特定活动、功能、或相互作用中的任何降低。例如，如果例如蛋白质的功能和/或一个蛋白与另一个蛋白的结合等的生物功能与例如类似野生型状态或不存在施加的试剂的状态的对照等参考状态相比为降低的，则其被抑制。例如，与PD-1蛋白未与试剂接触时相比，如果结合、信号传导、和其他免疫作用由于与例如抗PD-1抗体等试剂接触而降低，则PD-1蛋白与其一个或多个例如PD-L1和/或PD-L2等配体的结合、和/或产生的PD-1信号传导和免疫作用受到抑制或缺乏。这样的抑制或缺乏可以例如通过在特定时间和/或位置施加试剂、或可以是组成性的例如通过连续施用来诱导。这样的抑制或缺乏也可以是部分的或完全的(例如，与例如类似野生型状态的对照等参考状态相比，基本上无可测量的活性)。基本上完全抑制或缺乏被称为阻断。
如本文所使用的，“病况”和“疾病病况”可包括癌症、肿瘤或传染病。在示例性实施方案中，病况可包括但决不限于任何形式的恶性赘生性细胞增殖性病症或疾病。在示例性实施方案中，病况包括肾癌、黑色素瘤、***癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、肺癌、结肠癌、或膀胱癌的任何一种或多种。
“癌症”和“癌的”是指或描述哺乳动物中的生理状况，其通常表征为未调节的细胞生长。术语“癌症”是指包括所有类型的癌生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织、或器官，不考虑组织病理学类型或侵入阶段。实体瘤的实例包括各种器官***的恶性肿瘤，例如，肉瘤、腺瘤、和癌，例如影响肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠道(例如，结肠)、泌尿生殖道(例如，肾、泌尿上皮细胞)、***和咽的那些。腺癌包括恶性肿瘤，例如大部分的结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺的非小细胞癌、小肠癌和食道癌。在一个实施方案中，癌为恶性肿瘤，例如晚期黑色素瘤。还可使用本发明的方法和组合物治疗或预防上述癌症的转移性病灶。可被治疗的其他癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***、***癌、***癌、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、慢性或急性白血病包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经***(CNS)赘生物、原发CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症包括由石棉诱导的那些、和所述癌的组合。可使用本文所述的抗体分子来影响例如表达PD-L1的转移性癌(Iwai等人(2005)Int.Immunol.17:133-144)等转移性癌的治疗。
如本文所使用的，术语“治疗”、“疗法”、“处理”、或“改善”是指目的是逆转、减轻、改善、抑制、减慢或停止与疾病或病症相关的状况的发展或严重性的治疗疗法。术语“治疗”包括减少或减轻例如癌症等病况、疾病或病症的至少一种不利效果或症状。如果一个或多个症状或临床标志物被降低，则治疗通常为“有效的”。可选地，如果疾病的进展被减小或停止，则治疗为“有效的”。即，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括停止至少减慢在没有治疗的情况下预期到的症状的进展或恶化。有益或理想的临床结果包括但不限于一种或多种症状的缓和、疾病程度的减轻、疾病的稳定(即不恶化)状态、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分的或全部的)，无论是可检测的或不可检测的。疾病的术语“治疗”还包括减轻疾病的症状或副作用(包括姑息疗法)。在一些实施方案中，癌症的治疗包括减小肿瘤体积、降低癌细胞数量、抑制癌细胞转移、增加预期寿命、降低癌细胞增殖、降低癌细胞存活率、或改善与癌病况相关的各种生理状况。
如本文所使用的，“延迟疾病的发展”是指推迟、阻碍、减慢、阻滞、稳定、抑制和/或延缓疾病(例如癌症)的发展。该延迟可以是不同的时间长度，取决于疾病的历史和/或待治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，实际上，充分或显著的延迟可以包括预防，因为该个体不会发展该疾病。例如，晚期癌症，如转移的发展，可被延迟。
如本文所使用的，“预防”包括提供针对可能易患疾病但尚未诊断患有疾病的受试者中的疾病的发生或复发的预防。在一些实施方案中，提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。
如本文所使用的，“抑制”功能或活性是指，当与除了目标状态或参数以外的其他相同状态比较时、或可选地与另一状态相比时，降低功能或活性。例如，与不存在抑制肿瘤生长的细胞下的肿瘤的生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低肿瘤的生长速率。
在施用情况中，例如药物制剂、细胞、或组合物等试剂的“有效量”是指在以剂量/数量在所需的时间段中有效实现例如治疗或预防结果等期望结果的量。
例如药物制剂或细胞等试剂的“治疗有效量”是指在以剂量在所需的时间段中有效实现例如疾病、病况、或病症的治疗、和/或治疗的药代动力学或药效动力学效果等期望的治疗结果的量。治疗有效量可根据例如疾病状态、年龄、性别、和受试者的重量、以及待施用的细胞群等因素来变化。在一些实施方案中，提供的方法包括以例如治疗有效量等有效量施用细胞和/或组合物。
“预防有效量”是指在以剂量在所需时间段中有效实现期望的预防结果的量。通常但未必，由于受试者在患病前或患病的早期阶段使用预防剂量，预防有效量将小于治疗有效量。在较低肿瘤负荷的情况下，预防有效量在某些方面将高于治疗有效量。
根据本文所述的各种实施方案，本发明提供工程化细胞和含有所述工程化细胞的组合物/制剂。本发明还提供制造所述工程化细胞的方法或工艺，其可用于治疗患有病理性疾病或病况的患者。
此外，根据本文所述的各种实施方案，本发明提供含有适合于基因修饰细胞的核酸构建体的重组载体，其可用于治疗病理性疾病或病况。
此外，根据本文所述的各种实施方案，本发明提供含有适合于基因修饰细胞的核酸构建体的工程化细胞，其可用于治疗病理性疾病或病况，其中所述核酸编码：(a)与抗原特异性结合的基因工程化抗原受体；和(b)减少或能够实现降低肿瘤靶的表达的抑制性蛋白。在各种实施方案中，细胞表达基因工程化抗原受体和抑制性蛋白。在各种实施方案中，抑制性蛋白为组成型表达。
在用提供的细胞、组合物、方法和用途治疗的疾病、病况、和病症中有肿瘤，其包括实体瘤、血液病恶性肿瘤、和黑色素瘤，和传染性疾病，例如由病毒或其他病原体传染，例如HPV、HIV、HCV、HBV、EBV、HTLV-1、CMV、腺病毒、BK多瘤病毒、HHV-8、MCV或其他病原体，以及寄生虫病。在一些实施方案中，疾病或病况为肿瘤、癌、恶性肿瘤、赘生物、或其他增殖性疾病或病症。这样的疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤，例如，慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性-淋巴细胞白血病(ALL)、非-霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓白血病、多发性骨髓瘤、难治型滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、B细胞恶性肿瘤、子宫颈、结肠、肺、肝、乳腺、***、卵巢、皮肤的癌症、黑色素瘤、骨、和脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺癌、霍奇金氏淋巴瘤、***、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、成神经管细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤、和/或间皮瘤。
T细胞受体和结合分子
本公开提供T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，“T细胞受体”或“TCR”是含有可变a(或α)和b(或β)链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变g(或γ)和d(或δ)链(也分别称为TCRγ和TCRδ)、或其抗原结合部分的分子，并且其可特异性结合例如结合至MHC分子的肽抗原或肽表位等的抗原。在一些实施方案中，TCR为ab形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR通常结构上相似，但表达它们的T细胞可具有不同的解剖学位置或功能。通常，TCR被发现在T细胞(或T淋巴细胞)的表面，在那里其通常负责识别例如结合至主要组织相容性复合物(MHC)分子的肽等的抗原。
在一些实施方案中，TCR为完整或全长TCR，例如含有a链和b链的TCR。在一些实施方案中，TCR为小于全长TCR的抗原结合部分，但其结合与MHC分子结合的特异性肽，例如结合至MHC-肽复合物。在某些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可含有全长或完整TCR的结构域的仅一部分，但仍可以结合肽表位，例如完整TCR结合的MHC-肽复合物。在某些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域，例如TCR的可变a(Va)链和可变b(Vb)链、或足以形成用于结合特异性MHC-肽复合物的结合位点的其抗原结合片段。
TCR的可变结构域含有互补决定区(CDR)，其通常主要有助于抗原识别以及肽、MHC和/或MHC-肽复合物的结合能力和特异性。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的抗原结合位点的全部或几乎全部。TCR链的可变区中的各种CDR通常由框架区(FR)分隔，与CDR相比，框架区通常在TCR分子间表现较小的可变性(例如，参见Jores等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或是用于抗原识别、和/或用于与肽-MHC复合物的处理的肽部分相互作用的给定TCR可变区中的三个CDR中最重要的。在某些情况下，α链的CDR1可与特定抗原肽的N-末端部分相互作用。在某些情况下，β链的CDR1可与肽的C-末端部分相互作用。在某些情况下，CDR2最强力有助于与MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或识别MHC-肽复合物的MHC部分，或是负责这些的主要CDR。
在一些实施方案中，TCR的a-链和/或b-链还可含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾区(例如，参见Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health andDisease,第3版,Current Biology Publications,p.4:33,1997)。在一些方面中，TCR的各个链(例如α或β)可具有1个N-末端免疫球蛋白可变结构域、1个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区、和位于C-末端的短胞质尾区。在一些实施方案中，TCR例如通过胞质尾区与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白相关联。在一些情况下，结构允许TCR与例如CD3及其亚单元等其他分子相关联。例如，含有带跨膜区的恒定结构域的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中并且与CD3信号传导装置或复合物的不变亚单元相关联。CD3信号传导亚单元的细胞内尾(例如CD3y、CD35、CD3e和CD3z链)含有一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM，并且通常涉及TCR复合物的信号传导能力。
确定或识别TCR的各种结构域或区域在本领域技术人员的水平内。在一些情况下，结构域或区域的确切位点可根据特定结构或同源建模或用于描述特定结构域的其他特征而变化。应理解的是，对氨基酸的引用，包括对用于描述TCR的结构域组织的以SEQ ID NO记载的特定序列的引用，是为了说明的目的而不意在限制所提供的实施方案的范围。在一些情况下，特定结构域(例如可变或恒定)可以是更长或更短的几个氨基酸(例如1个、2个、3个或4个)。在一些方面中，TCR的残基是已知的或可以根据国际免疫遗传学信息***(International Immunogenetics Information System)(IMGT)编码***(例如，参见www.imgt.org；还参见，Lefranc等人(2003)Developmental and ComparativeImmunology,27(l)；55-77；和The T Cell Factsbook第2版,Lefranc and LeFrancAcademic Press 2001)来识别。
在一些实施方案中，TCR的a链和b链各自进一步含有恒定结构域。在一些实施方案中，a链恒定结构域(Ca)和b链恒定结构域(Cb)单独地为哺乳动物，例如人或鼠恒定结构域。在一些实施方案中，恒定结构域邻近细胞膜。例如，在一些情况下，TCR的细胞外部分由含有2个膜-近端恒定结构域和2个膜-远端可变结构域的2个链形成，其中可变结构域各自含有CDR。
在一些方面，本文提供的是含有人恒定区的TCR，例如含有人Ca区的α链和含有人Cb的β链。在一些实施方案中，提供的TCR完全为人的。提供的TCR中有例如完全人TCR等的含有人恒定区的TCR，例如当在人细胞中表达时，例如原代人T细胞等人T细胞，其表达和/或活性不受或基本上不受内源人TCR的存在的影响。
在一些实施方案中，与在其中降低或消除内源TCR的表达的类似人细胞中的相同TCR的表达水平、功能活性和/或抗肿瘤活性相比，当由含有或表达内源人TCR的例如人T细胞等的人细胞表达时，工程化TCR以相似或改善的水平在细胞表面上表达，表现相似或更大功能活性(例如细胞溶解活性)和/或表现相似或更大的抗肿瘤活性。在一些实例中，本文所述的工程化TCR当在人T细胞中表达时，以在降低或消除其内源TCR表达的相似人T细胞中表达时的相同TCR的表达水平的至少或至少约80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％或120％的水平在细胞表面表达。
在一些实施方案中，Ca和Cb结构域各自为人的。在一些实施方案中，Ca由TRAC基因(IMGT命名法)编码或为其变体。在一些实施方案中，Ca的变体含有至少1个非天然半胱氨酸的替换，例如本文所述的任何替换。
在一些实施方案中，TCR可为例如通过1个或多个二硫键等连接的2个链a和b的异二聚体。在一些实施方案中，TCR的恒定结构域可含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接TCR的2个链。在一些实施方案中，TCR可在a和b链的每个中含有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有2个二硫键。在一些实施方案中，各个恒定和可变结构域含有由半胱氨酸残基形成的二硫键。
在一些实施方案中，TCR包括本文所述的CDR、Va和/或Vb和恒定区序列。
在一些实施方案中，TCR为全长TCR。在一些实施方案中，TCR为抗原结合部分。在一些实施方案中，TCR为二聚TCR(dTCR)。在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽，其中与所提供的TCR a链可变区序列相对应的序列融合至与TCR a链恒定区胞外序列相对应的序列的N末端，以及第二多肽，其中与所提供的TCR b链可变区序列相对应的序列融合至与TCR b链恒定区胞外序列相对应的序列的N末端，第一多肽和第二多肽由二硫键连接。
在一些实施方案中，TCR可为细胞结合的或可溶形式。在一些实施方案中，TCR以细胞结合的形式在细胞的表面上表达。
在一些实施方案中，TCR为单链TCR(scTCR)。scTCR是含有可结合至MHC-肽复合物的a链和b链的单氨基酸链。通常，scTCR可使用本领域技术人员公知的方法产生，例如，参见WO 96/13593、WO 96/18105、W099/18129、WO 04/033685、W02006/037960、WO2011/044186；U.S.专利No.7,569,664；其各自的全部内容通过引用结合在此。
本文提供结合分子，例如结合或识别与抗原(例如，癌症抗原)相关的肽表位的那些。在一些实施方案中，在MHC分子的背景下，抗原可以是在癌细胞表面表达的肽表位和/或由Epstein–Barr病毒(EBV)或人***瘤病毒(HPV)感染的细胞。这样的结合分子包括表现对结合或识别此类肽表位的抗原特异性的T细胞受体(TCR)及其抗原结合片段以及抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中还提供编码结合分子的核酸分子、含有结合分子的工程化细胞、涉及施用这类结合分子、工程化细胞或组合物的治疗的组合物和方法。在一些方面中，表达例如TCR或抗原结合片段等的所提供的结合分子的工程化细胞对例如癌细胞或由EBV感染的细胞等表达肽表位的靶细胞表现细胞毒活性。
在一些方面中，本公开提供包括TCR或其抗原结合片段或例如其抗体片段等抗体的结合分子，和例如含有1个以上例如嵌合受体(TCR样CAR)等的前述的嵌合分子等的蛋白，和/或表达TCR或CAR的工程化细胞，结合至衍生自EBV的肽表位。在一些实施方案中，结合分子为抗LMP2结合分子。
在一些方面中，结合分子识别或结合MHC分子、例如MHC I类分子中的表位。在一些方面中，MHC I类分子是人白血球抗原(HLA)-A2分子，包括其任何一种或多种亚型，例如HLA-A*020l、*0202、*0203、*0206、或*0207。在一些情况中，不同群体之间的亚型频率可以是不同的。例如，在一些实施方案中，HLA-A2阳性高加索人群超过95％为HLA-A*020l，然而在中国人群中，该频率被报告为约23％HLA-A*020l、45％HLA-A*0207、8％HLA-A*0206和23％HLA-A*0203。在一些实施方案中，MHC分子为HLA-A*020l。在一些实施方案中，本公开提供结合EBV-LMP2/HLA-A02复合物的TCR或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，例如TCR或其抗原结合片段或者抗体或其抗原结合片段等结合分子是分离的或纯化的或是重组的。在特定实施方案中，任何所提供的结合分子，例如TCR或其抗原结合片段或者抗体或其抗原结合片段，是重组的。在一些方面，结合分子例如TCR或其抗原结合片段或者抗体或其抗原结合片段是人的。在一些实施方案中，结合分子是单克隆的。在一些方面中，结合分子是单链。在其他实施方案中，结合分子含有2个链。在一些实施方案中，结合分子例如TCR或其抗原结合片段或者抗体或其抗原结合片段在细胞表面表达。
在一些实施方案中，Va区包括在SEQ ID NOs:1、5、或9的任意者中记载的氨基酸序列、或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Vb区包括在SEQ ID NOs:2、6、或10任意者中记载的氨基酸序列、或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Va区包括1个或多个本文所述的Va CDR序列。在一些实施方案中，Vb区包括1个或多个本文所述的Vb CDR序列。
本公开还提供本文所述的TCR a和/或b链。在一些实施方案中，a链包括SEQ IDNOs:35、37、或39任意者中记载的氨基酸序列、或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，b链包括SEQ ID NOs:36、38、或40任意者中记载的氨基酸序列、或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，a链包括1个或多个本文所述的Va CDR序列。在一些实施方案中，b链包括1个或多个本文所述的Vb CDR序列。
Epstein-Barr病毒感染和癌症
Epstein Barr病毒(EBV)是最先识别致癌的病毒之一。EBV在通过其与CD21和MHCII类的相互作用来感染B细胞中是极其有效的。EBV还可感染或保留在上皮细胞中。世界上几乎所有的成人都已接触过EBV。在没有免疫妥协(immune compromise)的情况中，幼时的初次暴露会导致由细胞免疫应答控制的自限性疾病。公知存在针对Epstein Barr病毒(EBV)和EBV相关疾病的免疫防御。宿主针对病毒蛋白产生的抗原特异性T细胞对病毒非常有效。然而，EBV可持续留存在上皮或B细胞中而不被完全消除。宿主的免疫状态的任何改变可导致重激活并且根据免疫妥协的程度，该重激活可导致恶性肿瘤。
EBV涉及实体器官和造血细胞移植(HSCT)，在那里T细胞的数量降低或缺乏可导致带有EBV的B细胞的无限增殖。这样的不受控的扩增可导致移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)，其是最常见的移植后恶性肿瘤。该综合征的频率和强度在各个患者以及对其T细胞群的免疫抑制的效果中变化。EBV还涉及其他恶性肿瘤。几项研究已将EBV牵连至各种上皮和淋巴恶性肿瘤的发病机理中。例如，公知霍奇金(Glaser,等人"Epstein-Barr virus-associated Hodgkin's disease:epidemiologic characteristics in internationaldata."International journal of cancer 70.4(1997):375-382)和非霍奇金淋巴瘤涉及EBV。EBV和鼻咽癌之间也存在明显的因果关系(NPC；Raab-Traub"Nasopharyngealcarcinoma:an evolving role for the Epstein–Barr virus."Epstein Barr VirusVolume 1.Springer,Cham,2015.339-363.)。患有霍奇金淋巴瘤和NPC的患者的肿瘤样本表达包括潜伏膜蛋白2(LMP2)的EBV衍生蛋白。在40％的EBV相关的胃癌中也发现了LMP-2。由于其是非自身的并且是针对EBV的细胞免疫应答的主要靶，它们代表了免疫疗法的理想靶。
与EBV相关的LMP2(+)人恶性肿瘤的列表包括伯基特氏淋巴瘤、免疫抑制淋巴瘤、扩散型大B-细胞淋巴瘤、与慢性炎症相关的扩散型大B-细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、浆母细胞性淋巴瘤、原发渗出性淋巴瘤、移植后淋巴增生性障碍、鼻咽癌、胃腺癌、淋巴上皮瘤相关癌、和免疫缺陷相关平滑肌肉瘤。这些病症记载于例如WO/2019/213416A1；Thompson等人,"Epstein–Barr virus and cancer."Clinical Cancer Research 10.3(2004):803-821，其全部内容通过引用结合在此。
静息B细胞的EBV感染/转化产生潜伏性成淋巴细胞瘤系(Latent LymphoblastomaLine)(LCL)。LCL存在于潜伏复制中并且以附加体形式携带病毒基因的多个拷贝。它们表达许多称为潜伏蛋白的病毒基因产物，其根据潜伏期阶段而变化。总共描述了10种潜伏蛋白：6种Epstein病毒核抗原(EBNA1、2、3A、3B、3C和LP)、3种潜伏膜蛋白(LMP 1、2A和2B)和BARF1。当表达EBNA1、EBNA2、EBNA3、LMP1、LMP2和BARF1时，初始EBV感染激活B细胞并且诱导潜伏期III。这些蛋白记载于例如Bollard,等人,"T-cell therapy in the treatment ofpost-transplant lymphoproliferative disease."Nature reviews Clinical oncology9.9(2012):510中，其全部内容通过引用结合在此。
本公开提供治疗EBV感染和/或EBV诱导的疾病和病症的方法。
工程化细胞
本公开提供含有本文所述的TCR或其抗原结合片段、或其他类似抗原-结合分子的工程化细胞(例如，T细胞)。这些工程化细胞可用于治疗本文所述的各种病症或疾病(例如，病毒感染、癌症、病毒诱导的病症)。
在各种实施方案中，工程化的细胞获得自包括但不限于动物和人。在各种实施方案中，工程化的细胞为血细胞，其包括但不限于白血球、淋巴细胞或任何其他合适的血细胞类型。优选地，细胞为外周血细胞。更优选地，细胞为T细胞、B细胞或NK细胞。
在另一个实施方案中，细胞为T细胞。用于本发明的T细胞的实例包括但不限于：通过分离自患者(一个或多个)的T细胞(例如，肿瘤浸润的淋巴细胞)的体外培养来得到的细胞；通过用病毒载体转导分离自患者(一个或多个)外周血的T细胞来得到的TCR基因修饰的T细胞；和CAR转导的T细胞。优选地，T细胞为TCR基因修饰的T细胞。
在本发明的一个实施方案中，细胞为NK细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于结合分子的引入的细胞，例如TCR，可分离自样品，例如生物样品，如获得自或衍生自受试者的生物样品。在一些实施方案中，分离细胞的受试者是患有疾病或病况或需要细胞治疗或待施用细胞治疗的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要特定治疗干预的人，例如其中分离、处理、和/或工程化细胞的过继性细胞疗法。
在一些实施方案中，分离方法包括基于细胞中表达或存在一种或多种特定分子的各种细胞类型的分离，例如表面标志物，如表面蛋白、细胞内标志物、或核酸。在一些实施方案中，可以使用任何公知的基于这类标志物的分离方法。在一些实施方案中，分离是基于亲和性或免疫亲和性的分离。例如，在一些方面中，分离包括基于细胞的一种或多种标志物(通常是细胞表面标志物)的表达或表达水平的细胞和细胞群的分离，例如，通过用与这类标志物特异性结合的抗体或结合伴侣培养，通常接着进行清洗步骤、并将已结合抗体或结合伴侣的细胞与未结合抗体或结合伴侣的那些细胞分离。
这样的分离步骤可基于阳性选择，其中保留已结合试剂的细胞以备进一步使用，和/或阴性选择，其中保留未结合抗体或结合伴侣的细胞。在一些实例中，保留两部分以备进一步使用。在一些方面中，阴性选择可为特别有用的，其中无可特异性识别异源群体中的细胞类型的抗体，使得分离最好是基于除目标群体以外的其他细胞表达的标志物来进行。
还提供用于表达结合分子和用于产生表达这类结合分子的基因工程化细胞的方法、核酸、组合物、和试剂盒。基因工程通常涉及将编码例如TCR、CAR、例如TCR-样CAR、多肽、融合蛋白等的治疗分子的核酸引入至细胞中，例如通过逆转录病毒转导、转染或转化。在一些实施方案中，基因转移是通过以下来完成的：首先刺激细胞，例如通过将其与诱导例如增殖、存活、和/或激活等应答的刺激物相组合，例如通过细胞因子或激活标志物的表达所测量的，接着进行激活的细胞的转导，并且在培养中扩增至足以临床应用的数量。
在一些实施方案中，使用例如衍生自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体等重组传染病毒颗粒将重组核酸转移至细胞中。在一些实施方案中，使用例如γ-逆转录病毒载体等的重组慢病毒载体或逆转录病毒载体将重组核酸转移至T细胞中。在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如，衍生自Moloney小鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增殖性肉瘤病毒(MPSV)、小鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、小鼠干细胞病毒(MSCV)、或脾病灶形成性病毒(SFFV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体衍生自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括衍生自任何鸟类或哺乳动物细胞源的那些。逆转录病毒通常为双嗜性的，意味着它们可以感染数个物种的宿主细胞，包括人类。在一些实施方案中，载体为慢病毒载体。在一些实施方案中，通过电穿孔法将重组核酸转移至T细胞中。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移至T细胞中。在免疫细胞中引入和表达基因材料的其他方法包括磷酸钙转染法、原生质体融合法、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击法和磷酸锶DNA共沉淀法。这些方法的大部分在例如WO2019195486等中描述，其全部内容通过引用结合在此。
重组载体
任何载体或载体类型可用于将基因材料递送至细胞。这些载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、BAC、YAC、和HAC。相应地，病毒载体可包括但不限于重组逆转录病毒载体、重组慢病毒载体、重组腺病毒载体、泡沫病毒载体、重组腺相关病毒(AAV)载体、杂合载体、和质粒转座子(例如睡美人转座子***)或基于整合酶的载体***。可与本发明的替代实施方案一起使用的其他载体对于本领域技术人员是显而易见的。
在另一个实施方案中，使用的载体是重组逆转录病毒载体。病毒载体可在病毒载体制造用特异性培养基中生长。根据本文所述的实施方案，可使用用于生长病毒载体的任何合适的生长培养基和/或补充剂。
基因工程化的抗原受体
基因工程化的抗原受体包括但不限于T细胞受体(TCR)、杀手细胞免疫球蛋白样受体家族(KIR)、C型凝集素受体家族、白细胞免疫球蛋白样受体家族(LILR)、1型细胞因子受体、2型细胞因子受体家族、肿瘤坏死因子家族、TGFβ受体家族、趋化因子受体、和IgSF。
在本发明的一个实施方案中，由核酸构建体编码的基因工程化的抗原受体包括基因工程化NK细胞受体。在一些实施方案中，NK细胞受体包括杀手细胞免疫球蛋白样受体家族(KIR)。在可选实施方案中，NK细胞受体包括C型凝集素受体家族。
在其他实施方案中，由核酸构建体编码的基因工程化抗原受体包括基因工程化T细胞受体(TCR)。在一个实施方案中，表达TCR的T细胞是αβ-T细胞。在可选实施方案中，表达TCR的T细胞是γδ-T细胞。
靶向的抗原
在一些实施方案中，与疾病或病症相关的抗原选自由以下组成的组：由HPV、HIV、HCV、HBV、EBV、HTLV-1、CMV、腺病毒、BK多瘤病毒、HHV-8、MCV或其他病原体表达的分子，孤儿酪氨酸激酶受体ROR1，tEGFR，Her2，L1-CAM，CD19，CD20，CD22，间皮素，CEA，和乙型肝炎表面抗原，叶酸受体抗体，CD23，CD24，CD30，CD33，CD38，CD44，EGFR，EGP-2，EGP-4，EPHa2，ErbB2,3或4，FBP，胎儿乙酰胆碱e受体，GD2，GD3，HMW-MAA，IL-22R-α，IL-13R-α2，kdr，κ轻链，LewisY，L1-细胞粘附分子，MAGE-A1，间皮素，MUC1，MUC16，PSCA，NKG2D配体，NY-ESO-1，MART-1，gp100，癌胚胎抗原，ROR1，TAG72，VEGF-R2，癌胚抗原(CEA)，***特异抗原，PSMA，Her2/neu，***受体，孕酮受体，ephrinB2，CD123，CS-1，c-Met，GD-2，和MAGE A3和/或生物素化的分子。
基因工程化抗原受体结合来自人***瘤病毒(HPV)的抗原。HPV的亚型选自但不限于：HPV1、HPV2、HPV3、HPV4、HPV6、HPV10、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV27、HPV28、HPV29、HPV30、HPV31、HPV33、HPV34、HPV35、HPV39、HPV40、HPV41、HPV42、HPV43、HPV45、HPV49、HPV51、HPV52、HPV54、HPV55、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59、HPV68、HPV69。在一些实施方案中，由基因工程化抗原受体靶向的HPV的亚型选自至少一种高风险HPV，例如但不限于HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV69。
在一些实施方案中，HPV抗原包括但不限于E1、E2、E3、E4、E6和E7、L1和L2蛋白。在另一个实施方案中，抗原为E6抗原。在仍另一个实施方案中，抗原为E7抗原。在另一个实施方案中，抗原为HPV16 E6抗原。
在其他实施方案中，基因工程化抗原受体结合来自EBV的抗原。EBV抗原选自但不限于：潜伏膜蛋白(LMP1、LMP2A、LMP2B)和Epstein-Barr核抗原(EBNA1、-2、-3A、-3B、-3C、-LP)。
因此，治疗的疾病或病况是传染性疾病或病况，例如但不限于病毒性、逆转录病毒性、细菌性、和原生动物性感染、免疫缺陷、人***瘤病毒(HPV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein–Barr病毒(EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方案中，疾病或病况是病毒相关的恶性肿瘤，例如但不限于HPV、HCV、EBV、HIV、HHV-8、HTLV-1、和MCV。优选地，用于由所提供的组合物、细胞、方法和用途治疗的病毒相关的恶性肿瘤为HPV或EBV相关的癌症。此外，所提供的组合物、细胞、和方法可用于由HPV或EBV相关的癌症导致的实体瘤的治疗。具体地，所述疾病或病况包括HPV相关的癌症包括但不限于子宫颈、口咽、***、肛管、***直肠、***、***、和***的癌症。所述疾病或病况包括HPV相关的头颈癌、HPV相关的子***。具体地，疾病或病况还包括EBV相关的癌症，例如，鼻咽癌、淋巴癌、乳腺癌和肝细胞癌。
检查点抑制剂
在各种实施方案中，工程化细胞表达至少一种检查点抑制剂(CPI)。由本发明的工程化细胞表达的抑制性蛋白或CPI抑制或阻断免疫检查点，其中所述免疫检查点包括PD-1、PD-L1、PD-L2、2B4(CD244)、4-1BB、A2aR、B7.1、B7.2、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BTLA、嗜乳脂蛋白、CD160、CD48、CTLA4、GITR、gp49B、HHLA2、HVEM、ICOS、ILT-2、ILT-4、KIR家族受体、LAG-3、OX-40、PIR-B、SIRPα(CD47)、TFM-4、TIGIT、TIM-1、TIM-3、TIM-4、VISTA及其组合。
在一些实施方案中，抑制性蛋白阻断PD-1或PD-L1。在各种实施方案中，抑制性蛋白包括抗PD-1scFv。抑制性蛋白可导致PD-1或PD-L1的表达降低和/抑制群体中的T细胞中的PD-1或PD-L1的上调和/或物理上阻碍PD-1/PD-L1复合物的形成以及其后的信号转导。在一个实施方案中，抑制性蛋白阻断PD-1。
核酸构建体
参考图1A，根据各种优选的实施方案，核酸构建体包括两个序列，其中所述两个序列包括：(a)抗LMP2 TCR的α链的可变区融合至小鼠TCRα链的恒定区，确定为“aLMP-2_Va-Ca”，其中aLMP-2_Va对应于抗LMP2 TCR的α链的可变区，Ca对应于小鼠TCRα链的恒定区；(b)同一抗LMP2 TCR的β链的可变区融合至小鼠TCRβ链的恒定区，确定为“aLMP-2_Vb-Cb”，其中aLMP-2_Vb对应于同一人抗LMP2 TCR的β链的可变区，Cb对应于小鼠TCRβ链的恒定区。在一个实施方案中，核酸构建体进一步包括编码信号肽的序列。
参考图1B，根据各种实施方案，核酸构建体包括三个序列，其中所述三个序列包括：(a)人TCR的α链的可变区融合至小鼠TCRα链的恒定区，确定为“Va-Ca”，其中Va对应于人TCR的α链的可变区，Ca对应于小鼠TCRα链的恒定区；(b)同一人TCR的β链的可变区融合至小鼠TCRβ链的恒定区，确定为“Vb-Cb”，其中Vb对应于同一人TCR的β链的可变区，Cb对应于小鼠TCRβ链的恒定区；和(c)由GS接头连接的免疫检查点抑制剂(ICI)的重链和轻链的可变区，通过重链的可变区的C末端处的柔性接头肽融合至TCRβRII的胞外结构域的配体结合序列。在优选实施方案中，核酸构建体进一步包括编码信号肽的序列。在一些实施方案中，人TCR是抗LMP2 TCR。在一些其他实施方案中，人TCR是抗E-6TCR。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。TCR的可变区可连接至信号肽序列。
核酸构建体可进一步包括可以帮助和/或实现构建体的转染、转导、整合、复制、转录、翻译、表达和/或稳定的其他序列。在优选的实施方案中，核酸构建体包括连接上述序列(a)、(b)和/或(c)的P2A和/或T2A序列。
本公开还提供编码本文所述的TCR a和/或b链的核酸。在一些实施方案中，编码a链的核酸包括SEQ ID Nos：41、43、或45任意者中记载的序列、或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案，编码b链的核酸包括SEQ ID Nos：42、44、或46任意者中记载的序列、或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，a链包括一个或多个如本文所述的Va CDR序列。在一些实施方案中，b链包括一个或多个如本文所述的Vb CDR序列。
工程化细胞的制备方法
本发明还提供用于病理学疾病或病况的工程化细胞的制造和使用的方法或工艺。所述方法包括以下步骤：(I)从患者血液分离T细胞；(II)用含有编码基因工程化抗原受体和抑制性蛋白的核酸构建体的病毒载体转导群体T细胞；(III)体外扩增转导的细胞；和(IV)将扩增的细胞输注至患者中，在此工程化T细胞将寻找并破坏抗原阳性肿瘤细胞。在一些实施方案中，这些工程化T细胞将阻断PD-1/PD-L1免疫抑制并且增强抗肿瘤免疫应答。
所述方法进一步包括：在步骤(II)之前，用含有本发明的核酸构建体的病毒载体转染T细胞。
可以通过使用任何标准方法，例如磷酸钙法、电穿孔法、脂质体介导的转移、显微注射、基因枪粒子递送***(biolistic particle delivery system)、或任何技术人员公知的方法来实现T细胞的转染。在一些实施方案中，T细胞的转染是使用磷酸钙法来进行的。
根据本文所述的各种实施方案，本发明提供针对肿瘤、特别是EBV和HPV相关癌症的免疫疗法。工程化T细胞识别肿瘤相关HPV/EBV抗原并同时分泌阻断程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和TGFβ的单链抗体(scFv)融合蛋白。这些工程化T细胞表现更强的抗肿瘤应答和降低的T细胞耗竭。
已在实验中发现，用本发明PD-1检查点阻断更有效，因为(1)抗PD-1药物递送位于肿瘤部位并且(2)抗PD-1单链抗体比现存抗体更强力结合。此外，因为抗PD-1药物递送位于肿瘤部位，降低由于非特异性炎症导致的毒性。与现有替代品相比，本发明提供改善T细胞激活和/或防止T细胞耗竭的抗LMP2TCR和抗PD-1的组合。
此外，本发明提供产生个人化抗肿瘤免疫疗法的方法。抗LMP2+/抗PD-1工程化T细胞可产生自患者血液。然后将这些工程化T细胞作为细胞治疗产品回输至患者中。该产品可用于患有EBV LMP2相关肿瘤的任何患者，包括但不限于鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、胃癌等。
变体&修饰
可以修饰例如TCR或其抗原结合片段等的结合分子。在某些实施方案中，与例如TCR等本文所述的结合分子的序列相比，例如TCR或其抗原结合片段等的结合分子包括一种或多种氨基酸变体，例如取代、缺失、***、和/或突变。示例性变体包括设计成改善结合分子的结合亲和力和/或其他生物特性的那些。结合分子的氨基酸序列变体可通过将适合的修饰引入至编码结合分子的核苷酸序列中、或通过肽合成来制备。这样的修饰包括，例如结合分子的氨基酸序列中的残基的缺失、和/或***和/或取代。可以进行缺失、***、和取代的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所期望的特征，例如抗原结合。
在一些实施方案中，例如TCR等亲本结合分子的CDR中的一个或多个残基被取代。在一些实施方案中，进行取代以将序列或序列中的位置恢复至种系序列，例如在种系(例如，人种系)中发现的结合分子序列，例如来降低免疫原性的可能性，例如在对人受试者施用时。
本公开还提供抗体或其抗原结合片段，其含有关于TCR如上述的任何一个或多个CDR。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括在α链中含有CDR1、CDR2和/CDR3以及在β链中含有CDR1、CDR2和/或CDR3的可变重链和轻链。
在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长或可以是抗原结合部分(Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，抗体重链恒定区选自例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD、和IgE，特别地选自例如IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4，更特别地IgG1(例如，人IgG1)。在一些实施方案中，抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别地κ。抗原结合片段是指完整抗体以外的其他分子，其包括结合至完整抗体所结合的抗原的完整抗体的一部分。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子例如scFv和单域VH单抗体；和形成自抗体片段的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体为含有可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，例如scFv。单域抗体是含有抗体的重链可变区的全部或一部分或轻链可变区的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分在细胞上作为例如抗原受体等重组受体的部分来表达。抗原受体中有功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含有在MHC分子的背景下表现出针对肽的TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。因此，例如EBV结合分子等提供的结合分子中有抗原受体，例如包括例如TCR样抗体等提供的抗体之一的那些。在一些实施方案中，抗原受体和其他嵌合受体特异性结合LMP2的一个区域或表位，例如TCR样抗体。抗原受体中有功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)。还提供表达CAR的细胞并且将其用于过继性细胞疗法，例如与HPV或EBV表达相关的疾病或病症的治疗。
当在MHC分子的背景下展示或呈递时，含有非TCR分子的TCR样CAR表现T细胞受体特异性，例如针对T细胞表位或肽表位。在一些实施方案中，TCR样CAR可含有抗体或其抗原结合部分，例如TCR样抗体，例如本文所述的。在一些实施方案中，在MHC分子的背景下，抗体或其抗体结合部分针对特异性肽表位是反应性的，其中抗体或抗体片段可将MHC分子背景下的特异性肽与单独MHC分子、单独的特异性肽、和在一些情况下与MHC分子背景下的不相关肽区分开。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分可表现比T细胞受体更高的结合亲和力。
示例性抗原受体，包括CAR，和用于工程化并将这样的受体引入至细胞的方法，包括例如在美国专利申请公开号US2002/131960、US2013/287748、US2013/0149337、U.S.6,451,995、U.S.7,446,190、U.S.8,252,592中所述的那些；其每一者的全部内容通过引用结合在此。
在一些实施方案中，CAR通常包括细胞外抗原(或配体)结合结构域，包括对MHC分子背景下的肽为特异性的抗体或其抗原结合片段，连接至一个或多个细胞内信号传导组件，在一些方面通过接头和/或跨膜结构域(一个或多个)。在一些实施方案中，这样的分子通常可以模拟或近似通过例如TCR等天然抗原受体的信号，并且任选地通过这类受体与共刺激受体组合的信号。
在一些实施方案中，CAR通常在其细胞外部分包括一个或多个抗原结合分子，例如一个或多个抗原结合片段、结构域、或部分、或一个或多个抗体可变结构域、和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，例如衍生自单克隆抗体(mAh)的可变重(VH)链和可变轻(VL)链的单链抗体片段(scFv)。在一些实施方案中，CAR包括TCR样抗体，例如特异性识别MHC分子背景下的细胞表面上呈递的肽表位。
双功能Trap融合蛋白
本公开还提供双功能trap融合蛋白。靶向免疫检查点(例如PD-1或PD-L1)的单克隆抗体是这些试剂的主要类型。PD-1受体在激活的T细胞和自然杀伤(NK)细胞上表达。在与其配体PD-L1和PD-L2相互作用后，其通常在抗原呈递细胞上表达，PD-1通过抑制T细胞和NK细胞成熟、增殖、和效应子功能来调节免疫应答。
除了免疫检查点的表达，肿瘤微环境包含其他免疫抑制分子。特别感兴趣的是细胞因子TGFβ，其在癌症中具有多种功能。在肿瘤发展的早期，TGF-β(TGFB)防止肿瘤细胞的增殖并且促进分化和细胞凋亡。然后，在肿瘤进展期间，由于TGF-β受体表达的丧失或下游信号传导元件的突变，出现肿瘤TGF-β不敏感。然后，TGF-β通过其对血管新生、上皮-至-间充质转换(EMT)的诱导、以及免疫抑制的影响，促进肿瘤进展。肿瘤上的高TGF-β血清水平和TGF-β受体(TGFβR)表达的丧失与不良预后相关。TGFβ靶向疗法显示有限的临床活性。
在一些方面，本公开提供可靶向免疫检查点和TGF-β负调节途径的双功能trap蛋白。在一些实施方案中，双功能trap蛋白靶向PD-1和TGF-β。在一些实施方案中，双功能trap蛋白靶向PD-L1和TGF-β。在一些实施方案中，双功能融合蛋白设计成阻断PD-L1并且隔离TGF-β。基于人IgG1单克隆抗体(mAb)avelumab，M7824(MSB0011395C)包括连接至人抗PD-L1scFv的C-末端的人TGF-β受体II(TGFβRII)的胞外结构域。在一些实施方案中，双功能trap蛋白包括连接至人抗PD-1scFv的C-末端的人TGF-β受体II(TGFβRII)的胞外结构域。
在例如Knudson,等人"M7824,a novel bifunctional anti-PD-L1/TGFβTrapfusion protein,promotes anti-tumor efficacy as monotherapy and in combinationwith vaccine."Oncoimmunology 7.5(2018):e1426519中描述了这些双功能trap融合蛋白，其全部内容通过引用结合在此。
本公开提供通过使用如本文所述的TCR或抗原结合分子与一种或多种双功能trap融合蛋白的组合来治疗如本文所述的的各种病症(例如，癌症)的方法。在一些实施方案中，用表达如本文所述的TCR或抗原结合分子的细胞和一种或多种双功能trap融合蛋白来治疗受试者。
组合物、制剂和施用方法
本公开提供含有通过所公开的方法制备的工程化T细胞及其群体的组合物(包括药物和治疗组合物)。还提供方法，例如向例如患者等受试者施用工程化T细胞和其组合物的治疗方法。
A.组合物和制剂
提供含有用于施用的工程化T细胞的组合物，包括药物组合物和制剂，例如含有用于以给定剂量或其部分施用的细胞数的单位剂型组合物。药物组合物和制剂可包括一种或多种任选的药学上可接受的运载体或赋形剂。在一些实施方案中，组合物包括至少一种其他治疗剂。
在一些实施方案中，运载体的选择部分地由特定细胞(例如，T细胞或NK细胞)和/或由施用方法决定。因此，存在多种合适的制剂。例如，药物组合物可含有防腐剂。合适的防腐剂可包括，例如，尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、苯甲酸钠、和苯扎氯铵。在一些实施方案中，使用两种以上的防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物的按重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体在例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)中描述。药学上可接受的载体在采用的剂量和浓度下对于接受者为无毒的，并且包括但不限于：缓冲液例如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；尼泊金烷基酯类例如尼泊金甲酯或尼泊金丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖类、二糖类和其他碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂例如EDTA；糖类例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子(counter-ion)例如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂例如聚乙二醇(PEG)。
用于本发明的合适的缓冲剂包括，例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾、和各种其他酸类和盐类。在一些实施方案中，使用两种以上的缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物的按重量计约0.001％至约4％的量存在。已知制备可施用的药物组合物的方法。示例性方法在例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,LippincottWilliams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中更详细地描述。
制剂可包括水性溶液。制剂或组合物还可包括超过一种用于待用工程化T细胞治疗的特定适应症、疾病、或病况的有效成分，优选具有与细胞互补的活性的那些，其中各自的活性不会对彼此有不利的影响。这样的有效成分合适地以对于期望目的有效的量组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物可进一步包括其他药物活性剂或药物，例如化疗剂，例如门冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、阿霉素、氟脲嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、和/或长春新碱。
在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量、例如治疗有效量或预防有效量的细胞。在一些实施方案中，治疗或预防功效通过定期地评价治疗的受试者来监测。期望的剂量可以通过细胞的单次浓给药(bolus administration)、通过细胞的多次浓给药、或通过细胞的连续输注给药来递送。
可以使用标准给药技术、制剂、和/或设备来施用细胞和组合物。细胞的施用可以是自体的或异种的。例如，免疫应答T细胞或祖细胞可获得自一个受试者，并施用至同一受试者或者在根据本文所述各种实施方案将其基因修饰后施用至不同的、相容的受试者。外周血衍生的免疫应答T细胞或其后代(例如，在体内、离体或在体外衍生的)可通过局部注射来施用，包括导管给药、***性注射、局部注射、静脉内注射、或肠胃外给药。通常，当施用治疗组合物(例如，含有基因修饰的免疫应答细胞)时，其通常配制成单位剂量可注射形式(unit dosage injectable form)(溶液、悬浮液、乳剂)。
本文所公开的制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺的、经皮的、肌肉内、鼻内、颊部、舌下、或栓剂给药。在一些实施方案中，细胞群为肠胃外给药。如本文所使用的，术语“肠胃外”包括静脉内、肌肉内、皮下、直肠、***、和腹膜内给药。在一些实施方案中，使用通过静脉内、腹膜内、或皮下注射的外周***递送来向受试者施用细胞。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水性溶液、悬浮液、乳剂、分散剂、或粘性组合物，其在某些方面可被缓冲至所选的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物、和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物略微更便于施用，特别是通过注射施用。另一方面，粘性组合物可配制成在合适的粘度范围内来提供与特定组织更长的接触期。液体或粘性组合物可包括运载体，其可以是含有例如水、盐水(saline)、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物等的溶剂或分散介质。
无菌可注射溶液可通过将细胞掺入溶剂中来制备，例如将细胞与合适的载体、稀释剂、或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、或右旋糖等混合。取决于施用途径和所需的制备方法，组合物可包括佐剂物质如润湿剂、分散剂、或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或增粘添加剂、防腐剂、调味剂(flavoring agent)、和/或着色剂。在某些方面可以参考标准文本来制备合适的制剂。
可以添加增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂、和缓冲液。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂例如尼泊金酯类、氯丁醇、苯酚、和山梨酸来确保防止微生物的活动。可以通过使用例如单硬脂酸铝和明胶等延迟吸收的试剂以带来延长的可注射药物形式的吸收。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌性可以例如通过由无菌过滤膜过滤来容易地实现。
B.工程化T细胞在过继性细胞疗法中的施用方法和用途
提供细胞、群体、和组合物的施用方法以及这类细胞、群体、和组合物在治疗或预防包括癌症的疾病、病况、和病症中的用途。在一些实施方案中，本文所述方法可降低发展如本文所述的疾病、病况、和病症的风险。
在一些实施方案中，向患有待用例如通过过继性细胞疗法(例如过继性T细胞疗法)等治疗的特定疾病或病况的受试者或患者施用如本文所述的细胞、群体、和组合物。在一些实施方案中，向受试者例如患有疾病或病况或处于疾病或病况风险的受试者施用通过所提供的方法制备的细胞和组合物，例如工程化组合物以及培养和/或其他工艺步骤后的停产(end-of-production)组合物。在一些方面中，所述方法从而例如通过减小在表达由工程化T细胞识别的抗原的癌症中的肿瘤负荷来治疗疾病或病况，例如减轻疾病或病况的一种或多种症状。
公知用于过继性细胞疗法的施用方法，并且可与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继性T细胞治疗方法记载于例如，Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85)。参见，例如，Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
在一些实施方案中，通过自体转移来进行例如过继性T细胞疗法等细胞疗法，其中从接受细胞疗法的受试者中、或从源自这样的受试者的样品中分离和/或另外制备T细胞。因此，在一些方面，细胞衍生自需要治疗的受试者例如患者，并且将所述细胞在分离和处理后施用至同一受试者。
在一些实施方案中，通过异体转移来进行例如过继性T细胞疗法等细胞疗法，其中从接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者、例如第一受试者、中分离和/或另外制备T细胞。在这样的实施方案中，然后将所述细胞施用至相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一和第二受试者为基因上同一的(geneticallyidentical)。在一些实施方案中，第一和第二受试者为基因上相似的。在一些实施方案中，第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类或超类型(supertype)。
在一些实施方案中，在施用细胞或含有细胞的组合物之前，用靶向例如肿瘤等疾病或病况的治疗剂治疗受试者。在一些方面，受试者对其他治疗剂为难治性(refractory)或非应答性的。在一些实施方案中，受试者患有持久性或复发性疾病，例如，在用另一种治疗性干预治疗后，包括化疗、放射、和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如同种异体HSCT。在一些实施方案中，所述施用有效地治疗受试者，尽管受试者对另一种疗法产生抵抗力。
在一些实施方案中，受试者对其他治疗剂为应答性的，并且用所述治疗剂的治疗降低疾病负担。在一些方面，受试者最初对治疗剂为应答性的，但随着时间的推移表现出疾病或病况的复发。在一些实施方案中，受试者不复发。在一些这样的实施方案中，受试者确定为具有复发风险，例如处于复发的高风险，并且因此预防性地施用细胞例如来降低复发的可能性或预防复发。在一些实施方案中，受试者尚未接受用另一种治疗剂的在先治疗。
在一些实施方案中，以期望的剂量施用细胞，其在一些方面包括细胞或细胞类型(一种或多种)的期望剂量或数量和/或细胞类型的期望比。因此，在一些实施方案中，细胞的剂量是基于细胞的总数(或数量每kg体重)和个体群体或亚型的期望比，例如CD4+对CD8+的比。在一些实施方案中，细胞的剂量是基于个体群体中的细胞或个体细胞类型的期望总数(或数量每kg体重)。在一些实施方案中，剂量是基于以下特征的组合，例如期望的总细胞数、期望比、以及期望的个体群体中的细胞总数。
在一些实施方案中，可以等于或在例如T细胞的期望剂量等的总细胞的期望剂量的容许差异内施用例如CD8+和CD4+T细胞等细胞的群体或亚型。在一些实施方案中，期望剂量是细胞的期望数量、或对其施用细胞的受试者的每单位体重的细胞期望数量，例如，细胞/kg。在一些实施方案中，期望剂量等于或大于细胞最小数量或每单位体重的细胞最小数量。在一些实施方案中，在总细胞中，以期望剂量施用，个体群体或亚型以等于或接近期望输出比(output ratio)(例如CD4+对CD8+的比)存在，例如在这样的比的某些容许差异或误差内。
在一些实施方案中，以等于或在细胞的一个或多个个体群体或亚型的期望剂量(例如CD4+细胞的期望剂量和/或CD8+细胞的期望剂量)的容许差异内施用细胞。在一些实施方案中，期望剂量是亚型或群体的细胞的期望数量、或向其施用细胞的受试者的每单位体重的这类细胞的期望数量，例如，细胞/kg。在一些实施方案中，期望剂量等于或大于群体或亚型的细胞的最小数量、或每单位体重的群体或亚型的细胞的最小数量。
因此，在一些实施方案中，剂量是基于总细胞的期望固定剂量和期望比、和/或基于一种或多种(例如，每一个)个体亚型或亚群的期望固定剂量。因此，在一些实施方案中，剂量是基于T细胞的期望固定剂量或最小剂量以及CD4+与CD8+细胞的期望比、和/或是基于CD4+和/或CD8+细胞的期望固定剂量或最小剂量。
在某些实施方案中，细胞或细胞的亚型的个体群体在以下范围内向受试者施用：约1百万至约1000亿细胞，例如1百万至约500亿细胞(例如，约5百万细胞、约2500万细胞、约5亿细胞、约10亿细胞、约50亿细胞、约200亿细胞、约300亿细胞、约400亿细胞、或由前述值的任两者定义的范围)，例如约1千万至约1000亿细胞(例如，约2千万细胞、约3千万细胞、约4千万细胞、约6千万细胞、约7千万细胞、约8千万细胞、约9千万细胞、约100亿细胞、约250亿细胞、约500亿细胞、约750亿细胞、约900亿细胞、或由前述值的任两者定义的范围)，并且在一些情况下为1亿细胞至约500亿细胞(例如，约1.2亿细胞、约2.5亿细胞、约3.5亿细胞、约4.5亿细胞、约6.5亿细胞、约8亿细胞、约9亿细胞、约30亿细胞、约300亿细胞、或约450亿细胞)或这些范围之间的任何值。
在一些实施方案中，总细胞的剂量和/或细胞的个别亚群的剂量在等于或约约104和等于或约109细胞/千克(kg)体重之间，例如在105和106细胞/kg体重之间，例如，至少或至少约或等于或约1×105细胞/kg、1.5×105细胞/kg、2×105细胞/kg、或1×106细胞/kg体重。例如，在一些实施方案中，以等于以下或在以下的一定误差范围内施用细胞：在等于或约104和等于或约109T细胞/千克(kg)体重之间，例如在105和106T细胞/kg体重之间，例如，至少或至少约或等于或约1×105T细胞/kg、1.5×105T细胞/kg、2×105T细胞/kg、或1×106T细胞/kg体重。
在一些实施方案中，以等于以下或在以下的一定误差范围内施用细胞：在等于或约104和等于或约109CD4+和/或CD8+细胞/千克(kg)体重之间，例如在105和106CD4+和/或CD8+细胞/kg体重之间，例如，至少或至少约或等于或约1×105CD4+和/或CD8+细胞/kg、1.5×105CD4+和/或CD8+细胞/kg、2×105CD4+和/或CD8+细胞/kg、或1×106CD4+和/或CD8+细胞/kg体重。
在一些实施方案中，以等于以下或在以下的一定误差范围内施用细胞：大于、和/或至少约1×106、约2.5×106、约5×106、约7.5×106、或约9×106CD4+细胞，和/或至少约1×106、约2.5×106、约5×106、约7.5×106、或约9×106T细胞。在一些实施方案中，以等于以下或在以下的一定误差范围内施用细胞：约108和1012之间或约1010和1011T细胞之间、约108和1012之间或约1010和1011CD4+细胞之间、和/或约108和1012之间或约1010和1011CD8+细胞之间。
在一些实施方案中，以等于或在多种细胞群体或亚型、例如CD4+和CD8+细胞或亚型的期望输出比的容许范围内施用细胞。在一些方面，期望比可以是特定比或可以是比例范围。例如，在一些实施方案中，期望比(例如，CD4+对CD8+细胞的比)在等于或约5:1和等于或约5:1之间(或大于约1:5和小于约5:1)、或在等于或约1:3和等于或约3:1之间(或大于约1:3和小于约3:1)，例如在等于或约2:1和等于或约1:5之间(或大于约1:5和小于约2:1)，例如等于或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9:1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、或1:5。在一些方面，容许差异在期望比的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％内，包括这些范围之间的任何值。
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可取决于待治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和进程、是否以预防或治疗目的施用细胞、先前的治疗、受试者的临床史以及对细胞的应答、以及主治医师的判断。在一些实施方案中，一次或在一系列的治疗中向受试者适当地施用组合物和细胞。
可以通过任何合适的手段来施用本文所述的细胞，例如，通过浓输注，通过注射，例如，静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔(trans-septal)注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前眼房注射、结膜下注射(subconjectval injection)、结膜下注射(subconjuntival injection)、筋膜下注射(sub-Tenon's injection)、眼球后注射、球周注射、或后近巩膜递送(posteriorjuxtascleral delivery)。在一些实施方案中，它们通过以下方式递送：肠胃外、肺内、和鼻内，并且如果需要局部治疗，则病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。在一些实施方案中，通过细胞的单次浓给药来施用给定剂量。在一些实施方案中，通过细胞的多次浓给药来施用，例如在不超过3天的时间段中，或通过细胞的连续输注给药。
在一些实施方案中，细胞作为组合治疗的一部分来施用，例如与另一种治疗干预同时或以任何次序顺序施用，例如抗体或工程化细胞或受体或药剂，例如细胞毒性剂或治疗剂。在一些实施方案中，细胞与一种或多种其他治疗剂共施用或连同另一种治疗干预同时或以任何次序顺序施用。在一些情况下，细胞与另一种疗法以足够接近的时间共施用使得细胞群体增强一种或多种其他治疗剂的效果，反之亦然。在一些实施方案中，在一种或多种其他治疗剂之前施用细胞。在一些实施方案中，在一种或多种其他治疗剂之后施用细胞。在一些实施方案中，例如，一种或多种其他药剂包括例如IL-2等细胞因子，例如来增强持久性。在一些实施方案中，方法包括化疗剂的施用。
在施用细胞之后，在一些实施方案中，测量工程化细胞群的生物活性，例如通过许多已知方法中的任意者。评价的参数包括工程化T细胞与抗原的特异性结合，在体内例如通过成像、或离体例如通过ELISA或流式细胞术。在某些实施方案中，可以使用任何本领域已知的合适的方法来测量工程化细胞破坏靶细胞的能力，例如Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)、和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)中所描述的细胞毒性试验。在某些实施方案中，通过分析一种或多种细胞因子例如CD107a、IFNγ、IL-2、和TNF的表达和/或分泌来测量细胞的生物活性。在一些方面，通过分析临床结果如肿瘤负荷或负载的减少来测量生物活性。
在某些实施方案中，以许多方式进一步修饰工程化细胞，使得它们的治疗或预防功效增加。例如，可将由群体表达的工程化CAR或TCR与靶部分直接地或通过接头间接地缀合。将例如CAR或TCR等化合物缀合至靶部分的实践是本领域已知的。参见，例如，Wadwa等人,J.Drug Targeting 3:111(1995)、和美国专利号5,087,616。
C.给药计划或方案
在一些实施方案中，提供重复剂量方法，其中给出第一剂量的细胞接着一个或多个第二连续剂量。当在过继性疗法中向受试者施用时，细胞的多个剂量的时机和大小设计成增加表达TCR的工程化T细胞的功效和/或活性和/或功能。在一些实施方案中，重复给药降低当例如PD-1和/或PD-L1等抑制性免疫分子在表达TCR的工程化T细胞中上调时可发生的下调或抑制活性。所述方法涉及施用第一剂量，通常接着一个或多个连续剂量，并在不同剂量之间具有特定时间段。
在过继性细胞疗法的情况中，给定“剂量”的施用涵盖将给定量或数量的细胞作为单个组合物施用和/或单次不间断施用，例如作为单次注射或连续输注，并且还包括在不超过3天的指定时间段内，将给定量或数量的细胞作为以多个单独的组合物或输注来提供的分次剂量的施用。因此，在一些情况下，第一或连续剂量是在单个时间点给予或开始的、指定数量的细胞的单次或连续施用。然而，在一些情况下，第一或连续剂量在不超过3天的时间段中以多次注射或输注来施用，例如一次一天持续3天或持续2天、或在一天内多次输注。
因此，在一些方面，第一剂量的细胞以单一药物组合物施用。在一些实施方案中，连续剂量的细胞以单一药物组合物施用。
在一些实施方案中，第一剂量的细胞以多种组合物施用，这些组合物共同包含第一剂量的细胞。在一些实施方案中，连续剂量的细胞以多种组合物施用，这些组合物共同包含连续剂量的细胞。在一些方面，其他连续剂量可在不超过3天的时间段内以多种组合物施用。
术语“分次剂量”是指分开的剂量，使得其在1天以上的时间内施用。这类剂量包含在本发明中并且被视为单剂量。
因此，在一些方面，第一剂量和/或连续剂量(一个或多个)可作为分次剂量施用。例如，在一些实施方案中，剂量可在2天内或3天内向受试者施用。用于分次给药的示例性方法包括在第1天施用剂量的25％并且第2天施用剂量的剩余75％。在其他实施方案中，可在第1天施用第一剂量的33％并在第2天施用剩余的67％。在一些方面，在第1天施用剂量的10％、在第2天施用剂量的30％、并在第3天施用剂量的60％。在一些实施方案中，分次剂量不延续超过3天。
参考前述剂量，例如第一剂量，术语“连续剂量”是指在先前的例如第一剂量之后向相同受试者施用的剂量，且其间未向受试者施用任何中间剂量。然而，该术语不包括包含在单个分次剂量中的一系列输注或注射中的第二、第三、和/或以此类推的注射或输注。因此，除非特别另外指出，在1、2或3天时间段内的第二输注不被认为是此处所用的“连续”剂量。同样地，分次剂量内的多个剂量的系列中的第二、第三等也不被认为是“连续”剂量的含义背景中的“中间”剂量。因此，除非特别另外指出，在第一或先前剂量的开始之后、在大于3天的特定时间段内施用的剂量被认为是“连续”剂量，甚至是受试者在第一剂量开始后接着接受了第二或其后的细胞的注射或输注，只要第二或其后的注射或输注在第一或先前剂量开始后的3天内发生。
因此，除非另外特别指出，相同细胞在长达3天的时间段内的多次施用被视为是单剂量，并且细胞在初次施用后3天内的施用不被视为是连续施用，并且也不被视为为了确定第二剂量是否与第一剂量“连续”的中间剂量。
在一些实施方案中，给出多个连续剂量，在一些方面使用与关于第一剂量和第一连续剂量之间的时机的那些时机指南相同的时机指南，例如第一和多个连续剂量的施用，各个连续剂量在施用第一剂量后、在其中抑制性免疫分子如PD-1和/或PD-L1在受试者的细胞中上调的时间段内给予。以经验为主地确定何时提供连续剂量，例如通过评价来自外周血或其他体液的表达抗原的例如表达TCR的细胞中的PD-1和/或PD-L1的水平，在本领域技术人员的水平之内。
在一些实施方案中，第一剂量和第一连续剂量、或第一和多个连续剂量之间的时机是使得各个连续剂量在以下时间段内给予的：大于约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28或更多。在一些实施方案中，连续剂量在第一或紧接着先前的剂量的施用后小于约28天的时间段内给予。其他多个其他连续剂量(一个或多个)也称为后续剂量(subsequentdose)或后续连续剂量(subsequent consecutive dose)。
细胞的第一和/或一个或多个连续剂量的大小通常设计成提供改善的功效和/或降低的毒性风险。在一些方面，第一剂量或任何连续剂量的剂量的量和大小是如上所述的任何剂量或量。在一些实施方案中，第一剂量或任何连续剂量中的细胞数在约0.5×106细胞/kg受试者体重和5×106细胞/kg之间，在约0.75×106细胞/kg和3×106细胞/kg之间或约1×106细胞/kg和2×106细胞/kg之间，包含两端点。
如本文所使用的，“第一剂量”是用于描述给定剂量的时机早于连续或后续剂量的施用。该术语不一定意味着受试者之前从未接受过一定剂量的细胞疗法、或者甚至受试者之前未接受过一定剂量的相同细胞或表达相同重组受体或靶向相同抗原的细胞。
在一些实施方案中，由连续剂量中的细胞表达的例如TCR等受体含有至少一种免疫反应性表位作为由第一剂量的细胞表达的例如TCR等受体。在一些实施方案中，由以连续剂量施用的细胞表达的例如TCR等受体与由第一剂量表达的例如TCR等受体为相同的、或与由以第一剂量施用的细胞表达的例如TCR等受体为实质上相同的。
由以各种剂量向受试者施用的细胞表达的例如TCR等受体通常识别或特异性结合在待治疗的疾病或病况或其细胞中表达、与其相关、和/或对其为特异性的分子。在与例如抗原等分子特异性结合后，受体通常递送例如ITAM转导的信号等的免疫刺激信号至细胞中，从而促进靶向疾病或病况的免疫应答。例如，在一些实施方案中，第一剂量中的细胞表达特异性结合所表达的抗原的TCR。
实施例
以下实施例不旨在限制本发明的权利要求的范围，但意在作为某些实施方案的示例。对于本领域技术人员存在的示例性方法中的任何变化旨在落入本发明的范围内。
通常与包括Epstein Barr病毒(EBV)和人***瘤病毒(HPC)等病毒感染相关的癌症是过继性免疫疗法的优异靶。在此，我们鉴定可以响应EBV的潜伏膜蛋白2(LMP2)抗原而激活的新型T细胞受体(TCR)序列(TCR-L201；图10和11)。与这些干扰素γ(IFNγ)激活结果相一致，表达TCR-L201的T细胞可以特异性杀死经工程化来表达与HLA-A2连接的LMP2肽的癌症细胞(图13A)。由于HLA-A2是最常见的人类血清型之一，L201 TCR用于针对EBV-相关的NPC以及包括霍奇金氏和伯基特氏的淋巴瘤的工程化TCR-T细胞疗法。
构建体设计
对于LMP2 TCR-T细胞，使用标准分子生物技术产生含有2个编码区的MP71逆转录病毒载体构建体：(1)人抗LMP2 TCR的α链的可变区融合至小鼠TCRα链的恒定区；(2)相同人抗LMP2 TCR的β链的可变区融合至小鼠TCRβ链的恒定区。(图1A)
对于TCR-ICI-TGFβTRAP TCR-T细胞，使用标准分子生物技术产生含有3个编码区的MP71逆转录病毒载体构建体：(1)人特异性TCR的α链的可变区融合至小鼠TCRα链的恒定区；(2)相同人TCR的β链的可变区融合至小鼠TCRβ链的恒定区；(3)由GS接头连接的免疫检查点抑制剂(ICI)的重链和轻链的可变区，其通过可变重链的C末端处的柔性接头肽融合至TCRβRII的胞外结构域的配体结合序列。抗gp120-TCRβRII抗体用作非特异性scFv-TCRβRII对照。(图1B)
细胞系和培养基
HEK-293T、Ca Ski、和K562购自ATCC。来自匿名供体的外周血单核细胞(PBMC)购自Hemacare。通过用过表达人HLA-A2单链的载体对K562细胞进行慢病毒转导来制备K562-A2细胞。通过用过表达人E6和E7的载体对Ca Ski细胞进行逆转录病毒转导来制备Ca Ski E6/E7细胞。通过用过表达LLW表位-接头-HLA-A2或CLG表位-接头-HLA-A2的载体进行逆转录病毒转导来制备A375-pHLA(LLW)和A375-pHLA(CLG)细胞。在DMEM+10％FBS、RPMI+10％FBS、或X-Vivo+5％人血清A/B中培养细胞。
逆转录病毒载体产生
使用标准磷酸钙沉淀方案对HEK-293T细胞进行瞬时转染来制备逆转录病毒载体。第48小时收获病毒上清液并用于转导T细胞。T细胞转导和扩增。在逆转录病毒转导前，通过用T细胞激活珠(activator bead)和人IL-2培养来激活PBMC 2天。对于转导，通过在32℃下以2,000g离心2小时，将新鲜收集的逆转录病毒上清液旋转-上样(spin-loaded)至包被有15mg RetroNectin每/孔(Clontech Laboratories)的、非组织培养处理的24孔板中。将激活的PBMC上样至板中并在32℃下以600g旋转30分钟。在37℃和5％CO2下培养T细胞。每两天补充一次培养基。
TCR染色
所有的抗体购自Biolegend。通过对小鼠TCRβ链进行抗体染色接着进行流式细胞术，在转染后72小时检测重组TCR的表达。同时进行CD3、CD4、和CD8染色。使用可行的CD3+淋巴细胞门控策略。NT＝非转导对照。
用L201、L202和L203 TCR的构建体转导原代人T细胞。结果：(图9)抗LMP2 TCR在人T细胞中强烈表达。
用E6、E6-αPD1-TGFβRII、E6-αPDL1-TGFβRII、E6-HAC-TGFβRII或E6-αgp120-TGFβRII TCR的构建体转导原代人T细胞。结果：(图14)抗E6 TCR在含有原始抗E6 TCR、E6-αPD1-TGFβRII、E6-αPDL1-TGFβRII、E6-HAC-TGFβRII和E6-αgp120-TGFβRII TCR构建体的T细胞中强烈表达。
用LMP2-αPD1-TGFβRII、LMP2-αPDL1-TGFβRII、LMP2-HAC-TGFβRII或LMP2-αgp120-TGFβRII TCR的构建体转导原代人T细胞。结果：(图20)抗LMP2 TCR在含有原始抗LMP2 TCR、LMP2-αPD1-TGFβRII、LMP2-αPDL1-TGFβRII、LMP2-HAC-TGFβRII和LMP2-αgp120-TGFβRIITCR构建体的T细胞中强烈表达。
体外TCR-T IFNβ产生
如所指示的，将TCR-T细胞与不同类型的靶细胞以各种效靶比共培养。通过流式细胞术或根据制造商的说明书使用人IFN-γELISA试剂盒来分别地测量细胞内或分泌的IFN-γ表达。
将具有抗LMP2 TCR的TCR-T细胞与EBV肽脉冲的APC以1:1效靶比共培养过夜。结果：(图10和11A-11C)。含有抗LMP2 TCR的TCR-T细胞可由靶细胞特异性激活，如通过细胞内IFN-γ表达来测量的。全部三种抗LMP2 TCR显示亚微摩尔EC50。
将L201 TCR-T细胞与EBV肽脉冲的APC以1:0、1:1、和3:1效靶比共培养48小时。结果：(图12)TCR-T细胞可由靶细胞激活。更高的E:T比使得TCR-T细胞产生更多IFN-γ。
抗原特异性刺激下，分泌的ICI-TGFβRII trap对TCR-T细胞的IFNγ产生的效果。(a)将TCR-T细胞与肽脉冲的K562-A2细胞以1:1效靶比共培养过夜。然后收集细胞并通过流式细胞术测量细胞内IFN-γ表达。(图15A)(b)将TCR-T细胞与Ca Ski E6/E7细胞以1:0、1:2、1:1、和3:1效靶比共培养72小时(图15B)。然后收集上清液并根据制造商的说明书使用人IFN-γELISA试剂盒来测量IFN-γ产生。结果：(图15B)含有E6 TCR的TCR-T细胞可由靶细胞激活，如通过IFN-γ表达所测量的。由肽脉冲的APC或E6+靶细胞(Ca Ski E6/E7)所刺激的，E6-αPD1-TGFβRII、E6-αPDL1-TGFβRII、E6-HAC-TGFβRII或E6-αgp120-TGFβRII TCR-T细胞具有比单独E6更高的IFN-γ表达。与对照E6-αgp120-TGFβRII TCR-T细胞相比，E6-αPD1-TGFβRII、E6-αPDL1-TGFβRII、E6-HAC-TGFβRII TCR-T细胞在抗原特异性刺激下产生更高的IFN-γ水平。
将LMP2-αPD1-TGFβRII、LMP2-αPDL1-TGFβRII、LMP2-HAC-TGFβRII或LMP2-αgp120-TGFβRII TCR-T细胞与LMP2-LLW肽脉冲的APC以1:1效靶比共培养过夜。结果：(图21)含有LMP2 TCR的TCR-T细胞可由靶细胞激活，如通过IFN-γ表达所测量的。由肽脉冲的APC所刺激的，单独LMP2、LMP2-αPD1-TGFβRII、LMP2-αPDL1-TGFβRII、LMP2-HAC-TGFβRII和LMP2-αgp120-TGFβRII TCR-T细胞具有高IFN-γ表达。
特异性细胞裂解(细胞毒性)
对于LMP2 TCR-T细胞杀伤分析，用CFSE预染色EBV肽脉冲的APC(K562-A2)，然后与未转导的或TCR转导的T细胞以1:1、和3:1效靶比共培养过夜。通过Annexin V/7-AAD染色来测量T细胞针对靶细胞的细胞毒性。对于A375细胞杀伤，用CFSE和Celltrace Violet分别地标记靶(A375-pHLA(LLW))和非靶(A375-pHLA(CLG))细胞，并且以1:1比例混合。然后将混合的细胞与L202 TCR-T细胞以各种效应子-对-靶细胞比共培养过夜。通过靶细胞对非靶细胞的比来测量T细胞针对靶细胞的细胞毒性。
L201 TCR-T细胞或L202 TCR-T细胞针对靶细胞的细胞毒性。(a)用CFSE预染色EBV肽APC，然后与L201 TCR-T细胞以1:1和3:1效靶比共培养过夜。通过Annexin V/7-AAD染色测量T细胞针对靶细胞的细胞毒性。结果：(图13A)L201抗LMP2 TCR-T细胞以特异性方式杀死靶细胞。在更高E:T比的情况下，TCR-T细胞具有更高杀伤能力。
(b)用CFSE和Celltrace Violet分别地标记靶(A375-pHLA(LLW))和非靶(A375-pHLA(CLG))细胞，并且以1:1比例混合。然后将混合的细胞与L202 TCR-T细胞以指定的效应子-对-靶细胞比共培养过夜。结果：(图13B)L202抗LMP2 TCR-T细胞以特异性方式杀死靶细胞。在更高E:T比的情况下，TCR-T细胞具有更高杀伤能力。
各种抗LMP2 TCR-T细胞对靶细胞的特异性杀伤。用CFSE预染色LMP2-LLW肽脉冲的APC，然后与TCR-T细胞以多种效靶比共培养过夜。通过Annexin V/7-AAD染色测量T细胞针对LMP2-LLW肽冲击的APC的细胞毒性。结果：(图23)全部LMP2 TCR-T细胞以特异性方式杀死LMP2+靶细胞(Ca Ski)。对照LMP2.αgp120-TGFβRII TCR-T细胞比其他LMP2 TCR-T细胞更弱地杀死靶细胞。因此，LMP2-αPD1-TGFβRII、LMP2-αPDL1-TGFβRII、LMP2-HAC-TGFβRII TCR-T细胞具有比LMP2-αgp120-TGFβRII TCR-T细胞更高的杀伤能力。
对于E6-ICI-TGFbTRAP T细胞杀伤分析，用CFSE预染色Ca Ski肿瘤细胞，然后与E6、E6.αPD1-TGFβRII、E6.αPDL1-TGFβRII、E6.HAC-TGFβRII或E6.αgp120-TGFβRII TCR-T细胞以1:1效靶比共培养过夜。通过Annexin V/7-AAD染色测量T细胞针对Ca Ski7的细胞毒性。
结果：(图16)全部E6 TCR-T细胞以特异性方式杀死E6+靶细胞(Ca Ski)。E6.αgp120-TGFβRII TCR-T杀死靶细胞的效率与单独E6一样，并且E6.αPDL1-TGFβRII、E6.HAC-TGFβRII TCR-T细胞具有比E6.αgp120-TGFβRII TCR-T细胞更高的杀伤能力。
分泌的scFv-TGFβRII对TGFβ的结合活性。向包被有scFv-TGFβRII的板添加重组人TGFβ1，其通过生物素化抗TGFβ1和HRP-Avidin检测到。
结果：(图17)由E6.αPD1-TGFβRII、E6.αPDL1-TGFβRII、E6.HAC-TGFβRII或E6.αgp120-TGFβRII TCR转染的293T细胞产生的分泌的scFv-TGFβRII以相似的亲和力结合至重组人TGFβ1。
TGFβ表达。根据制造商的说明书使用人TGFβELISA试剂盒来测量E6+靶细胞(CaSki)中分泌的TGFβ。
结果：(图18)E6+靶细胞(Ca Ski)可产生并分泌TGFβ至上清液中。
体外TCR-T细胞增殖。用CFSE预染色E6、E6.αPD1-TGFβRII、E6.αPDL1-TGFβRII、E6.HAC-TGFβRII或E6.αgp120-TGFβRII TCR-T细胞。然后将染色的T细胞与Ca Ski细胞共培养72小时，通过流式细胞术测量CFSE的强度。非转导的(NT)T细胞用作对照。
结果：(图19)暴露于E6+靶细胞刺激全部E6 TCR-T细胞增殖，另一种激活措施。E6.αPDL1-TGFβRII TCR-T比其他试验的TCR-T细胞更快的增殖。
L202 TCR-T细胞的体内抗肿瘤功效
方法：对6-8周龄雌性NSG小鼠在右侧(right flank)皮下接种5.0x106A375-pep-HLA-A2黑色素瘤细胞。9天后即研究第0天，基于肿瘤体积将动物分组，其中各组具有35mm3的平均肿瘤体积。在研究第0天，对动物静脉注射10x106 TCR+L202细胞或未转导的细胞。7天后即研究第6天重复这些注射。
在指定天数测量肿瘤体积并且将其单独地(图24A)或作为各组的平均值(图24B)绘图。计算肿瘤倍数变化(图24C)并以(第20天的肿瘤体积)/(第0天的肿瘤体积)绘图。动物体重变化计算为基于第0天的初始动物体重的百分比(图24D)。这些结果共同表明L202TCR-T细胞的强力抗肿瘤功效，且无明显毒性的证据。
假设方法(Prophetic Method)
对6-8周龄雌性NSG小鼠在右侧(right flank)皮下接种5.0x106A375-pep-HLA-A2黑色素瘤细胞。在9天后即研究第0天，基于肿瘤体积将动物分组，其中各组具有35mm3的平均肿瘤体积。在研究第0天，对动物静脉注射1e6未转导的细胞或由以下构建体转导的TCR-T细胞：1)L202；2)L202-PD1；3)L202-TGFβRII；4)L202-PD1-TGFβRII。在7天后即研究第6天重复这些注射。每2天测量肿瘤体积和动物重量直至第20天，其为试验终止的时间。
与完全消除A375肿瘤的10x106 L202细胞相比(图24B)，我们预期用10x106 L202细胞适当地抑制体内肿瘤生长。基于PD1驱动A375黑色素瘤的生长的已知能力(引用PMID：26359984)，与L202单独相比，我们预期抗PD1的添加在小鼠肿瘤负荷中产生更强的减少(组2vs.组1)。通过检测具有或不具有抗PD1的TGFβ拮抗作用来确定进一步的累加或协同效果(组4和组3分别地对组1和组2)。总之，我们期望这些实验来提供原理论证，将TCR-T细胞疗法与免疫检查点抑制和/或TGFβ阻断联合提供数量上更大的抗肿瘤功效，从而促进更小给药方案的使用。
本文所引用的所有参考文献将其全部内容通过引入结合在此。除非另外定义，本文所使用的技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员所理解的相同含义。Allen等人,Remington:The Science and Practice of Pharmacy第22版,PharmaceuticalPress(September 15,2012)；Hornyak等人,Introduction to Nanoscience andNanotechnology,CRC Press(2008)；Singleton和Sainsbury,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology第3版,修订版,J.Wiley&Sons(New York,NY2006)；Smith,March’s Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms andStructure第7版,J.Wiley&Sons(New York,NY 2013)；Singleton,Dictionary of DNA andGenome Technology第3版,Wiley-Blackwell(November 28,2012)；和Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第4版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(Cold Spring Harbor,NY 2012)，为本领域技术人员提供本申请中所用的许多术语的通用指南。对于如何制备抗体的参考文献，参见Greenfield,Antibodies A LaboratoryManual第2版,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor NY,2013)；和Milstein,Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumorlines by cell fusion,Eur.J.Immunol.1976Jul,6(7):511-9；Queen和Selick,Humanizedimmunoglobulins,U.S.Patent No.5,585,089(1996Dec)；和Riechmann等人,Reshapinghuman antibodies for therapy,Nature 1988Mar 24,332(6162):323-7。
本领域技术人员将认识到类似于或等同于本文所述的那些的许多方法和材料，其将用于本发明的实践。与附图相结合，本发明的其他特征和优点将从以下详细描述中显而易见，所述附图通过例示的方式说明了本发明的实施方案的各种特征。实际上，本发明决不被限制于所述的方法和材料。为了方便起见，此处收集说明书、实施例和所附权利要求中本文所采用的某些术语。本发明的组合物不限于本文所公开的示例性序列的变体，而包括与本文所公开的示例性序列具有至少90％、至少95％和至少99％同一性的那些。
除非另外说明或在上下文中暗示，以下术语和短语包括以下提供的含义。除非另外明确说明或从上下文中显而易见的，以下术语和短语不排除所述术语或短语在其所属领域中所获得的含义。提供定义来帮助描述特定实施方案，而不旨在限制权利要求的发明，因为发明的范围仅由权利要求书限制。除非另外定义，本文使用的全部技术和科学术语具有与本发明所述领域普通技术人员所通常理解的含义。
本文所有出版物以如同各个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地通过引用并入那样的相同程度通过引用结合在此。以下描述包括可有助于理解本发明的信息。不承认本文提供的任何信息是现有技术或与目前权利要求保护的发明有关，或任何明确或隐含引用的出版物是现有技术。

Claims (57)

1.一种工程化T细胞，其包括：
编码抗LMP2 TCR的核酸，其中抗LMP2 TCR包括与肿瘤中LMP2特异性结合的基因工程化T细胞受体，
其中所述抗LMP2 TCR包括氨基酸SEQ ID NO:1的α链的位置27-32的CDR1、位置50-56的CDR2、位置90-101的CDR3和氨基酸SEQ ID NO:2的β链的位置27-31的CDR1、位置49-54的CDR2、位置92-106的CDR3；或
其中所述抗LMP2 TCR包括氨基酸SEQ ID NO:5的α链的位置25-30的CDR1、位置48-54的CDR2、位置89-100的CDR3和氨基酸SEQ ID NO:6的β链的位置25-29的CDR1、位置47-52的CDR2、位置91-103的CDR3；或
其中所述抗LMP2 TCR包括氨基酸SEQ ID NO:9的α链的位置32-37的CDR1、位置55-61的CDR2、位置96-108的CDR3和氨基酸SEQ ID NO:10的β链的位置25-29的CDR1、位置47-52的CDR2、位置90-105的CDR3。
2.根据权利要求1所述的工程化T细胞，其中所述抗LMP2 TCR包括SEQ ID NO:1所示的α链可变结构域和SEQ ID NO:2所示的β链可变结构域。
3.根据权利要求1所述的工程化T细胞，其中所述核酸包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
4.根据权利要求1所述的工程化T细胞，其中所述抗LMP2 TCR包括SEQ ID NO:5所示的α链可变结构域和SEQ ID NO:6所示的β链可变结构域。
5.根据权利要求1所述的工程化T细胞，其中所述核酸包括SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
6.根据权利要求1所述的工程化T细胞，其中所述抗LMP2 TCR包括SEQ ID NO:9所示的α链可变结构域和SEQ ID NO:10所示的β链可变结构域。
7.根据权利要求1所述的工程化T细胞，其中所述核酸包括SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。
8.根据权利要求1所述的工程化T细胞，其中所述抗LMP2 TCR为组成型表达。
9.根据权利要求1所述的工程化T细胞，其进一步包括降低肿瘤中抑制性受体的功能或表达的抑制性蛋白。
10.根据权利要求9所述的工程化T细胞，其中所述抑制性蛋白为免疫检查点抑制剂。
11.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-10中任一项所述的工程化T细胞和药学上可接受的运载体。
12.根据权利要求11中所述的细胞在制备用于通过以下方法治疗癌症的药物中的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求11中所述的细胞。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述癌症为鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、或胃癌。
14.根据权利要求13所述的用途，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的包括化学疗法或放射疗法的现有疗法。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述细胞和所述现有疗法顺序或同时施用。
16.一种工程化T细胞，其包括：
核酸，其编码(a)与肿瘤中抗原特异性结合的基因工程化T细胞受体；
(b)降低肿瘤中免疫检查点的功能或表达的抑制性蛋白；和
(c)与转化生长因子β家族(TGF-β)的成员结合的蛋白，
其中所述基因工程化T细胞受体是抗LMP2 TCR，
其中所述抗LMP2 TCR包括SEQ ID NO:1所示的α链可变结构域和SEQ ID NO:2所示的β链可变结构域；或
其中所述抗LMP2 TCR包括SEQ ID NO:5所示的α链可变结构域和SEQ ID NO:6所示的β链可变结构域；或
其中所述抗LMP2 TCR包括SEQ ID NO:9所示的α链可变结构域和SEQ ID NO:10所示的β链可变结构域。
17.根据权利要求16所述的工程化T细胞，其中所述免疫检查点包括PD1、PD-L1和CTLA-4中的一种或多种。
18.根据权利要求16所述的工程化T细胞，其中所述肿瘤中的抗原包括Epstein–Barr病毒(EBV)抗原。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的工程化T细胞，其中所述与转化生长因子β家族(TGF-β)的成员结合的蛋白包括TGFβRII的胞外结构域。
20.根据权利要求16所述的工程化T细胞，其中编码所述基因工程化T细胞受体的核酸包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；或SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；或SEQ ID NO:11和SEQID NO:12。
21.根据权利要求16-18中任一项所述的工程化T细胞，其中所述基因工程化T细胞受体为组成型表达。
22.根据权利要求21所述的工程化T细胞，其中所述与转化生长因子β家族(TGF-β)的成员结合的蛋白为组成型表达。
23.根据权利要求16-18中任一项所述的工程化T细胞，其中所述肿瘤为病毒相关的肿瘤。
24.一种载体，其包括根据权利要求16中所述的核酸。
25.根据权利要求24所述的载体，其中所述载体为逆转录病毒载体。
26.一种药物组合物，其包括根据权利要求16-23中任一项所述的工程化T细胞和药学上可接受的运载体。
27.根据权利要求26中所述的细胞在制备用于通过以下方法治疗癌症的药物中的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求26中所述的细胞。
28.根据权利要求27所述的用途，其中所述癌症为鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、或胃癌。
29.根据权利要求27所述的用途，其中所述癌症为子宫颈、***、口咽、或生殖器官癌。
30.根据权利要求28-29中任一项所述的用途，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的包括化学疗法或放射疗法的现有疗法。
31.根据权利要求30所述的用途，其中所述细胞和所述现有疗法顺序或同时施用。
32.一种T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包括含有可变α(Va)区的α链和含有可变β(Vb)区的β链，即含有Va区的α链和含有Vb区的β链，其中：
(1)所述Va区包括SEQ ID NO:1的位置27-32的互补决定区1(CDR1)、位置50-56的互补决定区2(CDR2)、和位置90-101的互补决定区3(CDR3)，和所述Vb区包括SEQ ID NO:2的位置27-31的CDR1、位置49-54的CDR2、和位置92-106的CDR3；
(2)所述Va区包括SEQ ID NO:5的位置25-30的CDR1、位置48-54的CDR2、和位置89-100的CDR3，和所述Vb区包括SEQ ID NO:6的位置25-29的CDR1、位置47-52的CDR2、和位置91-103的CDR3的氨基酸序列；或
(3)所述Va区包括SEQ ID NO:9的位置32-37的CDR1、位置55-61的CDR2、和96-108的CDR3的CDR1、CDR2、和CDR3，和所述Vb区包括SEQ ID NO:10的位置25-29的CDR1、位置47-52的CDR2、和位置90-105的CDR3的氨基酸序列。
33.根据权利要求32所述的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其中
(1)所述Va区包括氨基酸如SEQ ID NO:17-19所示的CDR1、CDR2、和CDR3，和所述Vb区包括氨基酸如SEQ ID NO:20-22所示的CDR1、CDR2、和CDR3；
(2)所述Va区包括氨基酸如SEQ ID NO:23-25所示的CDR1、CDR2、和CDR3，和所述Vb区包括氨基酸如SEQ ID NO:26-28所示的CDR1、CDR2、和CDR3；或
(3)所述Va区包括氨基酸如SEQ ID NO:29-31所示的CDR1、CDR2、和CDR3，和所述Vb区包括氨基酸如SEQ ID NO:32-34所示的CDR1、CDR2、和CDR3。
34.根据权利要求32所述的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其中：
所述Va区包括SEQ ID NOs:1、5、或9任一氨基酸序列；和
所述Vb区包括SEQ ID NOs:2、6、或10任一氨基酸序列。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述TCR或其抗原结合片段结合至或识别LMP2的肽表位LLWTLVVLL。
36.根据权利要求32-34中任一项所述的TCR或其抗原结合片段，其中，当在T细胞表面表达时，所述TCR或其抗原结合片段针对靶癌细胞刺激细胞毒活性。
37.根据权利要求36所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述靶癌细胞含有EBV DNA序列或表达LMP2。
38.一种载体，其含有编码根据权利要求32-37中任一项所述的TCR或其抗原结合片段的核酸。
39.根据权利要求38所述的载体，其中所述载体为表达载体。
40.根据权利要求38所述的载体，其中所述载体为病毒载体。
41.根据权利要求40所述的载体，其中所述病毒载体包括逆转录病毒载体或慢病毒载体。
42.一种工程化细胞，其含有根据权利要求38-41中任一项所述的载体。
43.一种工程化细胞，其含有根据权利要求32-37中任一项所述的TCR或其抗原结合片段。
44.根据权利要求43所述的工程化细胞，其中所述TCR或其抗原结合片段与细胞异源。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞为细胞系。
46.根据权利要求42-44中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞为获得自受试者的原代细胞。
47.根据权利要求46所述的工程化细胞，其中所述受试者为人受试者。
48.根据权利要求42-44中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞为T细胞。
49.根据权利要求48所述的工程化细胞，其中所述T细胞为CD8+。
50.根据权利要求48所述的工程化细胞，其中所述T细胞为CD4+。
51.一种产生工程化细胞的方法，其包括体外或离体地将根据权利要求38至41中任一项所述的载体引入至细胞中。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述载体为病毒载体并且通过转导进行引入。
53.根据权利要求42-50中任一项所述的工程化细胞在制备用于通过以下方法治疗疾病或病症的药物中的用途，所述方法包括向患有EBV相关疾病或病症的受试者施用根据权利要求42-50中任一项所述的工程化细胞。
54.根据权利要求53所述的用途，其中所述EBV相关疾病或病症为癌症。
55.工程化T细胞在制备用于通过以下方法治疗受试者中肿瘤的药物中的用途，所述方法包括
向有需要的受试者施用
(a)工程化T细胞，其包括：编码与肿瘤中的抗原特异性结合的TCR或其抗原结合片段的核酸；和
(b)与转化生长因子β家族(TGF-β)的成员结合的检查点抑制剂或蛋白的一者或两者，
其中TCR或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:1所示的α链可变结构域和SEQ ID NO:2所示的β链可变结构域；或
其中TCR或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:5所示的α链可变结构域和SEQ ID NO:6所示的β链可变结构域；或
其中TCR或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:9所示的α链可变结构域和SEQ ID NO:10所示的β链可变结构域。
56.工程化T细胞在制备用于通过以下方法治疗受试者中肿瘤的药物中的用途，所述方法包括
向有需要的受试者施用
工程化T细胞，其包括：编码以下的核酸：
(a)与肿瘤中的抗原特异性结合的TCR或其抗原结合片段；和
(b)靶向检查点抑制剂和转化生长因子β家族(TGF-β)的成员的双功能trap蛋白，
其中TCR或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:1所示的α链可变结构域和SEQ ID NO:2所示的β链可变结构域；或
其中TCR或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:5所示的α链可变结构域和SEQ ID NO:6所示的β链可变结构域；或
其中TCR或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:9所示的α链可变结构域和SEQ ID NO:10所示的β链可变结构域。
57.根据权利要求55或56所述的用途，其中所述肿瘤为EBV诱导的肿瘤。
CN201980081064.XA 2018-12-06 2019-12-05 靶向肿瘤抗原、TGF-β、和免疫检查点的组合型TCR-T细胞疗法 Active CN113226335B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862776012P 2018-12-06 2018-12-06
US62/776,012 2018-12-06
PCT/US2019/064757 WO2020118094A1 (en) 2018-12-06 2019-12-05 Combinational tcr-t cell therapy targeting tumor antigens, tgf-beta, and immune checkpoints

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113226335A CN113226335A (zh) 2021-08-06
CN113226335B true CN113226335B (zh) 2023-10-13

Family

ID=70974859

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980081064.XA Active CN113226335B (zh) 2018-12-06 2019-12-05 靶向肿瘤抗原、TGF-β、和免疫检查点的组合型TCR-T细胞疗法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20210369776A1 (zh)
JP (1) JP2022512326A (zh)
KR (1) KR20210112310A (zh)
CN (1) CN113226335B (zh)
SG (1) SG11202105975SA (zh)
TW (1) TW202039545A (zh)
WO (1) WO2020118094A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11535669B2 (en) 2018-07-09 2022-12-27 Precigen, Inc. Fusion constructs and methods of using thereof
CN111718409B (zh) * 2020-06-17 2021-03-02 深圳豪石生物科技有限公司 一种t细胞受体及其应用
CN112940108B (zh) * 2021-03-19 2022-10-14 河南省肿瘤医院 识别ebv抗原的t细胞受体以及该t细胞受体的应用
AU2022270361A1 (en) 2021-05-05 2023-11-16 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigen binding proteins specifically binding prame
WO2024054863A1 (en) * 2022-09-06 2024-03-14 Board Of Regents, The University Of Texas System T-cell receptor that targets egfr mutation and methods of using the same

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103249430A (zh) * 2010-09-20 2013-08-14 生物技术公司 抗原特异性t细胞受体和t细胞表位
WO2017165683A1 (en) * 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
WO2017190100A1 (en) * 2016-04-28 2017-11-02 The Trustees Of Dartmouth College Nucleic acid constructs for co-expression of chimeric antigen receptor and transcription factor, cells containing and therapeutic use thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060002941A1 (en) * 2004-01-23 2006-01-05 Vievax Corp. Compositions comprising immune response altering agents and methods of use
AU2015213988B2 (en) * 2014-02-10 2019-07-11 Merck Patent Gmbh Targeted TGFbeta inhibition
WO2016126608A1 (en) * 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
EP3286211A1 (en) * 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
US11242375B2 (en) * 2015-09-04 2022-02-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immune cell compositions and methods of use
WO2017133175A1 (en) * 2016-02-04 2017-08-10 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Engineered mammalian cells for cancer therapy
CA3014001A1 (en) * 2016-02-25 2017-08-31 Cell Medica Switzerland Ag Binding members to pd-l1
US20210095029A1 (en) * 2017-04-19 2021-04-01 University Of Southern California Compositions and methods for treating cancer

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103249430A (zh) * 2010-09-20 2013-08-14 生物技术公司 抗原特异性t细胞受体和t细胞表位
WO2017165683A1 (en) * 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
WO2017190100A1 (en) * 2016-04-28 2017-11-02 The Trustees Of Dartmouth College Nucleic acid constructs for co-expression of chimeric antigen receptor and transcription factor, cells containing and therapeutic use thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Knudson KM等.M7824, a novel bifunctional anti-PD-L1/TGFβ Trap fusion protein, promotes anti-tumor efficacy as monotherapy and in combination with vaccine.Oncoimmunology.2018,第7卷(第5期),e1426519：1-14. *

Also Published As

Publication number Publication date
TW202039545A (zh) 2020-11-01
WO2020118094A1 (en) 2020-06-11
US20210369776A1 (en) 2021-12-02
SG11202105975SA (en) 2021-07-29
KR20210112310A (ko) 2021-09-14
WO2020118094A9 (en) 2020-10-01
CN113226335A (zh) 2021-08-06
JP2022512326A (ja) 2022-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113226335B (zh) 靶向肿瘤抗原、TGF-β、和免疫检查点的组合型TCR-T细胞疗法
CN109983033B (zh) 调节细胞表达的生物活性的结合分子
JP7325959B2 (ja) 腫瘍特異的細胞の枯渇のための抗ＣＤ２５ ＦＣγ受容体二重特異性抗体
JP2020522495A (ja) 抗ｌａｇ−３抗体、ｐｄ−１経路阻害剤および免疫療法剤の組み合わせを含む組成物
CN110914295A (zh) 抗人***瘤病毒(hpv)抗原结合蛋白及其使用方法
AU2016336817A1 (en) High avidity HPV T-cell receptors
JP7458973B2 (ja) 新規抗体およびＴｒｅｇ枯渇抗体と免疫刺激性抗体との併用
WO2021232200A1 (en) Il-12 armored immune cell therapy and uses thereof
WO2021155830A1 (en) Anti-hpv t cell receptors and engineered cells
US20230227527A1 (en) Tcr-t cell therapy targeting epstein-barr virus
CA3202416A1 (en) Multispecific antibodies for the treatment of cancer
US20200046769A1 (en) Dual function engineered t cells with hpv e6 specificity and pd-1 blockade
JP2022537068A (ja) 抗ａｌｐｐ ｃａｒ－ｔ細胞療法
JP2021514188A (ja) Ｆｏｘｐ３標的因子組成物と養子細胞療法のための使用方法
EA044060B1 (ru) Антигенсвязывающие белки против вируса папилломы человека (hpv) и способы их применения

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40048906

Country of ref document: HK

SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Li Si

Inventor after: Paul Bryson

Inventor after: P. Alexander

Inventor after: Chen Rui

Inventor before: Li Si

Inventor before: Wang Pin

Inventor before: Paul Bryson

Inventor before: P. Alexander

Inventor before: Chen Rui

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant