CN113226319B - 抗病毒前药及其纳米制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了前药及其使用方法。

Description

抗病毒前药及其纳米制剂
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2018年10月22日提交的美国临时专利申请第62/748,798号的优先权。前述申请通过引用并入本文。
本发明是基于由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的批准号R01 MH104147、P01 DA028555、R01 NS036126、P01 NS031492、R01 NS034239、P01MH064570、P30 MH062261、P30 AI078498、R01AG043540和R56 AI138613在政府支持下完成的。政府在本发明中具有某些权利。
发明领域
本发明总体上涉及治疗剂的递送。更具体地，本发明涉及用于向患者递送治疗剂以治疗疾病或紊乱的组合物和方法。
发明背景
在针对1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的有效诊断和治疗的开发方面已经取得了显著进展。抗逆转录病毒疗法(ART)已经显著降低了与疾病相关的发病率和死亡率，使感染者能够具有接近正常的生活质量(Vittinghoff等人(1999)J.Infect Dis.,179(3):717-720；Lewden等人(2007)J.Acquir.Immune Defic.Syndr.,46(1):72–77)。然而，ART需要终身治疗，以便抑制病毒复制和防止AIDS发作。此外，ART的有效性可能受到HIV-1抗性、药物毒性和差的患者依从性(patient adherence)的限制(Wensing等人(2014)Top.Antivir.Med.,22(3):642-650；Siliciano等人(2013)Curr.Opin.Virol.,3(5):487-494；Prosperi等人(2012)BMC Infect.Dis.,12:296-296；Van den Berk等人(2016)文摘号:948,于Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections,22-25；Siefried等人(2017)PLoS One12(4):e0174613)。治疗疲劳、缺乏经济和社会支持、共存的精神症状和/或物质滥用可能导致无法坚持关键的ART方案(Tucker等人(2017)EBioMedicine,17:163-171)。
长效肠胃外(LAP)抗逆转录病毒药物已经改善了方案依从性(Spreen等人(2013)Curr.Opin.HIV AIDS,8(6):565-571)。将治疗时间表从每天施用减少到每月施用或甚至更低频率的施用提供更大的患者隐私和满意度，并且改善方案依从性(Sangaramoorthy等人(2017)J.Assoc.Nurses AIDS Care,28(4):518-531；Carrasco等人(2017)Afr.J.AIDSRes.16(1):11-18；Williams等人(2013)Nanomed.Lond.8(11):1807-1813)。然而，只有少数抗逆转录病毒药物被成功地重新配制成LAP。
卡博特韦(cabotegravir)(CAB)是一种整合酶抑制剂或整合酶链转移抑制剂(INSTI)，其具有低水溶解度、高熔点、高效能(potency)、长半衰期和慢代谢清除率(Karmon等人(2015)J.Acquir.Immune Defic.Syndr.,68(3):39-41；Trezza等人(2015)Curr.Opin.HIV AIDS 10(4):239-245)。这些性质使CAB能够被配制成200-mg/mL的悬浮液(CAB LAP)，并且每月或甚至更低频率地经肌内施用(Margolis等人(2017)Lancet390(10101):1499-1510；Spreen,W.W.(2014)J.Acquir.Immune Defic.Syndr.,67(5):481-486)。特别地，CAB加利匹韦林(rilpivirine)(RPV)是第一个长效联合ART方案，其中每月或每隔一个月的CAB和RPV LAP制剂已经显示出与用于维持疗法的每日口服三种药物的组合相当的抗逆转录病毒活性(Margolis等人(2017)Lancet 390(10101):1499-1510)。
有利地，CAB主要由尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶(UGT)1A1代谢，并且具有与其他抗逆转录病毒药物相互作用的低可能性(Trezza等人(2015)Curr.Opin.HIV AIDS 10(4):239-245；Bowers等人(2016)Xenobiotica46(2):147-162)。CAB LAP针对非人类灵长类动物的直肠、***和静脉内猿/人类免疫缺陷病毒(SHIV)传播具有高度保护作用，并且已经进入HIV预防的临床试验(NCT02720094)(Andrews等人(2014)Science343(6175):1151-1154；Andrews等人(2015)Sci.Transl.Med.,7(270)270ra4；Radzio等人(2015)Sci.Transl.Med.,7(270)270ra5-270ra5；Andrews等人(2016)AIDS 2016:461-467)。然而，CAB LAP的给药模式具有局限性。具体地，需要以2mL体积给予分次注射(splitinjection)，这导致因为注射部位不可忍受的反应而引起的治疗中断(Margolis等人(2017)Lancet390(10101):1499-510；Markowitz等人(2017)Lancet HIV 4(8):331-340)。此外，最大给药间隔仅为8周。最近，已经对每12周的CAB LAP施用进行了测试，目的是将血浆CAB浓度保持在高于4倍的蛋白结合调节的90％抑制浓度(4×PA-IC90，660ng/mL)，该浓度被证明针对猕猴的新感染具有保护作用(Spreen,W.W.(2014)J.Acquir.ImmuneDefic.Syndr.,67(5):481-486；Andrews等人(2014)Science 343(6175):1151-1154；Andrews等人(2015)Sci.Transl.Med.,7(270)270ra4；Radzio等人(2015)Sci.Transl.Med.,7(270)270ra5-270ra5；Andrews等人(2016)AIDS 2016:461-467；Markowitz等人(2017)Lancet HIV 4(8):331-340；Spreen等人(2014)J.Acquir.ImmuneDefic.Syndr.,67(5):487-492)。然而，三分之二的参与者具有快于预期的药物吸收，导致12周时血浆药物浓度低于4×PA-IC90的目标有效浓度。因此，非常需要将剂量间隔(doseinterval)延长至超过8周并减少注射体积以改善方案依从性的方式(Boyd等人(2017)Lancet 390(10101):1468-1470)。
发明概述
根据本发明，提供了整合酶抑制剂的前药。在特定的实施方案中，前药包括用酯修饰的整合酶抑制剂，所述酯包含脂肪族基团或烃基基团(例如，包含约3个至约30个碳的脂肪族基团或烃基基团)。在特定的实施方案中，脂肪族基团或烃基基团是任选地被至少一个杂原子取代的脂肪酸的烃基链或饱和线性脂肪族链。在特定的实施方案中，整合酶抑制剂选自由以下组成的组：卡博特韦(CAB)、拉替拉韦(raltegravir)(RAL)、艾维雷韦(elvitegravir)(EVG)、多替拉韦(dolutegravir)(DTG)和比克替拉韦(bictegravir)(BIC)。本发明还包括一种组合物，所述组合物包含至少一种本发明的前药和至少一种药学上可接受的载体。
根据本发明的另一个方面，提供了一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含至少一种本发明的前药和至少一种聚合物或表面活性剂。在特定的实施方案中，前药是结晶的。在特定的实施方案中，聚合物或表面活性剂是两亲性嵌段共聚物，诸如包含至少一个聚(氧乙烯)嵌段和至少一个聚(氧丙烯)嵌段的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆407)。纳米颗粒可以包含连接至至少一种靶向配体的聚合物或表面活性剂。单独的纳米颗粒可以包含靶向的表面活性剂和未靶向的表面活性剂。在特定的实施方案中，纳米颗粒具有约100nm至1μm的直径。本发明还包括一种组合物，所述组合物包含至少一种本发明的纳米颗粒和至少一种药学上可接受的载体。
根据本发明的另一个方面，提供了用于治疗、抑制和/或预防有相应需要的受试者的疾病或紊乱的方法。该方法包括向受试者施用至少一种本发明的前药或纳米颗粒，该前药或纳米颗粒任选地在包含药学上可接受的载体的组合物中。在特定的实施方案中，疾病或紊乱是病毒感染(例如，逆转录病毒感染)。在特定的实施方案中，该方法还包括施用至少一种针对疾病或紊乱的另外的治疗剂或疗法，例如至少一种另外的抗HIV化合物。
附图简述
图1A提供了由扫描电子显微镜确定的NM2CAB(上)和NCAB(下)纳米颗粒的图像。图1B提供了在25℃在指定时间段内的NM2CAB纳米颗粒稳定性的图。特别地，纳米颗粒ζ电势(上)、多分散性指数(中)和颗粒直径(下)通过动态光散射确定。
图2A提供了通过UPLC-UV/Vis测量的由人类单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)进行的药物摄取的图(上)和由MDM并在指定的时间点收集用于细胞内药物分析的药物保留的图(下)。图2B提供了在指定的药物浓度的HIV-1逆转录酶活性的图(上)和在用药物处理并用HIV-1ADA攻击并在治疗后的指定的时间点测量的MDM中HIV-1逆转录酶活性的图(下)。图2C提供了攻击后p24染色的MDM细胞的图像。
图3A提供了在雌性NSG小鼠(NOD scidγ小鼠)中单次肌内(IM)剂量的NCAB、NMCAB或NM2CAB之后血浆CAB水平的图。施用的剂量是45mg CAB当量(eq)/kg。顶部粗体虚线指示664ng/ml的血浆CAB4×PA-IC90，并且底部点线示出166ng/ml的血浆CAB 1×PA-IC90。图3B提供了在雌性NSG小鼠(NOD scidγ小鼠)中单次肌内(IM)剂量的NM3CAB之后血浆CAB水平的图。施用的剂量是45mg CAB当量(eq)/kg。顶部粗体虚线指示664ng/ml的血浆CAB 4×PA-IC90，并且底部点划线示出166ng/ml的血浆CAB 1×PA-IC90。
图4提供了通过针对HIV-1p24抗原的免疫细胞化学在10μM、50μM或100μM浓度的NM2CAB的抗逆转录病毒剂量-应答的图像。
图5提供了前药水平的图。前药(MCAB或M2CAB)的组织和血液生物分布在单次IM注射NMCAB或NM2CAB之后的14天、28天、42天和364天进行评估。在脾、肝、肠、肺、脑、直肠组织、肾、***解剖相关组织和血液中测量前药水平。前药水平通过LC-MS/MS确定。数据被表示为平均值±SEM。对于第14天、第28天和第42天组，每组的动物数目是N＝5，并且对于第364天组，动物数目是N＝3(NMCAB)，N＝4(NM2CAB)。单因素ANOVA随后是Tukey事后检验用于比较三种处理的在组织中的药物水平(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图6A和图6B提供了NM2CAB在恒河猴中的药代动力学和生物分布的图。四只恒河猴通过单次IM注射被施用45mg/kg CAB当量剂量的NM2CAB。收集血浆样品，并且测定CAB(顶部线)和M2CAB(底部线)水平直至第393天(图6A)。直肠、***和脂肪组织活检在药物施用后第204天收集，并且测定CAB(顶部)和M2CAB(底部)浓度二者(图6B)。血浆药物浓度和组织药物浓度二者均通过LCMS/MS确定。
发明详述
最大程度地限制组织感染部位的病毒载量可以有助于病毒根除策略。这可以通过生成由表面活性剂稳定的有效的亲脂且疏水的抗逆转录病毒前药纳米晶体来实现。疏水性、药物水解速率和抗逆转录病毒效能必须平衡，以便获得最佳治疗效果。本文中，证明了对前药的疏水且亲脂的碳链长度的大小的操控可以优化治疗效力，特别是在长效缓慢有效释放抗逆转录病毒疗法(LASER ART)方面。LASER ART指的是一种由纳米晶体前药生成的具有脂质尾的长效抗逆转录病毒药物。肉豆蔻酰化的CAB前药纳米晶体在单次45mg/kg CAB当量肌内注射剂量之后，在恒河猴中提供处于PA-IC90的持续的血浆CAB浓度持续4个月。本文中，示出了进一步的化学修饰出乎意料地用于增强CAB亲脂性和疏水性，改善药物效能，并且减缓前药水解，从而广泛延长母体药物的半衰期。新型卡博特韦前药(M2CAB)用适当的赋形剂和稳定剂诸如泊洛沙姆407(P407)增强药物包封。M2CAB纳米制剂(NM2CAB)提供持续的药物释放和部位特异性抗逆转录病毒药物递送。前药包括经由可水解共价键与疏水性部分缀合的天然药物(native drug)。NM2CAB纳米制剂容易被人类单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)摄取，在体外具有持续30天的持续的药物保留；而母体药物纳米制剂(NCAB)或第一代肉豆蔻酰化的卡博特韦(NMCAB)分别在治疗的1天或20天内示出MDM中的HIV-1突破(breakthrough)。值得注意的是，在单次药物治疗之后，在HIV-1攻击持续长达30天后，用NM2CAB治疗的MDM呈现出持续的抗逆转录病毒活性。在NM2CAB治疗组中，在持续长达30天或超过30天的5天增量时间点处未检测到HIV-1p24。此外，在雌性NSG小鼠(NOD scidγ小鼠)中以45mg CAB当量/kg的NM2CAB的单次肌内(IM)注射展示出活性CAB的零级控制释放动力学，并且提供了处于或高于4倍PA-IC90的药物水平持续超过5个月。本文提出的NM2CAB纳米制剂通过减少药丸负担、降低病毒反弹的风险、限制毒性和/或允许药物渗透到病毒储库中，改善了目前需要每日多次施用的联合ART方案。重要的是，NM2CAB还有助于每六个月一次(或甚至更低频率)的给药间隔，以使暴露前预防或治疗方案的有效性最大化。
长效缓慢有效释放ART(LASER ART)制剂可以延长给药间隔，降低全身毒性，并且改善药代动力学(PK)和药效动力学(PD)概况(Sillman等人,Nat.Commun.(2018)9:443；Zhou等人,Biomaterials(2018)151:53-65；McMillan等人,Antimicrob.AgentsChemother.(2018)62:e01316-17)。本文中，提供了新型整合酶抑制剂前药、其长效缓慢有效释放制剂以及其合成方法和用途。整合酶抑制剂(整合酶链转移抑制剂(INSTI))是一类被设计为阻断整合酶(例如，HIV整合酶)的作用的抗逆转录病毒药物，整合酶是一种将病毒基因组***到宿主细胞的DNA的病毒酶。整合酶抑制剂的实例包括但不限于卡博特韦(CAB，GSK1265744)、拉替拉韦(RAL)、艾维雷韦(EVG)、多替拉韦(DTG，GSK1349572)、比克替拉韦(BIC，GS-9883)、BI 224436(Boehringer Ingelheim,Ingelheim,Germany)和MK-2048(Merck,Kenilworth,NJ)。与母体整合酶抑制剂相比，疏水且亲脂的前药及其缓慢有效释放制剂呈现出增强的效能和效力、增加的细胞和组织穿透以及延长的半衰期。本发明的前药及其制剂及其组合可以用于管理病毒(例如，逆转录病毒)感染。
目前可用的病毒感染特别是HIV感染的治疗包括病毒进入、核苷逆转录酶、核苷酸逆转录酶、整合酶和蛋白酶的抑制剂。抗性与缩短的药物半衰期、病毒生命周期和导致高遗传变异性的快速突变有关。被认为是“鸡尾酒”疗法的联合疗法，例如抗逆转录病毒疗法(ART)，已经获得了大量的关注。益处包括降低的病毒抗性，有限的毒性，对治疗方案的改善的依从性和持续的抗逆转录病毒效力。联合疗法通过抑制病毒(例如，HIV)复制，从而减少自发的抗性突变体，来使潜在的耐药性最小化。治疗失败部分地归因于短的药物半衰期。此外，失败也可以部分地归因于药物进入组织和细胞病毒储库受限，从而阻碍了病毒根除努力。为此，细胞和组织靶向的纳米配制的前药(纳米颗粒)平台的开发在病毒(例如，HIV)感染的管理中引起了极大的兴趣。暴露前预防(PrEP)是用于管理病毒(例如，HIV)传播的另一种策略。例如，
Figure GDA0003305758360000071
(替诺福韦(tenofovir)/恩曲他滨(emtricitabine))已经被批准用于暴露前预防HIV感染。此外，拉米夫定(lamivudine)和齐多夫定(zidovudine)的组合
Figure GDA0003305758360000072
已经被用作暴露前预防和暴露后预防。
本文提供的前药和纳米配制的前药(纳米颗粒)出乎意料地延长了药物半衰期，增加了疏水性和亲脂性，并且改善了抗逆转录病毒效力。这将有益于必须每天接受高剂量或甚至一天接受若干个剂量的人群，因为较低剂量和较低给药频率不仅减少副作用，而且对患者是方便的。本文提供的前药和纳米配制的前药(纳米颗粒)也可以用作暴露后治疗和/或暴露前预防(例如，对于处于感染HIV-1的高风险的人群而言)。换句话说，本发明的前药和纳米颗粒及其组合可以用于预防病毒感染(例如，HIV感染)和/或治疗或抑制急性或长期病毒感染(例如，HIV感染)。虽然本发明的前药和纳米颗粒通常被描述为抗HIV剂，但本发明的前药和纳米制剂针对其他病毒感染也是有效的，所述其他病毒感染包括但不限于：逆转录病毒(例如，慢病毒)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人类T细胞白血病病毒(HTLV)，特别是逆转录病毒。
本发明描述了新颖的、有效的、广谱的前药，其具有相对于母体药物改善的生物活性。还提供了用于将前药包封成长效缓慢有效制剂的方法，用于有效的细胞内和组织递送以及延长的药物半衰期。本文描述的长效缓慢有效释放(LASER)组合物呈现出增强的效能，并且可以用作针对病毒感染(例如，逆转录病毒感染)的有效的治疗性干预或预防性干预。
本发明的前药允许整合酶抑制剂的有效细胞内递送。本文中，提供了前药，该前药是整合酶抑制剂的衍生物，其中化学部分，特别是含氧部分诸如羟基基团，已经被替换为包含疏水且亲脂的可裂解部分(例如，治疗性脂肪醇)的酯部分。疏水且亲脂的可裂解部分(例如，治疗性脂肪醇)可以呈现出针对包膜病毒的抗病毒活性(Katz等人,Ann.NY Acad.Sci.(1994)724:472-88)。值得注意的是，治疗性脂肪醇和核苷类似物之间的协同相互作用可以显著增强核苷的抗病毒效能(Marcelletti等人,Antiviral Res.(2002)56:153-66)。
如本文描述的，前药可以包含不稳定的治疗性脂肪醇，以改善药物效能，加速细胞内和组织穿透性、蛋白质结合和生物利用度。合成的前药的疏水性质有助于包封成具有改善的生物制药特征的长效缓慢释放药物纳米晶体。本发明的纳米制剂可以包含分散在无菌含水悬浮液中并且由聚合物赋形剂、脂质和/或表面活性剂或聚合物稳定的前药颗粒。不受理论束缚，药物释放的机制包括前药从纳米颗粒中溶解，随后有效裂解以生成两种生物活性剂，即整合酶抑制剂和广谱抗病毒脂肪醇。
本文描述的***的益处包括但不限于改善的药物效能、生物利用度和延长的半衰期以方便患者。事实上，本发明中描述的纳米制剂显示出显著增加的被单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)的药物摄取。此外，修饰的药物和纳米颗粒通过增加的和延长的对病毒复制的抑制而呈现出增强的效能。因此，本发明的纳米制剂允许增强抗病毒效能和向感染的解剖储库的加速的药物递送。
根据本发明，提供了整合酶抑制剂的前药。在特定的实施方案中，前药包括整合酶抑制剂，其中化学部分诸如羟基基团被替换为包含任选地被取代的脂肪族基团或烃基基团的酯。在特定的实施方案中，酯包含烃链，特别是长度为16个-20个碳原子或长度为18个碳原子的烃链(此处的编号包括酯的C＝O中的碳)。
在特定的实施方案中，整合酶抑制剂选自由以下组成的组：卡博特韦(CAB)、拉替拉韦(RAL)、艾维雷韦(EVG)、多替拉韦(DTG)、比克替拉韦(BIC)、BI 224436和MK-2048。在特定的实施方案中，整合酶抑制剂选自由以下组成的组：卡博特韦(CAB)、拉替拉韦(RAL)、艾维雷韦(EVG)、多替拉韦(DTG)和比克替拉韦(BIC)。这些整合酶抑制剂的化学结构的实例是：
Figure GDA0003305758360000091
Figure GDA0003305758360000101
在特定的实施方案中，本发明的前药选自以下组或其药学上可接受的盐：
Figure GDA0003305758360000111
Figure GDA0003305758360000121
其中R是任选地被取代的脂肪族基团或烃基基团。脂肪族基团或烃基基团可以是不饱和的或饱和的，并且可以被至少一个杂原子(例如，O、N或S)取代。在特定的实施方案中，R可以包含可以被至少一个杂原子(例如，O、N或S)取代的芳香族部分。
在特定的实施方案中，烃基基团或脂肪族基团是疏水性的。在特定的实施方案中，R是任选地被取代的烃链，特别地是饱和的。在特定的实施方案中，R是饱和的线性脂肪族链。在特定的实施方案中，烃基基团或脂肪族基团包含约3个至约30个碳(例如，在烃基基团或脂肪族基团的主链中)，该烃基基团或脂肪族基团可以被至少一个杂原子(例如，O、N或S)取代。在特定的实施方案中，R是C14-C21不饱和或饱和的烃基基团或脂肪族基团，该烃基基团或脂肪族基团可以被至少一个杂原子(例如，O、N或S)取代。在特定的实施方案中，R是C14-C19不饱和或饱和的烃基基团或脂肪族基团，该烃基基团或脂肪族基团可以被至少一个杂原子(例如，O、N或S)取代。在特定的实施方案中，R是C14-C17不饱和或饱和的烃基基团或脂肪族基团，该烃基基团或脂肪族基团可以被至少一个杂原子(例如，O、N或S)取代。在特定的实施方案中，R是C15-C21不饱和或饱和的烃基基团或脂肪族基团，该烃基基团或脂肪族基团可以被至少一个杂原子(例如，O、N或S)取代。在特定的实施方案中，R是C15-C19不饱和或饱和的烃基基团或脂肪族基团，该烃基基团或脂肪族基团可以被至少一个杂原子(例如，O、N或S)取代。在特定的实施方案中，R是C15-C17不饱和或饱和的烃基基团或脂肪族基团，该烃基基团或脂肪族基团可以被至少一个杂原子(例如，O、N或S)取代。在特定的实施方案中，R是C16-C21不饱和或饱和的烃基基团或脂肪族基团，该烃基基团或脂肪族基团可以被至少一个杂原子(例如，O、N或S)取代。在特定的实施方案中，R是C16-C19不饱和或饱和的烃基基团或脂肪族基团，该烃基基团或脂肪族基团可以被至少一个杂原子(例如，O、N或S)取代。在特定的实施方案中，R是C17-C21不饱和或饱和的烃基基团或脂肪族基团，该烃基基团或脂肪族基团可以被至少一个杂原子(例如，O、N或S)取代。在特定的实施方案中，R是C17-C19不饱和或饱和的烃基基团或脂肪族基团，该烃基基团或脂肪族基团可以被至少一个杂原子(例如，O、N或S)取代。在特定的实施方案中，R是C17不饱和或饱和的烃基基团或脂肪族基团，该烃基基团或脂肪族基团可以被至少一个杂原子(例如，O、N或S)取代。
在特定的实施方案中，R是脂肪酸(饱和或不饱和)的烃基链，特别是C16-C22脂肪酸、C16-C20脂肪酸、C16-C18脂肪酸、C18-C22脂肪酸、C18-C20脂肪酸或C18脂肪酸(此处的编号包括脂肪酸的C＝O中的碳)的烃基链。
在特定的实施方案中，R是至少14个碳的饱和的线性脂肪族链或烃链(例如，链中长度为14个至21个碳，链中长度为14个至19个碳，链中长度为14个至17个碳，链中长度为15个至21个碳，链中长度为15个至19个碳，链中长度为15个至17个碳，或链中长度为17个碳)。在特定的实施方案中，R是长度为14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个碳的饱和的线性脂肪族链或烃链，特别是长度为14个、15个、16个、17个、18个或19个碳，长度为15个、16个或17个碳，或长度为17个碳。在特定的实施方案中，R是长度为17个碳的饱和的线性脂肪族链或烃链。
在特定的实施方案中，本发明的前药是：
Figure GDA0003305758360000131
(M2CAB)或其药学上可接受的盐。
本发明还包括包含本发明的前药的纳米颗粒(在本文中有时被称为纳米制剂)。纳米颗粒可以用于向细胞或宿主递送化合物(例如，体外或体内)。在特定的实施方案中，纳米颗粒用于向受试者递送抗逆转录病毒疗法。本发明的纳米颗粒包含至少一种前药和至少一种表面活性剂或聚合物。在特定的实施方案中，纳米颗粒包含维持药物纳米颗粒的最佳靶向以维持巨噬细胞贮库的光谱学确定的表面活性剂/聚合物：药物比。纳米颗粒的这些组分连同其他任选的组分在下文描述。
合成本发明的纳米颗粒的方法是本领域已知的。在特定的实施方案中，该方法生成包含用聚合物和/或表面活性剂(部分地或完全地)包被的前药(例如，结晶的或无定形的前药)的纳米颗粒。合成方法的实例包括但不限于碾磨(例如，湿法碾磨)、均质化(例如，高压均质化)、在非浸润模板中的颗粒复制(particle replication in nonwettingtemplate)(PRINT)技术和/或超声技术。例如，美国专利申请公布第2013/0236553号(通过引用并入本文)提供了适合用于合成本发明的纳米颗粒的方法。在特定的实施方案中，聚合物或表面活性剂首先用靶向配体进行化学修饰，并且然后直接使用或与未靶向的聚合物或表面活性剂以一定的摩尔比混合，以包被在前药悬浮剂的表面上，例如，通过使用纳米颗粒合成工艺(例如，结晶纳米颗粒合成工艺)，诸如碾磨(例如，湿法碾磨)、均质化(例如，高压均质化)、在非浸润模板中的颗粒复制(PRINT)技术和/或超声技术，从而制备靶向纳米制剂。纳米颗粒可以在进一步纯化或不进一步纯化的情况下使用，尽管为了更快地生产纳米颗粒，避免进一步纯化是合意的。在特定的实施方案中，使用碾磨和/或均质化来合成纳米颗粒。靶向纳米颗粒(例如，使用配体(任选地具有高分子量的配体))可以通过在聚合物或表面活性剂和/或药物纳米悬浮剂的表面上物理地或化学地包被和/或结合来开发。
在特定的实施方案中，本发明的纳米颗粒是通过将前药(例如，晶体)添加至聚合物或表面活性剂溶液中，并且然后生成纳米颗粒(例如，通过湿法碾磨或高压均质化)来合成的。前药和聚合物或表面活性剂溶液可以在湿法碾磨或高压均质化之前搅拌。
本发明的纳米颗粒可以用于向细胞或受试者(包括非人类动物)递送本发明的至少一种前药。本发明的纳米颗粒还可以包含至少一种其他剂或化合物，特别是生物活性剂，特别是治疗剂(例如，抗病毒化合物)或诊断剂，特别是至少一种抗病毒剂或抗逆转录病毒剂。在特定的实施方案中，本发明的纳米颗粒包含至少两种治疗剂，特别是其中至少一种是本发明的前药。例如，纳米颗粒可以包含本发明的整合酶抑制剂前药和至少一种其他治疗剂(例如，抗HIV剂)。
在特定的实施方案中，本发明的纳米颗粒是由聚合物或表面活性剂稳定的纳米尺寸的(nanosized)前药晶体(例如，表面活性剂包被的药物晶体；纳米制剂)的亚微米胶体分散体。在特定的实施方案中，前药可以是结晶的(具有晶体特性的固体)、无定形的，或者是形成为包括药物和聚合物或表面活性剂的晶体的前药的固态纳米颗粒。在特定的实施方案中，前药是结晶的。如本文使用的，术语“结晶”指的是有序状态(即，非无定形的)和/或在三维空间中呈现出长程有序的物质。在特定的实施方案中，大部分(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)的前药和任选地表面活性剂的疏水性部分是结晶的。
在特定的实施方案中，本发明的纳米颗粒的直径(例如z平均直径)或其最长尺寸高达约2μm或3μm，特别是高达约1μm(例如，约100nm至约1μm)。例如，纳米颗粒的直径或最长尺寸可以是约50nm至约800nm。在特定的实施方案中，纳米颗粒的直径或最长尺寸是约50nm至约750nm、约50nm至约500nm、约200nm至约500nm、约200nm至约400nm或约250nm至约350nm。纳米颗粒可以是例如杆状、细长杆状、不规则形状或圆形。本发明的纳米颗粒可以是中性的或带电的。纳米颗粒可以带正电荷或带负电荷。
如上文陈述的，本发明的纳米颗粒包含至少一种聚合物或表面活性剂。“表面活性剂(surfactant)”指的是表面活性剂(surface-active agent)，包括通常被称为润湿剂、洗涤剂、分散剂或乳化剂的物质。表面活性剂通常是为两亲性的有机化合物。
聚合物或表面活性剂的实例包括但不限于合成或天然的磷脂、PEG化的脂质(例如，PEG化的磷脂)、脂质衍生物、聚山梨酯、两亲性共聚物、两亲性嵌段共聚物、聚(乙二醇)-共-聚(丙交酯-共-乙交酯)(PEG-PLGA)、它们的衍生物、配体缀合衍生物及其组合。在本发明中可以使用能够形成稳定的纳米悬浮剂和/或能够化学上/物理上结合至可感染/已感染HIV的CD4+T细胞、巨噬细胞和树突状细胞的靶向配体的其他聚合物或表面活性剂及其组合。聚合物或表面活性剂的另外的实例包括但不限于：1)非离子型表面活性剂(例如，聚乙二醇化的和/或多糖缀合的聚酯和其他疏水性聚合物嵌段，诸如聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、其他聚酯、聚(环氧丙烷)、聚(1,2-环氧丁烷)、聚(环氧正丁烷)、聚(四氢呋喃)和聚(苯乙烯)；甘油酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、脱水山梨醇酯、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、聚丙二醇、鲸蜡醇、鲸蜡硬脂醇、硬脂醇、芳基烷基聚醚醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、泊洛沙胺(poloxamine)、纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、多糖、淀粉及其衍生物、羟乙基淀粉、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮及其组合)；和2)离子型表面活性剂(例如，磷脂、两亲性脂质、1,2-二烷基甘油-3-烷基磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-羧基(聚乙二醇)(DSPE-PEG)、二甲基氨基乙烷氨基甲酰基胆固醇(DC-Chol)、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTAP)、烷基吡啶鎓卤化物、季铵化合物、月桂基二甲基苄基铵、酰基肉碱盐酸盐、双十八烷基二甲基铵(DDAB)、正辛胺、油胺、苄烷铵(benzalkonium)、鲸蜡基三甲基铵、壳聚糖、壳聚糖盐、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)和聚(烯丙基胺)(PAH)、聚(二甲基二烯丙基氯化铵)(PDDA)、烷基磺酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、月桂酸钾、三乙醇胺硬脂酸酯、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯硫酸盐、海藻酸、海藻酸盐、透明质酸、透明质酸盐、明胶、琥珀辛酯磺酸钠(dioctyl sodiumsulfosuccinate)、羧甲基纤维素钠、硫酸纤维素、硫酸葡聚糖和羧甲基纤维素、硫酸软骨素、肝素、合成的聚(丙烯酸)(PAA)、聚(甲基丙烯酸)(PMA)、聚(硫酸乙烯酯)(PVS)、聚(苯乙烯磺酸盐)(PSS)、胆汁酸及其盐、胆酸、脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨脱氧胆酸、其衍生物及其组合)。
本发明的聚合物或表面活性剂可以是带电荷的或中性的。在特定的实施方案中，聚合物或表面活性剂是中性的或带负电荷的(例如，泊洛沙姆、聚山梨酯、磷脂及其衍生物)。
在特定的实施方案中，聚合物或表面活性剂是两亲性嵌段共聚物或脂质衍生物。在特定的实施方案中，纳米颗粒的至少一种聚合物或表面活性剂是两亲性嵌段共聚物，特别是包含至少一个聚(氧乙烯)嵌段和至少一个聚(氧丙烯)嵌段的共聚物。在特定的实施方案中，聚合物或表面活性剂是三嵌段两亲性嵌段共聚物。在特定的实施方案中，聚合物或表面活性剂是包含以下的三嵌段两亲性嵌段共聚物：聚丙二醇的中心疏水性嵌段，侧接两个聚乙二醇的亲水性嵌段。在特定的实施方案中，表面活性剂是泊洛沙姆407。
在特定的实施方案中，两亲性嵌段共聚物是包含至少一个聚(氧乙烯)嵌段和至少一个聚(氧丙烯)嵌段的共聚物。在特定的实施方案中，两亲性嵌段共聚物是泊洛沙姆。泊洛沙姆的实例包括但不限于
Figure GDA0003305758360000172
L31、L35、F38、L42、L43、L44、L61、L62、L63、L64、P65、F68、L72、P75、F77、L81、P84、P85、F87、F88、L92、F98、L101、P103、P104、P105、F108、L121、L122、L123、F127、10R5、10R8、12R3、17R1、17R2、17R4、17R8、22R4、25R1、25R2、25R4、25R5、25R8、31R1、31R2和31R4。在特定的实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆407
Figure GDA0003305758360000171
在本发明的特定的实施方案中，聚合物或表面活性剂以按重量计从约0.0001％至约10％或15％的范围内的浓度存在于纳米颗粒和/或溶液中以合成纳米颗粒(如本文描述的)。在特定的实施方案中，聚合物或表面活性剂的浓度在按重量计从约0.01％至约15％，约0.01％至约10％，约0.1％至约10％，或约0.1％至约6％的范围内。在特定的实施方案中，纳米颗粒包含按重量计至少约50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高的治疗剂(前药)。在特定的实施方案中，纳米颗粒包含确定的药物：聚合物/表面活性剂比。在特定的实施方案中，药物：聚合物/表面活性剂比(例如，以重量计)是从约10:6至约1000:6、约20:6至约500:6、约50:6至约200:6或约100:6。
如上文陈述的，本发明的聚合物或表面活性剂可以连接至靶向配体。与游离药物或未靶向的纳米颗粒相比，纳米颗粒的靶向(例如，靶向巨噬细胞)可以提供优秀的靶向、降低的***速率、降低的毒性和延长的半衰期。靶向配体是特异性结合特定类型的组织或细胞类型(例如，以期望的靶：细胞比结合)的化合物。例如，靶向配体可以用于接合或结合靶细胞(例如，巨噬细胞)表面标志物或受体，这可以有助于靶向配体被摄入到细胞中(例如，在不受代谢降解影响的受保护的亚细胞器内)。在特定的实施方案中，靶向配体是细胞表面标志物/受体的配体。靶向配体可以是对于细胞表面标志物(例如，蛋白质或碳水化合物)免疫特异性的抗体或其抗原结合片段，该细胞表面标志物优先地或排他地在被靶向的组织或细胞类型上表达。靶向配体可以直接或经由连接基连接至聚合物或表面活性剂。通常，连接基是包含将配体共价附接至聚合物或表面活性剂的共价键或原子链的化学部分。连接基可以连接至配体和聚合物或表面活性剂的任何合成上可行的位置。示例性的连接基可以包含至少一个任选地被取代的；饱和或不饱和的；线性、支链或环状的脂肪族基团、烃基基团或任选地被取代的芳基基团。连接基可以是低级烃基基团或脂肪族基团。连接基也可以是多肽(例如，从约1个至约10个氨基酸，特别是约1个至约5个氨基酸)。在特定的实施方案中，靶向部分连接至聚合物或表面活性剂的一端或两端。连接基可以是不可降解的，并且可以是在生理环境或条件下大体上不能被裂解或完全不能被裂解的共价键或任何其他化学结构。
本发明的纳米颗粒/纳米制剂可以包含靶向的和/或未靶向的聚合物或表面活性剂。在特定的实施方案中，本发明的纳米颗粒/纳米制剂中的靶向的和未靶向的聚合物或表面活性剂的摩尔比率是从约0.001％至100％、约1％至约99％、约5％至约95％、约10％至约90％、约25％至约75％、约30％至约60％或约40％。在特定的实施方案中，纳米颗粒仅包含靶向的聚合物或表面活性剂。在特定的实施方案中，本发明的纳米颗粒/纳米制剂包含叶酸靶向的聚合物或表面活性剂以及该聚合物或表面活性剂的未靶向的形式。在特定的实施方案中，本发明的纳米颗粒/纳米制剂包含叶酸-泊洛沙姆407(FA-P407)和/或泊洛沙姆407。
靶向配体的实例包括但不限于巨噬细胞靶向配体、CD4+T细胞靶向配体、树突状细胞靶向配体和肿瘤靶向配体。在特定的实施方案中，靶向配体是巨噬细胞靶向配体。本发明的靶向的纳米制剂可以包含用于将纳米颗粒导向HIV组织和细胞保护区(sanctuaries)/储库(例如，中枢神经***、肠相关淋巴组织(GALT)、CD4+T细胞、巨噬细胞、树突状细胞等)的靶向配体。巨噬细胞靶向配体包括但不限于叶酸受体配体(例如，叶酸(folate)(叶酸(folic acid))和叶酸受体抗体及其片段(参见例如Sudimack等人(2000)Adv.DrugDel.Rev.,41:147-162))、甘露糖受体配体(例如，甘露糖)、甲酰肽受体(FPR)配体(例如N-甲酰基-Met-Leu-Phe(fMLF))和促吞噬肽(tuftsin)(四肽Thr-Lys-Pro-Arg)。其他靶向配体包括但不限于透明质酸、gp120及其肽片段，以及对CD4、CCR5、CXCR4、CD7、CD111、CD204、CD49a、CD29、CD19、CD20、CD22、CD171、CD33、Leis-Y、WT-1、ROR1、MUC16、MUC1、MUC4、***受体、转铁蛋白受体、EGF受体(例如HER2)、叶酸受体、VEGF受体、FGF受体、雄激素受体、NGR、整合素和GD2特异性的配体或抗体。在特定的实施方案中，靶向配体是叶酸。
如上文陈述的，本发明的纳米颗粒可以包含另外的治疗剂。本发明还包括治疗方法，其中本发明的前药和/或纳米颗粒与另一种治疗剂共施用。在特定的实施方案中，治疗剂是疏水性的、水不溶性的化合物或水溶性差的化合物，特别是当包含在纳米颗粒中时。例如，在0-14的pH范围内，优选地在pH 4和pH 10之间，特别是在20℃，治疗剂在水或含水介质中可以具有小于约10mg/ml、小于1mg/ml、更特别地小于约100μg/ml、并且更特别地小于约25μg/ml的溶解度。
在特定的实施方案中，治疗剂是抗病毒剂或抗逆转录病毒剂。抗逆转录病毒剂可以对慢病毒有效或对慢病毒特异。慢病毒包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)(例如，HIV-1、HIV-2)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)和马传染性贫血病毒(EIA)。在特定的实施方案中，治疗剂是抗HIV剂。抗HIV化合物或抗HIV剂是抑制HIV(例如，抑制HIV复制和/或感染)的化合物。抗HIV剂的实例包括但不限于：
(I)核苷类似物逆转录酶抑制剂(NRTI)。NRTI指的是抑制逆转录酶特别是HIV-1逆转录酶的活性的核苷和核苷酸及其类似物。NRTI包含糖和碱基。核苷类似物逆转录酶抑制剂的实例包括但不限于阿德福韦酯(adefovir dipivoxil)、阿德福韦(adefovir)、拉米夫定、替比夫定(telbivudine)、恩替卡韦(entecavir)、替诺福韦、司他夫定(stavudine)、阿巴卡韦(abacavir)、去羟肌苷(didanosine)、恩曲他滨、扎西他滨(zalcitabine)和齐多夫定。
(II)非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)。NNRTI是变构抑制剂，其在逆转录酶特别是HIV逆转录酶的非底物结合位点处可逆地结合，从而改变活性位点的形状或阻断聚合酶活性。NNRTI的实例包括但不限于地拉韦啶(delavirdine)(DLV，BHAP，U-90152；
Figure GDA0003305758360000201
)、依非韦伦(efavirenz)(EFV，DMP-266，
Figure GDA0003305758360000202
)、奈韦拉平(nevirapine)(NVP，
Figure GDA0003305758360000203
)、PNU-142721、卡拉韦林(capravirine)(S-1153，AG-1549)、依米韦林(emivirine)(+)-calanolide A(NSC-675451)和B、依曲韦林(etravirine)(ETR，TMC-125，
Figure GDA0003305758360000204
)、利匹韦林(rilpivirine)(RPV，TMC278，EdurantTM)、DAPY(TMC120)、多拉韦林(doravirine)(PifeltroTM)、BILR-355BS、PHI-236和PHI-443(TMC-278)。
(III)蛋白酶抑制剂(PI)。蛋白酶抑制剂是病毒蛋白酶特别是HIV-1蛋白酶的抑制剂。蛋白酶抑制剂的实例包括但不限于达芦那韦(darunavir)、氨普那韦(amprenavir)(141W94，
Figure GDA0003305758360000205
)、tipranivir(PNU-140690，
Figure GDA0003305758360000206
)、茚地那韦(indinavir)(MK-639；
Figure GDA0003305758360000207
)、沙奎那韦(saquinavir)
Figure GDA0003305758360000208
呋山那韦(fosamprenavir)
Figure GDA0003305758360000209
洛匹那韦(lopinavir)(ABT-378)、利托那韦(ritonavir)(ABT-538，
Figure GDA00033057583600002010
)、阿扎那韦(atazanavir)
Figure GDA00033057583600002011
奈非那韦(nelfinavir)(AG-1343，
Figure GDA00033057583600002012
)、拉西那韦(lasinavir)(BMS-234475/CGP-61755)、BMS-2322623、GW-640385X(VX-385)、AG-001859和SM-309515。
(IV)融合或进入抑制剂。融合或进入抑制剂是阻断HIV进入细胞(例如，通过结合至HIV包膜蛋白并且阻断病毒与宿主细胞融合所必需的结构变化)的化合物，诸如肽。融合抑制剂的实例包括但不限于CCR5受体拮抗剂(例如，马拉韦罗(maraviroc)(
Figure GDA00033057583600002013
Celsentri))、恩夫韦肽(enfuvirtide)(INN，
Figure GDA00033057583600002014
)、T-20(DP-178，
Figure GDA00033057583600002015
)和T-1249。
(V)整合酶抑制剂(除了本发明的前药之外)。整合酶抑制剂是一类被设计为阻断整合酶(例如，HIV整合酶)的作用的抗逆转录病毒药物，整合酶是一种将病毒基因组***到宿主细胞的DNA的病毒酶。整合酶抑制剂的实例包括但不限于拉替拉韦、艾维雷韦、GSK1265744(卡博特韦)、GSK1349572(多替拉韦)、GS-9883(比克替拉韦)和MK-2048。
抗HIV化合物还包括成熟抑制剂(例如贝韦立马(bevirimat))。成熟抑制剂通常是在病毒的成熟期间结合HIV gag并且破坏其加工的化合物。抗HIV化合物还包括HIV疫苗，诸如但不限于
Figure GDA0003305758360000211
HIV(vCP1521)、
Figure GDA0003305758360000212
(gp120)及其组合。抗HIV化合物还包括HIV抗体(例如，针对gp120或gp41的抗体)，特别是广谱中和抗体。
可以使用多于一种的抗HIV剂，特别是当剂具有不同的作用机制时(如上文概述的)。例如，不是NNRTI的抗HIV剂可以与本发明的NNRTI前药组合。在特定的实施方案中，抗HIV疗法是高效抗逆转录病毒疗法(HAART)。
本发明包括一种组合物(例如，药物组合物)，所述组合物(例如，药物组合物)包含至少一种本发明的前药和/或纳米颗粒和至少一种药学上可接受的载体。如上文陈述的，纳米颗粒可以包含多于一种的治疗剂。在特定的实施方案中，药物组合物包含含有第一前药的第一纳米颗粒和含有第二前药的第二纳米颗粒，其中第一前药和第二前药不同。在特定的实施方案中，第一前药是本发明的前药，并且第二前药是非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)特别是利匹韦林(RPV)的前药。本发明的组合物(例如，药物组合物)还可以包含其他治疗剂(例如，其他抗HIV化合物(例如，本文描述的那些))。
本发明还包括用于预防、抑制和/或治疗疾病或紊乱的方法。该方法包括向有相应需要的受试者施用本发明的前药和/或纳米颗粒(任选地在组合物中)。在特定的实施方案中，疾病或紊乱是病毒(例如，逆转录病毒)感染。病毒感染的实例包括但不限于：HIV、乙型肝炎、丙型肝炎和HTLV。在特定的实施方案中，病毒感染是逆转录病毒感染或慢病毒感染，特别是HIV感染(例如，HIV-1)。
本发明的前药和/或纳米颗粒(任选地在组合物中)可以被施用至动物，特别是哺乳动物，更特别地人类，以便治疗/抑制/预防疾病或紊乱(例如，逆转录病毒感染诸如HIV感染)。本发明的药物组合物还可以包含至少一种其他治疗剂，诸如抗病毒剂，特别是至少一种其他抗HIV化合物/剂。另外的抗HIV化合物也可以在与本发明的前药或组合物分开的药物组合物中被施用。药物组合物可以在相同时间或在不同时间(例如，依次地)被施用。
本发明的前药、纳米颗粒和/或组合物的施用的剂量范围是大至足以产生期望效果(例如，治愈、缓解、治疗和/或预防疾病或紊乱(例如，HIV感染)、其症状(例如，AIDS、ARC)或对其的易感性)的那些剂量范围。在特定的实施方案中，本发明的药物组合物以从约5μg/kg至约500mg/kg的量被施用至受试者。在特定的实施方案中，本发明的药物组合物以大于约5μg/kg、大于约50μg/kg、大于约0.1mg/kg、大于约0.5mg/kg、大于约1mg/kg或大于约5mg/kg的量被施用至受试者。在特定的实施方案中，本发明的药物组合物以从约0.5mg/kg至约100mg/kg、约10mg/kg至约100mg/kg或约15mg/kg至约50mg/kg的量被施用至受试者。剂量不应大至引起明显的不利的副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随着患者的年龄、状况、性别和疾病程度而变化，并且可以由本领域技术人员确定。在出现任何禁忌症(counter indication)的情况下，剂量可以由单独的医生调节。
本文描述的前药和纳米颗粒通常将作为药物组合物被施用至患者。如本文使用的术语“患者”指的是人类或动物受试者。这些前药和纳米颗粒可以在医生的指导下在治疗上使用。
包含本发明的前药和/或纳米颗粒的药物组合物可以方便地与任何药学上可接受的载体一起配制用于施用。例如，复合物可以用可接受的介质配制，可接受的介质诸如水、缓冲盐水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、二甲基亚砜(DMSO)、油、洗涤剂、悬浮剂或其合适的混合物，特别是水溶液。前药和/或纳米颗粒在所选择的介质中的浓度可以变化，并且可以基于药物组合物的期望的施用途径来选择介质。除了任何常规介质或剂与待施用的纳米颗粒不相容之外，预期了纳米颗粒在药物组合物中的用途。
适合用于施用至特定的患者的根据本发明的前药和/或纳米颗粒的剂量和剂量方案可以由医师考虑患者的年龄、性别、体重、一般医学状况、以及纳米颗粒被施用的具体状况及其严重程度来确定。医师也可以考虑施用途径、药学载体和纳米颗粒的生物活性。
合适的药物组合物的选择也将取决于所选择的施用方式。例如，本发明的纳米颗粒可以通过直接注射施用或静脉内施用。在这种情况下，药物组合物包含分散在与注射部位相容的介质中的前药和/或纳米颗粒。
本发明的前药和/或纳米颗粒可以通过任何方法施用。例如，本发明的前药和/或纳米颗粒可以不限于肠胃外、皮下、口服、局部、肺部、经直肠、经***、静脉内、腹膜内、鞘内、脑内、硬膜外、肌内、皮内或颈动脉内施用。在特定的实施方案中，前药和/或纳米颗粒被肠胃外施用。在特定的实施方案中，前药和/或纳米颗粒被口服、肌内、皮下施用或被施用到血流(例如，静脉内施用)。在特定的实施方案中，前药和/或纳米颗粒被肌内或皮下施用。注射用药物组合物是本领域已知的。如果选择注射作为用于施用前药和/或纳米颗粒的方法，则必须采取措施以确保足够量的分子或细胞到达其靶细胞以发挥生物效应。用于口服施用的剂型包括但不限于片剂(例如，包衣和未包衣的、可咀嚼的)、明胶胶囊(例如，软或硬明胶胶囊)、锭剂、糖锭剂、溶液、乳液、悬浮剂、糖浆、酏剂、粉末/颗粒(例如，可重构的或可分散的粉末/颗粒)、树胶和泡腾片剂。用于肠胃外施用的剂型包括但不限于溶液、乳液、悬浮剂、分散体和用于重构的粉末/颗粒。用于局部施用的剂型包括但不限于乳膏、凝胶、软膏、药膏、贴剂和经皮递送***。
含有与药学上可接受的载体紧密混合的作为活性成分的本发明的前药和/或纳米颗粒的药物组合物可以根据常规药物配制技术制备。取决于施用(例如，静脉内、口服、直接注射、颅内和玻璃体内)所期望的药物组合物的形式，载体可以采取多种形式。
本发明的药物组合物可以被配制成易于施用和剂量均匀性的剂量单位形式。如本文使用的剂量单位形式指的是适合于经历治疗的患者的药物组合物的物理离散的单位。每个剂量应包含一定量的活性成分，该一定量的活性成分被计算产生与所选择的药学载体相关的期望的效果。用于确定合适的剂量单位的程序是本领域技术人员熟知的。在特定的实施方案中，本发明的前药和/或纳米颗粒，由于其长效治疗效果，可以每1至12个月被施用一次或甚至更低频率地被施用。例如，本发明的纳米制剂可以每0.5个月、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月或更多个月被施用一次。在特定的实施方案中，本发明的前药和/或纳米颗粒少于每两个月被施用一次。在特定的实施方案中，前药和/或前药的纳米制剂每月一次、每两个月一次、特别地每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、每七个月一次、每八个月一次、每九个月一次、每十个月一次、每十一个月一次、每十二个月一次地被施用或更低频率地被施用。
剂量单位可以基于患者的体重按比例地增加或减少。如本领域已知的，用于减轻特定病理学状况的合适的浓度可以通过剂量浓度曲线计算来确定。
根据本发明，可以通过在动物模型中评价分子或细胞的毒性来确定用于施用纳米颗粒的合适的剂量单位。多种浓度的药物组合物中的纳米颗粒可以被施用至小鼠，并且最小剂量和最大剂量可以基于作为治疗结果观察到的有益结果和副作用来确定。合适的剂量单位也可以通过评估与其他标准药物组合的纳米颗粒治疗的效力来确定。纳米颗粒的剂量单位可以根据检测到的效果单独地确定或与每次治疗组合确定。
包含纳米颗粒的药物组合物可以以合适的间隔被施用，直到病理学症状减少或减轻，之后可以将剂量降低至维持水平。在特定情况下的合适的间隔通常将取决于患者的状况。
本发明包括治疗疾病/紊乱的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用药物组合物，该药物组合物包含本发明的前药和/或纳米颗粒，以及优选地至少一种药学上可接受的载体。本发明还包括其中受试者经由离体疗法治疗的方法。特别地，该方法包括从受试者取出细胞，使细胞在体外暴露于/接触本发明的纳米颗粒，以及使细胞返回至受试者。在特定的实施方案中，细胞包括巨噬细胞。治疗疾病或紊乱的其他方法可以与本发明的方法组合，或可以与本发明的药物组合物共施用。
本发明还包括在体外(例如，在培养物中)将本发明的纳米颗粒递送至细胞。纳米颗粒可以在至少一种载体中递送至细胞。
定义
提供以下定义以有助于理解本发明。
除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”、和“所述(the)”包括复数指示物。
“药学上可接受的”指示被联邦或州政府的管理机构所批准或在美国药典或其他一般公认的药典中列出用于在动物中并且更特别地在人类中使用。
“载体”指的是例如稀释剂、佐剂、防腐剂(例如硫柳汞、苄醇)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、增溶剂(例如聚山梨酯80)、乳化剂、缓冲剂(例如Tris HCl、乙酸盐、磷酸盐)、抗微生物剂、填充物质(例如乳糖、甘露糖醇)、赋形剂、助剂或与本发明活性剂一起施用的媒介物。药学上可接受的载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油。水或含水盐溶液以及含水右旋糖和甘油溶液优选地被用作载体，特别是用于可注射溶液。合适的药学载体在以下中被描述：E.W.Martin的“Remington'sPharmaceutical Sciences”(Mack Publishing Co.,Easton,PA)；Gennaro,A.R.,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,(Lippincott,Williams andWilkins)；Liberman等人编辑,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.；以及Kibbe等人编辑,Handbook of Pharmaceutical Excipients,AmericanPharmaceutical Association,Washington。
术语“前药”指的是通常在施用之后被代谢或以其他方式转化为生物活性或更具活性的化合物或药物的化合物。相对于药物而言，前药以使前药相对于药物活性更低、基本上无活性或无活性的方式被化学修饰。然而，化学修饰使得对应的药物通过代谢过程或其他生物过程产生，通常是在施用前药之后。
如本文使用的术语“治疗”指的是赋予罹患疾病的患者益处的任何类型的治疗，包括改善患者的状况(例如，一种或更多种症状)、延迟状况的进展等。在特定的实施方案中，治疗逆转录病毒感染导致至少抑制/降低感染细胞的数目和/或可检测的病毒水平。
如本文使用的，术语“预防”指的是对处于发展状况(例如，HIV感染)的风险的受试者的预防性治疗，导致受试者将发展状况的可能性降低。
化合物或药物组合物的“治疗有效量”指的是有效预防、抑制、治疗或减轻特定的紊乱或疾病的症状的量。本文中治疗微生物感染(例如，HIV感染)可以指的是治愈、缓解和/或预防微生物感染、其症状或对其的易感性。
如本文使用的，术语“治疗剂”指的是可以用于治疗状况、疾病或紊乱或者减少状况、疾病或紊乱的症状的化学化合物或生物分子，包括但不限于核酸、肽、蛋白质和抗体。
如本文使用的，术语“小分子”指的是具有相对低的分子量(例如，小于4,000，小于2,000，特别是小于1kDa或800Da)的物质或化合物。通常，小分子是有机的，但不是蛋白质、多肽或核酸，尽管它们可以是氨基酸或二肽。
如本文使用的术语“抗微生物剂”指示杀死微生物诸如细菌、真菌、病毒或原生动物或抑制其生长的物质。
如本文使用的，术语“抗病毒剂”指的是破坏病毒和/或抑制病毒的复制(繁殖)的物质。例如，抗病毒剂可以抑制和/或防止：病毒颗粒的产生、病毒颗粒的成熟、病毒附着、病毒被摄入到细胞中、病毒组装、病毒释放/出芽、病毒整合等。
如本文使用的，术语“高效抗逆转录病毒疗法”(HAART)指的是采用多种治疗剂的组合的HIV疗法，所述治疗剂诸如核苷逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂和融合抑制剂。
如本文使用的，术语“两亲性”意指在水和脂质/非极性环境中均溶解的能力。通常，两亲性化合物包含亲水性部分和疏水性部分。“疏水性”指示对非极性环境的偏好(例如，疏水性物质或疏水性部分相比水更容易溶解在非极性溶剂中或被非极性溶剂润湿，非极性溶剂诸如烃)。“疏水性”化合物大部分不溶于水。如本文使用的，术语“亲水性”意指在水中溶解的能力。
如本文使用的，术语“聚合物”表示由两个或更多个重复单元或单体的化学结合形成的分子。术语“嵌段共聚物”最简单地是指至少两种不同的聚合物链段(segement)的缀合物，其中每种聚合物链段包含相同类型的两个或更多个相邻单元。
“抗体”或“抗体分子”是结合至特定抗原的任何免疫球蛋白，包括抗体及其片段(例如，scFv)。如本文使用的，抗体或抗体分子预期完整的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的免疫活性部分以及免疫球蛋白分子的免疫活性部分的融合物。
如本文使用的，术语“免疫特异性”指的是结合包含抗原性生物分子的混合群体的样品中的感兴趣的蛋白质的一个或更多个表位或化合物，但基本上不识别和结合其他分子的蛋白质/多肽，特别是抗体。
如本文使用的，术语“靶向配体”指的是特异性地结合至特定类型的组织或细胞类型的任何化合物，特别是基本上不结合其他类型的组织或细胞类型的任何化合物。靶向配体的实例包括但不限于：蛋白质、多肽、肽、抗体、抗体片段、激素、配体、碳水化合物、类固醇、核酸分子和多核苷酸。
术语“脂肪族”指的是非芳香族的基于烃的部分。脂肪族化合物可以是无环的(例如，线性的或支链的)或环状的部分(例如，环烃基)，并且可以是饱和的或不饱和的(例如，烷基、烯基和炔基)。脂肪族化合物可以包含主要为碳的主链(例如，1个至约30个碳)，并且包含杂原子和/或取代基(参见下文)。如本文使用的术语“烃基”包括在正链/主链中含有1个至约30个碳的饱和或不饱和的直链或支链的烃。烃基基团的烃链可以被一个或更多个杂原子(例如，氧、氮或硫)中断。烃基(或脂肪族基团)可以任选地被取代(例如被少于约8个、少于约6个或1个至约4个取代基取代)。术语“低级烃基”或“低级脂肪族基团”分别指的是在烃链中含有1个至3个碳的烃基或脂肪族基团。烃基取代基或脂肪族取代基包括但不限于烷基(例如，低级烷基)、烯基、卤素(诸如F、C1、Br、I)、卤代烷基(例如，CCl3或CF3)、烷氧基、烷基硫基、羟基、甲氧基、羧基、氧代、环氧、烷氧基羰基、烷基羰基氧基、氨基、氨基甲酰基(例如，NH2C(＝O)-或NHRC(＝O)-，其中R是烷基)、脲(-NHCONH2)、烷基脲、芳基、醚、酯、硫酯、腈、硝基、酰胺、羰基、羧酸酯和硫醇。主链中具有至少约5个碳的脂肪族基团和烃基基团通常是疏水性的，没有亲水性取代基的广泛取代。
如本文使用的术语“芳基”指的是在环部分中含有6个至10个碳的单环和双环芳香族基团。芳基基团的实例包括但不限于苯基或萘基，诸如1-萘基和2-萘基，或茚基。芳基基团可以任选地包含一个至三个与环烃基环或杂环稠合的另外的环。芳基基团可以任选地通过可用的碳原子被例如1个、2个或3个基团取代，所述基团选自氢、卤素、烷基、多卤代烷基、烷氧基、烯基、三氟甲基、三氟甲氧基、炔基、芳基、杂环基、芳烷基、芳氧基、芳氧基烷基、芳烷氧基、芳基硫基、芳基偶氮(arylazo)、杂环基氧基、羟基、硝基、氰基、磺酰基阴离子、氨基或被取代的氨基。芳基基团可以是杂芳基。“杂芳基”指的是任选地被取代的单环、二环、三环或其他多环芳香族环体系，其包含至少一个，并且优选地从1个至约4个硫、氧或氮杂原子环成员。杂芳基基团可以具有例如从约3个至约50个碳原子(以及其中碳原子的范围和具体数目的所有组合和亚组合)，从约4个至约10个碳是优选的。
以下实施例提供了实施本发明的说明性方法，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
通过开发长效储库靶向药物，可以实现最大程度地减少HIV-1的组织保护区部位(包括脑、***、骨髓、肠相关淋巴组织和生殖道)的残余HIV-1。除了不频繁的给药间隔的益处之外，长效可注射药物制剂可以被设计为利用受体介导的过程来实现改善的细胞靶向、延长的药物半衰期和增强的组织生物分布。CAB是一种有效的病毒整合酶抑制剂，并且已经被配制为LAP(CAB-LAP)，LAP(CAB-LAP)在单次肌内剂量之后在人类中展示出持续的血浆药物水平。利匹韦林和CAB-LAP的长效可注射纳米制剂已经能够每月一次注射用于HIV抑制和预防(Andrews等人(2014)Science343(6175):1151-1154；Cohen,J.(2014)Science343(6175):1067；Spreen等人(2013)Curr.Opin.HIV AIDS,8(6):565-571)。现有纳米制剂的主要限制包括需要高剂量和高注射体积。为此，通过合成允许药物快速渗透穿过生理屏障的亲脂且疏水的前药纳米晶体，已经开发了长效缓慢有效释放抗逆转录病毒疗法(LASERART)。LASER ART通过有限的赋形剂使用使药物载量最大化，同时保持可缩放性(scalability)和长期储存。肉豆蔻酰化的前药已经用泊洛沙姆表面活性剂配制。通过增加药物亲脂性，该药物亲脂性在单次45mg/kg CAB当量肌内注射之后在恒河猴中将血浆CAB浓度维持在PA-IC90持续4个月，证实了CAB的改善的效能、生物利用度和组织分布。在这里，已经合成了改善的前药和纳米制剂，这些前药和纳米制剂降低了给药频率，同时改善了病毒储库靶向和药物活性。
本文提供了有效的CAB的酯前药，其具有允许使用LASER ART制剂进行不频繁的施用(诸如每6个至12个月一次的给药间隔或甚至更低频率)的物理化学性质。在选择最佳CAB前药候选物时评估的标准包括药物效能、亲脂性概况、在最小全身性前药循环的情况下在体内高效转化成CAB以及在单次肌内注射前药制剂之后持续6个月或更长时间的高于4倍PA-IC90的持续的CAB浓度。令人惊讶的是，本发明已经证明脂肪酯前药的烃链长度的变化明显改善了活性药物的释放和保留。这以M2CAB的鉴定告终，M2CAB是CAB的18碳脂肪酯前药，当与MCAB或其他脂肪酸烃链长度相比时，具有对CAB的出乎意料地优异的控制释放动力学。
本发明的前药是整合酶抑制剂的衍生物，诸如与疏水性可裂解部分缀合的CAB。因此，疏水性母体化合物被转化为更疏水性的酯衍生物。这通过附接脂肪酸部分来实现，该脂肪酸部分可以改善药物蛋白质结合和生物利用度。整合酶抑制剂(例如，CAB)和衍生部分之间的酯键易于酶促裂解或水解裂解。药物从颗粒中释放的机制包括前药从赋形剂中溶出，随后是有效的酯降解以产生活性母体化合物。开发的NM2CAB显著改善了MDM的药物摄取，在30天的观察期内具有持续的药物保留；而NCAB或NMCAB制剂分别在治疗的1天或20天之后从巨噬细胞中消除。类似地，在单次药物治疗长达30天之后，用HIV-1攻击持续时，用NM2CAB治疗的MDM呈现出比NCAB或NMCAB增强和持续的抗逆转录病毒活性。在任何这些时间点处，在NM2CAB治疗组中没有检测到HIV-1p24。该***的益处包括出乎意料地改善的药物生物利用度和延长的半衰期。NM2CAB延长的血浆和组织CAB浓度证实可以实现有效的每六个月一次的给药间隔。
M2CAB的合成
M2CAB前药的合成如描绘地进行：
Figure GDA0003305758360000301
简言之，M2CAB前药的制备通过以下进行：1)酚官能团用合适的碱诸如N,N-二异丙基乙胺去质子化；和2)与酰氯或烃基脂肪酸的活化的羧酸反应。
步骤1和步骤2均在单一容器中进行。具体地，使用合适的试剂将羟基基团去质子化。然后将醇阴离子与脂肪酰氯或活化的羧酸偶联以生成前药。可以用于活化羧酸的偶联试剂的实例包括但不限于脲盐、碳二亚胺试剂和鏻盐。可以用于偶联反应的碱的实例是但不限于N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。可以使用的极性非质子溶剂的实例包括但不限于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)和乙腈。试剂在0℃混合，并且在12-24小时内逐渐升温。最终化合物用硅胶柱色谱法纯化，并且通过核磁共振光谱学和与质谱法联用的高效液相色谱法进行表征。
羟基基团去质子化以及偶联至脂肪酸
将CAB(2g，4.93mmol，1.0当量)在无水二甲基甲酰胺(20mL)中的溶液在氩气下冷却至0℃。然后将N,N二异丙基乙胺(1.7mL，9.86mmol，2.0当量)逐滴添加至药物的预冷却的溶液。然后将硬脂酰氯(3.3mL，9.86mmol，2.0当量)添加至去质子化的酚溶液。混合物在搅拌下在16小时内逐渐升温至室温，浓缩，并且通过用80％至90％EtOAc/Hex洗脱的快速色谱法纯化，以便以90％的化学收率给出前药。M2CAB的1H-NMR光谱示出存在1.20ppm-1.50ppm处的宽峰，以及对应于脂肪酸部分上的脂肪族质子那些峰。
制剂合成
M2CAB纳米晶体被包被泊洛沙姆407(P407)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-羧基(聚乙二醇)-2000(DSPE-PEG)和/或聚乙烯醇(PVA)。纳米晶体也可以用聚山梨酯和聚乙二醇表面活性剂稳定。基于质子NMR光谱学数据，按重量计100:6的药物与表面活性剂的比被用于制造纳米配制的M2CAB、MCAB和CAB。简言之，将1％-5％(w/v)的M2CAB、MCAB或CAB和0.06％-0.3％(w/v)的P407混合在无内毒素的水中。通过湿法碾磨或以20,000psi压力的高压均质化直到获得期望的尺寸和多分散性指数(PDI)来配制预混合的悬浮液。通过动态光散射来表征纳米制剂的粒度、多分散性指数(PDI)和ζ电势(图1)。这是使用Malvern Zetasizer,Nano系列Nano-ZS(MalvernInstruments Inc,Westborough,MA)进行的。通过扫描电子显微镜(SEM)确定纳米颗粒形态学。UPLC MS/MS被用于药物定量。
巨噬细胞摄取和保留
人类单核细胞通过白细胞采集术从HIV-1/2和乙型肝炎血清阴性供体获得，并且然后通过逆流离心淘洗纯化(Balkundi等人,Intl.J.Nanomed.(2011)6:3393-3404；Nowacek等人,Nanomed.(2009)4(8):903-917)。使用补充有10％热灭活混合人类血清、1％谷氨酰胺、10μg/mL环丙沙星和50μg/mL庆大霉素的DMEM，将人类单核细胞以每孔1.0×106个细胞的密度铺板在12孔板中。细胞在5％CO2培养箱中在37℃保持。在存在1000U/mL重组人类巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)的情况下分化7天-10天之后，用一系列纳米制剂和天然药物处理MDM。通过测量处理之后不同时间点处的细胞内药物浓度来评估药物的摄取。对于药物保留研究，细胞被处理持续8小时，然后用PBS洗涤，并且用每隔一天的半数培养基更换来维持，直到在指定的时间点收集。对于这两项研究，粘附的MDM用PBS(3×1mL)洗涤，然后刮入1mL的新鲜PBS中，并且在指定的时间点使用CountessTM自动细胞计数器(Invitrogen,Carlsbad,CA)计数。通过在4℃以950×g离心8分钟来沉淀细胞。将细胞沉淀物在200μl的高效液相色谱(HPLC)级甲醇中重构，并且用探头声处理，随后以20,000×g离心20分钟。使用HPLC分析上清液的药物含量。
如图2A中可见，相比NMCAB，NM2CAB被MDM摄取到统计学上更高的水平。此外，相比NMCAB，MDM在统计学上更高的水平保留NM2CAB持续更长的时间(图2A)。
抗逆转录病毒活性
抗逆转录病毒效力通过测量HIV逆转录酶(RT)活性来确定(图2B和图2C)。为了评估抗逆转录病毒效力，用100μM的CAB-LAP、NMCAB或NM2CAB处理MDM持续8小时。在处理之后，用PBS洗涤细胞以除去过量的游离药物和纳米颗粒，并且用新鲜的培养基培养细胞，每隔一天进行半数培养基更换。以0.01个传染性病毒颗粒/细胞的MOI用HIV-1ADA攻击MDM持续长达30天。子代病毒体的产生通过培养基中的RT活性来测量(Kalter等人(1992)J.Clin.Microbiol.,30(4):993-995)。评估HIV-1p24蛋白抗原表达(Guo等人(2014)J.Virol.,88(17):9504-9513)。MDM用PBS洗涤并且在室温用4％多聚甲醛固定持续15分钟。在室温使用在PBS中的含1％Triton X-100的10％BSA封闭细胞持续30分钟。在封闭后，将细胞与HIV-1p24小鼠单克隆抗体(1:50；Dako,Carpinteria,CA,USA)在4℃孵育过夜，随后在室温孵育1小时。添加HRP标记的聚合物抗小鼠二级抗体(Dako En
Figure GDA0003305758360000321
System)(一滴/孔)。添加苏木精以对细胞核进行复染，并且使用具有20×物镜的Nikon TE300显微镜捕获图像。如图2B和图2C中可见，与纳米配制的CAB或MCAB相比，纳米配制的M2CAB观察到出乎意料地优异的抗逆转录病毒效力。
药代动力学/生物分布研究
向雌性NSG小鼠施用单次IM 45mg/kg CAB当量剂量的NM2CAB、NMCAB或NCAB。血浆和组织的药物水平通过UPLC-MS/MS测定。每周监测血浆中的药物水平。当与NMCAB或NCAB相比时，单次IM注射NM2CAB展示出活性CAB的零级控制释放动力学，其保持高于4倍PA-IC90(图3)。在注射之后第364天，血浆CAB水平对于NM2CAB是345.2ng/ml，对于NMCAB是8.5ng/ml，并且对于NCAB是检测不到的值(0.5ng/ml的检测限)。
小鼠还被施用单次IM 45mg/kg CAB当量剂量的NM3CAB(C22)。每周监测血浆中的药物水平。在注射之后第28天，血浆CAB水平是233.2ng/ml(图3B)。因此，清楚的是，在维持药物的长期、有效释放方面，NM2CAB(C18)在统计学上优于较短的NMCAB(C14)和较长的NM3CAB(C22)。
在衍生成M2CAB前药后，CAB的疏水性被大幅改善。M2CAB的改善的疏水性有助于产生具有高药物载量的稳定的制剂。此外，与纳米配制的CAB或MCAB相比，CAB转化为更疏水性的M2CAB和纳米颗粒的形成显著改善了药物的细胞内积累。与纳米配制的CAB或MCAB相比，对纳米配制的M2CAB观察到在MDM保留和抗逆转录病毒效力方面的显著改善。在雌性NSG小鼠中以45mg CAB当量/kg的NM2CAB的单次IM注射也出乎意料地展示出持续超过五个月的高于4倍PA-IC90的血浆CAB浓度，这明显大于纳米配制的CAB或MCAB。
实施例2
目前的抗逆转录病毒药物(ARV)治疗方案是有效且耐受良好的，能够实现1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的持续的、终身的抑制(Fauci等人,JAMA(2019)321:844-845)。然而，对病毒复制的这样的控制必须与方案依从性相联系，方案依从性又受到并发共病、社会污名、行为、并发非法药物使用和成本的影响(Fauci等人,JAMA(2019)321:844-845)。然而，即使严格依从每日给药，通常也会导致药物毒性、药物-药物相互作用和病毒耐药性的出现。所有药物方案都排除了病毒消除(Dash等人,Nat.Commun.(2019)10:2753)。这强调了这样的事实，即所有疗法都需要终身坚持，以维持HIV-1抑制和减轻疾病。这些导致科学家去开发长效(LA)治疗方法。所有的研究都集中在改善方案依从性和药物效能上(Gendelman等人,Trends Microbiol.(2019)27:593-606)。两个最活跃的和接近美国食品药品监督管理局临床批准的是ARV LA可注射剂，而可植入药物装置仍在开发中(Margolis等人,Lancet(2017)390:1499-1510；Taylor等人,Topics Antiviral Med.(2019)27:50-68)。
迄今为止，进行的研究已经显示了LA可注射剂用于广泛人类使用的相当大的前景(Margolis等人,Lancet(2017)390:1499-1510；Taylor等人,Topics Antiviral Med.(2019)27:50-68；Kerrigan等人,PloS One(2018)13:e0190487)。因此，作为两种药物的组合的卡博特韦(CAB)和利匹韦林(RPV)的LA可注射纳米制剂将可能在2019年底前获得批准，用于每月施用(Margolis等人,Lancet(2017)390:1499-1510；Taylor等人,TopicsAntiviral Med.(2019)27:50-68；Kerrigan等人,PloS One(2018)13:e0190487)。“作为长效抑制的抗逆转录病毒疗法”(ATLAS)和“第一长效可注射方案”(FLAIR)二者都证明了有前景的安全性、效力和耐受性(Taylor等人,Topics Antiviral Med.(2019)27:50-68)。当将治疗与标准口服三种药物的方案比较时，联合治疗证实了非劣效性(Taylor等人,TopicsAntiviral Med.(2019)27:50-68)。同样，药物植入物也已经示出前景(Kovarova等人,Nat.Commun.(2018)9:4156；Gunawardana等人,Antimicrob.Agents Chemother.(2015)59:3913-3919；Flexner,C.,Curr.Opin.HIV AIDS(2018)13:374-380；Barrett等人,Antimicrob.Agents Chemother.(2018)62(10):e01058-18.)。然而，这两种方法都存在局限性，包括注射部位反应、大的注射体积、剂量频率、渗透进入病毒储库有限(Margolis等人,Lancet(2017)390:1499-1510；Markowitz等人,Lancet HIV(2017)4:e331-e340；Zhou等人,Biomaterials(2018)151:53-65)。此外，这些较新的治疗方法需要频繁的专业保健服务，通过提供注射本身，或者进行植入物的***和取出。组织和血浆药物水平的测量与LAARV效力相关，包括药物进入粘膜、淋巴组织和中枢神经***的渗透以及长期安全性。基于这些未知的程度，对于LA ARV方案的进一步改善存在迫切需求。任何未来的LA ARV都需要在没有全身毒性的情况下以减小的体积被施用。如果实现，ARV方案也可以以反映ARV疫苗模拟物的方式表现。成功将防止新的感染和减少新的传播，并且以这样的方式可以实现功能性HIV-1治愈。
为此，已经针对一系列抗逆转录病毒剂建立了LA ARV文库(Zhou等人,Biomaterials(2018)151:53-65；Hilaire等人,J.Control Release(2019)311-312:201-211；Ibrahim等人,Int.J.Nanomedicine(2019)14:6231-6247；Lin等人,Chem.Commun.(Camb)(2018)54:8371-8374；McMillan等人,Antimicrob.Agents Chemother.(2017)62:e01316-17；McMillan等人,AIDS(2019)33:585-588；Sillman等人,Nat.Commun.(2018)9:443；Smith等人,Biomaterials(2019)223:119476；Soni等人,Biomaterials(2019)222:119441)。本文中，产生CAB前药的目的是延长药物的表观半衰期和抗逆转录病毒活性，同时严格控制水解。报告了具有14个碳、18个碳和22个碳的连接基臂的CAB的三种前药(分别是MCAB、M2CAB和M3CAB)的合成和全面的物理化学表征，以及对它们各自的纳米制剂(NMCAB、NM2CAB和NM3CAB)的完整的评估。这些分析扩展了第一代CAB前药MCAB的先前的测试(Zhou等人,Biomaterials(2018)151:53-65；McMillan等人,AIDS(2019)33:585-588)。C18纳米制剂NM2CAB增强了单核巨噬细胞中CAB的摄取和保留，并且示出针对HIV-1感染性攻击的长期月度保护。NM2CAB产生持续52周的高于166ng/mL的蛋白质相关的90％抑制剂浓度(PA-IC90)的CAB血浆浓度。这与单次肠胃外注射之后明显的淋巴、粘膜和肠生物分布水平相关。没有记录的全身性不良事件。注射药物的正常和免疫缺陷小鼠和恒河猴中的平行药物血浆浓度证实了预防和治疗方案的长期持续药物释放。这些结果综合表明前药可以用于针对HIV-1的预防性疫苗的相同目的。
材料和方法
试剂
CAB购自BOC sciences(Shirley,NY)。吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、肉豆蔻酰氯、硬脂酰氯、山嵛酸、泊洛沙姆407(P407)、环丙沙星、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、多聚甲醛(PFA)和3,3’-二氨基联苯胺(DAB)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。***、乙酸乙酯、己烷、乙腈(ACN)、甲醇、LC-MS级水、细胞培养级水(不含内毒素)、庆大霉素、磷酸二氢钾(KH2PO4)、牛血清白蛋白(BSA)、TritonTMX-100和
Figure GDA0003305758360000361
试剂购自Fisher Scientific(Hampton,NH)。单克隆小鼠抗人HIV-1p24(克隆Kal-1)和基于聚合物的HRP缀合的抗小鼠EnVisionTM+二级抗体购自Dako(Carpinteria,CA)。热灭活混合人类血清购自Innovative Biologics(Herndon,VA)。Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)购自Corning Life Sciences(Tewksbury,MA)。
CAB前药的合成和表征
通过将CAB上的10-羟基基团酯化合成了三种前药的系列，产生了具有14个碳、18个碳和22个碳的连接基的亲脂性前药，命名为MCAB、M2CAB和M3CAB。最初，将CAB从无水吡啶中干燥，并且然后悬浮在无水DMF中。在氩气下将混合物冷却至0℃。DIEA(2当量)被用于将CAB的10-羟基基团去质子化，再与2当量肉豆蔻酰氯或硬脂酰氯反应持续24小时，分别获得MCAB或M2CAB。M3CAB合成是两步过程。在第一步中，通过在无水氯仿中使用4当量亚硫酰氯将山嵛酸的羧酸基团氯化来合成二十二酰氯。从无水吡啶中干燥并在存在4当量三乙胺的情况下重悬在无水DMF中的CAB在氩气下在0℃被进一步添加到DMF中的二十二酰氯中，随后在50℃加热反应持续24小时。所有得到的前药通过硅胶柱色谱法纯化，针对初始级分使用4:1乙酸乙酯：己烷的初始流动相，然后针对剩余物使用9:1乙酸乙酯：己烷。最后，将前药沉淀并且在***中洗涤，在真空下干燥，以便以85％-95％的平均收率获得白色粉末。通过质子和碳核磁共振(1H和13C NMR)光谱证实前药的成功合成，该光谱由在500MHz、11.7T的磁场强度操作的Bruker Avance-III HD(Billerica,MA)记录。傅里叶变换红外分析(FT-IR)在通用衰减总反射(UATR)Spectrum Two(PerkinElmer,Waltham,MA)上进行。通过粉末X射线衍射(XRD)的CAB和前药的比较晶体学分析在40kV、45mA的设置下，使用具有Cu-Kα辐射
Figure GDA0003305758360000362
的PANalytical Empyrean衍射计(PANalytical Inc.,Westborough,MA)以1°/s的速率在2°-70°的2θ范围内进行。通过直接输注到Waters TQD质谱仪中来确定分子质量。
CAB、MCAB、M2CAB和M3CAB的UPLC-UV/Vis定量
具有TUV检测器的Waters ACQUITY超高效液相色谱(UPLC)H-Class***和Empower3软件(Milford,MA)被用于测量药物浓度。CAB、MCAB、M2CAB和M3CAB样品在PhenomenexKinetex 5μm C18柱(150×4.6mm)(Torrance,CA)上分离。使用由65％50mM pH3.2的磷酸二氢钾(KH2PO4)和35％乙腈(ACN)组成的流动相和1.0mL/分钟的流量，在254nm处检测到CAB。分别使用由90％ACN和10％水、95％ACN和5％水、98％ACN和2％水组成的流动相和1.0mL/分钟的流量，在230nm处检测到MCAB、M2CAB和M3CAB。药物含量相对于在甲醇中药物标准品(0.05μg/mL-50μg/mL)的峰面积来确定。
药物制剂水溶解度的测量
通过将过量的药物或前药粉末添加至1mL水中以制备饱和水溶液，确定了CAB、MCAB、M2CAB和M3CAB在optima水中的水溶解度。将混合物在室温搅拌持续24小时。此外，将溶液以14000rpm离心持续10分钟，以沉淀未溶解的粉末。将上清液收集，冻干并且溶解在甲醇中，用于通过UPLC UV/Vis进行药物含量分析。
化学稳定性
确定了MCAB、M2CAB和M3CAB在酸性(pH 1)、碱性(pH 11)和中性(pH 7)条件在室温和升高的温度(37℃)的稳定性。每种前药的储备溶液在DMSO中以1mg/mL的浓度制备。对于酸性、碱性和中性测定，将每种前药的100μL的储备溶液分别添加至1900μL的0.1M HCl、0.1M NaOH或optima级水(pH调节至7)。然后将样品在室温和40℃在振荡条件下(
Figure GDA0003305758360000371
42振荡培养箱，150rpm)孵育。样品在0小时、2小时、4小时、8小时和24小时取出，并且储存在-80℃。之后，通过UPLC-UV/Vis分析样品的药物含量。
血浆裂解药物水解动力学
在不同物种(小鼠、大鼠、兔、猴、狗和人类)的血浆中确定了MCAB、M2CAB和M3CAB的水解动力学和活性药物的相对释放。将MCAB、M2CAB或M3CAB(1μM)100μL血浆中在37℃孵育。在不同的时间点，将1mL酸化甲醇(0.1％甲酸和25mM甲酸铵以避免进一步的前药水解)添加至每个样品并涡旋持续3分钟以停止反应。对于0分钟时间点，向100μL冰冷的血浆掺入前药储备溶液，并且立即添加1ml的冰冷的酸性甲醇。添加甲醇后，样品以15,000g离心持续10分钟，并且收集的上清液通过UPLC-MS/MS(Waters Xevo TQ-XS)分析药物含量。
纳米颗粒合成和表征
通过使用泊洛沙姆表面活性剂407(P407)的高压均质化来制造母体CAB的纳米制剂(NCAB)及其前药的纳米制剂(NMCAB、NM2CAB和NM3CAB)。药物/前药和P407在2％-20％w/v药物/前药和0.2％-2％w/vP407的浓度范围内在无内毒素的水中预混合(10:1w/w)持续24小时。预混物使用Avestin EmulsiFlex-C3高压均质机(Ottawa,ON,Canada)在～18,000psi进一步均质化，以生成期望粒度的均质纳米晶体。使用Malvern Nano-ZS(Worcestershire,UK)通过动态光散射(DLS)表征纳米颗粒的粒度(Deff)、多分散性指数(PDI)和ζ电位。在4℃、25℃和37℃监测纳米制剂的稳定性持续3个月。纳米制剂中的药物/前药含量通过将纳米制剂溶解在甲醇中(稀释因子范围：1000-10000)，并且通过UPLC UV/Vis进行分析来测量。以下等式用于计算包封率。包封率(％)＝(制剂中药物的重量/添加的药物的初始重量)×100。通过扫描电子显微镜(SEM)评估纳米颗粒的形态学。纳米颗粒在4℃在2％戊二醛、2％多聚甲醛在0.1M sorenson磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中的溶液中固定持续24小时，并且被加工用于成像。简言之，纳米悬浮液在安装在SEM样品架上并且溅射涂覆约50nm的金/钯合金的玻璃盖玻片上风干。使用在5.0kV操作的FEI Quanta 200扫描电子显微镜(Hillsboro,OR)测定样品(Sillman等人,Nat.Commun.(2018)9:443)。
人类单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)
人类单核细胞通过白细胞分离术从HIV-1/2和乙型肝炎血清阴性供体获得，并且之后通过逆流离心淘洗纯化(Gendelman等人,J.Exper.Med.(1988)167:1428-1441)。单核细胞在DMEM培养基中培养，该DMEM培养基含有4.5g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠，补充有10％热灭活人类血清、50μg/mL庆大霉素和10μg/mL环丙沙星。细胞保持在37℃的5％CO2培养箱中。在前7天将重组人类巨噬细胞集落刺激因子(MCSF，1000U/mL)添加至培养基，以促进单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)的分化。每隔一天用新鲜的培养基替换半数培养基。在分化之后，MDM被用于随后的体外测定。
细胞毒性测定
用纳米颗粒治疗后的细胞生存力通过进行MTT测定来评估。用10μM、25μM、50μM、100μM、200μM或400μM的NCAB、NMCAB、NM2CAB或NM3CAB处理以每孔0.08×106个细胞的密度铺板在96孔板中的人类MDM持续24小时。未处理的细胞用作对照。对于每个组，样品为一式四份。细胞用PBS洗涤，并且用100μL/孔的MTT溶液(5mg/mL)在37℃孵育持续45分钟。在孵育之后，除去MTT溶液，并且用PBS洗涤细胞。然后，向每个孔中添加200μL的DMSO，并且在490nm处在Molecular Devices
Figure GDA0003305758360000391
M3读板器上用SoftMax Pro 6.2软件(Sunnyvale,CA)测量吸光度。
药物颗粒MDM摄取、保留和释放的研究
MDM摄取和保留研究在透明平底12孔板中以每孔1.0×106个细胞的密度进行，每个处理组以一式三份完成。对于细胞摄取研究，用100μM的NCAB、NMCAB、NM2CAB或NM3CAB处理MDM。在处理后2小时、4小时、8小时和24小时收集MDM，以测量细胞内药物和前药水平。对于保留研究，MDM用100μM的NCAB、NMCAB、NM2CAB或NM3CAB治疗持续8小时，并且然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次。每隔一天添加新鲜的培养基并且替换半数培养基。在第1天、第5天、第10天、第15天、第20天、第25天和第30天收集MDM，以测定细胞内药物和前药浓度。对于这两项研究，在规定的时间点，将粘附的MDM用PBS洗涤两次。然后将细胞刮入PBS中，并且使用Invitrogen CountessTM自动细胞计数器(Carlsbad,CA)计数。将细胞在PBS中的悬浮液在4℃以3,000rpm离心持续8分钟。将获得的细胞沉淀物在200μL甲醇中使用探头声波仪声处理以便提取细胞内药物。将所得物在4℃以20,000g离心持续10分钟，以分离细胞碎片与含有药物的上清液。通过UPLC-UV/Vis进一步分析样品的药物和前药含量。对于释放研究，在与保留研究中类似的时间点处收集培养基，以定量由MDM释放的药物和前药。将培养基与甲醇混合，以沉淀培养基中的不溶性组分，并且提取药物和前药。将混合物在4℃以17,000g离心持续10分钟，以分离不溶性沉淀物。将上清液转移至新的管中，以便在快速真空中干燥。将干燥的内容物悬浮在甲醇中，以便通过UPLC-UV/Vis进一步分析。
通过透射电子显微镜(TEM)的颗粒表征
MDM用100μM的浓度的NCAB、NMCAB、NM2CAB或NM3CAB处理持续8小时，并且然后用PBS洗涤两次。每隔一天添加新鲜的培养基并且替换半数培养基。在药物颗粒处理之后第0天、第15天和第30天收集MDM培养物上清液流体，并且通过TEM分析以对细胞内纳米颗粒成像。对于第0天，在8小时处理持续时间之后立即收集细胞。在规定的时间点，洗涤细胞，刮入PBS中，在室温以3000rpm沉淀持续8分钟，并且在2％戊二醛、2％多聚甲醛在0.1M Sorenson磷酸盐缓冲液(pH 6.2)的溶液中固定。将一滴固定的细胞悬浮液置于弗姆瓦(formvar)/一氧化硅200目铜网格上，并且允许静置持续2分钟。吸去过量的溶液并允许干燥。将一滴NanoVan钒负染色剂置于网格上持续1分钟，然后吸去并且允许干燥。在80kV操作的FEITecnai G2 Spirit TWIN透射电子显微镜(Hillsboro,OR)上检查网格。用AMT数字成像***(Woburn,MA)以数字方式获取图像(Sillman等人,Nat.Commun.(2018)9:443)。
HIV-1感染和感染的细胞液中逆转录酶(RT)活性的测量
将MDM以0.8×106个细胞/孔的密度铺板在透明平底24孔板中。用100μM的NCAB、NMCAB、NM2CAB或NM3CAB处理MDM持续8小时。在处理后，将细胞用PBS洗涤，并且在新鲜的培养基中培养，每隔一天进行半数培养基替换。在处理之后1天、5天、10天、15天、20天、25天和30天，用HIV-1ADA(一种嗜巨噬细胞病毒株)以每细胞0.1个感染性颗粒的感染复数(MOI)感染细胞持续16小时。在感染期后，将MDM用PBS洗涤，并且用新鲜的培养基补充。在接下来的十天培养细胞，每隔一天进行半数培养基替换，并且在第8天进行全培养基替换。在感染之后第10天收集培养基用于测量HIV-1RT活性(Kalter等人,J.Immunol.(1991)146:3396-3404；Nowacek等人,J.Neuroimmune Pharm.(2010)5:592-601)。感染程度被表示为未处理的感染的MDM的RT活性的百分比。将细胞固定在2％PFA中，并且通过免疫细胞化学确定HIV-1p24抗原的表达(Nowacek等人,J.Neuroimmune Pharm.(2010)5:592-601)。
半最大有效浓度(EC50)测定
将MDM铺板在透明平底96孔板(0.08×106个细胞/孔)中。将细胞用一系列药物浓度(0.01nM-1000nM)的CAB、MCAB、M2CAB、M3CAB、NCAB、NMCAB、NM2CAB或NM3CAB处理持续1小时，然后用HIV-1ADA(每个细胞0.1个感染性颗粒的MOI)感染持续4小时。在病毒攻击4小时之后，洗涤细胞并给予含有药物(0.1nM-1000nM)的新鲜的培养基。随后，在10天后收集细胞上清液，并且如上文描述测定HIV-1RT活性。
使用CEM-ss细胞作为标准物的CD4+T细胞的纳米颗粒摄取
将CEM-ss CD4+T细胞悬浮在补充有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI中。将细胞悬浮液(1mL/孔)添加至预先包被了聚-L-赖氨酸溶液(500μg/mL在蒸馏水中)的透明平底12孔板中持续1小时。在附接至孔表面之后，用25μM的NCAB、NMCAB、NM2CAB或NM3CAB处理细胞。在2小时、4小时和8小时，洗涤细胞并刮入PBS中。将细胞悬浮液以200g离心持续5分钟，并且通过Waters TQD质谱仪定量细胞内药物和前药浓度。在25μM浓度处理8小时之后，通过TEM成像证实CEM-ss CD4+T细胞系中纳米颗粒的摄取。用于TEM成像的样品加工在上文描述。
药代动力学(PK)和生物分布(BD)小鼠研究
NSG小鼠(雌性，6周-8周，Jackson Labs,Bar Harbor,ME)通过以40μL/25g小鼠的单次肌内(IM，尾部大腿肌肉)注射被施用45mg/kg CAB当量的NCAB、NMCAB、NM2CAB或NM3CAB。注射后，通过面颊穿刺(颌下静脉，MEDIpoint,Inc.,Mineola,NY)，在施用后第1天并且然后每周收集直至第364天将血液样品收集到肝素化的管中。收集的血液(25μL)被立即稀释到1mL ACN中，并且储存在-80℃，直到药物测量。将剩余的血液样品以2,000g离心持续8分钟，以便血浆收集。收集血浆并且储存在-80℃用于分析药物含量。在施用后第14天、第28天、第42天和第364天，通过异氟烷吸入和随后的颈椎脱臼对动物进行人工安乐死。收集脾、***、肝、肺、肠、肾、脑、***组织和直肠组织用于定量CAB和前药浓度。使用连接至Xevo TQ-S micro质谱仪的Waters ACQUITY H-class UPLC(Waters,Milford,MA,USA)通过UPLC-MS/MS定量小鼠血浆、血液和组织中的CAB、MCAB、M2CAB和M3CAB。用于样品加工和UPLC-MS/MS分析的所有溶剂均是LCMS级(Fisher)。对于血浆和血液样品，将25μL的样品添加至1mL的掺有10μL内标物(IS)的乙腈(ACN)中。分别以200ng/mL、20ng/mL和20ng/mL的最终浓度的d3-多替拉韦(d3-DTG)、肉豆蔻酰化的多替拉韦(MDTG)和硬脂酰化的达芦那韦(SDRV)分别被用作CAB、MCAB和M2CAB/M3CAB分析的IS。将样品涡旋，并且在4℃以17,000×g离心持续10分钟。上清液被收集，并且使用
Figure GDA0003305758360000421
干燥，并且在100μL 80％甲醇中重构；注射10μL用于MCAB、M2CAB和M3CAB UPLC–MS/MS分析。针对CAB、MCAB、M2CAB和M3CAB在0.2ng/mL-2000ng/mL的范围内在空白小鼠血浆/血液中制备标准曲线。对于组织药物定量，将3mg-200mg的样品在4-29体积的含有0.1％v/v甲酸和2.5mM甲酸铵的90％甲醇中均质化。向100μL的组织匀浆中添加含有0.1％甲酸和2.5mM甲酸铵的280μl甲醇、80％甲醇(10μL)和IS(10μL)，随后涡旋持续3min并且以17,000×g离心持续15分钟。对于MCAB、M2CAB和M3CAB分析，将85μl的上清液与15μl水混合。对于CAB分析，将20μl的上清液与80μl的50％ACN混合。将这些等分试样涡旋，以17,000×g离心持续10分钟，并且将10μl的上清液用于LC-MS/MS分析。使用含有10μL的加标溶液(CAB/MCAB/M2CAB/M3CAB，5ng/mL-20,000ng/mL在50％ACN中)的空白组织匀浆来类似地制备标准物。对于CAB定量，10μLCAB样品的色谱分离在Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱(1.7μm，2.1mm×100mm)上进行，使用流动相A(在水中的7.5mM甲酸铵，使用甲酸调节至pH 3)和流动相B(100％ACN)的10分钟梯度，以0.25mL/分钟的流量进行。对于前3.5min，流动相组成是35％B，并且在0.5min内增加至95％B，并且保持恒定持续1.5分钟。然后在0.5min内将流动相B重置为35％，并且在下一次注射之前使柱平衡持续1分钟。对于MCAB和M2CAB定量，色谱分离在较短的30mm柱上实现(PN，使用8-min梯度法，以0.28mL/分钟的流量)。初始流动相组成是80％B，持续前2min，并且在4分钟内增加至95％B，保持恒定持续0.75分钟，在0.25分钟内重置为80％，并且在下一次注射之前使柱平衡持续1分钟。对于M3CAB定量，色谱分离也在较短的30mm柱上实现，使用8分钟梯度法，以0.35mL/min的流量。初始流动相组成是88％B，持续前5min，并且在0.25min内增加至95％B，保持恒定持续1.5分钟，在0.25分钟内重置为88％，并且在下一次注射之前使柱平衡持续1分钟。在正电离模式下，在分别为10V、24V、2V和20V的锥孔电压以及分别为24V、18V、24V和26V的碰撞能量检测CAB、MCAB、M2CAB和M3CAB。用于CAB、MCAB、M2CAB、M3CAB、d3-DTG、MDTG和SDRV的多重反应监测(MRM)转换分别是406.04>126.93，616.28>406.09，672.34>406.07，728.47>406.09，422.84>129.99，630.20>420.07和814.52>658.44。光谱通过MassLynx软件4.1版进行分析和定量。使用分析物峰面积与内标物峰面积的比来确定所有定量。在NSG小鼠中的PK和BD分析后，在所有制剂中优秀的NM2CAB在另一小鼠品系BALB/cJ中被再次评价。(雄性，6周-8周，Jackson Labs)。NCAB被用作对照。将注射了NM2CAB的小鼠在施用后第280天被人工安乐死。收集的血浆和组织中药物和前药的定量与上文类似。对于NSG小鼠中的研究，使用Phoenix WinNonlin-8.0(Certara,Princeton,NJ)对血浆CAB进行非房室PK分析。
恒河猴(RM)中的PK和BD
将四只雄性RM(4.4kg-6.7kg；PrimeGen)用***(10mg/kg)麻醉，并且随后通过IM注射(股四头肌，0.5mL/kg)施用45mg/kg CAB当量的NM2CAB和实验室生成的RPV前药。血液样品被收集在钾-EDTA包被的管中，用于全血细胞计数(CBC)、代谢谱。分离血浆用于药物测量。在注射之后第204天收集***、脂肪和直肠组织的组织活检，用于药物定量。血浆和组织中药物和前药的定量方法与上文小鼠研究中描述的类似。
统计学分析
使用GraphPad Prism 7.0软件(La Jolla,CA)进行统计学分析。体外研究的数据被表示为平均值±SEM，最少3次生物学重复，而体内研究结果被表示为平均值±SEM，最少3次生物学重复。对于两组之间的比较，使用学生t检验(双侧)。单因素ANOVA随后是Tukey检验被用于比较三个或更多个组。统计学显著性表示如下：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
研究批准
所有动物研究均由内布拉斯加大学医学中心机构动物护理和使用委员会(IACUC)根据实验室动物护理和使用指南(美国国家科学院国家研究委员会，2011)中包含的标准批准。根据UNMC机构审查委员会批准的豁免方案，人类单核细胞通过白细胞分离术从HIV-1/2和乙型肝炎血清阴性供体分离。
结果
前药合成和表征
通过附接可变碳长度(14、18和22)的脂肪酸链，对CAB进行化学修饰，以分别产生酯MCAB、M2CAB和M3CAB。前药通过核磁共振(NMR)被进一步表征，以证实合成。所有三种前药的1H NMR光谱示出在0.86ppm-0.89ppm、1.77ppm-1.78ppm和2.66ppm-2.70ppm的范围内的三重峰和在1.24ppm-1.25ppm的范围内的宽单峰，对应于脂肪酸烃基链的末端甲基和重复亚甲基质子。11.5ppm处的酚质子峰的消失证实了CAB的羟基质子被脂肪酰基部分取代。每种前药的13C NMR光谱证实了缀合的脂肪族链的碳原子。电喷雾电离质谱法(ESI-MS)证实了所有前药的分子量。MCAB的ESI-MS输注在616.28m/z处生成强信号，M2CAB的ESI-MS输注在672.34m/z处生成强信号，并且M3CAB的ESI-MS输注在728.47m/z处生成强信号。傅里叶变换红外光谱学(FTIR)前药表征产生了在2908cm-1-2935cm-1和1748cm-1-1775cm-1的范围内的带，对于CAB未观察到这些带。这些带分别对应于脂肪族亚甲基基团中的C-H伸缩和酯键中对应于羧基基团的C＝O伸缩。在2θ＝2°-70°范围内的XRD光谱示出了前药MCAB、M2CAB和M3CAB的结晶特征。M2CAB的纳米颗粒保持了前药的结晶性质。与CAB(12.12±0.41μg/mL)相比，观察到MCAB(2.83±1.37μg/mL)、M2CAB(1.91±0.23μg/mL)和M3CAB(1.51±0.7μg/mL)的水溶解度的显著连续降低。此外，与CAB(0.09±0.002mg/mL)相比，观察到MCAB(2.31±28.15mg/mL)、M2CAB(2.64±0.02mg/mL)和M3CAB的1-辛醇溶解度的平行的显著增加。这些结果证实了与CAB相比，由于用脂肪酸缀合物进行化学修饰，前药的疏水性和亲脂性的增加。
前药是药理学上无活性的化合物，在生理条件下需要酶促活化或水解活化以生物转化为活性药物。因此，在不同物种(小鼠、大鼠、兔、猴、狗和人类)的血浆中评价了MCAB、M2CAB和M3CAB的水解动力学和随后的CAB形成。在所有测试物种的血浆中孵育后，MCAB在30分钟内示出超过85％的裂解，M2CAB截至2小时示出平均75％的裂解，并且截至6小时示出80％的裂解。M3CAB示出最慢的裂解速率，在血浆中孵育24小时之后，剩余约50％的前药。这些研究表明，MCAB快速转化为CAB，而M3CAB示出转化为CAB最少。截至6小时，由M2CAB水解形成的CAB为平均71.1％，表明在生理条件下的稳定性和活性药物形成方面M2CAB是最佳的前药。各种动物物种的血浆中前药水解的速率存在一定差异。测试物种中血浆CAB浓度的变异性可能是由于体脂分布、肌肉质量、身体活动和对于前药水解有效的血浆羧酸酯酶的差异导致的(Trezza等人,Curr.Opin.HIV AIDS(2015)10:239-245；Bahar等人(2012)J.Pharm.Sci.(2012)101:3979-3988；Wang等人,Acta Pharmaceutica Sinica.B(2018)8:699-712)。此外，M2CAB的化学稳定性在室温和升高的温度(37℃)在酸性条件(pH 1)、中性条件(pH 7)和碱性条件(pH 11)经24小时确定，以确定前药纳米制剂在多种储存条件下的长期稳定性。在室温，在24小时，确定了在酸性条件19％的水解和在中性条件24％的水解。然而，在碱性条件，M2CAB被完全水解，并且未被检测到。在37℃，在24小时，在酸性条件约>95％的前药被水解，并且在中性条件28％的前药被水解。然而，在碱性条件，M2CAB在2小时内被完全水解。将前药MCAB、M2CAB和M3CAB的半最大有效浓度(EC50)值与CAB进行比较，以确定由于化学修饰引起的抗逆转录病毒活性的变化(如果有的话)。感染HIV-1ADA的MDM的培养基的HIV-1RT活性测量证明，CAB(28.39nM)、MCAB(34.19nM)、M2CAB(44.71nM)和M3CAB(51.15nM)的EC50值是相当的，指示对于药物活性没有显著影响。
纳米制剂制造和表征
CAB(NCAB)、MCAB(NMCAB)、M2CAB(NM2CAB)和M3CAB(NM3CAB)的纳米制剂通过利用高压均质化的自上而下的合成来制造。药物或任何前药的包封率>85％。泊洛沙姆407(P407)表面活性剂提供颗粒表面稳定化。在室温(RT)、4℃和37℃通过DLS确定了纳米颗粒尺寸、多分散性指数(PDI)和ζ电位。所有制剂保持稳定长达98天，表明这些制剂在一系列储存条件下可以保持其物理完整性。此外，在研究期间，温度变化不影响任何制剂的物理化学性质。在制造当天，平均粒度、PDI和ζ电位对于NCAB是294.5±1.8nm、0.23±0.01、-28.3±0.21mV；对于NMCAB是302.1±10.8nm、0.23±0.01、-31.1±1.1mV；对于NM2CAB是359.7±3.63nm、0.23±0.02、-31.3±0.1mV；并且对于NM3CAB是268.47±6.9nm、0.23±0.03、-31.1±0.06mV。在制造后第98天，物理化学参数对于NCAB是327.5±4.9nm、0.21±0.04、-18.2±0.25mV；对于NMCAB是388.7±6.4nm、0.22±0.03、-24.8±2.87mV；对于NM2CAB是369.5±2.5nm、0.19±0.03、-19.6±0.53mV；并且对于NM3CAB是245.6±2.6nm、0.27±0.06、-25.7±0.56mV。SEM图像示出，NCAB、NMCAB、NM2CAB和NM3CAB纳米颗粒具有均匀的杆状形态学。为了证实重现性，以11个不同批次制造NM2CAB制剂(表1)。纳米颗粒尺寸从243.00±2.48nm至378.00±1.90nm变化，具有窄的PDI(0.18±0.03至0.33±0.03)。
制造批号 尺寸±SEM(nm) Pdl±SEM
1 320.13±6.81 0.23±0.02
2 322.10±2.99 0.21±0.01
3 328.67±1.60 0.18±0.03
4 311.43±4.53 0.33±0.03
5 287.17±0.94 0.22±0.01
6 317.57±2.83 0.27±0.01
7 378.00±1.90 0.26±0.01
8 244.63±5.85 0.19±0.01
9 268.97±7.66 0.19±0.02
10 259.77±2.09 0.23±0.01
11 243.00±2.48 0.22±0.01
表1：NM2CAB合成的重现性。
确定了纳米制剂对于前药的抗逆转录病毒活性(EC50)的影响。NCAB、NMCAB、NM2CAB或NM3CAB的抗病毒活性以浓度范围(0.01nM-1000nM)在MDM中确定，并且用HIV-1ADA以0.1的MOI进行病毒攻击之后通过HIV-1逆转录酶活性来测量。与非纳米配制的药物或前药相比，EC50值增加，这可能是由于前药裂解之前需要纳米颗粒溶解。EC50值在NCAB(39.83nM)、NMCAB(89.67nM)、NM2CAB(37.02nM)中是相当的。然而，NM3CAB的EC50值显著增加(～1.78E+06nM)。这可能是前药裂解和随后生成活性CAB较慢以及纳米制剂的细胞内稳定性的效果。为了进一步表征前药纳米制剂并确定体外研究的处理浓度，通过MTT测定在MDM和CEM-ssCD4+T细胞中评估细胞活力。在MDM中，对于所有纳米制剂，在测试浓度范围(10μM-400μM)未观察到细胞毒性。在CEM-ss CD4+T细胞中，细胞毒性被确定为50μM以及更高的浓度。因此，所有纳米制剂的处理浓度为，对于在MDM中的测定是100μM，并且对于在CEM-ss CD4+T细胞中的研究是25μM。
MDM和CEM-ss CD4+T细胞的体外筛选
巨噬细胞可以成功地被用作细胞药物贮库和载体。因为它们的吞噬性质和在全身迁移的能力(Zhou等人,Biomaterials(2018)151:53-65；Darville等人,J.Pharm.Sci.(2014)103:2072-2087；Aderem等人,Ann.Rev.Immunol.(1999)17:593-623；Dou等人,Blood(2006)108:2827-2835)，MDM可以用作病毒储库的药物递送***。因此，MDM被用作评价纳米制剂的体外***(Zhou等人,Biomaterials(2018)151:53-65；Hilaire等人,J.ControlRelease(2019)311-312:201-211；Ibrahim等人,Int.J.Nanomedicine(2019)14:6231-6247；Lin等人,Chem.Commun.(2018)54:8371-8374；Sillman等人,Nat.Commun.(2018)9:443；Smith等人,Biomaterials(2019)223:119476；Soni等人,Biomaterials(2019)222:119441)。
在用100μM的NCAB、NMCAB、NM2CAB或NM3CAB处理后长达24小时，通过测量药物和前药水平进行MDM中的摄取测定。截至24小时，针对NMCAB、NM2CAB和NM3CAB测量的细胞内前药水平分别是61.69±0.78纳摩/106个细胞、84.07±5.82纳摩/106个细胞和73.34±13.59纳摩/106个细胞；并且NCAB、NMCAB、NM2CAB或NM3CAB的细胞内CAB水平分别是0.58±0.11纳摩/106个细胞、12.31±0.46纳摩/106个细胞、17.79±2.92纳摩/106个细胞和7.97±1.76纳摩/106个细胞。然后，在单次处理后的30天时间内评价巨噬细胞保留细胞内药物和前药的能力。用100μM的NCAB、NMCAB、NM2CAB或NM3CAB处理MDM持续8小时。在单次处理后，细胞内前药水平持续长达30天。具体地，在第30天针对NMCAB、NM2CAB和NM3CAB测量的细胞内前药的量是0.41±0.09纳摩/106个细胞、14.21±2.28纳摩/106个细胞和26.70±3.29纳摩/106个细胞。类似地，由前药裂解形成的细胞内CAB水平被测量长达30天。在第30天针对NM2CAB和NM3CAB测量的细胞内CAB水平的量是1.71±0.35纳摩/106个细胞和2.05±0.10纳摩/106个细胞。然而，在NCAB处理之后24小时内，细胞内CAB水平下降至低于定量限；并且在NMCAB处理后的细胞内CAB浓度被测量直至第25天(0.09±0.04纳摩/106个细胞)，并且在第30天检测不到。与保留测定平行，经30天测量释放到培养液中的CAB。NM2CAB示出最持久的CAB释放，在第30天具有1.0±0.10纳摩/106个细胞的药物水平。NCAB处理和NM3CAB处理未检测到CAB。在任何处理的培养基中都没有检测到前药，指示前药的生物转化。
接下来，在用纳米制剂处理持续8小时之后，在第0天、第15天、第30天拍摄MDM的TEM图像，以评估细胞质囊泡中纳米颗粒的存在。TEM图像证实了前药纳米制剂(NM2CAB和NM3CAB)存在于MDM中直至第30天，表明MDM的药物贮库性质；并且验证了摄取、保留和释放结果。在25μM浓度的处理后，在CD4+T细胞中确定了NCAB、NMCAB、NM2CAB或NM3CAB的摄取，反映了在MDM中观察到的情况。在NCAB、NMCAB、NM2CAB或NM3CAB的单次处理持续8小时后，对CEM-ss CD4+T细胞进行的TEM成像证实了细胞质区室中存在纳米颗粒。
为了检查在MDM中持续的药物保留是否将保护免于HIV-1感染，用100μM的NCAB、NMCAB或NM2CAB处理细胞8小时后，用HIV-1ADA攻击长达30天，并且定量地测定HIV-1RT活性以及定性地测定HIV-1p24抗原表达。没有选择NM3CAB进行本研究，因为它在期望的EC50值未示出明显的保护作用。NM2CAB处理抑制HIV-1RT活性长达第30天，并且通过缺少HIV-1p24表达证实。相比之下，在NCAB处理后第1天和NMCAB处理后第20天出现完全的病毒突破。因此，与NCAB和NMCAB相比，NM2CAB呈现出的增强的MDM药物保留提供了针对HIV-1攻击的优异的保护作用。此外，确定了NM2CAB的剂量应答抗逆转录病毒活性(图4)。将MDM用10μM、50μM或100μM的NM2CAB处理持续8小时，并且用HIV-1ADA攻击。与上文类似，抗逆转录病毒活性被确定持续长达30天。在30天之后，在50μM和100μM的NM2CAB处理中观察到完全的病毒抑制，而在10μM的处理中观察到57％的保护作用，并且通过HIV-1p24表达得到验证(图4)。
药代动力学(PK)和生物分布
为了评估PK和生物分布概况，雌性NSG小鼠被IM注射单次剂量的45mg/kg CAB当量的NCAB或NMCAB或NM2CAB。免疫缺陷雌性NSG小鼠被用于评价免疫补偿的模拟疾病病理学和评估泌尿生殖道中的生物分布。NCAB是CAB-LA的有效的等效制剂，因为两种制剂在施用于BALB/cJ小鼠后产生了类似的血浆CAB水平直至第49天。
在注射后第1天，与NMCAB和NM2CAB两者相比，NCAB处理产生了更高的血浆CAB浓度，并且与NM2CAB相比在研究期中示出更快的衰减动力学。在NCAB处理的情况下，血浆CAB浓度维持在高于4倍蛋白调节的90％抑制浓度(4×PA-IC90；664ng/mL)直至第35天(792.7ng/mL)，然后截至第49天(75ng/mL)快速下降至低于PA-IC90(166ng/mL)，然后截至第126天下降至低于定量限(0.5ng/mL)。NMCAB治疗示出较慢的衰减，并且维持血浆CAB水平高于4×PA-IC90直至第91天(673.8ng/mL)，并且高于PA-IC90直至第168天(186.7ng/mL)。在NMCAB处理后第364天，CAB水平被定量在8.5ng/mL。形成鲜明对比的是，直至第364天，与NCAB和NMCAB两者相比，NM2CAB处理提供了较慢的血浆衰减动力学，维持持续的血浆CAB浓度高于4×PA-IC90直至第231天(702ng/mL)，并且高于PA-IC90直至第364天(354.2ng/mL)。对于所有处理组，使用非房室分析确定CAB的血浆药代动力学参数。PK参数的定量展示出NM2CAB(131.56天)处理后的表观CAB半衰期分别是NCAB(7.80天)和NMCAB(44.40天)的17倍和3倍。类似地，NM2CAB的CAB平均停留时间(MRT)是NCAB的21倍(分别是201.94天相对于9.79天)，并且是NMCAB的7倍(分别是201.94天相对于30.76天)。
NM2CAB还引起持续长达一年的显著较高的CAB组织水平。在单次IM注射之后第14天、第28天、第42天和364天，评估***组织、直肠组织、脾、肝、肠、脑、肾、肺和***解剖相关组织中CAB的组织生物分布。仅在第28天和第364天在与***相关的解剖区域中确定***中的药物水平，因为***在免疫缺陷NSG小鼠中的不成熟状态。特别地，MCAB水平在第14天、第28天和第42天低于M2CAB，并且在第364天检测不到。对于NM2CAB，在第364天，前药水平是3414.8ng/g(脾)、909.8ng/g(肝)、52.7ng/g(肺)、50.3ng/g(脑)、3.9ng/g(肾)和18710.1ng/g(***)。在第28天，所有组织中的CAB水平在NCAB和NM2CAB之间是相当的。然而，截至第42天，与NM2CAB处理之后的水平相比，在NCAB处理之后测试的所有组织中的CAB水平显著更低(***组织、脾、肠、脑、肾和肺、直肠组织和脑)。然而，与NCAB处理和NM2CAB处理相比，在NMCAB处理后直至第42天，组织中的CAB水平显著更高。在用NM2CAB处理后第364天，与其他制剂相比，所有测试的组织中的CAB浓度显著更高，并且CAB水平被测量为27ng/g(***组织)、19.7ng/g(直肠)、41.1ng/g(脾)、67.62ng/g(***解剖相关组织)、123.9ng/g(肝)、10.3ng/g(肠)、7.5ng/g(脑)、33.2ng/g(肾)和35.5ng/g(肝)。相比之下，在用NCAB或NMCAB处理之后第364天，所有组织中的CAB水平显著低或低于定量限(0.5ng/g)。
还测试了血液和所有组织中的前药(MCAB或M2CAB)浓度(图5)。在注射后第1天，两种前药在血液中的浓度较低，MCAB为22ng/mL并且M2CAB为31.3ng/mL，并且快速变为低于定量限，表明前药生物转化为活性母体药物。所有筛选的组织都是M2CAB的重要贮库，并且在整个研究期间都保持了M2CAB的水平。与NCAB(41237.6ng/mL)、NMCAB(30148.9ng/mL)和NM2CAB(7076.1ng/mL)相比，在雌性NSG小鼠中单次IM注射NM3CAB(45mg/kg CAB当量)在施用后第1天产生低水平的血浆CAB(2248ng/mL)。血浆CAB水平在治疗之后28天内达到约PA-IC90(233.2ng/mL)。在第28天测量CAB和M3CAB的血浆和组织水平。为了验证M3CAB的较慢水解，在BALB/cJ小鼠中以相同剂量单次IM注射NM3CAB后重复PK评价。与NSG小鼠中的PK结果类似，NM3CAB在施用后第1天产生低水平的血浆CAB(777.8ng/mL)；并且在28天内血浆CAB水平下降到低于1倍PA-IC90(98.9ng/mL)。这些数据证实了M3CAB前药较慢的前药水解和随后的生物转化为CAB。
在另一种小鼠品系BALB/cJ(雄性)中证实了NM2CAB在所有制剂中的优异的PK和BD概况。在这里，野生型小鼠被用于验证来自免疫缺陷NSG小鼠的结果。NM2CAB在血浆和组织中的PK和BD测量值与NSG小鼠中的那些平行。特别地，截至第231天，NM2CAB的血浆CAB浓度高于PA-IC90(170.8ng/mL)，证实了药物表观半衰期的改善。NCAB被用作对照，其中截至第28天，CAB水平变为低于PA-IC90(12.28ng/mL)。
为了验证在啮齿动物中观察到的结果，恒河猴被IM注射单次剂量的45mg/kg CAB当量的NM2CAB。测量血浆CAB和前药(M2CAB)水平直至第393天。与小鼠中的结果类似，NM2CAB处理提供了较慢的血浆衰减动力学，将持续的血浆CAB浓度维持直至第393天。在第393天，CAB水平被测量为56.1ng/mL的平均值。如所预期的，相比CAB水平，在整个研究中血浆M2CAB浓度更低，表明前药生物转化为其活性母体药物(图6A)。在NM2CAB施用后第204天收集直肠、***和脂肪组织活检，并且分析CAB水平和M2CAB水平。直肠、***和脂肪组织中的CAB浓度分别是10.12ng/g、22.7ng/g和29.5ng/g(图6B)。M2CAB在***和脂肪组织中以高水平存在(分别为33.3ng/g和233.2ng/g)，在直肠组织中具有较低水平(1.7ng/g)(图6C)。
毒性评价
NM2CAB施用后，在小鼠和恒河猴两者中都进行了毒理学测定。对于NSG小鼠中的毒性评估，每周记录动物体重持续一年；并且在研究得出结论时(第364天)，收集血浆和组织分别用于代谢谱和组织病理学。施用年龄匹配的未处理的小鼠作为对照。在来自所有组的动物中没有观察到体重差异。综合血清化学参数使用VetScan综合诊断概况盘(VetScancomprehensive diagnostic profile disc)和VetScan VS-2仪器进行定量。检查的参数是丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、淀粉酶(AMY)、总钙(CA++)、肌酐(CRE)、球蛋白(GLOB)、葡萄糖(GLU)、磷(PHOS)、钾(K+)、钠(NA+)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(TP)和尿素氮(BUN)。在对照和NM2CAB处理组之间没有注意到显著差异，指示NM2CAB没有不利地影响全身器官的功能。由经认证的病理学家对用H&E染色的组织切片(肝、肺、肠、脾、肾和脑)进行的组织学检查显示，在NM2CAB处理的动物中没有异常病理学。此外，两种品系的小鼠(NSG和BALB/cJ)对该制剂耐受良好，并且没有观察到注射部位反应和行为或运动的变化。
对于恒河猴中的评估，从制剂施用前开始记录体重，并且收集血浆和外周血单核细胞(PBMC)用于全血细胞计数和代谢谱，直至NM2CAB施用后第393天。通过测量血液学概况(中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞)和代谢谱(ALT、碱性磷酸酶、BUN/肌酐)两者来评价全身毒性。在注射后，任何动物中未记录到体重变化。所有动物中在注射部位处观察到的最初的轻微发红在第3天前得到解决。在注射之后3天没有注意到炎症或硬块(bolus)。在NM2CAB施用之前和之后，对中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞进行计数；并且血细胞计数是一致的。在注射后第1天，记录了中性粒细胞计数的增加，并且中性粒细胞计数在所有动物中在2周内恢复正常。这样的变化可能与注射有关，并且可能与药物无关。在治疗后，在所有动物中肝和肾的代谢谱没有变化。总体而言，在NM2CAB施用之后未观察到不良事件。
药物-药物相互作用
评价了不同类别的药物(CAB(INSTI)和利匹韦林(RPV；NNRTI))的两种前药纳米制剂(NM2CAB和NM3PRV)之间的药物-药物相互作用。由于目前长效CAB和RPV的纳米制剂的的组合临床开发，RPV是与CAB一起的药物的选择。NM3RPV是RPV的长效制剂(Hilaire等人,J.Control Release(2019)311-312:201-211)。BALB/cJ小鼠用单次剂量的单独的NM2CAB(45mg/kg CAB当量)、单独的NM3RPV(45mg/kg RPV当量)或两种前药纳米制剂的共施用(NM2CAB和NM3RPV，45mg/kg药物当量)进行IM治疗。测量了CAB和RPV的血浆水平，在用单独或组合的制剂治疗的动物之间没有观察到活性药物水平的差异，表明多于一种前药纳米制剂的组合用于治疗或预防的用途。
在不能根除HIV感染的情况下，针对处于风险的人的保护性疫苗和暴露前预防(PrEP)、长效ART是可用于预防疾病和阻止新的感染和病毒传播的仅有的方法。对于那些处于感染风险的人而言，“作为预防的治疗”突出了这一点。开发LA ARV可注射剂的焦点是创造具有长半衰期的药物。对于PrEP，LA ARV需要防止HIV暴露之后的感染的“覆盖范围(coverage)”。病毒感染需要在血浆中检测到保护性ARV水平的时间段期间被停止。药物还必须在没有不利副作用的情况下被给予，不利副作用包括胃肠道毒性和任何明显的药物-药物相互作用。目前，由于具有消除病毒感染的污名以及需要少于每日的给药间隔(一些以每2个至3个月的频率给药)的潜在优点，LA剂已经受到***的欢迎。通过皮下或肌内途径施用的LA ARV高度有效，并且已经证明提高了生活质量和寿命(May等人,AIDS(2014)28:1193-1202；Antiretroviral Therapy Cohort,Lancet(2017)HIV 4:e349-e356)。它们有助于避免缺乏对药物的依从性，对药物的依从性仍然是关键的治疗挑战(Shubber等人,PLoSMed.(2016)13:e1002183；Osterberg等人,New Eng.J.Med.(2005)353:487-497)。事实上，任何导致治疗失败、抗药突变和新的病毒传播的对ARV方案不良依从性都可以通过改善的依从性来消除。在改进现有的LA ARV平台的尝试中，已经开发了长效缓慢有效释放抗逆转录病毒疗法(LASER ART)前药。这些新的制剂用于降低注射频率，同时在更长的持续时间内保持ARV的持续的治疗水平(Edagwa等人,Exp.Opinion Drug Del.(2017)14:1281-1291)。LASER ART包括通过对现有ARV的化学修饰进行的前药合成，以提供慢的天然药物溶解、差的水溶性、增强的通过细胞生物膜和组织储库的渗透以及有限的全身性脱靶毒性。前药合成允许形成由聚合物赋形剂稳定的ARV纳米晶体。LASER ART制剂的PK和效力(PD)已经在一系列ARV中得到证实，包括但不限于多替拉韦(DTG)、CAB、阿巴卡韦(ABC)、拉米夫定(3TC)和恩曲他滨(FTC)(Zhou等人,Biomaterials(2018)151:53-65；Hilaire等人,J.ControlRelease(2019)311-312:201-211；Ibrahim等人,Int.J.Nanomed.(2019)14:6231-6247；Lin等人,Chem.Commun.(2018)54:8371-8374；McMillan等人,Antimicrob.Agents Chemother.(2018)62:e01316-17；McMillan等人,AIDS(2019)33:585-588；Sillman等人,Nat.Commun.(2018)9:443；Smith等人,Biomaterials(2019)223:119476；Soni等人,Biomaterials(2019)222:119441)。
CAB是一种HIV-1整合酶链转移抑制剂(INSTI)，并且目前正在被开发为口服和LA可注射剂二者(McPherson等人,Expert Opin.Investig.Drugs(2018)27:413-420)。其独特的固有性质，诸如疏水性质、长全身半衰期(口服施用之后约40小时)、高效能、耐受特性(resistant profile)、低的每日口服给药要求(≤30mg/天)和有限的药物-药物相互作用，使其成为开发成LA可注射剂的有吸引力的候选物(Trezza等人,Curr.Opin.HIV AIDS(2015)10:239-245)。本文中，证明了单次注射NM2CAB在药物持久性方面产生了出乎意料地优异的改善，这由与NCAB、NMCAB或NM3CAB相比的持续的药物血浆浓度和组织生物分布反映。NM2CAB提供了持续的血浆衰减，同时在单次注射后364天内将药物水平保持在高于166ng/mL的PA-IC90。
目前接近临床批准的CAB LA在恒河猴中被广泛的研究，证实其用作ARV可注射剂用于暴露前预防(PrEP)研究的能力(Edagwa等人,Exp.Opin.Drug Del.(2017)14:1281-1291；Stellbrink等人,Curr.Opin.HIV AIDS(2018)13:334-340)。这些研究证明，CAB LA针对***、直肠、静脉内和***的SHIV株攻击提供了高度的保护作用，这支持其未来用作具有高的HIV暴露风险的那些人群和静脉内药物使用者的PrEP。高于3×PA-IC90的血浆水平提供针对病毒攻击的100％的保护，并且高于PA-IC90的浓度提供针对病毒攻击的97％的保护(Edagwa等人,Exp.Opin.Drug Del.(2017)14:1281-1291；Stellbrink等人,Curr.Opin.HIVAIDS(2018)13:334-340)。本文中，NM2CAB施用产生高于PA-IC90的血浆CAB浓度持续超过6个月，表明其优越性以及其作为PrEP的临床效力。
总之，针对HIV-1感染患者的有效抗逆转录病毒药物(ARV)治疗和预防措施的开发已经使HIV感染从必然死亡转变为可控制的终身慢性病。控制HIV-1流行的需求仍然存在，因为估计全世界有3790万人被感染。LA ARV的出现无疑将扩大克服次最优药物依从性挑战的选择，并且减轻HIV感染的负担。迄今为止，使用含富马酸替诺福韦酯(TDF)的化合物在最大程度上证明了HIV抗逆转录病毒剂的化学预防。然而，每日或接近每日口服片剂所需的依从性水平被证明是挑战性的。在理解安全性、耐受性和效力将继续作为治疗结果评估的一部分的情况下，LA制品为实现预防提供了更多的选择。能够每月或更低频率地施用的LAARV将改善治疗依从性，并且延长PrEP的机会。
在先前说明书中引用了许多出版物和专利文件，以便描述本发明所属领域的现有技术。这些引用中的每个的完整公开内容通过引用并入本文。
虽然上文已经描述并且具体例示了本发明的某些优选的实施方案，但本发明不意图被限于这些实施方案。在不偏离如所附权利要求中阐述的本发明的范围和精神的情况下，可以对这些实施方案进行多种修改。
本文还提供以下项目：
1.整合酶抑制剂的前药或其药学上可接受的盐，其中所述前药包括含有与所述整合酶抑制剂缀合的脂肪族基团或烃基基团的酯。
2.根据项目1所述的前药，其中所述整合酶抑制剂选自由以下组成的组：卡博特韦(CAB)、拉替拉韦(RAL)、艾维雷韦(EVG)、多替拉韦(DTG)、比克替拉韦(BIC)、BI 224436和MK-2048。
3.根据项目1所述的前药，其中所述整合酶抑制剂选自由以下组成的组：卡博特韦(CAB)、拉替拉韦(RAL)、艾维雷韦(EVG)、多替拉韦(DTG)和比克替拉韦(BIC)。
4.根据项目1所述的前药或其药学上可接受的盐，其中所述前药选自由以下组成的组：
Figure GDA0003305758360000561
Figure GDA0003305758360000571
其中R是任选地被取代的脂肪族基团或烃基基团。
5.根据项目4所述的前药，其中R是脂肪酸的烃基链。
6.根据项目4所述的前药，其中R具有至少15个碳的主链。
7.根据项目4所述的前药，其中R是长度为15个至19个碳的饱和线性脂肪族链。
8.根据项目4所述的前药，其中R是长度为15个至17个碳的饱和线性脂肪族链。
9.根据项目4所述的前药，其中R是长度为17个碳的饱和线性脂肪族链。
10.根据项目1所述的前药或其药学上可接受的盐，其中所述前药是
Figure GDA0003305758360000581
11.一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含至少一种项目1-10中任一项所述的前药和至少一种聚合物或表面活性剂。
12.根据项目11所述的纳米颗粒，其中所述前药是结晶的。
13.根据项目11所述的纳米颗粒，其中所述聚合物或表面活性剂是两亲性嵌段共聚物。
14.根据项目13所述的纳米颗粒，其中所述两亲性嵌段共聚物包含至少一个聚(氧乙烯)嵌段和至少一个聚(氧丙烯)嵌段。
15.根据项目11所述的纳米颗粒，其中所述聚合物或表面活性剂是P407。
16.根据项目11所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒还包含连接至至少一种靶向配体的聚合物或表面活性剂。
17.根据项目11所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径是约100nm至1μm。
18.一种组合物，所述组合物包含至少一种项目11所述的纳米颗粒和至少一种药学上可接受的载体。
19.一种组合物，所述组合物包含至少一种项目1-10中任一项所述的前药和至少一种药学上可接受的载体。
20.一种用于治疗、抑制和/或预防有相应需要的受试者的疾病或紊乱的方法，所述方法包括向所述受试者施用项目1所述的前药或项目11所述的纳米颗粒。
21.根据项目20所述的方法，其中所述疾病或紊乱是病毒感染。
22.根据项目21所述的方法，其中所述疾病或紊乱是逆转录病毒感染。
23.根据项目21所述的方法，其中所述病毒感染是HIV感染。
24.根据项目1所述的前药或根据项目11所述的纳米颗粒，用于治疗疾病或紊乱。

Claims (6)

1.一种式I的化合物：
Figure FDA0003993895050000011
或其药学上可接受的盐，其中R是长度为17个碳的饱和线性脂肪族链。
2.一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及聚合物或表面活性剂，其中所述聚合物或表面活性剂是泊洛沙姆407(P407)。
3.一种药物组合物，所述药物组合物包含：权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
4.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐、权利要求2所述的纳米颗粒或权利要求3所述的药物组合物在制造用于治疗有相应需要的受试者的HIV感染的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中当所述药物被使用时，所述化合物或其药学上可接受的盐、所述纳米颗粒或所述药物组合物经由注射被施用至所述受试者。
6.根据权利要求4所述的用途，其中当所述药物被使用时，所述化合物或其药学上可接受的盐、所述纳米颗粒或所述药物组合物在3个月、6个月、9个月、12个月、18个月或24个月时间段内被施用至所述受试者一次。
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