CN113223618A - 基于宏基因组的临床重要致病菌毒力基因检测的方法及*** - Google Patents

基于宏基因组的临床重要致病菌毒力基因检测的方法及*** Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于宏基因组的临床重要致病菌毒力基因检测的方法和***。该方法包括：S10，建立临床致病菌毒力基因数据库；S20，获取临床样本宏基因组测序原始数据，对其预处理获得目标数据；S30，利用预设宏基因组测序数据多重比对注释***分析目标数据，鉴定毒力基因；S40，建立重要毒力基因‑毒力因子‑表征(功能/临床表型)关联数据库；S50，利用预设临床自动化报告***，基于毒力基因鉴定结果和关联数据库，生成毒力基因鉴定报告。该***能够对不同类型(脑脊液等)的临床感染样本的宏基因组测序数据进行毒力基因鉴定，一次性鉴定样本中多种病原菌的多个重要毒力基因，具有较好的灵敏性和准确性，帮助医生及时进行诊断、治疗和预后。

Description

基于宏基因组的临床重要致病菌毒力基因检测的方法及***
技术领域
本发明属于生物信息算法软件技术领域。可以应用于临床致病菌检测产品-病原宏基因组检测的临床致病菌毒力基因分析，包括多种临床致病菌的数百个毒力基因。应用领域：各类感染性疾病患者的组织、体液(脑脊液、肺泡灌洗液、血液、痰液)等样本的病原宏基因组检测的致病菌毒力基因的识别、鉴定和溯源，协助临床医生进行精准诊断、治疗方案选择和预后判断，且在细菌感染类疾病的监控中提供有用信息。
背景技术
细菌作为在自然界中广泛分布的微生物，其感染人类事件在世界范围内发生，细菌感染可以引发多种急性和慢性疾病，也可以作为条件致病菌，通过病原、宿主及环境因素之间相互作用引发疾病，其中某些临床致病菌会严重危害人类生命健康。如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，常引起人类化脓感染，可直接导致肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓血症等全身感染。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)广泛存在于动物粘膜表面(如人体胃肠道)或环境，是医院医疗相关感染、严重社区获得性感染的主要病原。在中国，肺炎克雷伯菌占呼吸机相关肺炎和重症监护病房获得性肺炎分离病原体的11.9％。而肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是社区获得性肺炎、中耳炎、脑膜炎、脓肿、败血症等主要致病菌之一。在发展中国家，每年超过110万儿童因患肺炎而死亡，其中肺炎链球菌导致的约占20％。另一类治疗棘手、致死率高、常呈现多重耐药或泛耐药的是铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)，它是一种革兰氏阴性菌，易在呼吸道形成定植和感染，特别是免疫力低下人群易感。这些临床致病菌在感染人类的过程中常常通过多种毒力基因发挥其致病性，导致疾病发生。
毒力因子是病原微生物产生、导致宿主疾病发生的一类效应或调控分子(蛋白质、脂质分子或化合物等)及其组合的功能单元的统称。编码这些毒力因子的基因，常称为毒力基因。如金黄色葡萄球菌可通过产生多种毒力因子来实现对宿主细胞的黏附、侵染和散播，并可通过形成生物被膜逃避宿主免疫***或抗生素的作用，其重要毒力基因包括pvl、sea、seb等，pvl可促进中性粒细胞溶解而赋予菌株强致病性，与皮肤、软组织化脓性感染相关，严重者可导致坏死性肺炎，致死率较高；sea、seb等肠毒素基因可刺激呕吐中枢导致以呕吐为主要症状的急性肠胃炎，是引起人类细菌性食物中毒的主要原因。而肺炎链球菌具有多种毒力基因，如荚膜多糖合成素A基因、肺炎链球菌溶血素基因(ply)、lytA和nanA等。其中cps4A等荚膜相关基因是肺炎链球菌具有致病性的前提；溶血素可导致宿主细胞溶解，引起肺泡水肿和出血，并诱发肺炎，以及促使细菌进入血液引起菌血症；lytA参与细菌的自溶，导致溶血素等成分分泌，会引起宿主的强炎症反应。肺炎克雷伯菌的不同菌株毒力基因的差异会导致其致病性的差异，其重要毒力基因有rmpA，可调节其荚膜多糖合成，参与其高黏液表型的产生，导致菌株的强致病性，与iutA等毒力基因共同影响形成肝脓肿时的毒力作用等。这些编码毒素、表面蛋白质等毒力因子的毒力基因，能协助细菌粘附与侵入宿主细胞、提高其在宿主细胞内存活与繁殖、导致宿主细胞中毒死亡等，最终引发宿主的各种感染性疾病。因此，检测鉴定临床样本高频或重要致病菌的毒力基因，有助于识别潜在的致病菌，评估临床菌株的毒力强弱，辅助临床感染类疾病的诊断、精准治疗、预后处理等具体措施的选择实施。另一方面，在公共卫生领域，毒力基因检测及其特定毒力谱的识别，对细菌感染类疾病的监控、疫情暴发几率的判断、疫情严重性评估等方面提供了有用信息，助力合理疾控防治措施的提出和实施。
目前临床致病菌的毒力基因检测和鉴定方法主要如下：基于聚合酶链式反应(PCR)及其衍生技术的单/多基因检测、环介导等温扩增、基因芯片和二代测序宏基因组检测技术等。其中，临床应用最为广泛的为PCR技术，主要针对特定毒力基因的核酸序列的保守区域设计特异性引物，以临床样本或分离菌株的核酸为模板进行扩增检测。该技术可以实现基因的快速检测，有着灵敏性高特点。临床应用主要包括：1)多重PCR技术：在同一PCR反应体系中加入两对及以上引物，同时扩增出多个核酸片段，可以同时对两个及以上毒力基因进行检测鉴定；2)荧光定量PCR技术：在普通PCR基础上，增加了每一循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板DNA定量及定性的分析，与普通PCR相比，实时荧光定量PCR有着可定量、更为简便、敏感、快速等优点。同时，上述两种PCR技术也存在着操作较复杂，对仪器和人员要求较高，不适合现场快速诊断等缺点。环介导等温扩增反应(LAMP)是一种不同于PCR的新式核酸扩增技术，它依靠一种具有链置换活性的DNA聚合酶和2对特殊设计的引物，不需要反复的温度循环和昂贵的仪器设备，在等温条件下即可高效快速地完成扩增反应，目前已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测鉴定。相比于普通PCR技术，LAMP具有高特异性、高灵敏度、操作简单、对仪器设备要求低、可在恒温条件下快速完成核酸扩增等特点。不足之处是对引物设计要求高，不易辨别非特异性扩增，受污染影响较大等。基因芯片，又称为DNA微阵列(DNA microarray)，指采用原位合成(in-situ synthesis)或微量点样等方法将大量DNA探针如基因片段、人工合成的寡核苷酸等以预先设计的方式固定在载体上组成密集分子阵列,与荧光素或其它方式标记的核酸样品进行杂交,通过检测杂交信号的强弱来判断样品中有无靶基因并定量。近年的发展使得基因芯片技术也被应用在基因表达分析、突变和多态性分析等领域。相较于PCR或LAMP技术，基因芯片技术具有一次实验可实现大量基因的检测，快速、高度并行性、多样性和自动化等优点。另一方面，基因芯片检测成本昂贵，对操作要求高、灵敏性较差，这些则导致其应用范围受限。无论PCR、LAMP或基因芯片均有着需要对样本的先验知识有所了解，仅能检测特定细菌的特定毒力基因，难以应对变异较大、未预估的基因类别，无法全面覆盖在临床上有重要意义的毒力基因。近年快速发展的、基于二代测序的宏基因组测序技术(Metagenomic sequencing)，在克服上述缺点上有着独有的优势。宏基因组测序无需单独对病原分离培养，通过核酸提取纯化，可以直接分析临床样本。利用序列同源性比对，进行全面的毒力基因注释和鉴定。
临床感染类疾病样本中存在多种致病菌，其致病机制涉及不同毒力因子，由多个毒力基因协同调控作用，产生致病性。涉及微生物毒力基因检测的现有技术包括PCR及其衍生技术、环介导等温扩增、基因芯片等，均存在检测毒力基因数量与范围有限、需先验认知、易交叉污染等问题。目前毒力基因鉴定的产品主要是基于PCR技术，此类技术只能检测有限范围的细菌和有限数量的毒力基因。特别是普通PCR，一次实验仅能检测一种细菌的一个毒力基因，如中国专利公开CN110669853A，只能检测非粘性肺炎克雷伯菌的ampR基因。即使是多重PCR，也需要考虑引物对数量过多会易形成二聚体，影响扩增效率的问题，而导致检测毒力基因数量较少，如中国专利公开CN111876509A，应用多重PCR技术一次检测鲍曼不动杆菌的abaR、CsuA、bap等四个毒力基因，中国专利公开CN109554449A的多重PCR产品检测气单胞菌的7个毒力基因和中国专利公开CN108707680A技术设计七重PCR检测引物组，也仅覆盖了无乳链球菌的sip、fbsA、hylB等21个毒力基因的特定区域。多重荧光PCR技术由于结果判读便捷也被应用在毒力基因的检测上，如2020年提交的中国专利公开CN112430677A设计多重荧光PCR定量检测了肺炎克雷伯菌的icuA、rmpA1、rmpA2三个毒力基因。同时，近年发展出来的环介导等温扩增技术也被应用于临床毒力基因检测。如中国专利公开CN11150075A应用2对引物扩增高毒力肺炎克雷伯菌的peg-344基因的6个不同区域，鉴定临床高毒力株。基因芯片由于成本较高，较少应用于临床毒力基因检测。2016年提交的中国专利授权CN105950732B产品，设计鉴定9种动物源食品致病菌：沙门氏菌(Salmonella)、肠球菌(Enterococcus)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)等的17个毒力基因。现有的这些技术由于实验前均需要设计或使用已知的一个或特定若干基因的特异性引物，因此只能检测预先设定范围内的毒力基因。临床上需要更灵敏、更全面的感染类致病菌的毒力基因检测策略，满足我国对高发、高毒性的重要致病菌的诊断、治疗和流行病学监控的需求。近年发展起来的宏基因组测序技术，以特定生境中的整个微生物群落作为研究对象，直接提取临床样本的全部微生物组的DNA进行测序注释和比对分析。该技术弥补了以前测序方法的不足，无需培养，无需样本的先验知识，可以同时对临床病原宏基因组进行全面的毒力基因扫描和鉴定。目前中国专利公开申请或获得的项目中没有基于宏基因组的毒力基因检测的产品或类似项目，研发和推广该类产品有助于满足临床感染类疾病高毒力致病菌诊断的需要。
发明内容
本专利提供一种基于宏基因组的临床重要致病菌毒力基因检测的方法和***，包括但不限于肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌等多种致病菌的数百个重要毒力基因鉴定，如rmpA、iucA、ply、cps、stx1A、bexA、lukF-PV、hly、ompA、plc、cylL、ctxA、eccA1、lipA、slo、acm、icmTlef、toxA、pgm等。本方法包含以下主要部分：1)建立临床致病菌毒力基因数据库；2)获取临床样本宏基因组测序原始数据，对其预处理获得目标数据；3)利用预设宏基因组测序数据多重比对注释***分析目标数据，鉴定毒力基因；4)建立重要毒力基因-毒力因子-表征(功能/临床表型)关联数据库；5)利用预设临床自动化报告***，基于毒力基因鉴定结果和关联数据库，生成毒力基因鉴定报告。该方法适用于临床多种感染疾病样本类型(脑脊液、肺泡灌洗液、血液等)，一次性对多种临床致病菌的多个高频和重要毒力基因进行鉴定，减少额外筛查时间，深度关联数据库、多重比对策略具有较高的灵敏性和准确性，自动化报告***快速生成报告，帮助医生及时进行感染类高毒力致病菌株的鉴定诊断、治疗和预后。
本发明的第一方面在于公开一种基于宏基因组的临床重要致病菌毒力基因检测的方法，包括：
S10，建立临床致病菌毒力基因数据库；
S20，获取临床样本宏基因组测序原始数据，预处理获得目标数据；
S30，利用预设宏基因组测序数据多重比对注释***分析目标数据，鉴定毒力基因；
S40，建立重要毒力基因-毒力因子-表征(功能/临床表型)关联数据库；
S50，利用预设临床自动化报告***，基于S30毒力基因鉴定结果和S40关联数据库，生成毒力基因鉴定报告。
在本发明的一些实施方式中，所述S10包括以下步骤：
从毒力基因数据库中获取临床致病菌毒力基因及序列；
从公共数据库获取所述临床致病菌的全部基因组、基因序列及注释信息；
过滤基因序列中的假基因、片段和错误注释的序列；
多重阈值聚类各基因单元序列，组内交叉比对去重；
模拟数据集测试基因单元参考基因序列，调整补充基因单元参考序列；
循环多重阈值聚类各基因单元序列，组内交叉比对去重；
对各基因单元参考序列聚类，过滤异常序列；
提取参考序列的基因名、物种名等公共数据库注释信息，校对和标准化各基因单元参考序列注释；
建立全部毒力基因单元的参考序列索引；
和可选的，建立软件实现自动下载序列、聚类去重、更新和标准化数据库。
在本发明的一些实施方式中，所述S20包括：
过滤质量值低于2，碱基数占整个read 40％的读序；
切除滑窗(5bp)内碱基平均质量小于20的碱基；
过滤平均质量小于20、含N数量大于5、长度小于50的读序。
在本发明的一些实施方式中，所述S30包括以下步骤：
特定毒力基因的参考序列集设为：{s1,s2,…,sn}；其中，sn：参考序列n；
应用多重比对算法比对宏基因组的高质量读序(clean reads)到参考序列集，阈值e-value＝1e-5；
每条读序的比对结果为：{R1,R2,…,Rm}∈gi；其中，0≤m≤n；Rm：第m个比对的结果；gi：第i个基因单元；
毒力基因的检出结果(VF-result)的过滤策略：
Figure BDA0003085682040000051
其中，id＝序列相似度得分(％)；
Figure BDA0003085682040000052
score＝序列两两比对的质量得分；
过滤条件：VF-result∈gi，i>1，丢弃，结果为无；
和可选的，建立软件实现自动化比对、过滤和结果列表产生。
在本发明的一些实施方式中，所述S30的比对结果包括：
当比对结果为单一结果(m＝1)，取该结果(Rm)为最终结果(r)；
当多个比对结果(m>1)，且靶向参考序列为相同物种的同一基因单元,得分排序后，最终结果ri如下：
Figure BDA0003085682040000061
当多个比对结果(m>1)，且靶向参考序列为相同物种的不同基因单元(gi，i>1)，最终结果r为每个基因分组中取最优结果的并集{r1,r2,…,ri}，其中，gi分组中结果如下：
Figure BDA0003085682040000062
在本发明的一些实施方式中，所述S40包括以下步骤：
致病菌临床样本的宏基因组测序数据收集；
基于所述S20和S30对上述数据进行分析，构建每个样本单个致病菌的毒力基因谱；
样本相应临床表型和生理生化指标提取和标准化；
应用最大似然法分析提取基因特征；
结合临床常规检测指标和毒力基因的序列特征(PAAC和PSSM-C)，应用多重机器学习策略构建临床诊断相关的毒力基因特征谱；
聚类协同作用的毒力基因到单一毒力因子单元，关联相应的表征(功能/临床表型)；
构建毒力因子-毒力基因，毒力因子-表征(功能/临床表型)关联表，建立临床重要毒力基因-毒力因子-表征(功能/临床表型)关联数据库；
和可选的，通过软件实现自动化比对、过滤和结果列表产生。
在本发明的一些实施方式中，所述S40中的应用最大似然法分析提取基因特征包括：
毒力基因的蛋白序列理化特征(PAAC)的提取：
Figure BDA0003085682040000063
Ai：20个氨基酸的理化特征集，
Figure BDA0003085682040000064
第N位理化特征,N：氨基酸理化特征总数；
其中，单个氨基酸理化特征如下：
Figure BDA0003085682040000065
对于任意两个氨基酸Rb和Rd的相关性为：
Figure BDA0003085682040000066
Fk(Rb)是Rb的第q位的理化特征；
对于长度为L的氨基酸序列，序列位置相关性参数θh定义如下：
Figure BDA0003085682040000067
则，对于20+λ(λ＝2)维度序列里氨基酸e的理化特征提取公式如下：
Figure BDA0003085682040000071
其中，fe：氨基酸e在序列中的频率；ω：氨基酸在序列在的位次加权参数，默认值为0.1。
毒力蛋白序列的进化特征(PSSM)的提取：
转化基因单元内毒力基因的蛋白序列为原始PSSM矩阵如下：
Figure BDA0003085682040000072
其中，L：序列长度；20:列数呈现20个天然氨基酸；pu,v：第u个氨基酸进化突变为第v个氨基酸可能性；
PSSM-C转换PSSM矩阵为20x20矩阵，其中第u行的氨基酸Zu计算如下：
Figure BDA0003085682040000073
其中，
Figure BDA0003085682040000074
zt：原始PSSM表中第t位的值；pt：序列中第t位的氨基酸；L：序列的长度；au是20种氨基酸中第u位的氨基酸。
在本发明的一些实施方式中，所述S50包括以下步骤：
导入所述S30获得的结果列表，比对所述S40关联数据库，生成毒力基因结果，包含致病菌物种(物种拉丁名、中文名)和基因信息(基因名、毒力因子、表征和支持得分等)；
将上述结果导入报告模板的相应表格；
将数据库的客户信息导入报告模板；
生成最终的临床样本的特定致病菌的毒力基因鉴定报告(PDF格式)。
本发明的第二方面在于公开一种基于宏基因组的临床重要致病菌毒力基因检测的***，包括以下组成部分：
临床致病菌毒力基因数据库；
重要毒力基因-毒力因子-表征(功能/临床表型)关联数据库；
宏基因组测序数据多重比对注释***；
临床自动化报告***。
本发明的有益技术效果是：
(1)建立了一种基于宏基因组的临床重要致病菌毒力基因检测***，克服了目前现有技术与方法的多方面局限性，能够对不同样本类型(脑脊液、肺部灌洗液、血液、咽拭子等)，核酸含量偏低的临床感染样本进行毒力基因检测鉴定，可一次性对多种临床致病菌的数百个重要毒力基因进行鉴定，减少额外筛查时间。深度层级数据库、两步法比对策略提高了鉴定的灵敏性和准确性。临床自动化报告***快速生成报告，帮助医生及时进行诊断、治疗和预后；
(2)构建全面、经过人工校对的临床重要致病菌毒力基因数据库，包含多种临床重要致病菌的数百个重要毒力基因的全部参考序列，以及校对后的物种和功能注释信息；
(3)应用机器学习算法进行文献和临床大数据挖掘，识别每个致病菌高频、重要毒力基因谱及其毒力因子与表征(功能/临床表型)，并按基因的协同效应划分为不同毒力因子单元，建立重要毒力基因及其毒力因子与表征(功能/临床表型)的强关联知识库，对临床诊断和预后处理更具参考价值；
(4)基于大样本分析后的比对分级阈值过滤算法，兼顾比对的准确性同时，提高毒力基因检测结果的敏感性，克服了现有相关技术对于低丰度、短读序样本鉴定的局限性，尤其适宜于单端短读序(50～75bp)、低核酸含量的临床样本(如脑脊液)的毒力基因检测鉴定；
(5)临床自动化报告***中整合宏基因组数据的比对结果和重要毒力基因的毒力因子与表征(功能/临床表型)信息，有着较高可靠性和临床实用性。
附图说明
图1本发明的一种实施方式的临床重要致病菌毒力基因检测方法的流程图；
图2本发明的一种实施方式的临床重要致病菌毒力基因检测***的工作流程图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
如图1所示，基于宏基因组的临床重要致病菌毒力基因检测方法，主要步骤如下：
1.建立临床致病菌毒力基因数据库
1.1.从VFDB等毒力数据库中，获取24种重要致病菌(覆盖18个属，10种革兰氏阴性菌，14种革兰氏阳性菌)的1761个毒力基因及其序列；
1.2.从公共数据库(NCBI RefSeq)下载过滤24种致病菌的全部基因组和基因序列及注释信息；
1.3.应用自研发软件软件过滤下载序列中的假基因、片段和错误注释的序列；
1.4.多重阈值聚类各基因单元序列，组内交叉比对去重；
1.5.模拟数据集测试基因单元参考基因序列，调整补充基因单元参考序列；
1.6.循环1.4步骤，聚类各基因单元序列，组内交叉比对去重；
1.7.对各基因单元参考序列聚类，过滤异常序列；
1.8.应用正则表达式提取参考序列的基因名、物种名等NCBI注释信息，校对和标准化各基因单元参考序列注释；
1.9.建立全部毒力基因单元的参考序列索引；
1.10.软件(VF_MKDB)实现自动下载序列、聚类去重、更新和标准化数据库。
2获取临床样本宏基因组测序原始数据，对其预处理获得目标数据
2.1.过滤质量值低于2，碱基数占整个read 40％的读序；
2.2切除滑窗(5bp)内碱基平均质量小于20的碱基；
2.3过滤平均质量小于20、含N数量大于5、长度小于50的读序。
3用预设宏基因组测序数据多重比对注释***分析目标数据，鉴定毒力基因
基于宏基因组测序读序(Read)的两步法比对策略和判断方法如下：
3.1.特定毒力基因的参考序列集设为：{s1,s2,…,sn}；其中，sn：参考序列n；
3.2.应用多重比对算法比对宏基因组的高质量读序(clean reads)到参考序列集(阈值e-value＝1e-5)；
3.3.每条读序的比对结果为：{R1,R2,…,Rm}∈gi；其中，0≤m≤n；Rm：第m个比对的结果；gi：第i个基因单元；
3.4步骤一：
如果比对结果为单一结果(m＝1)，取该结果(Rm)为最终结果(r)；
3.5.如果多个比对结果(m>1)，两种情况：
3.5.1靶向参考序列为相同物种的同一基因单元,得分排序后，最终结果ri如下：
Figure BDA0003085682040000091
3.5.2靶向参考序列为相同物种的不同基因单元(gi，i>1)，最终结果r为每个基因分组中取最优结果的并集{r1,r2,…,ri}，其中，gi分组中结果如下：
Figure BDA0003085682040000101
3.6.步骤二：
毒力基因的检出结果(VF-result)的过滤策略：
Figure BDA0003085682040000102
其中，id＝序列相似度得分(％)；
Figure BDA0003085682040000103
score＝序列两两比对的质量得分；
过滤条件：VF-result∈gi，i>1，丢弃，结果为无(None)；
3.7.软件(VF_Finder)实现自动化比对、过滤和结果列表产生。
4.建立重要毒力基因-毒力因子-表征(功能/临床表型)关联数据库
4.1. 24种致病菌临床样本的宏基因组测序数据收集(约50样本/单个致病菌)；
4.2.基于所述宏基因组测序数据多重比对注释***对上述数据进行分析，构建每个样本单个致病菌的毒力基因谱；
4.3样本相应临床表型和生理生化指标提取和标准化，主要包括血常规：白细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞比值、淋巴细胞比值、C反应蛋白、内毒素等；
4.4.应用最大似然法分析提取基因特征：
4.4.1.毒力基因的蛋白序列理化特征(PAAC)的提取：
Figure BDA0003085682040000104
Ai：20个氨基酸的理化特征集，
Figure BDA0003085682040000105
第N位理化特征,N：氨基酸理化特征总数；
其中，单个氨基酸理化特征如下：
Figure BDA0003085682040000106
对于任意两个氨基酸Rb和Rd的相关性为：
Figure BDA0003085682040000107
Fk(Rb)是Rb的第q位的理化特征；
对于长度为L的氨基酸序列，序列位置相关性参数θh定义如下：
Figure BDA0003085682040000111
则，对于20+λ(λ＝2)维度序列里氨基酸e的理化特征提取公式如下：
Figure BDA0003085682040000112
其中，fe：氨基酸e在序列中的频率；ω：氨基酸在序列在的位次加权参数，默认值为0.1。
4.4.2.毒力蛋白序列的进化特征(PSSM)的提取：
应用PSI-BLAST转化基因单元内毒力基因的蛋白序列为原始PSSM矩阵(Position-specific scoring matrix)如下：
Figure BDA0003085682040000113
其中，L：序列长度；20:列数呈现20个天然氨基酸；pu,v：第u个氨基酸进化突变为第v个氨基酸可能性；
PSSM-C(PSSM-composition)转换PSSM矩阵为20x20矩阵，其中第u行的氨基
酸Zu计算如下：
Figure BDA0003085682040000114
其中，
Figure BDA0003085682040000115
zt：原始PSSM表中第t位的值；pt：序列中第t位的氨基酸；L：序列的长度；au是20种氨基酸中第u位的氨基酸。
4.5.结合临床常规检测指标和毒力基因的序列特征(PAAC和PSSM-C)，应用多重机器学习策略(多任务逻辑回归、随机森林、支持向量机等)构建临床诊断相关的毒力基因特征谱；
4.6.聚类协同作用的毒力基因到单一毒力因子单元，关联相应的表征(功能/临床表型)；
4.7.构建毒力因子-毒力基因，毒力因子-表征(功能/临床表型)关联表，建立临床重要毒力基因-毒力因子-表征(功能/临床表型)关联数据库；
4.8.软件(VF-KDB)实现数据的收集、分析和升级。
5.利用预设临床自动化报告***，基于毒力基因鉴定结果和关联数据库，生成毒力基因鉴定报告
5.1.导入所述宏基因组测序数据多重比对注释***获得的结果列表，比对重要毒力基因-毒力因子-表征(功能/临床表型)关联数据库，自动生成基因结果列表(text文本格式)：包含致病菌物种(物种拉丁名、中文名)和基因信息(基因名、毒力因子、表征和支持得分等)；
5.2.程序自动将上述结果导入报告模板的相应表格；
5.3.程序自动将数据库的客户信息导入报告模板；
5.5.生成最终的临床样本的特定致病菌的毒力基因鉴定报告(PDF格式)。
如图2所示，基于宏基因组的临床重要致病菌毒力基因检测的***，包括以下组成部分：
1.临床致病菌毒力基因数据库；
2.重要毒力基因-毒力因子-表征(功能/临床表型)关联数据库；
3.宏基因组测序数据多重比对注释***；
4.临床自动化报告***。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

Claims (9)

1.一种基于宏基因组的临床重要致病菌毒力基因检测的方法，其特征在于，包括：
S10，建立临床致病菌毒力基因数据库；
S20，获取临床样本宏基因组测序原始数据，预处理获得目标数据；
S30，利用预设宏基因组测序数据多重比对注释***分析目标数据，鉴定毒力基因；
S40，建立重要毒力基因-毒力因子-表征(功能/临床表型)关联数据库；
S50，利用预设临床自动化报告***，基于毒力基因鉴定结果和关联数据库，生成毒力基因鉴定报告。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S10包括：
从毒力基因数据库中获取临床致病菌毒力基因及序列；
从公共数据库获取所述临床致病菌的全部基因组、基因序列及注释信息；
过滤基因序列中的假基因、片段和错误注释的序列；
多重阈值聚类各基因单元序列，组内交叉比对去重；
模拟数据集测试基因单元参考基因序列，调整补充基因单元参考序列；
循环多重阈值聚类各基因单元序列，组内交叉比对去重；
对各基因单元参考序列聚类，过滤异常序列；
提取参考序列的公共数据库注释信息，校对和标准化各基因单元参考序列注释；
建立全部毒力基因单元的参考序列索引；
和可选的，建立软件实现自动下载序列、聚类去重、更新和标准化数据库。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S20包括：
过滤质量值低于2，碱基数占整个read 40％的读序；
切除滑窗(5bp)内碱基平均质量小于20的碱基；
过滤平均质量小于20、含N数量大于5、长度小于50的读序。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S30包括：
特定毒力基因的参考序列集设为：{s1,s2,…,sn}；其中，sn：参考序列n；
应用多重比对算法比对宏基因组的高质量读序到参考序列集，阈值e-value＝1e-5；
每条读序的比对结果为：{R1,R2,…,Rm}∈gi；其中，0≤m≤n；Rm：第m个比对的结果；gi：第i个基因单元；
毒力基因的检出结果的过滤策略：
Figure FDA0003085682030000021
其中，id＝序列相似度得分(％)；
Figure FDA0003085682030000022
score＝序列两两比对的质量得分；
过滤条件：VF-result∈gi，i>1，丢弃，结果为无；
和可选的，建立软件实现自动化比对、过滤和结果列表产生。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述S30中的比对结果包括：
当比对结果为单一结果，取该结果为最终结果；
当多个比对结果，且靶向参考序列为相同物种的同一基因单元,得分排序后，最终结果ri如下：
Figure FDA0003085682030000023
当多个比对结果，且靶向参考序列为相同物种的不同基因单元，最终结果为每个基因分组中取最优结果的并集，其中，gi分组中结果如下：
Figure FDA0003085682030000024
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S40包括：
致病菌临床样本的宏基因组测序数据收集；
基于所述S20和S30对上述数据进行分析，构建每个样本单个致病菌的毒力基因谱；
样本相应临床表型和生理生化指标提取和标准化；
应用最大似然法分析提取基因特征；
结合临床常规检测指标和毒力基因的序列特征，应用多重机器学习策略构建临床诊断相关的毒力基因特征谱；
聚类协同作用的毒力基因到单一毒力因子单元，关联相应的表征(功能/临床表型)；
构建毒力因子-毒力基因，毒力因子-表征(功能/临床表型)关联表，建立临床重要毒力基因-毒力因子-表征(功能/临床表型)关联数据库；
和可选的，通过软件实现自动化比对、过滤和结果列表产生。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述S40中的应用最大似然法分析提取基因特征包括：
毒力基因的蛋白序列理化特征的提取：
Figure FDA0003085682030000031
Ai：20个氨基酸的理化特征集，
Figure FDA0003085682030000032
第N位理化特征,N：氨基酸理化特征总数；
其中，单个氨基酸理化特征如下：
Figure FDA0003085682030000033
n＝1,2,…,N；x为1～n；
对于任意两个氨基酸Rb和Rd的相关性为：
Figure FDA0003085682030000034
Fk(Rb)是Rb的第q位的理化特征；
对于长度为L的氨基酸序列，序列位置相关性参数θh定义如下：
Figure FDA0003085682030000035
h＝1,2,…,L-1；
则，对于20+λ(λ＝2)维度序列里氨基酸e的理化特征提取公式如下：
Figure FDA0003085682030000036
其中，fe：氨基酸e在序列中的频率；ω：氨基酸在序列在的位次加权参数，默认值为0.1；
毒力蛋白序列的进化特征的提取：
转化基因单元内毒力基因的蛋白序列为原始PSSM矩阵如下：
Figure FDA0003085682030000037
其中，L：序列长度；20:列数呈现20个天然氨基酸；pu,v：第u个氨基酸进化突变为第v个氨基酸可能性；
转换PSSM矩阵为20x20矩阵，其中第u行的氨基酸Zu计算如下：
Figure FDA0003085682030000038
其中，
Figure FDA0003085682030000039
(u＝1,…,20；t＝1,…,L)
zt：原始PSSM表中第t位的值；pt：序列中第t位的氨基酸；L：序列的长度；au是20种氨基酸中第u位的氨基酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S50包括：
导入所述S30获得的结果列表，比对所述S40关联数据库，生成毒力基因结果，包含致病菌物种和基因信息；
将上述结果导入报告模板的相应表格；
将数据库的客户信息导入报告模板；
生成最终的临床样本的特定致病菌的毒力基因鉴定报告。
9.一种基于宏基因组的临床重要致病菌毒力基因检测的***，包括以下组成部分：
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