CN113219112B - 一种二维高压制备液相色谱***及药物中低含量的目标组分的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及制备液相色谱分离的技术领域，具体公开了一种二维高压制备液相色谱***及药物中低含量的目标组分的分离纯化方法。***包括第一维高压制备液相色谱***、二位六通切换阀、多位选择阀、捕集柱和第二维高压制备液相色谱***；第二维高压制备液相色谱***包括第二混合器和二维分离柱；第一维高压制备液相色谱***和二位六通切换阀、多位选择阀、捕集柱依次连通，捕集柱的出口端和二位六通切换阀再次连通；第二混合器和二位六通切换阀、二维分离柱依次连通。所述方法为：自一维***检测样品后捕集目标组分至捕集柱；切换二位六通切换阀，反冲洗出被捕集组分并做二维检测。本申请的方法具有高效分离纯化药物中含量极低的杂质成分的优点。

Description

一种二维高压制备液相色谱***及药物中低含量的目标组分 的分离纯化方法

技术领域

本申请涉及医药技术和制备液相色谱分离的技术领域，更具体地说，它涉及一种二维高压制备液相色谱***及药物中低含量的目标组分的分离纯化方法。

背景技术

任何影响药物纯度的物质统称为杂质，杂质的研究是药品研发的一项重要内容，与药物生产、安全性及效能密切相关，是药物的关键质量属性之一。美国药典(USP)和欧洲药典(EP)中明确规定：药物在临床使用前必须对表观含量≥0.1％的杂质进行结构确证，表观含量在0.1％以下的具有强烈生物作用的杂质、毒性杂质以及在稳定性试验中出现的降解产物，均应予以定性测定或确证其结构。我国从2005年颁布《中华人民共和国药典》开始，也出台了关于药物杂质研究的相关指导原则。在药物杂质的研究中，最重要的环节是对其进行正确的结构确证，而对其进行结构确证的前提条件是在复杂的药物杂质中对其进行分离和纯化，得到足够量的样品进行结构鉴定。由于大多数杂质在药物中的含量极低，且存在化学性质不稳定、见光易分解、受热易变性等特点，导致在对该类杂质进行分离纯化的过程中会遇到很多困难。

制备型高压液相色谱由于具有高流速、高分离度、载样量大及分离时间短等优点，近些年来，在天然产物的分离和纯化中得到了广泛的应用。由于药物生产中出现的杂质，大多数与其原料药具有相似的结构，因此难以分离纯化。但是，一般在鉴定药物中杂质的化学结构时，往往要求待测杂质经分离纯化后达到一定的纯度，才能在样品杂质的结构鉴定中得到准确的鉴定结果。因此，当待测杂质难以经一次分离纯化达到鉴定所需的纯度要求时，便需要反复多次进行分离纯化，这样就会导致待测杂质的含量越来越少。同时每次回收待测杂质的过程中也存在待测杂质不稳定而发生化学变化的问题，最后虽然待测杂质的纯度达到要求，但是待测杂质的总量过低，最终无法进行结构鉴定。

基于上述原因，开发一种新型，高效的色谱分离纯化***就显得十分必要。

其中，二维制备液相色谱是近年来发展起来的一种新的色谱分离手段，它能将在第一维色谱上没能完全分离开的多种不同组分或者是微量成分(某组分含量过少时，其在色谱中的谱峰会被其他组分的谱峰遮掩而显示不出来该微量组分的谱峰)，通过特定装置进行收集和保留，然后在第二维色谱进行再次分离纯化；目前该方法在蛋白质和多肽等大分子化合物的分离纯化中得到了广泛的应用。由于该手段避免了样品多次分离纯化导致的各种风险，同时提高了分离效率，缩短分离时间，节约了生产成本，使其可以在药物杂质的分离纯化中也能得到很好的应用。

相关技术中主要通过三通阀将第一维色谱单元与第二维色谱单元联通，而三通阀有两种工作状态，一种工作状态下，第一维色谱单元的出样端直接与检测单元连通；在另一种工作状态下，第一维色谱的出样端通过三通阀直接与第二维色谱的进样端连通。该方法适用于含量大，分离度好的组分的分离纯化，对微量成分没有富集和纯化作用，因而无法对该类物质进行有效的分离纯化。

另有相关技术提供的是一种在线将低、中、高压结合的二维制备液相色谱***：第一维分离***与第二维分离***通过六通阀进行连接；第一维分离***使用低或中压制备液相色谱***，第二维分离***使用低、中、高压制备液相色谱***；且第二维分离***使用的压力不低于第一维分离***。但是第一维分离***使用低压或者中压制备液相色谱***对复杂样品的分离度，达不到分离效果，最终无法实现对复杂样品的低含量的目标组分的有效分离纯化。

发明内容

为了进一步提高对药物中低含量的目标组分的分离纯化效果，本申请提供一种二维高压制备液相色谱***及药物中低含量的目标组分的分离纯化方法。

第一方面，本申请提供一种二维高压制备液相色谱***，采用如下的技术方案：

一种二维高压制备液相色谱***，包括第一维高压制备液相色谱***、二位六通切换阀、多位选择阀、第一多通阀、捕集柱、第二多通阀和第二维高压制备液相色谱***；

所述第二维高压制备液相色谱***包括第二混合器、二维分离柱和第二检测器；所述第一维高压制备液相色谱***的目标组分的出口端和所述第一多通阀连通，所述第一多通阀与二位六通切换阀的1号位连通，所述二位六通切换阀的2号位和所述多位选择阀的进口端连通，所述多位选择阀的出口端和捕集柱的进口端切换连通，捕集柱的出口端通过所述第二多通阀连通至所述二位六通切换阀的5 号位；

所述第二混合器的出口端和所述二位六通切换阀的4号位连通，所述二位六通切换阀的3号位和所述二维分离柱的进口端连通，所述二维分离柱的出口端和所述第二检测器的进口端连通。

通过采用上述技术方案，在采用本申请的二维高压制备液相色谱***进行目标组分的分离纯化的过程中，分别设置两套高压制备液相色谱***(第一维高压制备液相色谱***和第二维高压制备液相色谱***)，并通过设置二位六通切换阀以实现将两套高压制备液相色谱***连通。此外，通过设置捕集柱以实现在一维分离纯化后对目标组分的捕集，并结合二位六通切换阀的设置以实现将捕集柱内的目标组分冲洗至第二维高压制备液相色谱***，以进行二维分离纯化，从而实现同一目标组分的两次分离纯化，最终实现药物中低含量的目标组分的有效分离纯化。此外，当流动相的流速较高时，将产生高压，而一维分离柱、二维分离柱和捕集柱的不锈钢的材质使得本申请的捕集***能够耐受的最高压力为25MPa，为进一步实现高效的目标组分的分离纯化提供基础。而本申请中所指的药物中低含量的目标组分可以是某已知样品中的杂质成分，也可以是某已知药物中含量低的其它待分离纯化的物质。本申请中的低含量是指目标组分的重量含量低于药品5％。

优选的，所述多位选择阀的可连接端口的数量大于捕集柱的数量，所述第二多通阀的可连接端口的数量大于捕集柱的数量。

其中，捕集柱的数量可以是1个、2个、3个、4个、5个或者更多。在本申请中，多位选择阀以及第二多通阀的可连接端口的数量可以根据捕集柱的数量来确定；捕集柱的数量不少于目标组分的数量，多位选择阀和第二多通阀的可连接端口的数量大于捕集柱的数量。例如，当某一已知的样品(即本申请所说的药物)中的低含量的目标组分的种类数量为3种时，捕集柱的数量至少设置有3 个。而此时，多位选择阀可以选择为六位选择阀(六位选择阀的可连接端口为7 个)，第二多通阀可以选择为七通(七通的可连接端口为7个)。

优选的，二维高压制备液相色谱***还包括辅助泵，所述辅助泵的进口端连通有稀释剂盛装瓶，所述辅助泵的出口端和所述第一多通阀连通。

通过辅助泵的设置能够将适当用量的稀释剂通入捕集柱内，从而达到将自第一检测器流出的目标组分稀释的目的，以增加目标组分在捕集柱上的保留量，进一步提高目标组分的分离纯化效果。其中，稀释剂可以是纯水，也可以是包含pH调节剂的水，以增加目标组分在捕集柱中的保留量。pH调节剂可以是挥发性酸或者氨水。

优选的，所述二维分离柱的直径为20-50mm，长度为150-250mm。

通过采用上述技术方案，分离柱的大体积以实现每一样品的进样量可以达到百毫克以上，更多的进样量使得在分离纯化后获得总量更多的目标组分，进而为实现高效的低含量的目标组分的分离纯化提供基础。

优选的，所述二维分离柱内的填料为C18键合硅胶填料、AQ-C18键合硅胶填料、C8键合硅胶填料、C4键合硅胶填料、硅胶填料、苯基键合硅胶填料、氰基键合硅胶填料、氨基键合硅胶填料或亲水键合填料。对应制备得到的分别是 C18色谱柱、AQ-C18色谱柱、C8色谱柱、C4色谱柱、硅胶色谱柱、苯基色谱柱、氰基色谱柱、氨基色谱柱或HILIC色谱柱。

优选的，所述捕集柱的直径为20-50mm，长度为20-50mm。

通过采用上述技术方案，捕集柱的规格使得本申请的***对目标组分的收集量能够达到百毫克以上，更多的收集量使得在分离纯化后能够获得总量更多的目标组分。

优选的，所述捕集柱内的填料为C18键合硅胶填料、AQ-C18键合硅胶填料、C8键合硅胶填料、C4键合硅胶填料、硅胶填料、苯基键合硅胶填料、氰基键合硅胶填料、氨基键合硅胶填料或亲水键合填料。对应制备得到的分别是C18 捕集柱、AQ-C18捕集柱、C8捕集柱、C4捕集柱、硅胶捕集柱、苯基捕集柱、氰基捕集柱、氨基捕集柱或HILIC捕集柱。

优选的，所述第一维高压制备液相色谱***还包括一维高压色谱泵和第一混合器，所述一维高压色谱泵和第一混合器的进口端连通。

通过采用上述技术方案，通过一维高压色谱泵的设置以及其和第一混合器、一维分离柱的连通，实现对低含量的目标组分在一维分离柱中进行有效分离。

优选的，所述第二维高压制备液相色谱***还包括二维高压色谱泵，所述二维高压色谱泵的出口端和所述第二混合器的进口端连通。

通过采用上述技术方案，通过二维高压色谱泵的设置以及其和第二混合器、二维分离柱的连通，实现在二维分离柱中对目标组分的有效分离。

优选的，所述一维分离柱的直径为20-50mm，长度为150-250mm。

通过采用上述技术方案，一维分离柱的规格能够使每一样品的进样量达到百毫克以上，更多的进样量使得经分离纯化后获得总量更多的目标组分(即药品中低含量的物质)，进而为实现高效的低含量的目标组分的分离纯化提供基础。

优选的，所述一维分离柱内的填料为C18键合硅胶填料、AQ-C18键合硅胶填料、C8键合硅胶填料、C4键合硅胶填料、硅胶填料、苯基键合硅胶填料、氰基键合硅胶填料、氨基键合硅胶填料或亲水键合填料。对应制备得到的分别是 C18色谱柱、AQ-C18色谱柱、C8色谱柱、C4色谱柱、硅胶色谱柱、苯基色谱柱、氰基色谱柱、氨基色谱柱或HILIC色谱柱。

其中，根据待分离纯化的目标组分的特性，对应的一维分离柱、二维分离柱以及捕集柱可以选择规格合适的填料，以能够实现相应的分离或捕集目标。若是相应的分离或捕集目标改变，可选择的填料并不限于以上列举的填料种类。

第二方面，本申请提供一种药物中低含量的目标组分的分离纯化方法，采用如下的技术方案：

一种药物中低含量的目标组分的分离纯化方法，采用上述的二维高压制备液相色谱***实施，具体包括以下步骤：

使得经过第一维高压制备液相色谱***检测后流出的目标组分经第一多通阀后，经二位六通切换阀的1号位进入、2号位流出，接着通过切换多位选择阀，使目标组分进入捕集柱并被捕集在所述捕集柱内；

将流动相通入第二混合器内，随后切换所述二位六通切换阀，使得来自第二混合器的流动相经所述二位六通切换阀的4号位进入、所述二位六通切换阀的5号位流出，随后流经第二多通阀并进入所述捕集柱内，使得捕集在所述捕集柱内的目标组分被冲洗流出所述捕集柱；

冲洗出的目标组分流经所述多位选择阀，经所述二位六通切换阀的2号位流入、二位六通切换阀的3号位流出后，依次流入二维分离柱、第二检测器，实现对目标组分的二维检测。

通过采用上述技术方案，使得一个目标组分能够经过两次分离纯化，从而能够更多地将样品中低含量的目标组分分离纯化，以满足鉴定需求。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、由于采用的是二维高压制备液相色谱***来进行药物中低含量的目标组分的分离纯化，该***分别设置两套高压制备液相色谱***(第一维高压制备液相色谱***和第二维高压制备液相色谱***)，并通过设置二位六通切换阀以实现将两套高压制备液相色谱***连通；设置捕集柱和二位六通切换阀以实现一维分离纯化后对目标组分的捕集及冲洗，冲洗后的目标组分进入第二维高压制备液相色谱***，以进行二维分离纯化，从而实现同一目标组分的两次分离纯化，最终实现药物中低含量的目标组分的有效分离纯化，以达到对目标组分成分鉴定时所需的含量和纯度要求。

2、本申请采用的整个***是一个封闭的耐高压色谱分离***，最高耐受的高压是24MPa，其主要利用两种不同极性流动相的梯度混合并设置高流速 (0-100mL/min)，结合不同类型填料(C18键合硅胶填料、AQ-C18键合硅胶填料、C8键合硅胶填料、C4键合硅胶填料、硅胶填料、苯基键合硅胶填料、氰基键合硅胶填料、氨基键合硅胶填料或亲水键合填料)的一维分离柱、二维分离柱和捕集柱，实现对复杂的目标组分的有效分离。

3、本申请的一维分离柱和二维分离柱的规格是直径为20-50mm，长度为 150-250mm的耐高压不锈钢色谱柱，以实现每一针样品的进样量可以达到百毫克以上；捕集柱的规格是直径为20-50mm，长度为20-50mm的耐高压不锈钢色谱柱，对目标组分的收集量同样可以达到百毫克以上。上述的设置为高效进行药品中低含量组分的高效分离纯化提供前提条件。

附图说明

图1是二维高压制备液相色谱***的整体结构示意图；

图2是对一维分离柱进行预平衡时相关器件的连接示意图；

图3是对第一捕集柱、第二捕集柱、第三捕集柱、第四捕集柱以及第五捕集柱预冲洗时相关器件的连接示意图；

图4是对二维分离柱进行预平衡时相关器件的连接示意图；

图5是***处于捕集状态时(以第一捕集柱为例)相关器件的连接示意图；

图6是冲洗捕集柱内的目标组分以及进行目标组分二维检测时(以第一捕集柱为例)相关器件的连接示意图；

图7是目标组分经第一维高压制备液相色谱***后的检测谱图；

图8是目标组分经第二维高压制备液相色谱***后的检测谱图。

其中，1、第一维高压制备液相色谱***；11、一维高压色谱泵；12、第一混合器；13、一维分离柱；14、第一检测器；15、第一水相瓶；16、第一有机相瓶；2、二位六通切换阀；3、六位选择阀；4、三通阀；5、辅助泵；6、捕集柱；61、第一捕集柱；62、第二捕集柱；63、第三捕集柱；64、第四捕集柱；65、第五捕集柱；7、七通阀；8、废液接收装置；9、第二维高压制备液相色谱***； 91、二维高压色谱泵；92、第二混合器；93、二维分离柱；94、第二检测器；95、第二水相瓶；96、第二有机相瓶；97；目标组分收集装置。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。

本申请公开了一种二维高压制备液相色谱***及药物中低含量的目标组分的分离纯化方法。本申请公开的二维高压制备液相色谱***，包括第一维高压制备液相色谱***、二位六通切换阀、多位选择阀、第一多通阀、捕集柱、第二多通阀、第二维高压制备液相色谱***和废液接收装置。

其中，第一多通阀至少含有两个连接端口；第一多通阀可以是二通阀，可以是三通阀，可以是四通阀，可以是五通阀，可以是六通阀，还可以是七通阀。当本申请的二维高压制备液相色谱***还包括辅助泵时，第一多通阀至少含有三个连接端口；第一多通阀可以是三通阀，可以是四通阀，可以是五通阀，可以是六通阀，还可以是七通阀。

多位选择阀可以是六位选择阀。

第二多通阀可以是三通阀，可以是四通阀，可以是五通阀，可以是六通阀，还可以是七通阀。

本申请中涉及的器件以能够实现相关目的即可，本申请中涉及到的三通阀、七通阀、辅助泵、二位六通切换阀、六位选择阀、一维高压色谱泵、二维高压色谱泵、第一混合器和第二混合器均为市售的常见商品。以下提供部分器件的型号信息。

本申请涉及的二位六通切换阀为能够在两个状态间切换的六通阀，可以是购自vici公司的型号为EUDA-C6UW的阀门。二位六通切换阀包括1号位-6 号位的六个可选择性连接的端口，每个端口连通不同的管路。可以通过调节将其中的两个号位的端口连通，以使得和对应端口连接的两个管路之间的连通，进而实现不同管路中的液体自一个管路流入另一个管路中。而切换二位六通切换阀的阀门方向，以使得初始的进水管路和出水管路之间互换，即初始的进水管路变为出水管路，初始的出水管路变为进水管路；从而实现同一管路连通状态下的水流方向的改变。

本申请中提及的六位选择阀主要包括一个公共进口端和六个分别命名为 1号位、2号位、3号位、4号位、5号位、6号位的出口端，每个端口连接有不同的管路；其中可以选择将公共口端和1号位-6号位出口端中的任意一个连通，以实现公共进口端选择连通不同的出口端(六位选择阀的各个端口的命名顺序没有特殊含义，仅为便于描述)。六位选择阀可以是购自vici公司的型号为 EUTA-SD6UW的阀门。

三通阀主要包括分别命名为1号位、2号位和3号位的端口，每个端口连接有不同的管路。三通阀的各个端口的命名仅为便于描述，没有特殊含义。

七通阀包括六个分别命名为1号位、2号位、3号位、4号位、5号位、6 号位的进口端和一个公共出口端，每个端口连接有不同的管路；其中可以选择将公共进口端和1号位-6号位的出口端中的任意一个连通，以实现公共出口端连通不同的进口端(七通的各个端口的命名顺序没有特殊含义，仅为便于描述)。

本申请的捕集柱的规格为：直径为50mm、长度为50mm的不锈钢色谱柱，装填的可以是C18键合硅胶填料、AQ-C18键合硅胶填料、C8键合硅胶填料、C4键合硅胶填料、硅胶填料、苯基键合硅胶填料、氰基键合硅胶填料、氨基键合硅胶填料或亲水键合(HILIC)填料。填料的粒径为8μm-10μm，对目标组分的载样量可以达到500-1000mg。具体的，捕集柱可以是购自月旭公司的型号为AQ-C18的捕集柱。

一维高压色谱泵和二维高压色谱泵是指能提供流速在0-100mL/min范围内、最高耐受压力为24MPa的双柱塞泵。

第一混合器和第二混合器是能将多种不同高流速的溶剂***充分混合均匀的混合器。

本申请的一维分离柱的规格为：直径为50mm，长度250mm；其可以是不锈钢色谱柱；色谱柱内装填的分离填料可以是C18键合硅胶填料、AQ-C18键合硅胶填料、C8键合硅胶填料、C4键合硅胶填料、硅胶填料、苯基键合硅胶填料、氰基键合硅胶填料、氨基键合硅胶填料或亲水键合(HILIC)填料。填料的粒径为8μm-10μm；每一针样品的进样量可以为100-500mg，具体的进样量可以为200mg。

二维分离柱的规格为：直径为50mm，长度250mm；其可以是不锈钢色谱柱；色谱柱内装填的分离填料可以是C18键合硅胶填料、AQ-C18键合硅胶填料、C8键合硅胶填料、C4键合硅胶填料、硅胶填料、苯基键合硅胶填料、氰基键合硅胶填料、氨基键合硅胶填料或亲水键合(HILIC)填料中的一种。填料的粒径为8μm-10μm；每一针样品的进样量可以为100-500mg，具体的进样量可以为200mg。

本申请的第一检测器和第二检测器可以是全波长紫外检测器(200-400 nm)、蒸发光检测器、示差折光检测器等。

此外，本申请中的相关管路可以是孔径为8mm的管路，进一步的可以为耐高压不锈钢材质。

如图1所示的一种二维高压制备液相色谱***，包括第一维高压制备液相色谱***1、二位六通切换阀2、六位选择阀3、三通阀4、捕集柱6、七通阀 7、第二维高压制备液相色谱***9和废液接收装置8。

第二多通阀以捕集柱6的数量设置有5个为例进行说明，捕集柱6包括第一捕集柱61、第二捕集柱62、第三捕集柱63、第四捕集柱64和第五捕集柱 65。

第一维高压制备液相色谱***1包括用于将流动相和样品进行混合的第一混合器12、以及沿着流动相的流动方向和第一混合器12依次连通的一维分离柱13和第一检测器14，以实现对样品中低含量的目标组分的分离纯化。第一维高压制备液相色谱***1还包括第一水相瓶15和第一有机相瓶16；第一水相瓶15、第一有机相瓶16均和第一混合器12连通。其中第一水相瓶15中盛放有水相流动相，第一有机相瓶16中盛放的是有机相流动相。

其中的检测过程为：第一维高压制备液相色谱***1还包括第一控制***(图中未显示)，流动相和样品流经第一混合器12后充分混合，随后进入一维分离柱13。在一维分离柱13内的样品中低含量的目标组分被分离，并在第一检测器14中被检测，最后检测结果传输至第一控制***。

和第一维高压制备液相色谱***1类似的，第二维高压制备液相色谱***9包括二维高压色谱泵91、第二混合器92、二维分离柱93、第二检测器94、第二水相瓶95和第二有机相瓶96。其中，第二水相瓶95、第二有机相瓶96均和第二混合器92连通，沿着流动相的流向，第二混合器92和二维分离柱93、第二检测器94依次连通。

第二维高压制备液相色谱***9还包括第二控制***(图中未显示)，第二维高压制备液相色谱***9的流动相和来自第一维高压制备液相色谱***1 的目标组分在第二混合器92中混合后进入二维分离柱93内，随后目标组分在第二检测器94中实现组分检测，最后检测结果传输至第二控制***。

采用本申请的二维高压制备液相色谱***对样品中低含量的目标组分进行分离纯化时，样品首先进入第一维高压制备液相色谱***1并经一维分离纯化，随后样品中不同的目标组分被捕集在不同捕集柱6(若是有一种目标组分，则其被捕集在一个捕集柱内即可)之后，分别被冲洗至第二维高压制备液相色谱***9，并经二维分离纯化。因此，本***能够实现对一个待分离纯化的样品中多个(或一个)目标组分的两次分离纯化。此外，第二维高压制备液相色谱*** 9的流动相和第一维高压制备液相色谱***1中的流动相可以相同也可以不同，其中以不同的流动相改变同一组分的分配行为作为优选项，以实现将在第一维高压制备液相色谱***1中无法分离纯化(或者只能少量分离纯化)的组分的充分分离纯化。此外，两个***的高压环境可以改善微量组分的分离度，是得到高纯目标组分的基础。

(一)分离柱平衡状态及预冲洗状态时的各器件间的连接***处于初始状态时，分离组分需要不同流动相的梯度洗脱，因此***处于初始状态时的流动相比例，为分离组分时的起始比例。

(I-I)、对第一维高压制备液相色谱***1的一维分离柱13进行预平衡在***处于初始状态时，如图2所示，按照平衡液的流动方向，一维高压色谱泵 11依次和第一混合器12、一维分离柱13、第一检测器14连通；第一检测器14 的出口端与三通阀4的1号位连通，三通阀4的3号位与辅助泵5连通，三通阀 4的2号位与二位六通切换阀2的1号位连通，二位六通切换阀2的2号位与六位选择阀3的公共进口端相连，六位选择阀3的6号位连通七通阀7的6号位，七通阀7的公共端口和二位六通切换阀2的5号位连通，二位六通切换阀2的6 号位和废液接收装置8连通。

在上述的管路连通前提下，经一维高压色谱泵11于第一混合器12内泵入平衡液，随后平衡液流经一维分离柱13后进入第一检测器14，平衡一维分离柱13后，平衡液依次经三通阀4、二位六通切换阀2、六位选择阀3、七通阀7 后，再次经过二位六通切换阀2后进入废液接收装置8。至此完成了对第一维高压制备液相色谱***1的一维分离柱13的预平衡。

(I-II)、对捕集柱6(第一捕集柱61、第二捕集柱62、第三捕集柱63、第四捕集柱64和第五捕集柱65)的依次进行预冲洗如图3所示，自辅助泵5的进口端通入有预冲洗液，辅助泵5的出口端和三通阀 4的3号位连通，三通阀4的2号位与二位六通切换阀2的1号位连通，二位六通切换阀2的2号位与六位选择阀3的公共进口端相连通，此时切换六位选择阀 3的1号-5号位的出口端分别一一对应的和第一捕集柱61、第二捕集柱62、第三捕集柱63、第四捕集柱64和第五捕集柱65的进口端连通，第一捕集柱61、第二捕集柱62、第三捕集柱63、第四捕集柱64和第五捕集柱65的出口端分别一一对应的与七通阀7相对应的1号-5号位的进口端连通，七通阀7的公共出口端与二位六通切换阀2的5号位相连，二位六通切换阀2的6号位连通废液接收装置8。

在对第一捕集柱61、第二捕集柱62、第三捕集柱63、第四捕集柱64和第五捕集柱65进行预冲洗时，是分别对第一捕集柱61、第二捕集柱62、第三捕集柱63、第四捕集柱64和第五捕集柱65进行冲洗的。以对第一捕集柱61的冲洗为例进行解释说明：

首先将辅助泵5与三通阀4的3号位连通，三通阀4的2号位与二位六通切换阀2的1号位连通，二位六通切换阀2的2号位与六位选择阀3的公共进口端相连，六位选择阀3的1号位的出口端与第一捕集柱61的进口端连通，第一捕集柱61 的出口端和七通阀7的1号位的进口端连通，七通阀7的公共出口端与二位六通切换阀2的5号位相连，二位六通切换阀2的6号位连通废液接收装置8。将冲洗液由辅助泵5泵入第一捕集柱61后清洗第一捕集柱61，随后冲洗废液经七通阀7、二位六通切换阀2后最后流通至废液接收装置8。随后再分别预冲洗第二捕集柱62、第三捕集柱63、第四捕集柱64和第五捕集柱65即可。

(I-III)、对第二维高压制备液相色谱***9的二维分离柱93进行预平衡如图4所示，第二维高压制备液相色谱***9的第二混合器92的进口端连通有平衡液，其中，分离组分需要不同流动相的梯度洗脱，该对应比例的流动相是分离组分时流动相的起始比例。此时，第二混合器92的出口端与二位六通切换阀 2的4号位相连，二位六通切换阀2的3号位与二维分离柱93的进口端连通，二维分离柱93的出口端和第二检测器94的进口端连通，第二检测器94的出口端与废液接收装置8连通。

在第二维高压制备液相色谱***9的二维分离柱93进行预平衡时，平衡液经二维高压色谱泵91泵入第二混合器92内，随后流经二维分离柱93后进入第二检测器94，平衡二维分离柱93后，平衡液进入废液接收装置8。至此完成了对第二维高压制备液相色谱***9的二维分离柱93的预平衡。(二)进样后进行样品分离时的各器件间的连接状态

(II-I)、在进样后第一维高压制备液相色谱***1的工作状态待测样品在第一维高压制备液相色谱***1进样后，根据第一检测器14的信息，通过软件控制六位选择阀3，保证***处于样品捕集状态，以实现捕集柱6的对目标组分的捕集。

***处于样品捕集状态时具体器件的连接情况为：

如图5所示，将第一检测器14的出口端与三通阀4的1号位连通，三通阀4的 3号位与辅助泵5相连，三通阀4的2号位与二位六通切换阀2的1号位连通，二位六通切换阀2的2号位与六位选择阀3的公共进口端连通，此时，在线分析第一维高压制备液相色谱***1检测器的色谱峰分离情况。使得第一维高压制备液相色谱***1处于上述的样品检测状态，并根据第一维高压制备液相色谱***1的色谱峰的出峰情况，随时调整第一检测器14和三通阀4、二位六通切换阀2、六位选择阀3以及捕集柱6之间的具体连接关系，以实现将不同出峰时间的目标组分分别捕集在不同的捕集柱6的内的目的，进而完成对第一检测器14的流出液中的目标组分的捕集。

其中，第一捕集柱61、第二捕集柱62、第三捕集柱63、第四捕集柱64 和第五捕集柱65的进口端分别与六位选择阀3的1号位、2号位、3号位、4号位和5号位连通；以下将以第一检测器14流出液的某一组分捕集在第一捕集柱 61内为例进行说明。

如图5所示，第一检测器14的出口端与三通阀4的1号位连通，三通阀 4的3号位与辅助泵5相连，三通阀4的2号位与二位六通切换阀2的1号位连通，二位六通切换阀2的2号位和六位选择阀3的公共进口端；随后切换六位选择阀3，使得六位选择阀3的1号位(即出口端)与第一捕集柱61的进口端连通。同时，辅助泵5的进口端连通有稀释剂盛装瓶，稀释剂盛装瓶内装有稀释液，稀释剂为纯水。随后稀释剂经辅助泵5、三通阀4、二位六通切换阀2以及六位选择阀3后，最终进入捕集柱61内，以实现在目标组分捕集前对目标组分的稀释。

此外，第一捕集柱61的出口端与七通阀7的1号位的进口端连通，七通阀7的公共端出口与二位六通切换阀2的5号位连通，二位六通切换阀2的6 号位和废液接收装置8连通。

在上述的管路连接下，管路内的液体流向具体为：自第一检测器14流出的某一目标峰的目标组分自三通阀4的1号位进入并自三通阀4的2号位流出，经二位六通切换阀2的1号位进入并自二位六通切换阀2的2号位流出，随后自六位选择阀3的公共进口端进入并自六位选择阀3的1号位流出，最后进入第一捕集柱61后，该目标组分被捕集在第一捕集柱61内。在该组分进入第一捕集柱 61之前，经三通阀4的3号位进入的稀释液自三通阀4的2号位流出后将该含有目标组分的溶液稀释，以提高该目标组分在第一捕集柱61内的捕集量。至此完成了自第一维高压制备液相色谱***1上分离纯化后的某一谱峰的捕集。而自第一捕集柱61的出口端流出的废液，经七通阀7的1号位的进口端进入后经七通阀7的公共出口端流出，随后自二位六通切换阀2的5号位进入后自二位六通切换阀2的6号位流出，直至进入废液接收装置8。

随后，当第一维高压制备液相色谱***1上显示的另一目标谱峰出现时，再次调节六位选择阀3和捕集柱6的连通关系，即切换六位选择阀3，将六位选择阀3的公共进口端和六位选择阀3的2号位的出口端连通，使得另一目标组分被捕集在第二捕集柱62内。重复上述操作，直至将所有不同目标组分分别捕集在第三捕集柱63、第四捕集柱64和第五捕集柱65内(一般的，将第一种目标组分捕集在第一捕集柱61内，将第二种目标组分捕集在第二捕集柱62内，以此类推；即将不同的目标组分捕集在不同的捕集柱6内)。

而第二维高压制备液相色谱***9的二维分离柱93继续保持预平衡状态。即：第二混合器92的出口端与二位六通切换阀2的4号位相连，二位六通切换阀2的3号位与二维分离柱93的进口端相连，二维分离柱93的出口端和第二检测器94的进口端连通，第二检测器94)的出口端与废液接收装置8连通。

(II-II)、待检测样品经第一次分离检测后的第二次分离检测时的各器件间的连接状态如(II-I)中所述，待检测样品进入第一维高压制备液相色谱***1后，待检测样品经第一次分离检测后，自第一检测器14流出的目标组分进入第一捕集柱61 内，相应的目标组分被捕集在第一捕集柱61内。

逆时针切换二位六通切换阀2，此时，***处于样品分离回收状态。随后捕集在第一捕集柱61内的目标组分被冲洗出第一捕集柱61后，进入第二维高压制备液相色谱***9，并进行二次的分离检测。

在该过程中，由于要对第一捕集柱61(以及第二捕集柱62、第三捕集柱 63、第四捕集柱64和第五捕集柱65)内的目标组分进行冲洗，因此二位六通切换阀2、七通阀7、捕集柱6、六位选择阀3的进口端和出口端将要互换，即之前的进口端在本部分变化为出口端，之前的出口端在本部分变化为进口端。以下以对第一捕集柱61内的目标组分的反冲洗为例说明具体各器件之间的连接关系：

如图6所示，第二混合器92的出口端与二位六通切换阀2的4号位连通，二位六通切换阀2的5号位与七通阀7的公共进口端(也是II-I中的七通阀7的公共出口端)相连；七通阀7的1号位的出口端(也是II-I中的七通阀7的1号位的进口端)与相对应的第一捕集柱61的入口端(也是II-I中第一捕集柱61的出口端)连通，相对应的第一捕集柱61的出口端(也是II-I中第一捕集柱61的入口端)和六位选择阀3的1号位的入口端(也是II-I中六位选择阀3的1号位的出口端)相连，六位选择阀3的公共出口端(也是II-I中六位选择阀3的公共进口端)与二位六通切换阀2的2号位相连，二位六通切换阀2的3号位与二维分离柱93的进口端相连。

在上述管路连接的情况下，管路内的液体流向具体为：

第二混合器92中的流动相流经二位六通切换阀2的4号位和5号位后经过七通阀7的公共进口端(也是II-I中的七通阀7的公共出口端)进入、七通阀7的1 号位的出口端(也是II-I中的七通阀7的1号位的进口端)流出，随后经第一捕集柱61的进口端(也是II-I中第一捕集柱61的出口端)进入第一捕集柱61的，并将在(II-I)中捕集在第一捕集柱61的目标组分冲洗出第一捕集柱61，冲洗出的目标组分经六位选择阀3的1号位的入口端(也是II-I中六位选择阀3的1号位的出口端)进入、六位选择阀3的公共出口端(也是II-I中六位选择阀3的公共进口端)流出后，再次经过二位六通切换阀2的2号位进入、二位六通切换阀 2的3号位流出并最后进入二维分离柱93，进而使得自第一捕集柱61内冲洗出的目标组分进入第二维高压制备液相色谱***9，随后进行二维分离检测。此外，第二检测器94的出口端与目标组分收集装置97连通，并根据第二维高压制备液相色谱***9的色谱峰情况，将不同的目标组分分别收集，并进行后期的结构鉴定。

一种采用二维高压制备液相色谱***进行药物杂质分离纯化的方法，包括以下步骤：

S1、按照(I-I)中的管路连接对一维分离柱13进行预平衡：其中，水相为纯水、酸水或碱水，有机相为甲醇、乙腈或异丙醇；随后通过软件设置水相与有机相的比例，打开一维高压色谱泵11，使得平衡液进入第一混合器12、一维分离柱13，然后进入第一检测器14后进行预平衡(***压力稳定，检测器显示的基线平稳)，平衡液最后进入废液接收装置8。

按照(I-II)的管路连接依次对第一捕集柱61、第二捕集柱62、第三捕集柱63、第四捕集柱64以及第五捕集柱65进行预冲洗：其中，清洗液为甲醇或乙腈、纯水，在清洗时，先用有机相的甲醇或有机相清洗，随后用水相的纯水清洗。随后打开辅助泵5，切换六位选择阀3，使得清洗液依次进入第一捕集柱61、第二捕集柱62、第三捕集柱63、第四捕集柱64以及第五捕集柱65，最终进入废液接收装置8内。

按照(I-III)的管路连接对二维分离柱93进行预平衡：其中，水相为纯水、酸水或碱水，有机相为甲醇、乙腈或异丙醇；随后通过软件设置水相与有机相的比例，打开二维高压色谱泵91，使得平衡液依次进入第二混合器92、二维分离柱93，然后进入第二检测器94对二维分离柱93进行预平衡(***压力稳定，检测器显示的基线平稳)，最终平衡液进入废液接收装置8。

S2、样品的一维检测及目标组分的捕集：

当一维高压制备液相色谱***处于检测状态时，将待检测的样品进样至一维高压制备液相色谱***，经第一次分离检测后，样品自第一检测器14的出口端流出。随后流出的样品经二位六通切换阀2的1号位、2号位后进入六位选择阀3，然后自六位选择阀3的1号位(或者2号-5号位中的一种进口端)流出后，进入第一捕集柱61的入口端(或者对应的第二捕集柱62、第三捕集柱63、第四捕集柱 64以及第五捕集柱65中的一种)，目标组分被捕集并截留在第一捕集柱61内，随后洗脱液自第一捕集柱61的出口端流出，并通过七通阀7最终进入废液接收装置8。

在该过程中，二维高压制备液相色谱***仍处于(I-III)中的二维分离柱93预平衡状态。

S3、目标组分的二维检测：

当二维高压制备液相色谱***仍处于(I-III)中的二维分离柱93预平衡状态时，调节一维高压制备液相色谱***的管路连接如(II-II)中所述，切换二位六通切换阀2，使得第二混合器92依次和二位六通切换阀2、七通阀7、捕集柱6、以及六位选择阀3连通，最后六位选择阀3又和二位六通切换阀2连通后连通废液处理装置。

此时在一维高压制备液相色谱***和二维高压制备液相色谱***中没有新的样品进样，具体的操作过程为：首先逆时针切换二位六通切换阀2，此时***处于样品分离回收状态。调节经过二维高压制备液相色谱***的流动相，使得流动相自第二混合器92后流经二位六通切换阀2的4号位、5号位后进入七通阀7的公共端进口，并经七通阀7后逆向进入第一捕集柱61的入口端(也是S2 中的第一捕集柱61的出口端)，并将在S2时捕集在第一捕集柱61的组分反冲洗出来，被反冲洗的组分通过六位选择阀3后经过二位六通切换阀2的2号位、3 号位后进入二维分离柱93进行分离检测。

实施例

一种采用二维高压制备液相色谱***进行药物杂质分离纯化的方法，包括以下步骤：

S1、按照(I-I)中的管路连接对一维分离柱13进行预平衡：其中，水相为超纯水(加入0.05％三氟乙酸，v/v)，有机相为乙腈；随后通过软件设置水相与有机相的比例，打开一维高压色谱泵11，使得平衡液进入第一混合器12、一维分离柱13，然后进入第一检测器14后进行预平衡(***压力稳定，检测器显示的基线平稳)，平衡液最后进入废液接收装置8。

按照(I-II)的管路连接对第一捕集柱61、第二捕集柱62、第三捕集柱 63、第四捕集柱64以及第五捕集柱65依次进行预冲洗：其中，清洗液为乙腈和纯水。随后打开辅助泵5，切换六位选择阀3，使得清洗液依次进入第一捕集柱 61、第二捕集柱62、第三捕集柱63、第四捕集柱64以及第五捕集柱65，最终进入废液接收装置8。

按照(I-III)的管路连接对二维分离柱93进行预平衡：其中，水相为超纯水(加入0.05％三氟乙酸，v/v)，有机相为乙腈。随后通过软件设置水相与有机相的比例，打开二维高压色谱泵91，使得平衡液依次进入第二混合器92、二维分离柱93，然后进入第二检测器94对二维分离柱93进行预平衡(***压力稳定，检测器显示的基线平稳)，平衡液进入废液接收装置8。

S2、目标组分的一维检测及目标组分的捕集：

当一维高压制备液相色谱***处于检测状态时，将待处理的样品伊维菌素降解产物进样至一维高压制备液相色谱***，经第一次分离检测后，目标组分自第一检测器14的出口端流出。

根据目标组分的出峰情况，需要将第目标组分收集在第一捕集柱61内。切换相关管路连接，使得随后流出的目标组分经二位六通切换阀2的1号位、2 号位后自六位选择阀3的公共进口端进入，然后自六位选择阀3的1号位出口端流出后，进入第一捕集柱61的入口端，随后目标组分被捕集并截留在第一捕集柱61内，随后流出液(该流出液是进入第一捕集柱61的样品中除去被捕集的目标组分后剩余的液体)自第一捕集柱61的出口端流出，并通过七通阀7的公共出口端流出后经二位六通切换阀2的5号位、6号位后最终进入废液接收装置8。

在该过程中，二维高压制备液相色谱***仍处于(I-III)中的二维分离柱 93预平衡状态。

其中，一维高压制备液相色谱***的实验参数见表1。

表1

一维高压制备液相色谱***的检测结果如图7所示：目标组分含量较少(约为经一维检测的样品重量的5％)，出峰较小，因此需要进行目标组分进一步的分离纯化。

S3、目标组分的二维检测：

当二维高压制备液相色谱***仍处于(I-III)中的二维分离柱93预平衡状态时，调节一维高压制备液相色谱***的管路连接如(II-II)中所述，切换二位六通切换阀2，使得第二混合器92依次和二位六通切换阀2、七通阀7、第一捕集柱61、以及六位选择阀3连通，最后六位选择阀3又和二位六通切换阀2连通后连通废液处理装置。

此时在一维高压制备液相色谱***和二维高压制备液相色谱***中没有新的样品进样，具体的操作过程为：首先逆时针切换二位六通切换阀2，此时***处于样品分离回收状态。调节经过二维高压制备液相色谱***的流动相，使得流动相自第二混合器92后流经二位六通切换阀2的4号位、5号位后进入七通阀7的公共端进口，并经七通阀7后逆向进入第一捕集柱61的入口端(也是S2 中的第一捕集柱61的出口端)，并将在S2中捕集在第一捕集柱61内的目标组分冲洗出来，被冲洗的目标组分通过六位选择阀3后经过二位六通切换阀2的2 号位、3号位后进入二维分离柱93进行分离检测。

其中，二维高压制备液相色谱***的实验参数见表2。

表2

二维高压制备液相色谱***的检测结果如图8所示：目标组分得到有效分离纯化，得到的目标化合物含量较多(约为经二维检测的反冲洗出的目标组分总重量的85％)。本实施例中的目标组分经过二维制备液相色谱***的两次分离，将2g 样品中的低含量的目标组分进行了成功的分离和纯化，最终得到目标化合物(即单体化合物)大约30mg，单体化合物为一个未知物，纯度大于95％，达到了做核磁进行结构确证的要求。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种二维高压制备液相色谱***，其特征在于，包括第一维高压制备液相色谱***（1）、二位六通切换阀（2）、多位选择阀、第一多通阀、捕集柱（6）、第二多通阀和第二维高压制备液相色谱***（9）；

所述第二维高压制备液相色谱***（9）包括二维高压色谱泵（91）、第二混合器（92）、二维分离柱（93）和第二检测器（94）；

所述第一维高压制备液相色谱***（1）的目标组分的出口端和所述第一多通阀连通，所述第一多通阀与二位六通切换阀（2）的1号位连通，所述二位六通切换阀（2）的2号位和所述多位选择阀的进口端连通，所述多位选择阀的出口端与所述捕集柱（6）的进口端切换连通，所述捕集柱（6）的出口端通过所述第二多通阀连通至所述二位六通切换阀（2）的5号位；

所述二维高压色谱泵（91）的出口端和所述第二混合器（92）的进口端连通，所述第二混合器（92）的出口端和所述二位六通切换阀（2）的4号位连通，所述二位六通切换阀（2）的3号位和所述二维分离柱（93）的进口端连通，所述二维分离柱（93）的出口端和所述第二检测器（94）的进口端连通。

2.根据权利要求1所述的一种二维高压制备液相色谱***，其特征在于，所述二维分离柱（93）的直径为20-50 mm，长度为150-250 mm。

3.根据权利要求1所述的一种二维高压制备液相色谱***，其特征在于，所述二维分离柱（93）内的填料为C18键合硅胶填料、AQ-C18键合硅胶填料、C8键合硅胶填料、C4键合硅胶填料、硅胶填料、苯基键合硅胶填料、氰基键合硅胶填料、氨基键合硅胶填料或亲水键合填料。

4.根据权利要求1所述的一种二维高压制备液相色谱***，其特征在于，所述捕集柱（6）的直径为20-50mm，长度为20-50 mm。

5.根据权利要求1所述的一种二维高压制备液相色谱***，其特征在于，所述捕集柱（6）内的填料为C18键合硅胶填料、AQ-C18键合硅胶填料、C8键合硅胶填料、C4键合硅胶填料、硅胶填料、苯基键合硅胶填料、氰基键合硅胶填料、氨基键合硅胶填料或亲水键合填料。

6.根据权利要求1所述的一种二维高压制备液相色谱***，其特征在于，所述第一维高压制备液相色谱***（1）包括一维高压色谱泵（11）、第一混合器（12）和一维分离柱（13），所述一维高压色谱泵（11）和第一混合器（12）以及一维分离柱（13）的进口端连通。

7.根据权利要求6所述的一种二维高压制备液相色谱***，其特征在于，所述一维分离柱（13）的直径为20-50 mm，长度为150-250 mm。

8.根据权利要求7所述的一种二维高压制备液相色谱***，其特征在于，所述一维分离柱（13）内的填料为C18键合硅胶填料、AQ-C18键合硅胶填料、C8键合硅胶填料、C4键合硅胶填料、硅胶填料、苯基键合硅胶填料、氰基键合硅胶填料、氨基键合硅胶填料或亲水键合填料。

9.一种药物中低含量的目标组分的分离纯化方法，其特征在于，采用权利要求1-8任一项所述的二维高压制备液相色谱***实施，具体包括以下步骤：

将经过第一维高压制备液相色谱***（1）检测后流出的目标组分经第一多通阀后，经二位六通切换阀（2）的1号位进入、2号位流出，接着通过切换多位选择阀，使目标组分进入所述捕集柱（6）并被捕集在所述捕集柱（6）内；

将流动相通入第二混合器（92）内，随后通过切换二位六通切换阀（2），使得来自所述第二混合器（92）的流动相经所述二位六通切换阀（2）的4号位进入、所述二位六通切换阀（2）的5号位流出，随后流经所述第二多通阀并进入所述捕集柱（6）内，使得捕集在所述捕集柱（6）内的目标组分被冲洗流出所述捕集柱（6）；

冲洗出的目标组分流经所述多位选择阀，经所述二位六通切换阀（2）的2号位流入、二位六通切换阀（2）的3号位流出后，依次流入二维分离柱（93）、第二检测器（94），实现对目标组分的二维检测。

Images