CN113215094A - 逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用,属于生物医学技术领域,所述外泌体为由间充质干细胞分泌的含miR‑146a的外泌体,所述充质干细胞可以为骨髓间充质干细胞或脐带充质干细胞。本发明充质干细胞外泌体的制备方法作简单,制备的间充质干细胞外泌体可有效降低2型糖尿病空腹血糖,逆转逆转胰岛β细胞去分化,达到治疗2型糖尿病的作用。可应用于制备降低血糖含量制剂、制备逆转胰岛β细胞去分化制剂、制备治疗2型糖尿病胰岛功能损伤的生物制剂以及制备治疗2型糖尿病药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,具体涉及一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
2型糖尿病(type 2diabetes mellitus,T2DM)是一种病因复杂的慢性代谢性疾病,不断进展的糖尿病相关并发症严重降低了患者的生存质量和寿命。
T2DM主要发病核心为胰岛β细胞功能减退和胰岛素抵抗。β细胞功能的衰竭主要归因于β细胞数量和质量的下降。传统观点认为β细胞数量的减少是细胞过早凋亡的结果,且早期研究工作主要集中在增加β细胞存活上。
近年来的多项研究表明,β细胞去分化是一种解释功能性β细胞丧失的新机制。β细胞去分化即正常胰岛β细胞褪去成熟细胞的特征和功能,退化成具有多分化潜能的前体细胞,或适应逆向分化为其他类型的细胞,进而丧失部分或全部胰岛素分泌能力的现象。胰岛β细胞“去分化”程度越高,胰岛素的分泌功能下降越明显。在去分化过程中,β细胞不发生凋亡,而是随着关键β细胞标志物表达的减少而丧失原有成熟β细胞的身份,转变为表达神经元素3(NGN3)和八聚体结合蛋白-4(OCT4))等转录因子的内分泌前体细胞,进一步致使β细胞数量、胰岛素分泌减少。因此,抑制胰岛β细胞数量和功能的下降是治疗T2DM十分重要的策略。
干细胞具有独特的生物学特性、极强的自我更新能力、多向分化潜能以及分泌多种细胞因子等特性,是实现胰岛再生的最佳种子细胞。干细胞治疗能够使部分糖尿病患者停用胰岛素治疗或减少胰岛素用量,其治疗糖尿病的有效性及安全性也得到了有效验证。尽管有证据表明,间充质干细胞(MSC)可以诱导胰岛内分泌谱系,但有报告显示,MSC不能分化成体内β细胞,表明MSC可以通过旁分泌发挥他们的作用。
外泌体(Exosome,EXO)是细胞分泌的细胞外纳米颗粒,含有生物活性分子,包括蛋白质、脂质和核酸。参与糖尿病葡萄糖代谢的外泌体引起了人们的关注。研究发现,脂肪来源的外泌体可以将miR-99b转移到肝细胞中,从而调节成纤维细胞生长因子21(FGF-21)的表达并参与葡萄糖代谢。已经发现心肌细胞来源的外泌体可以直接将GLUT蛋白和糖酵解酶转移到内皮细胞来调节葡萄糖转运。这些研究表明,携带活性成分的外泌体可能是介导MSC在糖尿病中的治疗效果的关键因子。有证据表明,外泌体比其他纳米粒子具有更多优势,可能是糖尿病治疗的潜在的“智能”纳米医学。
目前研究发现间充质干细胞外泌体可以通过增强外周器官胰岛素敏感性和减轻胰岛破坏来降低T2DM大鼠的血糖水平,可以通过促进肌肉中GLUT4的表达和膜转运以及依赖于胰岛素的肝糖原储存来恢复T2DM的葡萄糖稳态,还可以通过抑制STZ诱导的β细胞凋亡来缓解T2DM中的胰岛素分泌功能障碍。但间充质干细胞外泌体对胰岛β细胞去分化的作用还未曾研究,获得一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的骨髓间充质干细胞外泌体,来促进2型糖尿病胰岛功能,提高糖尿病治疗效果具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用,以解决上述背景技术中存在的至少一项技术问题。
为了实现上述目的,本发明采取了如下技术方案:
第一方面,本发明提供一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体,所述外泌体为由间充质干细胞分泌的含miR-146a的外泌体。
优选的,所述外泌体为由骨髓间充质干细胞分泌的含miR-146a的外泌体。
优选的,所述外泌体为由脐带间充质干细胞分泌的含miR-146a的外泌体。
第二方面,本发明提供一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体的制备方法,所述外泌体为由间充质干细胞分泌的含miR-146a的外泌体,包括:
用完全培养基冲洗骨髓腔体,获得骨髓;
将骨髓液接种培养,一定时间后更换新的完全培养基;在随后的培养中使用FBS+双抗的DMEM/F12完全培养基进行培养;
培养至目标融合度后进行传代;用PBS清洗细胞表面,加入适当胰酶消化细胞,进行传代培养;
当传代培养至第3-4代达到目标融合度时,更换为不含外泌体的血清的完全培养基,培养一定时间后收集细胞上清;
将上清液离心,去除残留细胞及碎片,过滤后,加入外泌体提取试剂,离心,沉淀即为外泌体。
优选的,使用外泌体提取试剂Exoquick-TCTM提取外泌体。
第三方面,本发明提供一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体的制备方法,所述外泌体为由间充质干细胞分泌的含miR-146a的外泌体,包括:
在无菌条件下,将脐带剪成小段,充分洗涤,去除脐带的动静脉;
将脐带小段剪碎,于培养皿中贴壁,置于培养箱内培养;
在体外培养体系中对脐带间充质干细胞进行扩增培养,收集扩增培养后的上清液,进行超速梯度离心,使用外泌体提取试剂,提取得到外泌体。
第四方面,本发明提供一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体在制备降低血糖含量制剂中的应用,所述外泌体为由间充质干细胞分泌的外泌体。
第五方面,本发明提供一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体在制备逆转胰岛β细胞去分化制剂中的应用,所述外泌体为由间充质干细胞分泌的外泌体。
第六方面,本发明提供一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体在制备治疗2型糖尿病胰岛功能损伤的生物制剂中的应用,所述外泌体为由间充质干细胞分泌的外泌体。
第七方面,本发明提供一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的应用,所述外泌体为由间充质干细胞分泌的外泌体。
本发明有益效果:首次提出了间充质干细胞外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的新用途,以及在制备逆转胰岛β去分化药物中的新用途;可有效降低2型糖尿病空腹血糖,促进胰岛素分泌,逆转去分化的β细胞,在一定程度上改善了胰岛功能减退,达到治疗2型糖尿病的作用;富含miR-146a的间充质干细胞外泌体的制备方法,操作简单,效率高。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出,这些将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1所述的骨髓来源间充质干细胞外泌体的透射电镜图;图中标尺为100nm。
图2为本发明实施例1所述的外泌体标志western-blot的鉴定结果示意图。
图3为本发明实施例1所述的外泌体干预治疗对血糖曲线变化示意图。
图4为本发明实施例1所述的外泌体干预治疗对葡萄糖耐量的影响结果示意图。
图5为本发明实施例1所述的外泌体干预治疗对胰岛素敏感性的影响结果示意图。
图6为本发明实施例1所述的血清胰岛素水平示意图。
图7为本发明实施例1所述的外泌体干预治疗对胰岛β细胞去分化的影响结果示意图。
图8为本发明实施例1所述的miR-146a敲低的外泌体对血糖曲线变化的影响结果示意图。
图9为本发明实施例1所述的miR-146a敲低的外泌体对胰岛β细胞去分化的影响结果示意图。
图10为本发明实施例2所述的脐带间充质干细胞诱导分化后的图。
图11为本发明实施例2所述的脐带间充质干细胞表型鉴定示意图。
图12为本发明实施例2所述的外泌体透射电镜图;图中标尺为100nm。
图13为本发明实施例2所述的外泌体标志western-blot的鉴定结果示意图。
图14为本发明实施例2所述的外泌体干预治疗对胰岛β细胞去分化的影响结果示意图。
图15为本发明实施例2所述的外泌体对血糖曲线变化的影响结果示意图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施方式,所述实施方式的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过附图描述的实施方式是示例性的,仅用于解释本发明,而不能解释为对本发明的限制。
本技术领域技术人员可以理解,除非另外定义,这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。
还应该理解的是,诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义,并且除非像这里一样定义,不会用理想化或过于正式的含义来解释。
本技术领域技术人员可以理解,除非特意声明,这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是,本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件,但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件和/或它们的组。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
为便于理解本发明,下面结合附图以具体实施例对本发明作进一步解释说明,且具体实施例并不构成对本发明实施例的限定。
本领域技术人员应该理解,附图只是实施例的示意图,附图中的部件并不一定是实施本发明所必须的。
实施例1
骨髓来源间充质干细胞(bmMSC)存在于骨髓基质中,具有自我更新和多向分化潜能。bmMSC在体外可被诱导分化为骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞等不同的组织细胞,是组织修复及再生医学研究的热点和重点。bmMSC外泌体(exosome,bmMDEs)作为旁分泌途径的重要表现形式,因其具有多种生物活性和细胞间通讯功能而被认为是一种有前途的无细胞疗法。Exosome携带的RNA中主要为miRNA,已证实miRNA在调节胰岛β细胞功能方面起着至关重要的作用。外泌体(exosome)是直径约100nm、由脂质双分子层包裹的囊泡。通过传递囊泡内包含的RNA(mRNA,miRNA和其他RNA)、蛋白质和脂质等物质进行细胞间通讯,影响包括细胞因子的产生、细胞增殖、凋亡和新陈代谢等多种生命活动。
本发明实施例1中,通过高脂饮食+STZ诱导建立2型糖尿病模型,进行bmMSC来源外泌体干预,分别检测外泌体干预后大鼠的血糖、糖耐量、胰岛素敏感性、血清胰岛素水平的变化,胰岛β细胞去分化水平。根据miRNA高通量测序筛选出功能性miR-146a,通过建立miR-146a稳定敲低的细胞系,提取外泌体干预2型糖尿病大鼠,miR-146a在外泌体逆转胰岛β细胞去分化方面具有积极的作用。bmMSC外泌体富含的miR-146a能改善2型糖尿病大鼠血糖、逆转胰岛β细胞去分化,起到治疗2型糖尿病的作用。
在本实施例1中,所用的试验材料均为本领域常规的试验材料,均可通过商业渠道购买得到。
本实施例1中,对骨髓间充质干细胞(bmMSC)的提取与分离包括:
(1)股骨的分离:选取4周龄左右的雄性SD大鼠,过量麻醉剂处死后用75%乙醇浸泡5分钟,随后移入超净台,在无菌条件下分离大鼠的双侧股骨和胫骨。
(2)骨髓的获取:剪掉股骨两端,暴露骨髓腔,用5ml注射器吸取完全培养基(79%DMEM/F12培养基+20%FBS+1%双抗)冲洗腔体,反复抽打2-3次收获骨髓。
(3)种板:按照一条股骨所提骨髓液接种至六孔板中一个孔的原则进行种板,每孔约2.5ml。放至37℃、5%CO2细胞培养箱中过夜培养,24小时后更换新的完全培养基。在随后的培养中使用10%FBS+1%双抗的DMEM/F12完全培养基进行培养。
(4)传代:细胞融合度达90%时可进行传代。用PBS清洗细胞表面,加入适当胰酶消化细胞,按照每孔细胞传至一个25cm2培养瓶的原则进行传代培养。选取第3-4代细胞用于后续实验。
本实施例中,bmMSC来源外泌体的提取与鉴定包括:
当第3-4代bmMSCs融合至50%左右时,更换为不含外泌体的血清的完全培养基,48小时后收集细胞上清。将上清液于4℃、2000g离心20分钟以去除残留细胞及碎片。0.22μm无菌过滤器过滤后将条件培养基移入新的15ml离心管,加入Exoquick-TCTM外泌体提取试剂,4℃过夜后,4℃、5000g离心30分钟,沉淀即为外泌体。将所有含外泌体的沉淀重悬于PBS中或溶解于RNA裂解缓冲液中,-80℃保存以进行后续实验。
将提取到的外泌体用透射电镜的方法对其直接大小以及形态进行检测,结果如图1所示;用western-blot的方法检测外泌体标志TSG101、CD9,以及内质网标记蛋白Calnexin,进一步对其进行鉴定,结果如图2所示。
在本实施例1中,研究bmMSC来源外泌体对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞去分化的影响实验,如下:
(1)高脂饮食+STZ诱导建立2型糖尿病模型与外泌体干预
4周龄雄性SD大鼠用于构建2型糖尿病模型。适应性喂养一周后,给予高脂饮食喂养4周,禁食不禁饮12小时后称量体重,然后按照30mg/kg剂量腹腔注射STZ,继续高脂饮食。STZ注射后隔日测大鼠空腹血糖,连续2次测得空腹血糖≥16.7mmol/L即为2型糖尿病(T2DM)建模成功。从STZ注射后第5天开始,尾静脉注射bmMSCs(5×106细胞/大鼠,两周一次,共5个周期)或bmMSCs来源的外泌体(bmMDEs,10mg/kg,每3天注射一次,持续10周)。正常对照组及T2DM组尾静脉注射等体积的PBS(0.2ml),每3天一次,共10周。
(2)检测大鼠的血糖变化。
STZ注射前后,每周对大鼠血糖进行监测,记录数据并作出血糖曲线进行统计学分析。结果如图3所示,STZ注射之后,模型组大鼠空腹血糖迅速升高且>16.7mmol/L。与T2DM组相比,bmMSC来源的外泌体大大改善了高血糖症,且在干预结束后血糖仍呈持续低水平状态。
(3)检测大鼠葡萄糖耐量、胰岛素敏感性。
最后一次干预1周后进行检测。葡萄糖耐量检测:实验前大鼠禁食不禁饮14-16小时,称完体重后,按1.5g/kg剂量腹腔注射50%葡萄糖溶液。分别于0、30、60、120、180分钟监测大鼠血糖。胰岛素敏感性检测:实验前大鼠禁食不禁饮4-6小时,称完体重后,按2IU/kg剂量腹腔注射胰岛素。分别于0、30、60、120、180分钟监测大鼠血糖。由图4、图5可以看出,bmMSC来源的外泌体干预组T2DM大鼠葡萄糖耐量异常和胰岛素敏感性下降得到显著改善,主要表现为禁食后血糖水平下降,糖负荷/胰岛素负荷后血糖升高/降低幅度较T2DM组明显降低,且峰值恢复更为迅速,曲线下面积较模型组低。
(4)检测大鼠血清胰岛素水平。
大鼠过夜禁食不禁饮,10%水合氯醛麻醉后,迅速逐层打开胸腔,行心尖取血,使用Elisa试剂盒检测血清胰岛素水平。由图6可知,外泌体干预后血清胰岛素水平明显升高。图6中,最左边框为Control+PBS,中间框为T2DM+PBS,最右边框为T2DM+bmMDEs。
(5)检测胰岛β细胞去分化情况。
大鼠胰腺组织石蜡切片行胰岛素与胰岛β细胞标志物PDX1/FOXO1、胰岛祖细胞标志物NGN3/OCT4免疫荧光染色。如图7结果显示,相较于正常对照组,T2DM胰岛β细胞标志物(PDX1、FOXO1)表达下降、胰岛祖细胞标志物(NGN3、OCT4)表达显著上升;外泌体干预10周后,PDX1、FOXO1表达上调、NGN3、OCT4表达下调。以上结果表明,bmMSC来源的外泌体能够逆转胰岛β细胞去分化。图7中,最左边框为Control+PBS,中间框为T2DM+PBS,最右边框为T2DM+bmMDEs。
在本实施例1中,为了研究间充质干细胞外泌体对逆转胰岛β细胞去分化的机理,确定外泌体富含的miR-146a对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞去分化的影响,对骨髓间充质干细胞进行了海绵抑制剂转染,提取外泌体干预2型糖尿病大鼠。转染干细胞敲低了外泌体中miRNA-146a的表达,发现敲低miRNA-146后外泌体逆转β细胞的作用下降了,逆向证明miRNA-146a在外泌体发挥功能中的重要性。
(1)慢病毒转染bmMSCs及exosome提取
1)将细胞状态良好的第2代bmMSCs胰酶消化后计数种到12孔板,37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。
2)当细胞融合达50%左右时更换培养基,分别更换为新的完全培养基、慢病毒阴性对照剂(sponge inhibitor NC序列:5’TTCTCCGAACGTGTCACGT 3’)、
miR-146a knockdown慢病毒(miR-146a sponge inhibitor序列:5’TAACCCATGGAATTCAGTTCTCACGATAACCCATGGAATTCAGTTCTCAACCGGTAACCCATGGAATTCAGTTCTCATCACAACCCATGGAATTCAGTTCTCATTTTTTC 3’),37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养。
3)12小时后更换新的培养基。
4)转染48小时后,每孔加入嘌呤霉素建立miR-146a敲除的稳转细胞系。提RNA/蛋白检测转染效率。
5)加入Exoquick-TCTM外泌体提取试剂分别提取miR-NC KD组外泌体(bmMDEsmiR-NC KD)及miR-146a KD(bmMDEsmiR-146a KD)组外泌体。
(2)miR-146a对2型糖尿病大鼠血糖及胰岛β细胞去分化的作用
STZ注射后,大鼠空腹血糖均≥16.7mmol/L。除外第一部分所用大鼠外,其余大鼠分为以下4组(n=7/组):正常对照组、T2DM组、T2DM+bmMDEsmiR-NC KD组、T2DM+bmMDEsmiR-146a KD组。从STZ注射后第5天开始,将两种bmMDEs(10mg/kg)重悬于0.2ml PBS中,通过尾静脉注入大鼠体内,每3天注射一次,持续10周。正常对照组及T2DM组尾静脉注射等体积的PBS,每3天一次,共10周。
结果如图8所示,所有注射STZ的大鼠1周后空腹血糖水平均升高至 与T2DM+PBS组和bmMDEsmiR-146a KD干预组相比,bmMDEsmiR-NC KD干预组大鼠的空腹血糖明显降低。大鼠胰腺组织石蜡切片行胰岛素与胰岛β细胞标志物PDX1/FOXO1、胰岛祖细胞标志物NGN3/OCT4免疫荧光染色。如图9结果显示,与T2DM+PBS组和T2DM+bmMDEsmiR-146a KD组相比,bmMDEsmiR-NC KD治疗后的T2DM大鼠胰岛中PDX1和FOXO1的表达水平升高,而NGN3和OCT4表达降低。这些数据表明,bmMDEs携带的miR-146a在改善T2DM大鼠血糖和逆转β细胞去分化方面具有重要作用。图9中,四条竖直框从左至右依次为Control+PBS,T2DM+PBS,T2DM+bmMDEsmiR-NC KD,T2DM+bmMDEsmiR-146a KD。
以上结果显示,bmMSC来源的外泌体能够改善2型糖尿病大鼠血糖、促进胰岛素分泌、逆转胰岛β细胞去分化,进而恢复减退的胰岛功能,达到治疗2型糖尿病的作用,外泌体富含的miR-146a在该过程中发挥了重要作用。
实施例2
本发明实施例2中,所述间充质干细胞外泌体由如下方法制备而成:
(1)在无菌条件下,将脐带剪成小段,充分洗涤,去除脐带的动静脉。
(2)将脐带小段剪碎,置于培养皿中,直接与皿底贴壁,置于37℃、5%CO 2培养箱内培养,4h后添加完全培养基。每隔3d换液一次。
(3)在体外培养体系中对脐带间充质干细胞进行扩增培养,收集扩增培养后的上清液,进行超速梯度离心,即提取得到脐带来源间充质干细胞外泌体。
步骤(1)中,冲洗用液体为:无菌生理盐水+1%双抗。
步骤(2)中,培养用完全培养基为20%FBS+1%青链双抗的低糖α-MEM培养液。
步骤(3)中,收集上清液提取外泌体前将培养基更换为10%无外泌体FBS+1%青链双抗的低糖α-MEM培养液。
所述脐带来源间充质干细胞外泌体具有CD44、CD90标志。
所述脐带来源间充质干细胞外泌体来源于人脐带。
在本实施例2中,使用的仪器和试剂、材料均是本领域技术人员公知的,可通过商业机构购买获得。所使用的方法,如HE染色、Western blot等均为本领域公知的方法,可通过教科书或相关文献的描述进行,不再赘述。
本实施例2中,人间充质干细胞的分离与鉴定包括:
在无菌条件下,将脐带剪成小段,充分洗涤,去除脐带的动静脉,将脐带小段剪碎,置于培养皿中,直接与皿底贴壁,置于37℃、5%CO 2培养箱内培养,4h后添加20%FBS和5%青链双抗的低糖α-MEM培养液。3d后更换培养液,每隔3d换液一次。待MSC融合达70~80%后,用0.25%的胰酶消化,传代培养,取P3代细胞进行实验。取P3代细胞成脂成骨诱导如图10所示,其中,图10(a)为成脂分化,图10(b)为成骨分化,并做表型CD44、CD90、CD34、CD45鉴定,如图11所示,结果证明分离的细胞为间充质干细胞。
在本实施例2中,将P3代的MSC种植于培养皿的中,当细胞融合达60~80%,用PBS清洗细胞,更换无外泌体血清的培养基,继续培养培养48~72h后,收集细胞上清,以2000rpm的转速离心10min,然后以10000rpm的转速离心30min,去除细胞或者细胞碎片。使用外泌体提取试剂盒依照说明书分离提取MSC外泌体,电镜下观察(如图12所示)。用Western blot鉴定MSC外泌体相关蛋白CD63、CD81的表达,结果如图13所示,收集到的蛋白均有表达CD81和CD63,说明分离得到了间充质干细胞外泌体。
MSCs外泌体对体外胰岛β细胞去分化的影响:
胰岛β细胞株在高糖培养基中培养72h后,分别予以不同浓度EXO(0、10、20、30μg/ml)干预24h,检测各组β细胞PDX1、MafA、INS1、INS2、Ngn3、Nanog、Oct4基因mRNA表达水平。结果如图14所示,与对照组相比,高糖可使β细胞表面标志物(PDX1、MafA、INS1、INS2)表达减少、去分化指标(Ngn3、Nanog、Oct4)表达增加;EXO作用后,减轻了糖毒性诱导的β细胞去分化程度。
图14中,MSCs外泌体对体外胰岛β细胞去分化的影响(PDX1:胰岛素基因表达的关键调节子,结合于胰岛素基因的A3元件,调节胰岛素基因的表达;MafA:是一种碱性亮氨酸拉链(bZIP)结构的转录因子,结合于胰岛素基因的启动子,启动胰岛素基因的表达;Ngn3:功能主要是作为内分泌前体细胞基因转录的激活子;Nanog:胚胎干细胞核心转录因子;Oct4:八聚体结合蛋白-4,都是反映细胞多能性的经典标记。)
在本实施例2中,脐带MSC外泌体可降低STZ诱导的T2DM大鼠的空腹血糖,其实验步骤如下:
STZ诱导T2DM大鼠模型的建立:
选取4周龄60g左右SD大鼠,高脂饮食(HFD)喂养4周后禁食12h,按30mg/kg一次性腹腔注射STZ柠檬酸溶液,72h后尾静脉全血血糖大于16.7mmol/L为糖尿病模型造模成功;对照组则注射等量柠檬酸缓冲液。
尾静脉内给予MSC外泌体可降低STZ诱导的T2DM大鼠的空腹血糖:
STZ诱导的T2DM模型,在注射STZ后第5天尾静脉输注100μl浓度为10μg/ml的MSCs外泌体,隔日一次,共10周;检测大鼠的空腹血糖,结果如图15所示,MSC外泌体治疗组大鼠的空腹血糖明显低于未治疗组(P<0.05)。
本实施例2中,上述脐带来源间充质干细胞外泌体的制备方法,操作简单可行,提出了脐带来源间充质干细胞外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的新用途,以及在制备逆转胰岛β细胞去分化制剂中的新用途,脐带来源间充质干细胞外泌体可有效降低2型糖尿病空腹血糖,逆转逆转胰岛β细胞去分化,达到治疗2型糖尿病的作用。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已,并不用于限制本公开,对于本领域的技术人员来说,本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本公开的保护范围之内。
上述虽然结合附图对本公开的具体实施方式进行了描述,但并非对本公开保护范围的限制,所属领域技术人员应该明白,在本发明公开的技术方案的基础上,本领域技术人员在不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体,其特征在于,所述外泌体为由间充质干细胞分泌的含miR-146a的外泌体。
2.根据权利要求1所述的逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体,其特征在于,所述外泌体为由骨髓间充质干细胞分泌的含miR-146a的外泌体。
3.根据权利要求1所述的逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体,其特征在于,所述外泌体为由脐带充质干细胞分泌的含miR-146a的外泌体。
4.一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体的制备方法,所述外泌体为由间充质干细胞分泌的含miR-146a的外泌体,其特征在于,包括:
用完全培养基冲洗骨髓腔体,获得骨髓;
将骨髓液接种培养,一定时间后更换新的完全培养基;在随后的培养中使用FBS+双抗的DMEM/F12完全培养基进行培养;
培养至目标融合度后进行传代;用PBS清洗细胞表面,加入适当胰酶消化细胞,进行传代培养;
当传代培养至第3-4代达到目标融合度时,更换为不含外泌体的血清的完全培养基,培养一定时间后收集细胞上清;
将上清液离心,去除残留细胞及碎片,过滤后,加入外泌体提取试剂,离心,沉淀即为外泌体。
5.根据权利要求4所述的逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体的制备方法,其特征在于,使用外泌体提取试剂Exoquick-TCTM提取外泌体。
6.一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体的制备方法,所述外泌体为由间充质干细胞分泌的含miR-146a的外泌体,其特征在于,包括:
在无菌条件下,将脐带剪成小段,充分洗涤,去除脐带的动静脉;
将脐带小段剪碎,于培养皿中贴壁,置于培养箱内培养;
在体外培养体系中对脐带间充质干细胞进行扩增培养,收集扩增培养后的上清液,进行超速梯度离心,使用外泌体提取试剂,提取得到外泌体。
7.一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体在制备降低血糖含量制剂中的应用,其特征在于,所述外泌体为由间充质干细胞分泌的外泌体。
8.一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体在制备逆转胰岛β细胞去分化制剂中的应用,其特征在于,所述外泌体为间充质干细胞分泌的外泌体。
9.一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体在制备治疗2型糖尿病胰岛功能损伤的生物制剂中的应用,其特征在于,所述外泌体为由间充质干细胞分泌的外泌体。
10.一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的应用,其特征在于,所述外泌体为由间充质干细胞分泌的外泌体。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113750110A (zh) * | 2021-09-14 | 2021-12-07 | 山东大学齐鲁医院 | 间充质干细胞外泌体在制备用于预防或治疗1型糖尿病及其相关疾病药物中的应用 |
CN116751735A (zh) * | 2023-07-04 | 2023-09-15 | 重庆市铂而斐细胞生物技术有限公司 | 一种脐带间充质干细胞的无血清培养方法 |
CN117257837A (zh) * | 2023-06-26 | 2023-12-22 | 山东大学 | 外泌体在制备治疗由2型糖尿病引起的肌肉萎缩药物中的应用 |
CN117866889A (zh) * | 2024-01-13 | 2024-04-12 | 山东大学齐鲁医院 | 促进间充质干细胞外泌体分泌的方法及外泌体在制备治疗糖尿病溃疡药物中的应用 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102908621A (zh) * | 2011-08-02 | 2013-02-06 | 中国科学院上海生命科学研究院 | miRNAs作为调节胰岛素敏感性的靶标的新用途 |
US20170321225A1 (en) * | 2013-01-18 | 2017-11-09 | Henry Ford Health System | METHODS, SYSTEMS, AND COMPOSITIONS RELATING TO MiRNA-146a |
CN108103017A (zh) * | 2018-02-28 | 2018-06-01 | 江苏大学 | 人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用 |
CN111235209A (zh) * | 2020-03-09 | 2020-06-05 | 山东大学齐鲁医院 | 一种评估干细胞免疫调控功能的方法 |
CN111281889A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-06-16 | 博生众康(厦门)医药生物技术股份有限公司 | 人脐带间充质干细胞外泌体的用途 |
US20200208115A1 (en) * | 2017-09-11 | 2020-07-02 | Symbiocelltech, Llc | Adaptation of Hollow-Fiber-Based Cell Culture Technology for the Manufacturing of (1) Neo-Islets, Employed for the Treatment of Type 1 and Type 2 Diabetes Mellitus, and (2) the Generation of Exosomes from Various Cell Types, Used in the Treatment of Different Organ Injuries and Diseases |
CN111849882A (zh) * | 2020-07-17 | 2020-10-30 | 尧舜泽生物医药(南京)有限公司 | 间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 |
CN112352047A (zh) * | 2020-09-08 | 2021-02-09 | 江苏大学 | 一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法及应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20170010956A (ko) * | 2015-07-20 | 2017-02-02 | 울산대학교 산학협력단 | 줄기세포 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물 |
CN108642004A (zh) * | 2018-05-17 | 2018-10-12 | 广东芙金干细胞再生医学有限公司 | 一种外泌体的制备方法及含有外泌体的干细胞增殖试剂 |
CN110772538A (zh) * | 2019-11-13 | 2020-02-11 | 上海奈康生物科技有限公司 | 一种间充质干细胞外泌体制剂及其应用 |
CN111437286A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-07-24 | 百澳瑞派(天津)生物科技有限公司 | 基因工程改造外泌体递送miRNA-146a在糖尿病足溃疡治疗方面的应用 |
-
2021
- 2021-05-17 CN CN202110536528.0A patent/CN113215094A/zh active Pending
-
2022
- 2022-04-20 CN CN202210416150.5A patent/CN116042517A/zh active Pending
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102908621A (zh) * | 2011-08-02 | 2013-02-06 | 中国科学院上海生命科学研究院 | miRNAs作为调节胰岛素敏感性的靶标的新用途 |
US20170321225A1 (en) * | 2013-01-18 | 2017-11-09 | Henry Ford Health System | METHODS, SYSTEMS, AND COMPOSITIONS RELATING TO MiRNA-146a |
US20200208115A1 (en) * | 2017-09-11 | 2020-07-02 | Symbiocelltech, Llc | Adaptation of Hollow-Fiber-Based Cell Culture Technology for the Manufacturing of (1) Neo-Islets, Employed for the Treatment of Type 1 and Type 2 Diabetes Mellitus, and (2) the Generation of Exosomes from Various Cell Types, Used in the Treatment of Different Organ Injuries and Diseases |
CN108103017A (zh) * | 2018-02-28 | 2018-06-01 | 江苏大学 | 人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用 |
CN111235209A (zh) * | 2020-03-09 | 2020-06-05 | 山东大学齐鲁医院 | 一种评估干细胞免疫调控功能的方法 |
CN111281889A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-06-16 | 博生众康(厦门)医药生物技术股份有限公司 | 人脐带间充质干细胞外泌体的用途 |
CN111849882A (zh) * | 2020-07-17 | 2020-10-30 | 尧舜泽生物医药(南京)有限公司 | 间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 |
CN112352047A (zh) * | 2020-09-08 | 2021-02-09 | 江苏大学 | 一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
KENTA KUBOTA等: "An enriched environment prevents diabetes-induced cognitive impairment in rats by enhancing exosomal miR-146a secretion from endogenous bone marrow-derived mesenchymal stem cells", 《PLOS ONE》 * |
YAOXIANG SUN等: "Human Mesenchymal Stem Cell Derived Exosomes Alleviate Type 2 Diabetes Mellitus by Reversing Peripheral Insulin Resistance and Relieving β-Cell Destruction", 《ACS NANO》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113750110A (zh) * | 2021-09-14 | 2021-12-07 | 山东大学齐鲁医院 | 间充质干细胞外泌体在制备用于预防或治疗1型糖尿病及其相关疾病药物中的应用 |
CN117257837A (zh) * | 2023-06-26 | 2023-12-22 | 山东大学 | 外泌体在制备治疗由2型糖尿病引起的肌肉萎缩药物中的应用 |
CN116751735A (zh) * | 2023-07-04 | 2023-09-15 | 重庆市铂而斐细胞生物技术有限公司 | 一种脐带间充质干细胞的无血清培养方法 |
CN116751735B (zh) * | 2023-07-04 | 2024-03-15 | 重庆市铂而斐细胞生物技术有限公司 | 一种脐带间充质干细胞的无血清培养方法 |
CN117866889A (zh) * | 2024-01-13 | 2024-04-12 | 山东大学齐鲁医院 | 促进间充质干细胞外泌体分泌的方法及外泌体在制备治疗糖尿病溃疡药物中的应用 |
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