CN113215058B

CN113215058B - 一株能够降解胶原蛋白的菌株及其应用

Info

Publication number: CN113215058B
Application number: CN202110640091.5A
Authority: CN
Inventors: 张玉忠; 陈秀兰; 王珍; 张晓玉; 程俊慧; 宋晓妍
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2021-06-08
Filing date: 2021-06-08
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2041-06-08
Also published as: WO2022257391A1; KR20230170105A; CN113215058A

Abstract

本发明涉及一株能够降解胶原蛋白的菌株及其应用。该菌株2021年5月8日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2021506，地址：中国，武汉，武汉大学。该菌株具有胶原蛋白降解能力，可以制备的胶原蛋白酶，该酶能够应用于酶解胶原蛋白，生产胶原蛋白寡肽。特别是对牛骨等胶原蛋白原料具有很强的降解能力，可以对牛骨、鱼皮等肉类加工和渔业加工的副产品做进一步的酶解处理。采用牛骨作为原料，制备的胶原蛋白寡肽分子量小于5000Da的肽段达到了77％以上，分子量小且均一度高，易于被人体吸收利用，有效的提高了胶原蛋白副产品的附加值，具有很好的经济效益。

Description

一株能够降解胶原蛋白的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株能够降解胶原蛋白的菌株及其应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白质，是细胞外基质内的一种主要结构蛋白。胶原蛋白分布广泛，是哺乳动物***的主要成分，在水产及海洋动物的皮、骨、鳞等部位也含有丰富的胶原蛋白，主要以不溶性纤维状蛋白的形式存在。这些胶原蛋白在食品加工过程中往往作为下脚料处理，不仅造成生物资源的浪费，还对环境造成不良的影响。充分合理的利用这些食品加工过程中的废弃物，不仅能够推动畜产、水产加工业的发展，而且能够减少环境污染。

利用胶原蛋白原料生产胶原蛋白寡肽是食品加工过程中产生的胶原蛋白下脚料高值化利用的重要途径。胶原蛋白寡肽具有独特的生物活性，如抗菌、降血压、抗氧化、免疫调节等。另外，相较于陆源动物为原料来源制备的胶原蛋白肽，水产及海洋动物胶原蛋白肽具有更高的生物安全性、更低的免疫原性和其它独特的理化性质，且对机体健康具有良好保健功能，在生物制药、美容护肤、卫生健康、食品保健等领域均有着巨大的应用潜力。

胶原蛋白分子量大且由于三股螺旋超分子的结构以及存在于各级层中的交联聚集作用，胶原蛋白的分子稳定性很高，不易被降解。目前工业生产上酶法提取胶原蛋白这一工艺中使用的蛋白酶主要分为微生物蛋白酶、植物蛋白酶、动物蛋白酶这三类，这些酶可以水解除去胶原纤维的末端肽，使之可溶于有机酸，但无法破坏胶原蛋白的三股螺旋特性。因此筛选获得新的特异性的高效胶原蛋白酶尤为重要。成熟的微生物发酵工艺和产物提取纯化工艺使得微生物来源的胶原蛋白酶尤为引人关注。

目前，人们已经从枯草杆菌、蜡状芽孢杆菌、放线菌、假交替单胞菌等微生物中获得了胶原蛋白酶，但大多数菌株产酶活力较低或需要特殊的诱导条件，能够分泌高效胶原蛋白酶的进而降解胶原蛋白的菌株还很缺乏。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一株能够降解胶原蛋白的菌株及其应用。该菌株属于莱茵海默氏属的一个新种，能够分泌的胶原蛋白酶，可用于胶原蛋白的降解，提高畜产、水产加工中胶原蛋白下脚料的附加值。

本发明的技术方案如下：

一株莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107，该菌株2021年5月8日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M2021506，地址：中国，武汉，武汉大学。

上述菌株自西南印度洋多金属硫化物区热液口(E 49.34627°,S 37.89947°)的沉积物样品分离得到。

根据本发明优选的，所述莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107的16SrDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107的生长温度范围为10～40℃，最适生长温度为25～30℃；生长的NaCl浓度范围为1.0～9.0％(w/v)，最适生长的NaCl浓度为3.0～4.0％(w/v)；生长的pH范围为5～9，最适生长的pH值为7.0～7.5。

本发明所述莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107在制备胶原蛋白酶以及降解胶原蛋白中的应用。

上述应用，包括步骤如下：

(1)制备胶原蛋白酶：将莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107接种至发酵培养基中进行发酵培养，在摇床转速150～200rpm，培养温度23～27℃下培养4～6d，得到发酵液；再将发酵液经离心得到的上清液即为胶原蛋白酶液；

(2)降解胶原蛋白：向胶原蛋白中加入步骤(1)得到的胶原蛋白酶液，在45～55℃的条件下反应2～3h，经离心后去除沉淀，得到的上清液即为胶原蛋白酶解液。

根据本发明优选的，步骤(1)中，所述的发酵培养基组分如下：牛骨胶原蛋白3份，酵母粉2份，海盐30份，水1000份，pH 7.0～7.4，均为重量份。

根据本发明优选的，步骤(1)中，所述的发酵培养条件为：摇床转速180rpm，培养温度25℃，培养时间5d；所述的离心转速为6000～8000r/min，离心时间为8～12min。

根据本发明优选的，步骤(2)中，所述的离心转速为6000～8000r/min，离心时间为8～12min；所述的胶原蛋白为牛骨胶原蛋白。

根据本发明优选的，步骤(2)中，所述的胶原蛋白酶液的加入量为1300～1700U/g的酶料比(E/S)。

一种胶原蛋白酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述胶原蛋白酶分离自莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107。

上述胶原蛋白酶的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述编码基因来源于莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107。

上述胶原蛋白酶在降解胶原蛋白中的应用。

有益效果：

本发明提供的莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107是莱茵海默氏属的一个新种，具有胶原蛋白降解能力，可以制备的胶原蛋白酶，该酶能够应用于酶解胶原蛋白，生产胶原蛋白寡肽。特别是对牛骨等胶原蛋白原料具有很强的降解能力，可以对牛骨、鱼皮等肉类加工和渔业加工的副产品做进一步的酶解处理。采用牛骨作为原料，制备的胶原蛋白寡肽分子量小于5000Da的肽段达到了77％以上，分子量小且均一度高，易于被人体吸收利用，有效的提高了胶原蛋白副产品的附加值，具有很好的经济效益。

附图说明

图1为莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107的透射电子显微镜(TEM)图；

图2为根据莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107以及其它细菌的16SrDNA序列构建的***发育树图。

图3为莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107的极性脂双向层析图。

图中：图a、磷钼酸染色，图b、茚三酮染色

图4为莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107对牛骨胶原蛋白的酶解效果图；

图中：1、降解前，2、降解后。

图5为实施例6不同酶料比对牛骨胶原蛋白的水解率折线图。

图6为实施例6牛骨胶原蛋白水解物的分子量分布图。

图7为实施例7胶原蛋白酶的SDS-PAGE图谱。

图8为实施例7牛骨经胶原蛋白酶酶解后产物的分子量分布图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

一株莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107，2021年5月8日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2021506，地址:中国，武汉，武汉大学。

实施例中培养基的配制原料均为本领域常用原料；牛骨胶原蛋白可在市场购得。

实施例1菌株的筛选与分离

(1)样品采集

从西南印度洋多金属硫化物区热液口(E 49.34627°,S 37.89947°)采集沉积物，放置在冰盒中带回实验室。

(2)富集驯化

吸取沉积物样品500μL加入到50mL唯一碳源液体培养基中，在摇床中以25℃，180rpm的条件，培养一周，得到富集的菌液。

(3)菌株的筛选和分离

将步骤(2)中富集的菌液按照10¹，10²，10³，10⁴，10⁵的倍数进行梯度稀释，然后分别接种于筛选培养基平板上，在25℃条件下培养48h，并进一步采用平板划线法纯化接种至明胶培养基上；接着在明胶培养基上将形成降解圈的菌株挑出，得到具有高效降解胶原蛋白能力的菌株，通过甘油管方法保藏。

上述培养基组分如下：

唯一碳氮源液体培养基：NaCl 30份，NH₄Cl 0.5份，MgCl₂·6H₂O 3份，K₂SO₄ 2份，K₂HPO₄ 0.2份，CaCl₂ 0.01份，FeCl₃·6H₂O 0.006份，Na₂MoO₄·7H₂O 0.005份，CuCl₂·2H₂O0.004份，Tris 6份，几丁质10份，pH 7.8～8.0，均为重量份。本培养基以几丁质为唯一碳源。

筛选培养基：在每升唯一碳氮源液体培养基基础上添加15g琼脂粉，pH 7.8～8.0。

明胶培养基：蛋白胨5份，明胶20份，琼脂粉15份，海盐30份，蒸馏水1000份，均为重量份。

实施例2菌株形态学的鉴定

将实施例1筛选和分离的菌株划线到TYS固体培养基平板上，在温度为25℃的条件下培养24h，观察并记录平板上菌落的生长情况，菌落形态的透射电子显微镜(TEM)图，如图1所示。

由图1可知，该菌株在TYS固体培养基平板上，菌落呈透明(后期发黄)，圆形，边缘整齐，表明光滑较湿润；革兰氏染色呈红色，表明为革兰氏阴性菌；透射电子显微镜(TEM)图中细胞呈杆状，长宽为1.7～2.4×0.5～1.1μm，单胞，可分泌大量的胞外聚合物。

TYS固体培养基：蛋白胨5份，酵母粉1份，海盐30份，水1000份，pH 7.0～7.4，均为重量份。

实施例3菌株生理生化的鉴定

通过常规生理生化实验和API 20NE、ZYM试剂条对实施例1筛选和分离的菌株的生理生化特征进行鉴定。

鉴定分析结果见表1。

表1实施例1分离的菌株和莱茵海默氏属亲缘关系相近菌株的生理生化特征比较

表中：1为实施例1分离的菌株；2为菌种Rheinheimera tuosuensis CGMCC1.12461^T；3为菌种Rheinheimera longhuensis LH2-2^T；4为菌种Rheinheimera aestuariH29^T；5为菌种Rheinheimera pacifica KMM 1406^T；6为菌种Rheinheimera perlucidaBA131^T。+代表阳性；w代表弱阳性；-,negative reaction；ND，代表没有可用数据。

由表1可知，实施例1筛选和分离的菌株生长温度范围为10～40℃，最适生长温度为25～30℃；生长的NaCl浓度范围为1.0～9.0％(w/v)，最适生长的NaCl浓度为3.0～4.0％；生长的pH范围为5～9，最适生长的pH值为7.0～7.5。实施例1筛选和分离的菌株能够还原硝酸盐为亚硝酸盐，其氧化酶和触酶反应为阳性。同时该菌株能够水解酪蛋白、明胶、Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80、淀粉和七叶苷。

实施例4菌株的16S rDNA序列扩增与鉴定

使用BioTeke细菌基因组提取试剂盒提取实施例1筛选和分离的菌株中的DNA，具体提取方法参照该试剂盒的说明书。

PCR引物采用通用引物：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTTC-3'。

PCR反应条件为：温度为95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸90s；30个循环，72℃延伸5min，4℃保存。

PCR产物由北京擎科生物科技有限公司进行测序，测序结果如序列表SEQ ID NO.1所示，长度为1523bp。

将扩增出的16S rDNA序列在EZBioCloud数据库与所有标准菌株16S rDNA序列进行同源性分析，结果显示同源性较高的序列属于莱茵海默氏属，选取莱茵海默氏属内的相近亲缘关系的菌株与实施例1分离的菌株进行***发育分析。采用MEGA-X软件运用邻接法(Neighbor-joining)构建***发育树，如图2所示。

根据16S rDNA序列比对结果并结合该菌株的生物学特性，将该菌株鉴定为莱茵海默氏属新菌，命名为Rheinheimera indica SM2107。

实施例5菌株的脂肪酸、细胞醌和极性脂成分分析

使用MIDI(Microbial Identification)公司的Sherolock全自动细菌鉴定***对莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107进行脂肪酸成分分析，具体分析方法参照该全自动细菌鉴定***的说明书，分析结果如表2所示。

通过薄层双向层析方法(TLC)分析实施例1筛选和分离的莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107极性脂组成，结果如图3所示。

使用反相高效液相色谱分析法，用十八烷基硅烷色谱柱(ODS 5mm，150×4.6mm)分析莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107呼吸醌组分。

表2莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107和亲缘关系相近菌株的脂肪酸含量比较

表中：1为菌种Rheinheimera indicate SM2107^T；2为菌种Rheinheimeratuosuensis CGMCC1.12461^T；3为菌种Rheinheimera longhuensis LH2-2^T；4为菌种Rheinheimera aestuari H29^T；5为菌种Rheinheimera pacifica KMM 1406^T；6为菌种Rheinheimera perlucida BA131^T。

TR,Trace(<0.5％)；–,not detected.Major fatty acids(>10％)in eachstrain are shown in bold。

由表2可知，莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107的主要脂肪酸为：C_18:1ω7cand/or C_18:1ω6c,C_16:0,C_17:1ω8с,and C_16:1ω7c and/or C_16:1ω6c；主要呼吸醌为Q-8，主要的极性脂类为：磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)，磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，PG)。莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107的基因组DNA的G+C含量为48.76mol％。

实施例6

实施例1筛选和分离的莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107在胶原蛋白降解中的应用，包括步骤如下：

将莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107接种至发酵培养基中进行发酵培养，摇床转速180rpm，培养温度25℃，培养时间5d，发酵液经7000r/min，离心10min，得到的上清液即为胶原蛋白酶液；然后按照1700U/g的酶料比向牛骨胶原蛋白中加入胶原蛋白酶液，在50℃下反应2h；两者反应完成后经7000r/min离心10min后去除沉淀，得到的上清液即为胶原蛋白酶解液。

所述的发酵培养基组分如下：牛骨胶原蛋白3份，酵母粉2份，海盐30份，水1000份，pH7.0～7.4，均为重量份。

本实施例中牛骨胶原蛋白的酶解效果如图4所示，反应后，称量反应剩余的底物量，计算牛骨胶原蛋白底物的酶解率，结果如图5所示。

由图4～5可知，莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107产生的胶原蛋白酶能够高效地酶解牛骨胶原蛋白，最高酶解率达到97.52％。

本实施例中牛骨胶原蛋白降解得到的胶原蛋白酶解液经冷冻干燥后，用流动相溶液(乙腈：蒸馏水：三氟乙酸＝45：55：0.1)配制成5.0mg/mL的胶原蛋白酶解液，待样品充分溶解后，用0.22μm的滤器过滤后，利用HPLC分析酶解液中胶原蛋白肽的分子量分布，结果如图6和表3所示。

表3牛骨胶原蛋白酶解液中不同分子量肽段的相对丰度

由图6和表3可知，采用本发明提供的莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indicaSM2107分泌的胶原蛋白酶来降解牛骨，所得的胶原蛋白酶解液中不同分子量的胶原蛋白肽分子量5000Da以下的胶原蛋白肽占总肽段77％以上。因此，可将莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107和其分泌的胶原蛋白酶用于降解牛骨胶原蛋白制备含有不同分子量的胶原蛋白肽。

实施例7

将实施例4提取的莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107基因组DNA进行测序(上海凌恩生物科技有限公司)。从蛋白酶库MEROPS中找出S8家族的蛋白酶，再根据测序结果与S8家族的蛋白酶进行比对分析，分析结果显示莱茵海默氏属新菌Rheinheimeraindica SM2107基因组上携带一个胶原蛋白酶的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，长度为1539bp，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，由512个氨基酸组成，命名为胶原蛋白酶48。

以实施例4提取的莱茵海默氏属新菌Rheinheimera indica SM2107基因组DNA为模板，进行PCR扩增，引物如下：

pET-22b-F:AAGAAGGAGATATACATATGAAAACTACAAAAACCCTCTTA

pET-22b-R:TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTACTGATAGCTGTATGTCA

将PCR产物经Nde I和Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切PCR产物，然后将酶切后的PCR产物与同样经过双酶切的pET-22b载体质粒连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株后涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素钠的LB培养基固体平板上，37℃培养14h，挑取单克隆；将单克隆接入含有100μg/mL氨苄青霉素钠的液体LB培养基中培养，提取质粒；接着将该重组质粒送去北京擎科生物科技有限公司，结果表明，在pET-22b的Nde I和Xho I酶切位点之间成功***SEQ ID NO.2所示的胶原蛋白酶基因，且***方向正确。

将上述验证后的载体质粒转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，然后按照该公司提供的操作步骤进行胶原蛋白酶48的异源诱导表达。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测胶原蛋白酶48的表达情况，结果如图7所示，胶原蛋白酶48在电泳胶上呈单一条带，分子量大小在35-45kDa之间，位置与预测的分子量相吻合。

实施例8

取1mL实施例7异源诱导表达的胶原蛋白酶48，加入至10mg牛骨中进行酶解反应，酶解反应条件为：摇床转速180rpm，反应温度50℃，反应时间2h。反应产物经7000r/min，离心10min，得到的上清液即为蛋白酶解液；然后蛋白酶解液冷冻干燥后，按照实施例6中的方法处理后经HPLC分析酶解液中的胶原蛋白肽的分子量分布。结果如图8和表4所示。

表4牛骨胶原蛋白酶解液中不同分子量肽段的相对丰度

由图8和表4可知，采用本发明提供的胶原蛋白酶48的来降解牛骨，所得的胶原蛋白酶解液中不同分子量的胶原蛋白肽分子量5000Da以下的胶原蛋白肽占总肽段76％以上，分子量在1000Da以下的胶原蛋白肽占总肽段40％以上。因此，可将胶原蛋白酶48用于降解牛骨胶原蛋白制备含有不同分子量的胶原蛋白肽，特别是分子量在1000Da以下的胶原蛋白肽。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一株能够降解胶原蛋白的菌株及其应用

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agagtttgat catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 60

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ccgatagagg gggataacca ctggaaacgg tggctaatac cgcataatgt ctacggacca 180

aagtatggga ccttcgggcc atatgctatc ggatgcgcct atatgggatt agctagttgg 240

tgtggtaatg gcgcaccaag gcgacgatcc ctagctggtt tgagaggatg atcagccaca 300

ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat 360

gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggccttcggg ttgtaaagca 420

ctttcagcga ggaggaaggg gttgttgtta atagcaacaa tttttgacgt tactcgcaga 480

agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat 540

cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg cggcttttta agtcggatgt gaaagccccg 600

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Met Lys Thr Thr Lys Thr Leu Leu Ala Leu Gly Val Ser Ser Cys Phe

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ser Ala Thr Pro Ala Met Ala Asp Ser Leu Val Asp Asp

20 25 30

Ser Asp Lys Ser Ser Arg Tyr Ile Ile Lys Phe Lys Pro Thr Ala Ala

35 40 45

Val Met Asn Ser Asn Asn Gly Gln Ser Glu Phe Ser Thr Gln Gln Ala

50 55 60

Glu Thr Val Leu Arg Gly His Gln Val Ala Ala Leu Met His Leu Lys

65 70 75 80

Ser Ala Asn Ala Ser Val Ala Lys Leu Ser Ala Lys Gln Leu Lys Ala

85 90 95

Leu Gln Ala Asn Pro Asn Val Gln Tyr Val Glu Glu Asp Ala Lys Arg

100 105 110

Tyr Leu Met Asp Val Ile Thr Pro Met Ala Gln Ser Thr Pro Tyr Gly

115 120 125

Ile Asn Met Val Gln Ala Asn Gln Leu Ser Asp Gly Ser Ala Gly Asn

130 135 140

Ile Lys Val Cys Val Ile Asp Thr Gly Tyr Thr Tyr Gly His Glu Asp

145 150 155 160

Leu Gln Ser Ser Gly Val Thr Gly Tyr Ala Phe Pro Gly His Gly Asn

165 170 175

Trp Tyr Ser Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Met

180 185 190

Val Ala Leu Asp Asn Asn Ser Gly Val Val Gly Val Ile Gly Ser Gly

195 200 205

Gln Ala Gly Val His Ile Val Lys Ile Phe Asn Asp Ser Gly Asn Trp

210 215 220

Thr Tyr Ala Ser Asn Leu Ile Gln Gly Ile Gln Ser Cys Gln Asp Ala

225 230 235 240

Gly Ala Lys Val Val Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Ser Ser Asn Gln

245 250 255

Thr Glu Asn Asn Ala Met Asn Asn Phe Tyr Asn Asn Gly Met Leu Leu

260 265 270

Val Ala Ala Ala Gly Asn Ala Gly Asn Thr Ser Leu Ser Tyr Pro Ala

275 280 285

Ser Tyr Asn Ser Val Val Ser Val Ala Ala Val Asp Ser Asn Arg Asn

290 295 300

Leu Ala Ser Phe Ser Gln Arg Asn Ser Gln Val Glu Ile Ala Gly Pro

305 310 315 320

Gly Val Asn Val Ser Ser Thr Trp Arg Asn Gly Gly Tyr Asn Ser Ile

325 330 335

Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Val Ala Ala Leu

340 345 350

Val Trp Ser Asn His Pro Ser Cys Ser Ala Ser Gln Ile Arg Asn Ala

355 360 365

Leu Asn Thr Thr Ala Gln Asp Arg Gly Ala Ala Gly Arg Asp Asn Ser

370 375 380

Tyr Gly Phe Gly Ile Val Gln Ala Lys Ala Ala Ser Asp Tyr Ile Thr

385 390 395 400

Asn Asn Gly Cys Asp Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Pro Pro Gly Gly

405 410 415

Gly Ala Thr Phe Pro Asn Leu Ser Ala Ser Thr Gly Gln Trp Leu Arg

420 425 430

Gly Ser Tyr Gln Ile Pro Ala Gly Val Ser Gln Ile Thr Phe Gln Ile

435 440 445

Ser Gly Gly Ser Gly Asp Ala Asp Leu Tyr Val Arg Tyr Gly Ser Gln

450 455 460

Pro Ser Thr Ser Ala Tyr Thr Cys Arg Pro Tyr Leu Thr Gly Asn Asn

465 470 475 480

Glu Val Cys Thr Ile Asn Asn Pro Gln Ala Gly Thr Trp His Val Gly

485 490 495

Ile Arg Ala Tyr Ser Ala Phe Ser Gly Val Thr Tyr Ser Tyr Gln Tyr

500 505 510

Claims

1.一株莱茵海默氏属菌Rheinheimera indica SM2107，该菌株2021年5月8日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M2021506，地址：中国，武汉，武汉大学。

2.权利要求1所述莱茵海默氏属菌Rheinheimera indica SM2107在制备胶原蛋白酶以及降解胶原蛋白中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括步骤如下：

(1)制备胶原蛋白酶：将莱茵海默氏属菌Rheinheimera indica SM2107接种至发酵培养基中进行发酵培养，在摇床转速150～200rpm，培养温度23～27℃下培养4～6d，得到发酵液；再将发酵液经离心得到的上清液即为胶原蛋白酶液；

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述的发酵培养条件为：摇床转速180rpm，培养温度25℃，培养时间5d；所述的离心转速为6000～8000r/min，离心时间为8～12min。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述的胶原蛋白为牛骨胶原蛋白；所述的胶原蛋白酶液的加入量为1300～1700U/g的酶料比E/S。