CN113215054A - 一种巨大芽孢杆菌菌株lxb4070及其应用 - Google Patents

一种巨大芽孢杆菌菌株lxb4070及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种巨大芽孢杆菌菌株LXB4070及其应用。本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070，保藏编号为CGMCC NO.21867，其具有显著的解磷、促钾、解硅等促生特性，基本不具备生防特性；本发明的生防促生型微生物菌剂包括上述巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)菌株LXB4070和/或其发酵产物，其不仅保留了原有显著的解磷、促钾、解硅等促生特性，同时具备了高效的生防特性，对尖孢镰刀菌、姜茎基腐病原菌、韭菜灰霉病原菌、苹果镰刀病原菌和马铃薯黑痣病病原菌具有高效的抑制能力，同时对大葱、苹果、葡萄、草莓、马铃薯等具有明显的促生长作用和对果实具有显著的增益作用。

Description

一种巨大芽孢杆菌菌株LXB4070及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)菌株LXB4070及其应用。
背景技术
微生物肥料是由一种或数种有益微生物、经工业化培养发酵而成的生物性肥料。通常将微生物肥料分为两类：一类是通过其中所含微生物的生命活动增加植物营养元素的供应量，导致植物营养状况的改善，进而增加产量，其代表品种是菌肥；另一类是广义的微生物肥料，虽然其也是通过所含的微生物生命活动作用使作物增产，但不仅仅限于提高植物营养元素的供应水平，还包括了它们所产生的次生代谢物质，如激素类物质对植物的刺激作用。
随着微生物肥料应用的逐步开发，对其各方面的品质要求也越来越高，尤其是对兼具促生和生防功能的微生物肥料的需求越来越急迫。然而，目前农业领域所使用的单一菌剂，多数仅具有促生或者仅具有生防的作用，如不外源添加功能性物质，则少有两者兼得的菌剂产品。巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)作为典型的解磷促钾和解硅的微生物，对作物的生长具有明显的促进作用；然而，现有的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)主要为促生菌，基本不具有生防作用。
为了解决现有巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)所面临的利用现状，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070及其应用，该巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070具有显著的解磷、促钾、解硅等促生特性，此外在与防御假单胞菌(Bacillus megaterium)组合使用时兼具高效的促生和生防作用。
本发明提供一种巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070，该巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070的保藏编号为CGMCC NO.21867。
本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070，于2021年03月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNO.21867，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070，其16SrDNA基因序列如SEQ ID NO：1。
本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070具有显著的解磷、促钾、解硅等促生特性，且基本不具备生防特性。
本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070，经液态发酵后，所得到的液体发酵液的芽孢形成率为80-90％。
本发明还提供一种生防促生型微生物菌剂，包括上述巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)菌株LXB4070和/或其发酵产物。
进一步地，本发明的生防促生型微生物菌剂还可以包括防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1和/或其发酵产物。
在一实施方式中，所述生防促生型微生物菌剂为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)菌株LXB4070和防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1的混合发酵产物；进一步地，所述混合发酵产物是经灭活后的混合发酵产物。
研究表明：本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070在与防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1组合使用时，不仅保留了原有显著的解磷、促钾、解硅等促生特性，还能够显著提高防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1的生防功能；同时，防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1还能够显著地将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070的芽孢率提升到98％以上，进而获得了一种兼具高效的促生和生防作用的生防促生型微生物菌剂，其不仅具有对尖孢镰刀菌、姜茎基腐病原菌、韭菜灰霉病原菌、苹果镰刀病原菌和马铃薯黑痣病病原菌的高效抑制能力，同时对大葱、苹果、葡萄、草莓、马铃薯等具有明显的促生长和对果实具有显著的增益作用。
本发明对生防型微生物菌剂的产品形态不作严格限制，既可以冻干粉等固态形式，也可以是发酵液等液态形式。
本发明还提供上述生防促生型微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
A)对巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070进行液态发酵，得到发酵液；
B)向所述发酵液中接入防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1进行混合发酵，得到混合发酵液；
C)对所述混合发酵液进行灭活，得到生防型微生物菌剂。
在步骤A)中，可以采用本领域的常规培养基和常规培养条件对巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070进行液态发酵；更具体地，步骤A)可以包括：
A1)对巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070进行活化，得到种子液；
A2)将种子液接种至发酵培养基中进行液态发酵，得到发酵液。
在步骤A1)中，活化可以采用本领域的常规活化方法，例如：将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070从冷冻保藏的甘油管中划线培养于固体培养基上，36℃培养32h，得到原始斜面种子，再将原始斜面种子接种于250mL三角瓶中，在180r/min、36℃的条件下，培养24h。
在步骤A2)中，对液态发酵的条件不作严格限制；具体地，种子液的接种量可以为1-3％；液态发酵时温度可以控制为34-36℃，溶氧可以控制为30-50％。
此外，液态发酵时的发酵培养基组成可以为：玉米粉34-36g/L、豆粕粉30-35g/L、蛋白胨1.2-1.8g/L、酵母粉1.5-2.5g/L、磷酸二氢钾1.5-2.5g/L、磷酸氢二钾1.5-2.5g/L、氯化亚铁0.04-0.06g/L、碳酸钙0.4-0.6g/L、氯化钙0.4-0.6g/L、硫酸镁0.3-0.5g/L和硫酸锰0.05-0.15g/L，发酵培养基的初始pH值为6.5-7.0。
特别是，在步骤A)中，液态发酵至菌体生长稳定期中后期；该时期菌体呈现短杆状或者微中空状，该时期的活菌数达到最大；具体地，达到该时期所需的液态发酵时间大致为15-20h。
在步骤B)中，防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1的接种量可以为1.5-2.2％；混合发酵时的温度可以控制为36-38℃，溶氧可以控制为15-20％。此外，可以控制液态发酵和混合发酵的总时间为25-30h。
在步骤C)中，灭活方法可以采用升温灭活法；更具体地，灭活条件可以为：在50-65℃下灭活10-20min，此时防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1的灭活率为100％，且该灭活条件不会杀灭巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070。
上述制备方法得到的生防促生型微生物菌剂中，芽孢形成率达到98％以上，芽孢数≥1×1010cfu/mL，具体为1.1×1010-1.5×1010cfu/mL。
为了解决现有巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)所面临的利用现状，本发明着手目前行业内巨大芽孢杆菌菌剂功能单一的现状，通过上述特定的菌株组合及发酵工艺对其液体混合发酵进行有目的性的激活诱导，在保证本身具有的高效解磷、促钾、解硅等促生特性不改变的前提下，使其具有高效的生防功能；本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)菌株LXB4070能够显著增加防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1产生抗病原菌的活性物质，最终赋予液体混合发酵液产品广谱高效的生防功能，获得了兼具促生和防病双重功能的微生物菌剂，为其广泛的开发利用提供了有利的技术支持。
本发明还提供上述生防促生型微生物菌剂或利用上述制备方法制得的生防型微生物菌剂在促生和/或生防中的应用。
具体地，促生包括但不限于解磷、促钾和解硅等促生功能；生防包括但不限于防治尖孢镰刀菌、姜茎基腐病原菌、韭菜灰霉病原菌、苹果镰刀病原菌、马铃薯黑痣病等病原菌。
本发明的生防促生型微生物菌剂对尖孢镰刀菌、姜茎基腐病原菌、韭菜灰霉病原菌、苹果镰刀病原菌和马铃薯黑痣病病原菌的抑菌率分别达到79.7-88.3％、82.8-90.1％、76.5-91.6％、88.1-93.5％和73.3-90.1％。
此外，本发明的生防促生型微生物菌剂对大葱、苹果、葡萄、草莓、马铃薯等具有明显的促生长和对果实具有显著的增益作用。
本发明的实施，至少具有以下优势：
1、本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070具有显著的解磷、促钾、解硅等促生特性，基本不具备生防特性，液态发酵后所得到的液体发酵液的芽孢形成率为80-90％；
2、本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070在与防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1组合培养时，不仅保留了原有显著的解磷、促钾、解硅等促生特性，还能够显著增加防御假单胞菌产生抗病原菌的活性物质，进而显著提高了微生物菌剂的生防功能；
3、本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070在与防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1组合使用时，防御假单胞菌能够显著地将巨大芽孢杆菌菌株的芽孢率提升到98％以上；
4、本发明的生防促生型微生物菌剂兼具高效的促生和生防作用，不仅具有对尖孢镰刀菌、姜茎基腐病原菌、韭菜灰霉病原菌、苹果镰刀病原菌和马铃薯黑痣病病原菌的高效抑制能力，同时对大葱、苹果、葡萄、草莓、马铃薯等具有明显的促生长和对果实具有增益作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为试验例1中生防促生微生物菌剂对尖孢镰刀病原菌抑菌增益图；
图2为试验例1中生防促生微生物菌剂对姜茎基腐病原菌抑菌增益图；
图3为试验例1中生防促生微生物菌剂对韭菜灰霉病原菌抑菌增益图；
图4为试验例1中生防促生微生物菌剂对苹果镰刀病原菌抑菌增益图；
图5为试验例1中生防促生微生物菌剂对马铃薯黑痣病病原菌的抑菌增益图；
图6为试验例2中生防促生型微生物菌剂对大葱增益作用效果图；
图7为试验例2中生防促生型微生物菌剂对苹果增益作用效果图；
图8为试验例2中生防促生型微生物菌剂对葡萄增益作用效果图；
图9为试验例2中生防促生型微生物菌剂对草莓增益作用效果图；
图10为试验例2中生防促生型微生物菌剂对马铃薯增益作用效果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
各实施例及对照例所采用的菌株如下：
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070：于2021年03月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.21867，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1：为本申请人自有菌株，于2019年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18750，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
市购巨大芽孢杆菌菌株(对照菌株1)：购自江苏绿科生物科技有限公司；
市购巨大芽孢杆菌菌株(对照菌株2)：购自湖北启明生物工程有限公司。
实施例1
本实施例提供巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070的制备方法，步骤如下：
1、菌种活化培养
将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070从冷冻保藏的甘油管中划线培养于固体培养基上，于36℃培养32h，得到原始斜面种子。
将上述原始斜面种子接种于250mL三角瓶中，于180r/min、36℃的条件下，培养24h，得到种子液。
2、液态发酵
发酵培养基的组成为：玉米粉35g/L、豆粕粉32g/L、蛋白胨1.5g/L、酵母粉2.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、氯化亚铁0.05g/L、碳酸钙0.5g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸镁0.4g/L和硫酸锰0.1g/L。
发酵罐中培养基的装料系数为0.6，于121℃高温蒸汽灭菌35min，培养基初始pH值为6.90，将上述得到的种子液按照2.2％的接种量接种于灭菌冷却后的发酵培养基中进行液体培养，其中控制培养温度36℃，通气量1.0:0.8(v/v·min)，通过调节搅拌转速控制发酵液溶氧饱和度DO值30％，培养时间为25h，得到发酵液。
3、热处理
对上述发酵后的发酵液进行热处理，热处理条件为：温度为55℃，时间为15min，热处理后得到巨大芽孢杆菌液体菌剂，其芽孢率为80％，芽孢数为9.2×109cfu/mL。
实施例2
本实施例提供巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070的制备方法，步骤如下：
1、菌种活化培养：
将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070从冷冻保藏的甘油管中划线培养于固体培养基上，于36℃培养32h，得到原始斜面种子。
将上述原始斜面种子接种于250mL三角瓶中，于180r/min、36℃的条件下，培养24h，得到种子液。
2、液态发酵
发酵培养基的组成为：玉米粉35g/L、豆粕粉32g/L、蛋白胨1.5g/L、酵母粉2.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、氯化亚铁0.05g/L、碳酸钙0.5g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸镁0.4g/L和硫酸锰0.1g/L。
发酵罐中培养基的装料系数为0.6，于121℃高温蒸汽灭菌35min，培养基初始pH值为6.90，将上述得到的种子液按照2.2％的接种量接种于灭菌冷却后的发酵培养基中进行液体培养，其中控制培养温度36℃，通气量1.0:0.8(v/v·min)，通过调节搅拌转速控制发酵液溶氧饱和度DO值40％，培养时间为30h，得到发酵液。
3、热处理
对上述发酵后的发酵液进行热处理，热处理条件为：温度为65℃，时间为15min，热处理后得到巨大芽孢杆菌液体菌剂，其芽孢率为90％，芽孢数为1.2×1010cfu/mL。
实施例3
本实施例提供一种含有巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070的生防促生型微生物菌剂的制备方法，步骤如下：
a.液态发酵巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070
a1、菌种活化培养
将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070从冷冻保藏的甘油管中划线培养于固体培养基上，于36℃培养32h，得到原始斜面种子；再将原始斜面种子接种于250mL三角瓶中，于180r/min、36℃条件下培养24h。
a2、发酵培养
发酵培养基的组成为：玉米粉35g/L、豆粕粉32g/L、蛋白胨1.5g/L、酵母粉2.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、氯化亚铁0.05g/L、碳酸钙0.5g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸镁0.4g/L和硫酸锰0.1g/L。
发酵罐中发酵培养基的装料系数为0.6，121℃高温蒸汽灭菌35min，培养基初始pH值为6.90，将a1制备的种子液按照2.2％的接种量接种于灭菌冷却后培养基中，培养温度36℃，通气量1.0:0.8(v/v·min)，通过调节搅拌转速控制发酵液溶氧饱和度DO值30％，进行液体培养。
b.混合培养
b1.待上述巨大芽孢杆菌液体发酵培养进行到发酵稳定中期(大约培养15h)，此时呈现短杆状或者微中空状，按1.5％的接种量接种防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1。
接种后，将发酵温度升高至38℃，溶氧控制在15％，继续培养13h，发酵结束，得到混合发酵液。
c.灭活
发酵结束后，对混合发酵液进行防御假单胞菌灭活，灭活温度为55℃，灭活时间为15min，最终得到生防促生型微生物菌剂，其芽孢率为98％，芽孢数为1.1×1010cfu/mL。
实施例4
本实施例提供生防促生型微生物菌剂的制备方法，步骤如下：
a.液态发酵巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070
a1、菌种活化培养
将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070从冷冻保藏的甘油管中划线培养于固体培养基上，36℃培养32h，得到原始斜面种子；再将原始斜面种子接种于250mL三角瓶中培养，于180r/min、36℃条件下培养24h。
a2、发酵培养
发酵培养基的组成为：玉米粉35g/L、豆粕粉32g/L、蛋白胨1.5g/L、酵母粉2.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、氯化亚铁0.05g/L、碳酸钙0.5g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸镁0.4g/L和硫酸锰0.1g/L。
发酵罐中发酵培养基的装料系数为0.6，121℃高温蒸汽灭菌35min，培养基初始pH值为6.90，将a1中种子液按照2.2％的接种量接种于灭菌冷却后培养基中，培养温度36℃，通气量1.0:0.8(v/v·min)，通过调节搅拌转速控制发酵液溶氧饱和度DO值40％，进行液体培养。
b.混合培养
b1.待上述巨大芽孢杆菌液体发酵培养进行到发酵稳定中期(大约培养20h)，此时呈现短杆状或者微中空状，按2.2％的接种量接种防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1。
将发酵温度升高至38℃，溶氧控制在20％，继续培养10h，发酵结束，得到混合发酵液。
c.灭活
发酵结束后，对混合发酵液进行防御假单胞菌灭活，灭活温度为65℃，灭活时间为15min，最终得到生防型微生物菌剂，芽孢率为99％，芽孢数为1.5×1010cfu/mL。
对照例1
采用普通市购的巨大芽孢杆菌菌株(对照菌株1)替换实施例1的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070，作为对照例1。
对照例2
采用普通市购的巨大芽孢杆菌菌株(对照菌株1)替换实施例3的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070，作为对照例2。
对照例3
采用普通市购的巨大芽孢杆菌菌株(对照菌株2)替换实施例1的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070，作为对照例3。
对照例4
采用普通市购的巨大芽孢杆菌菌株(对照菌株2)替换实施例3的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070，作为对照例4。
对照例5
本对照例除混合培养步骤中，b1步骤待上述巨大芽孢杆菌液体发酵培养进行到发酵延滞期(大约培养4h)，此时菌体呈现长杆状，按2.2％的接种量接种防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1，其它与实施例3基本相同，发酵结束后芽孢数仅为6.3×109cfu/mL，芽孢率仅为78％。
对照例6
本对照例除混合培养步骤中，b1步骤待上述巨大芽孢杆菌液体发酵培养进行到发酵对数生长期(大约培养8h)，此时菌体呈现长杆状，按2.2％的接种量接种防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1，其它与实施例3基本相同，发酵结束后芽孢数仅为7.1×109cfu/mL，芽孢率仅为81％。
对照例7
以防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1的发酵液作为对照，发酵条件为常规条件(参照实施例3)，控制其发酵液中防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1的活菌数与实施例3混合发酵液中防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1的活菌数基本相当。
试验例1
对实施例1-4和对照例1-7制备的各菌剂进行抑菌试验验证，抑菌试验所用培养基选用PDA固体培养基：马铃薯200g，用1L水煮沸过滤弃渣，20g葡萄糖，20g琼脂，定容为1L，灭菌待用；抑菌率计算公式如下：
Figure BDA0003093138300000131
式中：A为对照组PDA平板上病原菌的菌落直径；a为试验组PDA平板上病原菌的菌落直径。
以抑菌率大小作为衡量标准，结果见表1、表2；此外，实施例1菌剂(对照组)与实施例3菌剂(实验组)对各病原菌的抑菌试验对照图见图1至图5。
表1各实施例菌剂的抑菌率
Figure BDA0003093138300000132
表2各对照例菌剂的抑菌率
Figure BDA0003093138300000141
表1、表2结果表明：
1、普通市购的巨大芽孢杆菌和本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070均基本不具备生防特性；
2、普通市购的巨大芽孢杆菌在与防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1混合培养时，或无法进行混合培养，或混合培养后的培养液并未获得相对于单一防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1在生防性能方面的提高，对各病原菌的抑制能力并未显示出显著的差异；
3、本发明巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070在与防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1混合培养时，能够显著增加防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1产生抗病原菌的活性物质含量，进而显著提高了防御假单胞菌的生防功能；
4、相对于单一的防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1，本发明由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070在与防御假单胞菌(Pseudomonasprotegens)菌株LXPP-1混合培养制得的生防型微生物菌剂对尖孢镰刀菌、姜茎基腐病原菌、韭菜灰霉病原菌、苹果镰刀病原菌和马铃薯黑痣病病原菌的抑制能力大大提高；
5、相对于在发酵延滞期和发酵对数生长期接种防御假单胞菌(Pseudomonasprotegens)菌株LXPP-1，在发酵至菌体生长稳定期中后期接种防御假单胞菌(Pseudomonasprotegens)菌株LXPP-1，对各病原菌的抑制能力显著提高。
试验例2
采用实施例3菌剂(实验组1)、实施例1菌剂(对照组1)、对照例1菌剂(对照组2)、对照例2菌剂(对照组3)和对照例7菌剂(对照组3)对大葱、苹果、葡萄、草莓、马铃薯进行种植，种植试验及条件如下：选取长势一致的作物为试验对象，采用小区试验，小区面积100m2，每个处理设置3次重复，进行冲施，冲施用量按1.5L/亩/次，生长期内冲施1-2次。
各菌剂对植物的增益作用试验结果见表2；同时，实施例3菌剂(实验组)、实施例1菌剂(对照组)对各植物的增益作用对照图见图6至图10。
表3各菌剂对植物的增益作用试验结果
Figure BDA0003093138300000151
表3结果表明：
1、单一的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070对大葱、苹果、葡萄、草莓、马铃薯等具有一定的促生长作用，且促生长作用明显优于现有普通市购的巨大芽孢杆菌；
2、相对于单一巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070或单一的防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1，将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070与防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1混合培养后的混合发酵液对大葱、苹果、葡萄、草莓、马铃薯等具有明显的促生长作用和对果实具有显著的增益作用，协同作用显著。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Figure BDA0003093138300000171
Figure BDA0003093138300000181

Claims (10)

1.一种巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070，其特征在于，该巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070的保藏编号为CGMCC NO.21867。
2.一种生防促生型微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070和/或其发酵产物；
优选地，所述生防促生型微生物菌剂还包括防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1和/或其发酵产物；
优选地，所述生防促生型微生物菌剂为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070和防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1的混合发酵产物；
优选地，所述混合发酵产物是经灭活后的混合发酵产物。
3.一种生防促生型微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A)对巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070进行液态发酵，得到发酵液；
B)向所述发酵液中接入防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1进行混合发酵，得到混合发酵液；
C)对所述混合发酵液进行灭活，得到生防型微生物菌剂；
优选地，生防促生型微生物菌剂的芽孢数≥1×1010cfu/mL，更优选为1.1×1010-1.5×1010cfu/mL。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤A)包括：
A1)对巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株LXB4070进行活化，得到种子液；
A2)将种子液接种至发酵培养基中进行液态发酵，得到发酵液；
优选地，种子液的接种量为1-3％；液态发酵时温度控制为34-36℃，溶氧控制为30-50％。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤A)中，液态发酵时的发酵培养基组成为：玉米粉34-36g/L、豆粕粉30-35g/L、蛋白胨1.2-1.8g/L、酵母粉1.5-2.5g/L、磷酸二氢钾1.5-2.5g/L、磷酸氢二钾1.5-2.5g/L、氯化亚铁0.04-0.06g/L、碳酸钙0.4-0.6g/L、氯化钙0.4-0.6g/L、硫酸镁0.3-0.5g/L和硫酸锰0.05-0.15g/L，发酵培养基的初始pH值为6.8-7.0。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤A)中，液态发酵至菌体生长稳定期中后期；
优选地，步骤A)中，控制液态发酵时间为15-20h；
优选地，步骤A)和步骤B)中，控制液态发酵和混合发酵的总时间为25-30h。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤B)中，防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株LXPP-1的接种量为1.5-2.2％；混合发酵时的温度控制为36-38℃，溶氧控制为15-20％。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤C)中，灭活条件为：在50-65℃下灭活10-20min。
9.权利要求2所述的生防促生型微生物菌剂或利用权利要求3-8任一所述的制备方法制得的生防型微生物菌剂在促生和/或生防中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，促生包括解磷、促钾和解硅中的至少一种；生防包括防治尖孢镰刀菌、姜茎基腐病原菌、韭菜灰霉病原菌、苹果镰刀病原菌和马铃薯黑痣病病原菌中的至少一种。
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