CN113214400A - 一种双特异性抗pd-l1/vegf抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开提供了双特异性抗VEGF x PD‑L1抗体或其抗原结合部分，产生该双特异性抗体或其抗原结合部分的方法，以及该双特异性抗体或其抗原结合部分在用于治疗疾病例如癌症中的用途。

Description

一种双特异性抗PD-L1/VEGF抗体及其用途

对相关申请的交叉引用

本申请要求2020年1月21日提交的中国专利申请202010070440.X的优先权，其全部内容通过提述并入本文。

序列表

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技术领域

本公开一般涉及双特异性抗PD-L1 x VEGF抗体，用于制备该抗体的方法及其用途。

背景技术

血管生成对于肿瘤生长和转移进展至关重要。控制肿瘤相关的血管生成是一种有前景的癌症治疗策略。血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成的关键介导物，已在各种类型的人类癌症中得到验证。肿瘤细胞释放与附近内皮细胞结合的生长因子(例如VEGF)，从而启动信号传导级联反应，刺激内皮细胞***并形成新血管。VEGF通过其受体VEGFR进行的信号传导在许多实体瘤的血管生成和生长中起着至关重要的作用。靶向VEGF途径的抗血管生成药物，例如Avastin(贝伐单抗(Bevacizumab))，已在临床上取得成功。

另一方面，靶向免疫检查点分子例如程序性死亡配体1(PD-L1)或其受体程序性死亡1(PD-1)已显示出有前景的临床成功。PD-L1表达与各种类型的癌症的不良预后密切相关。抗PD-L1抗体可以靶向在肿瘤细胞和肿瘤浸润性免疫细胞上表达的PD-L1，防止与T细胞表面上的PD-1和B7.1结合，还可以激活T细胞以及募集其他T细胞来攻击肿瘤，然后使免疫***能够抵抗多种类型的癌症。

除了已确立的抗血管生成作用外，抗VEGF疗法还可以进一步增强抗PD-1/PD-L1疗法恢复抗癌免疫力的能力，其通过抑制VEGF相关的免疫抑制、促进T细胞的肿瘤浸润以及引发和激活针对肿瘤抗原的T细胞应答等来实现。因此，开发将抗血管生成治疗和免疫检查点抑制结合起来的VEGF和PD-L1双特异性抗体可以在癌症治疗中取得有前景的成果。

尽管靶向VEGF以及靶向PD-1/PD-L1疗法具有明显的益处，但是仍然存在大量未满足的需求。15％-20％的患者对抗VEGF治疗无应答，而且越来越多的证据表明，将抗VEGF药剂长期用于癌症治疗会增强肿瘤耐药性。3％-9％的患者形成了治疗的免疫原性。此外，总体生存时间的延长有限和安全性问题受限，包括骨骼形态的变化、肾小球病变伴随肾脏炎症、以及肾上腺中空泡形成的减少伴随炎症。阻断PD-1/PD-L1途径的免疫检查点抑制剂(例如nivolumab、pembrolizumab和atezolizumab)代表了患有多种癌症的患者的标准治疗选择。但是，这些药物在未选择人群中的应答率为14–23％，在患有表达PD-L1的肿瘤的患者中的应答率为16–48％，这些药物在部分而非所有患者中都能提供更好的治疗效果。

因此，非常需要开发新的抗PD-L1/抗VEGF双特异性抗体。在本公开中，产生了能够同时以高亲和力结合人PD-L1和VEGF，阻断PD-1/PD-L1和VEGF/VEGFR两者的信号传导，并显示出优越的抗肿瘤功效的双特异性抗体。

发明概述

广义而言，本公开涉及提供具有改善功效的抗体的化合物、方法、组合物和制品。本公开提供的益处广泛地适用于抗体治疗和诊断领域，并且可以与能够与各种靶标反应的抗体联合使用。

在一个方面，本公开提供一种双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含与VEGF抗原结合模块联合的PD-L1抗原结合模块，其中：

所述PD-L1抗原结合模块包含：包含SEQ ID NO:1的互补决定区(CDR)1、包含SEQID NO:2的CDR2、和包含SEQ ID NO:3的CDR3；和

所述VEGF抗原结合模块包含：包含SEQ ID NO:4的重链互补决定区(HCDR)1、包含SEQ ID NO:5的HCDR2、包含SEQ ID NO:6的HCDR3、包含SEQ ID NO:7的轻链互补决定区(LCDR)1、包含SEQ ID NO:8的LCDR2、以及包含SEQ ID NO:9的LCDR3。

在某些实施方案中，如本文公开的PD-L1抗原结合模块包含可变域，其包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10至少85％、90％、或95％相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，如本文公开的VEGF抗原结合模块包含：重链可变域，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11至少85％、90％、或95％相同的氨基酸序列；和

轻链可变域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12至少85％、90％、或95％相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述PD-L1抗原结合模块融合于所述VEGF抗原结合模块的N末端。在一些其它的实施方案中，所述PD-L1抗原结合模块融合于所述VEGF抗原结合模块的C末端。

在某些实施方案中，所述PD-L1抗原结合模块来自单域抗体(sdAb)，例如VHH抗体。所述VHH可以衍生自骆驼科动物，包括羊驼(alpaca)和美洲驼(llama)。优选地，所述VHH是人源化VHH。

在某些实施方案中，所述PD-L1抗原结合模块可操作地连接于所述VEGF抗原结合模块的轻链或重链的N末端，任选地经由接头。该接头可以包含2至4个拷贝的GGGGS(G4S)或由其组成，例如该接头可以是(G4S)₂。

在某些实施方案中，如本文公开的双特异性抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，其中：

所述重链包含如VH-CH1-铰链-Fc中可操作连接的域，其中VH-CH1来自所述VEGF抗原结合模块；和

所述轻链包含如VHH-VL-CL中可操作连接的域，其中VHH来自所述PD-L1抗原结合模块且VL-CL来自所述VEGF抗原结合模块。

在某些实施方案中，所述Fc区是人IgG Fc区，优选为人IgG1Fc区。

在某些实施方案中，本公开提供了一种双特异性抗体或其抗原结合部分，其中重链包含SEQ ID NO:13，轻链包含SEQ ID NO:14。

在某些实施方案中，如本文中公开的双特异性抗体或其抗原结合部分是人源化抗体。

在一个方面，本公开提供了分离的核酸分子，其包含编码如本文中公开的双特异性抗体或其抗原结合部分的核酸序列。

在一个方面，本公开提供了包含如本文中公开的核酸分子的载体。在一个方面，本公开提供了包含如本文中公开的核酸分子或载体的宿主细胞。

在一个方面，本公开提供了包含如本文中公开的双特异性抗体或其抗原结合部分以及药学可接受的载体的药物组合物。

在一个方面，本公开提供了一种产生如本文中公开的双特异性抗体或其抗原结合部分的方法，包括以下步骤：

-在宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合部分；和

-从该宿主细胞分离抗体或其抗原结合部分。

在一个方面，本公开提供了一种调控受试者中免疫应答的方法，包括对所述受试者施用如本文中公开的双特异性抗体或其抗原结合部分或药物组合物。

在一个方面，本公开提供了一种抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括对所述受试者施用有效量的如本文中公开的双特异性抗体或其抗原结合部分或药物组合物。

在一个方面，本公开提供了一种预防或治疗受试者中癌症的方法，包括对所述受试者施用有效量的如本文中公开的双特异性抗体或其抗原结合部分或药物组合物。所述癌症可选自结肠癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、***、肾癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、***癌、食道癌、胃癌、淋巴瘤、黑素瘤、肝癌和头颈癌。在某些实施方案中，所述癌症为结肠癌或结直肠癌。

在一些实施方案中，所述双特异性抗体或其抗原结合部分可与化疗剂、放疗和/或用于癌症免疫治疗的其他药剂组合施用。

在一个方面，本公开提供了如本文中公开的双特异性抗体或其抗原结合部分，其用于：

i)调控PD-L1/VEGF有关的免疫应答；

ii)增强T细胞增殖和细胞因子产生；和/或

iii)刺激免疫应答或功能，例如激发针对癌细胞的免疫应答。

在一个方面，本公开提供了如本文中公开的双特异性抗体或其抗原结合部分用于诊断、预防或治疗癌症。

在一个方面，本公开提供了如本文中公开的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于调控受试者中的免疫应答或抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途。

在一个方面，本公开提供了如本文中公开的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。

在一个方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含如本文中公开的双特异性抗体或其抗原结合部分。该试剂盒可用于疾病或病况(例如癌症)的检测、诊断、预后或治疗。

以上内容是一个概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。提供概述以简化地介绍一些选择的概念，这些概念将在下面的详细描述中进一步描述。本概述不旨在确定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用作确定所要求保护的主题的范围的辅助手段。此外，贯穿本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用整体并入本文。

附图简述

图1显示了W3256抗体的示意图。

图2显示了W3256抗体的SDS-PAGE(第1泳道)。NuPAGE(Novex 4-12％Bis-Tris)凝胶中，NR：非还原性状态，R：还原性状态，M：PageRuler^TM未染色蛋白质梯度。

图3显示了W3256抗体的HPLC-SEC结果。

图4显示了W3256抗体的DSF概况。

图5显示了W3256抗体对人VEGF(与食蟹猴VEGF相同)的ELISA结合结果。WBP332-1.80.12×Ab.hIgG1是同种型对照。

图6显示了W3256抗体对人PD-L1的FACS结合结果。

图7显示了W3256抗体对VEGF和之后的PD-L1的双重结合结果。

图8显示了W3256抗体对PD-L1和之后的VEGF的双重结合结果。

图9显示了W3256抗体对食蟹猴PD-L1的FACS结合结果。

图10显示了W3256抗体对小鼠VEGF的ELISA结合结果。

图11显示了W3256抗体对小鼠PD-L1的FACS结合结果。

图12-13显示了W3256抗体对人PD-L1(图12)和VEGF(图13)的SPR传感图谱。

图14-15显示了W3256抗体在人VEGF结合上与人VEGFR1的竞争(图14)，以及在人PD-L1结合上与人PD-1的竞争(图15)。

图16-17显示了W3256抗体在人VEGF结合上与小鼠VEGFR1的竞争(图16)，以及在小鼠PD-L1结合上与小鼠PD-1的竞争(图17)。

图18显示了抗体对HUVEC细胞增殖的抑制。

图19显示了抗体报道基因测定(RGA)的效果。

图20显示了抗体在MLR中对hCD4+T细胞的IFN-γ分泌的效果。“Combo”表示WBP325-BMK3.uIgG1和W315-BMK8.uIgG1K(RKNA)的联用。

图21显示了在总IgG结合测定中在单次静脉内注射等摩尔剂量的抗体之后W3256抗体的小鼠PK分析。“mpk”是“mg/kg”的缩写。

图22显示了在双重抗原结合测定中在单次静脉内注射等摩尔剂量的抗体之后W3256抗体的小鼠PK分析。

图23显示了在PBMC-RKO小鼠癌症模型中抗体的功效。

发明详述

虽然本发明可以以许多不同的形式来实施，但在此公开的是验证本发明原理的其具体的举例说明性实施方案。应该强调的是，本发明不限于所举例说明的具体实施方案。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。

除非在此另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一个细胞”包括细胞的混合物等。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和断点之间的所有值。

通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的术语以及其技术是本领域众所周知和常用的术语。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并如在本说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述进行。参见例如Abbas等人,Cellular and Molecular Immunology,第6版,W.B.Saunders Company(2010)；SambrookJ.&Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人,Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002)；Harlow和Lane Using Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；和Coligan等人,Short Protocols in Protein Science,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)。与本文描述的分析化学，合成有机化学和药物和药物化学有关的术语以及实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的术语。

定义

为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。

术语“抗体”或“Ab”在本文中以最广泛含义使用，其涵盖多种抗体结构，包括多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如双特异性抗体)。天然的完整抗体通常是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重链(H)和两条轻链(L)多肽链的Y形四聚体蛋白。抗体的轻链可以分为κ和λ轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区与恒定区连接，并且重链还包含约3个或更多个氨基酸的“D”区。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1，CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区(FR))间隔开的高变区(称为互补决定区(CDR))。每个VH和VL由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N端到C端的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。每个重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合位点。氨基酸在各种区域或结构域中的分布遵循KabatSequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1987和1991))或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature 342:878-883中的定义。抗体可以具有不同的抗体同种型，例如IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”，可以在本申请的上下文中互换使用，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保留了与全长抗体特异性结合的抗原特异性结合的能力，和/或其与全长抗体竞争结合相同的抗原。一般而言，参见FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.编,第二版,Raven Press,N.Y.(1989)，其出于所有目的通过引用并入本文。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术，例如蛋白质水解消化作用或涉及编码抗体可变结构域和任选地恒定结构域的DNA的操作和表达的重组基因工程技术，衍生自例如全抗体分子。这样的DNA为已知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体-抗体文库)取得，或是可合成的。DNA可用化学或通过使用分子生物技术来测序和操作，例如，以将一或多个可变和/或恒定结构域排列成适合的构型，或导入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、增加或删除氨基酸等。

抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基所组成的最小识别单位(例如分离的互补决定区(CDR)，例如CDR3肽)或限制性FR3-CDR3-FR4肽。其他工程化的分子，例如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域删除的抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、双价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)及鲨可变IgNAR结构域，也涵盖在文中所用的表达法“抗原结合片段”内。在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或可以通过完整或部分铰链或接头区域连接。铰链区可由至少2个(例如5,10,15,20,40,60个或更多个)氨基酸组成，其导致单个多肽分子中相邻的可变和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。

如本文中使用的，术语抗体的“可变域/可变结构域”指包含一个或多个CDR的抗体可变区或其片段。尽管可变域可以包含完整的可变区(如HCVR或LCVR)，但也可以包含少于完整的可变区但仍然保留结合抗原或形成抗原结合位点的能力。

如本文中使用的，术语“抗原结合模块”是指由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的抗体片段，或与抗原结合但不包含完整天然抗体结构的任何其他抗体片段。与通常指可变结构域的术语“抗原结合位点”不同，抗原结合模块除了可变结构域之外还可以包含恒定结构域。抗原结合模块的例子包括但不限于，可变结构域、可变区、双抗体、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段、二硫化键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫化键稳定的双抗体(ds diabody)、多特异性抗体、骆驼化单域抗体、纳米抗体(nanobody)、域抗体、和二价域抗体。抗原结合模块能与亲本抗体结合相同的抗原。在某些实施方案中，抗原结合模块可以是Fab片段或VHH抗体。在一些实施方案中，抗原结合模块可包含来自特定人抗体的一个或多个CDR嫁接到来自一个或多个不同人抗体的框架区上。抗原结合模块的详细形式的更多描述参见Spiess等人，Molecular Immunology,67(2),第95–106页(2015)，和Brinkman等人,mAbs,9(2),第182–212页(2017)，其通过提述完整并入本文。

抗体的“Fab”是指抗体的以下部分，其由单个轻链(可变区和恒定区均有)与单个重链的可变区和第一恒定区通过二硫键联合组成。在某些实施方案中，轻链和重链的两个恒定区均被TCR恒定区替换。

抗体的“Fc”是指抗体的以下部分，其包含第一重链的第二(CH2)和第三(CH3)恒定区经由二硫键联合第二重链的第二和第三恒定区。在提及Fc区时，根据上下文，可以指Fc区的一条链或两条链。抗体的Fc部分负责多种效应器功能例如ADCC和CDC，但并不在抗原结合中发挥功能。抗体经由其Fc域启动和调节效应器功能的能力是其体内保护性活性的关键部分。尽管以前认为抗体的中和活性仅仅是Fab-抗原相互作用的结果，但越来越多的证据表明其体内活性还高度依赖于IgG Fc域与其相关受体Fcγ受体(FcγR)之间的相互作用，这些受体在效应器淋巴细胞表面上表达。

术语“PD-L1”，也称为程序性死亡配体1，是一种40kDa的1型跨膜蛋白，据推测在抑制免疫***的适应性臂中起主要作用。PD-L1是程序性死亡1(PD-1)的主要配体，PD-1是一种共抑制性受体，可以在髓样、淋巴样、正常上皮细胞和癌症中组成性表达或诱导。如本文所用，术语“PD-L1”在指PD-L1蛋白的氨基酸序列时，包括全长PD-L1蛋白，或PD-L1的胞外域(PD-L1 ECD)或含有PD-L1 ECD的片段；还包括PD-L1 ECD的融合蛋白，例如与小鼠或人(mFc或hFc)的IgG Fc融合的片段。此外，如本领域技术人员所理解的，PD-L1蛋白也将包括那些天然或人工引入氨基酸序列的突变(包括但不限于置换、缺失和/或添加)而不影响生物学功能的蛋白。

如本文所用，术语“结合PD-L1的抗体”或“抗PD-L1抗体”包括特异性识别PD-L1的抗体及其抗原结合片段。本公开的抗体和抗原结合片段可以结合可溶性PD-L1蛋白和/或细胞表面表达的PD-L1。可溶性PD-L1包括天然PD-L1蛋白以及缺少跨膜结构域或与细胞膜不相关联的重组PD-L1蛋白变体。如本文所用，表述“抗PD-L1抗体”包括具有单一特异性的单价抗体，以及包含结合PD-L1的第一抗原结合位点和结合第二(靶)抗原的第二抗原结合位点的双特异性抗体，其中抗PD-L1抗原结合位点包含如本文表A所述的重链可变区/轻链可变区或CDR序列的任意一种或多种。抗PD-L1双特异性抗体的实例在本文其他地方描述。术语“抗原结合分子”包括抗体和抗体的抗原结合片段，包括例如双特异性抗体。

术语“VEGF”(血管内皮生长因子，也称为VEGF-A)是细胞产生的信号蛋白，其刺激血管形成。VEGF是胱氨酸结(cystine-knot)生长因子的血小板衍生的生长因子家族的一个子家族。它们是参与血管发生(胚胎循环***从头形成)和血管生成(来自现有血管的血管生长)的重要信号传导蛋白。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF(胎盘生长因子)、VEGF-E(Orf-VEGF)和Trimeresurus flavoviridis svVEGF。

如本文所用，“VEGF受体”或“VEGFR”是指血管内皮生长因子(VEGF)的受体。有三种子类型的VEGFR，编号为1、2和3。根据其可选的剪接，VEGF受体可以是结合膜的或者可溶的。在VEGF受体中，VEGFR-1结合VEGF-A、PlGF和VEGF-B。

如本文所用，“双特异性”抗体是指具有源自两种不同单克隆抗体的片段并能够结合两种不同表位的人工抗体。两个表位可以存在于相同的抗原上，或者它们可以存在于两种不同的抗原上。

术语“双特异性抗原结合分子”是指包含至少第一抗原结合结构域(在本文中也称为第一抗原结合位点)和第二抗原结合结构域(在本文中也称为第二抗原结合位点)的蛋白质、多肽或分子复合物。在一些实施方案中，“双特异性抗原结合分子”是“双特异性抗体”。双特异性抗体内的每个抗原结合结构域包含至少一个CDR，其单独地或与一个或多个另外的CDR和/或FR组合地特异性结合特定抗原。在本发明的上下文中，第一抗原结合位点特异性结合第一抗原(例如PD-L1)，并且第二抗原结合位点特异性结合第二不同抗原(例如VEGF)。

术语“抗PD-L1/抗VEGF抗体”、“抗PD-L1/抗VEGF双特异性抗体”、“针对PD-L1和VEGF的抗体”、“抗PD-L1×VEGF双特异性抗体”、“PD-L1×VEGF抗体”在本文中可交换使用，其是指特异性结合PD-L1和VEGF的双特异性抗体。

如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指单分子成分的抗体分子制剂。单克隆抗体显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。

如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中可变区序列衍生自一个物种而恒定区序列衍生自另一物种的抗体，例如其中可变区序列衍生自小鼠抗体而恒定区序列衍生自人抗体的抗体。

术语“人源化抗体”意指其中衍生自另一哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列已嫁接到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行其他框架区修饰。

术语“可操作地连接”是指两个或多个感兴趣的生物序列的并置(带有或不带有间隔区或接头)以使得它们处于允许以预期方式起作用的关系。就多肽而言，是指以允许连接的产物具有预期的生物学功能的方式连接多肽序列。例如，抗体可变区可以可操作地连接于恒定区，以便提供具有抗原结合活性的稳定产物。该术语也可以关于多核苷酸使用。举例来说，当编码多肽的多核苷酸可操作地连接于调节序列(例如启动子、增强子、沉默子序列等)时，其意指多核苷酸序列以允许调节多肽从该多核苷酸的表达的方式连接。

如本文所用，术语“Ka”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“Kd”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离速率。抗体的Kd值可以使用本领域良好建立的方法来确定。如本文所用，术语“KD”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离常数，其从Kd与Ka的比率(即，Kd/Ka)获得并且表示为摩尔浓度(M)。确定抗体Kd的优选方法是通过使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器***如

***。

如本文所用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指针对靶抗原具有1×10^-7M或更低，更优选5×10^-8M或更低，甚至更优选1×10^-8M或更低，甚至更优选5×10^-9M或更低，和甚至更优选1×10^-9M或更低的K_D的抗体。

如本文所用，术语“EC₅₀”，也被称为“半数有效浓度”，是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50％的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。在本申请的上下文中，EC₅₀的单位为“nM”。

如本文所用，术语“IC₅₀”，也被称为“半数抑制浓度”，是对一种物质在抑制特定生物学或生物化学功能中的效力的量度。在本申请的上下文中，IC₅₀的单位为“nM”。

如本文所用，“抑制结合”的能力是指抗体或其抗原结合片段抑制两个分子(例如人PD-L1/VEGF和人PD-1/VEGFR)的结合至任何可检测水平。在某些实施方案中，两个分子的结合可以被抗体或其抗原结合片段以不超过50nM、不超过30nM、不超过10nM、不超过5nM、不超过1nM或甚至更低的IC₅₀抑制。

如本文所用，术语“表位”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原部分。“表位”也被称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子例如氨基酸、碳水化合物或糖侧链的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构和特定的电荷特征。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,编(1996)。

如本文所用，术语“分离的”是指通过人工方式从天然状态获得的状态。如果某种“分离的”物质或组分天然存在，则可能是因为其天然发生变化，或者物质与天然分离，或者两者兼而有之。例如，某种未分离的多核苷酸或多肽天然存在于某个活动物体内，从该天然状态分离的相同的高纯度多核苷酸或多肽被称为分离的多核苷酸或多肽。术语“分离的”既不排除混合的人造或合成物质，也不排除不影响分离的物质的活性的其他不纯物质。

如本文所用，术语“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合PD-L1/VEGF蛋白的分离的抗体基本上不含特异性结合除PD-L1/VEGF蛋白以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合人PD-L1/VEGF蛋白的分离的抗体对其他抗原如来自其他物种的PD-L1/VEGF蛋白可能具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。

如本文所用，术语“载体”是指可以在其中***多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许***其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时，该载体称为表达载体。该载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)或P1衍生人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，***瘤病毒，乳多空病毒(如SV40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列，转录起始序列，增强子序列，选择元件和报道基因。另外，载体可以包含复制起点。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可被工程化以产生感兴趣的蛋白质、蛋白质片段或肽的细胞***。宿主细胞包括但不限于培养细胞，例如来源于啮齿动物(大鼠，小鼠，豚鼠或仓鼠)的哺乳动物培养细胞，如CHO，BHK，NSO，SP2/0，YB2/0；或人体组织或杂交瘤细胞，酵母细胞和昆虫细胞，以及包含在转基因动物或培养组织内的细胞。该术语不仅涵盖特定的受试细胞，还涵盖这种细胞的后代。由于突变或环境影响可能在后代中发生某些修饰，这样的后代可能与亲本细胞不同，但仍包括在术语“宿主细胞”的范围内。

如本文所用，术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。对于这些计算，比对中的间隙(如果有的话)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来寻址。可以用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.编),1988,New York:Oxford University Press；Biocomputing Informaticsand Genome Projects,(Smith,D.W.编),1993,New York:Academic Press；ComputerAnalysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编),1994,NewJersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in MolecularBiology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.和Devereux,J.编),1991,New York:M.Stockton Press；和Carillo等人,1988,SIAMJ.Applied Math.48:1073中描述的那些。

如本文所用，术语“免疫原性”是指刺激生物体中特异性抗体或致敏淋巴细胞形成的能力。它不仅指抗原刺激特定免疫细胞活化、增殖和分化以最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的性质，还指抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答可以在用抗原刺激生物体后在生物体的免疫***中形成。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原是否能够成功诱导宿主中免疫应答的产生取决于三个因素：抗原的性质，宿主的反应性和免疫手段。

如本文所用，术语“转染”是指将核酸引入真核细胞特别是哺乳动物细胞的过程。用于转染的方案和技术包括但不限于脂质转染和化学和物理方法如电穿孔。许多转染技术在本领域是公知的并且在本文中公开。参见例如Graham等人,1973,Virology 52:456；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,同上；Davis等人,1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu等人,1981,Gene 13:197。在本发明的一个具体实施方案中，将人PD-L1/VEGF基因转染入293F细胞。

如本文所用，术语“SPR”或“表面等离子体共振”是指并且包括允许通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore***(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)。关于详细描述，参见实施例和

U.,等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；

U.,等人(1991)Biotechniques 11:620-627；Johnsson,B.,等人(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；和Johnnson,B.,等人(1991)Anal.Biochem.198:268-277。

如本文所用，术语“荧光激活细胞分选”或“FACS”是指专门类型的流式细胞术。它提供了根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物细胞的异质混合物以每次一个细胞分拣到两个或更多个容器中的方法(FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence ActivatedCell Sorting”.2017-11-09)。用于进行FACS的仪器是本领域技术人员已知的并且可以对于公众是可商购获得的。这种仪器的实例包括Becton Dickinson(Foster City，CA)的FACSStar Plus、FACScan和FACSort仪器、来自Coulter Epics Division(Hialeah，FL)的EpicsC和来自Cytomation(Colorado Springs，Colorado)的MoFlo。

术语“受试者”包括任何人或非人动物，优选人。

如本文所用，术语“癌症”是指引发医学病症的任何肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移介导的实体瘤和非实体瘤如白血病。

本文在治疗病况的情况中使用的术语“治疗”、“处理”和“医治”一般涉及人或动物的治疗和疗法，其中实现了一些期望的治疗效果，例如，抑制病况进展，包括进展速度下降，进展速度停滞，病况消退，病况改善和病况治愈。还包括了作为预防措施(即预防)的治疗。对于癌症，“治疗”可能是指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移或其某种组合。对于肿瘤，“治疗”包括去除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延迟肿瘤的发展或其某种组合。

如本文所用，术语“有效量”涉及活性化合物的量或包含活性化合物的材料、组合物或剂量的量，其在按照所需的治疗方案施用时有效用于产生与合理的益处/风险比相称的某些所需的治疗效果。例如，当与治疗CD3/CD20相关疾病或病症联合使用时，“有效量”是指抗体或其抗原结合部分有效治疗所述疾病或病症的量或浓度。

如本文所用，关于哺乳动物中的某种疾病病况的术语“预防”、“防止”或“阻止”是指预防或延迟疾病的发作或预防其临床或亚临床症状的表现。

如本文所用，术语“药学上可接受”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载体和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,第19版，Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于pH调节剂、表面活性剂、佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文所用，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，其在与抗原一起递送至生物体或被提前递送至有机体时可以增强生物体中的对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。存在多种佐剂，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、短小棒状杆菌(coryne bacterium parvum)、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂更常用于临床试验。

双特异性抗体及其抗原结合部分

在某些实施方案中，本文中提供的抗体及其抗原结合部分是双特异性的。在一些实施方案中，本文中提供的抗体及其抗原结合部分具有对PD-L1的第一特异性，和对VEGF的第二特异性。

根据某些示例性实施方案，本公开包括双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含与PD-L1特异性结合的第一抗原结合模块和与VEGF特异性结合的第二抗原结合模块。这类抗体在本文中可称为，例如“抗VEGF/抗PD-L1”或“抗PD-L1/VEGF”或“抗PD-L1xVEGF”或“PD-L1xVEGF”双特异性抗体，或其他类似的命名。

本公开的双特异性抗体能以高亲和力结合人PD-L1和人VEGF。本公开的抗体对PD-L1或VEGF的结合可使用本领域中确立的一种或多种技术(例如ELISA)来评估。本公开的抗体的结合特异性也可以通过监测抗体对表达PD-L1蛋白或VEGF蛋白的细胞的结合(例如流式细胞术)来测定。例如，可以通过流式细胞术测定来测试抗体，其中使抗体与表达人PD-L1的细胞系反应，例如经过转染以在其细胞表面上表达PD-L1的CHO细胞。另外或者备选地，可以在BIAcore结合测定法中测试抗体的结合，包括结合动力学(例如K_D值)。其他合适的结合测定法包括ELISA或FACS测定法，例如可使用重组PD-L1蛋白。

例如，本公开的抗体以1×10^-7M或更低的K_D、5×10^-8M或更低的K_D、2×10^-8M或更低的K_D、1×10^-8M或更低的K_D、5×10^-9M或更低的K_D、4×10^-9M或更低的K_D、3×10^-9M或更低的K_D、2×10^-9M或更低的K_D、1×10^-9M或更低的K_D、5×10^-10M或更低的K_D、1×10^-10M或更低的K_D结合人PD-L1蛋白或人VEGF蛋白，如通过表面等离子共振测量的。

如实施例部分验证的，本公开的双特异性抗体能够以较高的亲和力结合人PD-L1和人VEGF(与食蟹猴VEGF相同)；结合食蟹猴和小鼠PD-L1；有效阻断PD-1/PD-L1和VEGFR/VEGF两种信号传导途径，例如以nM级别的IC₅₀；阻断VEGF诱导的HUVEC增殖；并在细胞因子分泌上产生较强的激动剂作用。

PD-L1抗原结合模块

如本文中定义的PD-L1抗原结合模块可以具有多种形式(例如VHH、scFv、Fab)，只要其能特异性结合抗原。一般地，包含在双特异性抗体中的PD-L1结合模块衍生自单特异性抗PD-L1抗体，该抗体可以是本领域已知的抗体或者全新开发的抗体。在根据本申请的一些实施方案中，PD-L1抗原结合模块可以衍生自亲本的单域抗体(sdAb)，例如VHH抗体，其通常指由单一抗体可变域组成的抗体。与完整抗体相似，单域抗体也能选择性地结合特定的抗原。在一些其它的实施方案中，PD-L1抗原结合模块可以衍生自没有轻链的重链抗体。

术语“单可变域”或“重链抗体的重链可变区”与术语“VHH”、“VHH抗体”、“VHH结构域”、“VHH抗体片段”、“V_HH”或“纳米抗体”等可交换使用。来源于骆驼科抗体的V_HH分子是已知的最小的完整抗原结合结构域(约15kDa，或比常规IgG小10倍)，因此非常适合递送至致密组织和进入大分子之间的有限空间。

本文公开的亲本VHH抗体可以由技术人员根据本领域已知的方法或任何未来的方法来制备。例如，可以使用本领域已知的方法获得VHH，例如通过免疫骆驼并从中获得杂交瘤，或通过使用本领域已知的分子生物学技术克隆本发明的VHH的文库，随后通过使用噬菌体展示进行选择。

例如，可以通过用所需抗原免疫羊驼或美洲驼，然后分离编码重链抗体的mRNA来获得VHH抗体。通过反转录和聚合酶链式反应，产生了包含数百万个克隆的单域抗体的基因文库。筛选技术例如诸如噬菌体展示和核糖体展示可用于帮助鉴定结合抗原的克隆。在噬菌体展示中，在噬菌体上合成(例如人)抗体的文库，用目的抗原或其抗体结合部分筛选该文库，并分离与抗原结合的噬菌体，从而可以获得免疫反应片段。制备和筛选此类文库的方法是本领域众所周知的，并且用于产生噬菌体展示文库的试剂盒是可商购获得的(例如Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目录号27-9400-01；和StratageneSurfZAP^TM噬菌体展示试剂盒，货号240612)。还存在可用于产生和筛选抗体展示文库的其他方法和试剂(参见，例如，Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982(1991))。

VHH抗体的人源化可通过许多本领域中已确立的方法实现，例如，可将VHH框架区的氨基酸序列对人种系V基因数据库blast，并根据Kabat CDR定义通过将高命中序列中的人CDR序列用VHH CDR序列替换来产生人源化VHH序列。此外，框架区中的某些残基可以回复突变以维持亲和力。

在一些实施方案中，所述PD-L1抗原结合模块包含一个或多个选自下组的CDR：

(i)包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1相差不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失、或取代的氨基酸序列的CDR1；

(ii)包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2相差不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失、或取代的氨基酸序列的CDR2；和

(iii)包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3相差不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失、或取代的氨基酸序列的CDR3。

在一些实施方案中，所述PD-L1抗原结合模块是VHH抗体，其包含：(i)包含SEQ IDNO:1或由其组成的CDR1；(ii)包含SEQ ID NO:2或由其组成的CDR2；和(iii)包含SEQ IDNO:3或由其组成的CDR3。

在一些实施方案中，所述PD-L1抗原结合模块的VHH包含：(i)SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO:10至少85％、90％或95％相同的氨基酸序列；或(iii)与SEQ IDNO:10相比具有一个或多个(例如10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

VEGF抗原结合模块

类似地，本文中提供的VEGF抗原结合模块可以衍生自抗VEGF单特异性抗体。在根据本申请的一些实施方案中，VEGF抗原结合模块是一种抗VEGF完整抗体的Fab片段，即包含重链的VH和CH1区，和包含轻链的VL和CL区。

被用作亲本抗体的抗VEGF完整抗体可以是本领域中已知的单抗(例如贝伐单抗)，或者是全新开发的。优选地，所述抗VEGF抗体是全人抗体或人源化抗体。

在一些实施方案中，所述VEGF抗原结合模块的VH区包含选自下组的一个或多个重链CDR(HCDR)：

(i)由SEQ ID NO:4组成的HCDR1或氨基酸序列与SEQ ID NO:4相差不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失、或取代的HCDR1；

(ii)由SEQ ID NO:5组成的HCDR2或氨基酸序列与SEQ ID NO:5相差不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失、或取代的HCDR2；和

(iii)由SEQ ID NO:6组成的HCDR3或氨基酸序列与SEQ ID NO:6相差不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失、或取代的HCDR3；和/或

VL区包含选自下组的一个或多个轻链CDR(LCDR)：

(i)由SEQ ID NO:7组成的LCDR1或氨基酸序列与SEQ ID NO:7相差不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失、或取代的LCDR1；

(ii)由SEQ ID NO:8组成的LCDR2或氨基酸序列与SEQ ID NO:8相差不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失、或取代的LCDR2；和

(iii)由SEQ ID NO:9组成的LCDR3或氨基酸序列与SEQ ID NO:9相差不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失、或取代的LCDR3。

在一些实施方案中，所述VH包含：(i)包含SEQ ID NO:4或由其组成的HCDR1；(ii)包含SEQ ID NO:5或由其组成的HCDR2；和(iii)包含SEQ ID NO:6或由其组成的HCDR3；且所述VL包含：(i)包含SEQ ID NO:7或由其组成的LCDR1；(ii)包含SEQ ID NO:8或由其组成的LCDR2；和(iii)包含SEQ ID NO:9或由其组成的LCDR3。

在一些实施方案中，所述VEGF抗原结合模块的VH包含：(i)SEQ ID NO:11的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO:11至少85％、90％或95％相同的氨基酸序列；或(iii)与SEQ IDNO:11相比具有一个或多个(例如10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述VEGF抗原结合模块的VL包含：(i)SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO:12至少85％、90％或95％相同的氨基酸序列；或(iii)与SEQ IDNO:12相比具有一个或多个(例如10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

除非另有说明，否则将氨基酸分配给每个CDR可以根据以下提供的编号方案之一：Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版),USDept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication no.91-3242；Chothia等人,1987,PMID:3681981；Chothia等人,1989,PMID:2687698；MacCallum等人,1996,PMID:8876650；或Dubel编(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies,第3版,Wily-VCHVerVEGF GmbH and Co.。

抗体序列中的可变区和CDR可以根据本领域已经开发的一般规则(如上所述，例如Kabat编号***)或通过将序列与已知可变区的数据库比对来鉴定。在Kontermann和Dubel编,Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001和Dinarello等人,CurrentProtocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken,NJ,2000中描述了鉴定这些区域的方法。抗体序列的示例性数据库描述于并可获自www.bioinf.org.uk/abs上的“Abysis”网站(由Department of Biochemistry&Molecular Biology UniversityCollege London,London,England的A.C.Martin维护)和VBASE2网站www.vbase2.org，如Retter等人,Nucl.Acids Res.,33(Database issue):D671-D674(2005)中所述。优选使用Abysis数据库分析序列，其整合了来自Kabat、IMGT和蛋白质数据库(PDB)的序列数据与来自PDB的结构数据，参见Dr.Andrew C.R.Martin所著的书中的Protein Sequence andStructure Analysis of Antibody Variable Domains.In:Antibody Engineering LabManual(编:Duebel,S.和Kontermann,R.,Springer-VerVEGF,Heidelberg,ISBN-13:978-3540413547，也可在网站bioinforg.uk/abs上获得)。Abysis数据库网站还包括已经开发用于识别可以根据本文的教导使用的CDR的一般规则。除非另有说明，否则本文所述的所有CDR均根据Kabat的Abysis数据库网站获得。

两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))确定，该算法已被并入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以通过Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))确定，其已并入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空隙权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。

另外地或可选地，本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来执行针对公共数据库的搜索以例如识别相关序列。这种搜索可以使用Altschul,等人(1990)J.MoI.Biol.215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)来执行。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可使用空位BLAST，如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述的。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

在其他实施方案中，CDR氨基酸序列可以是与上述相应序列中所包含的具体的CDR氨基酸序列至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同。在其他实施方案中，可变区的氨基酸序列可以与上述相应序列至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同。

优选地，分离的抗体或其抗原结合部分的CDR包含不多于2个氨基酸或不多于1个氨基酸的保守取代。本文使用的术语“保守取代”是指氨基酸取代，其不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小，形状，电荷，化学性质包括形成共价键或氢键的能力等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。用于鉴定氨基酸保守取代的方法在本领域中是公知的(参见例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人,Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

双特异性抗体的生成

为了构建抗PD-L1/VEGF双特异性抗体，如上文描述的PD-L1抗原结合模块和VEGF抗原结合模块可以以多种形式融合在一起。在某些实施方案中，PD-L1抗原结合模块融合于VEGF抗原结合模块的N末端。当PD-L1抗原结合模块是VHH时，该PD-L1抗原结合模块的单链可以可操作地连接于VEGF抗原结合模块的重链或轻链，任选地经由接头。优选地，PD-L1抗原结合模块连接于VEGF抗原结合模块的轻链。该接头可以是肽接头，例如可以包含1-4个拷贝的GGGGS(G4S)。在一个实施方案中，该接头是(G4S)2。

本文中提供的双特异性抗体及其抗原结合部分可使用本领域中已知的任何适宜的方法来制备。一种常规的办法是将两对免疫球蛋白重链-轻链在宿主细胞中共表达从而以重组方式产生双特异性抗体(参见，例如Milstein和Cuello,Nature,305:537(1983))，然后通过亲和层析纯化。还可以将编码针对两种特异性的抗体重链可变域的序列分别与免疫球蛋白恒定域序列融合，然后***表达载体，将该表达载体与轻链序列的表达载体共转染至适宜的宿主细胞，从而重组表达双特异性抗体(参见，例如WO 94/04690；Suresh等人,Methods in Enzymology,121:210(1986))。

Fc区

在某些实施方案中，所述双特异性抗体包含可操作地连接于VEGF抗原结合模块的Fc区。本文中公开的双特异性抗体的Fc区可以是人IgG Fc区。所述IgG Fc区可以具有任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些实施方案中，所述Fc区为IgG1同种型。

在本公开的双特异性抗体的背景下，与指定的Fc区嵌合形式相比，Fc区可以包含一个或多个氨基酸改变(例如，***，缺失或取代)。例如，本公开包括在Fc区中包含一个或多个修饰的双特异性抗原结合分子，其导致在Fc与FcRn或FcγR之间具有修饰的结合相互作用的修饰的Fc区。

当述及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号***”或“EU索引”(例如报道在Kabat等人，见上文中的EU索引)。“如Kabat中的EU编号”或“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文中另外说明，对抗体恒定域中残基编号的提述都指的是通过EU编号***的残基编号。

在某些实施方案中，Fc区经由铰链区可操作地连接于VEGF抗原结合模块。任选地，该铰链区可以源自人IgG1、IgG2或IgG4。在某些实施方案中，该铰链区源自人IgG1。

编码本公开抗体的核酸分子

在一些方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的双特异性抗体或其抗原结合部分的核酸序列。例如，所述核酸序列可以编码双特异性抗体的重链和/或轻链，或者所述核酸序列可以编码PD-L1抗原结合模块，或VEGF抗原结合模块的重链或轻链可变区。所述核酸序列也可以编码双特异性抗体的Fc区。

在一些方面，本公开涉及包含编码如本文所公开的核酸序列的载体。在一些实施方案中，表达载体进一步包含编码双特异性抗体例如嵌合的或人源化双特异性抗体的恒定区的核苷酸序列。

在本发明的情况下载体可以是任何合适的载体，包括染色体、非-染色体和合成的核酸载体(包含一组合适的表达控制元件的核酸序列)。这样的载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，和病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施方案中，CD20或CD3抗体-编码核酸包含在裸DNA或RNA载体中，包括例如线性表达元件(描述于例如Sykes和Johnston,Nat Biotech 17,355-59(1997))、紧密核酸载体(描述于例如US 6,077,835和/或WO 00/70087)、质粒载体例如pBR322,pUC 19/18或pUC 118/119、"midge"最小尺寸的核酸载体(描述于例如Schakowski等人,Mol Ther 3,793-800(2001))或作为沉淀的核酸载体构建体，例如CaP04-沉淀的构建体(描述于例如WO200046147,Benvenisty和Reshef,PNAS USA 83,9551-55(1986),Wigler等人,Cell14,725(1978)和Coraro和Pearson,SomaticCell Genetics 7,603(1981))。这样的核酸载体和其用途是本领域众所周知的(参见例如US5,589,466和US 5,973,972)。

在一个实施方案中，载体适合在细菌细胞中表达抗PD-L1/VEGF双特异性抗体。这样的载体的实例包括表达载体，例如BlueScript(Stratagene)、pIN载体(Van Heeke&Schuster,J Biol Chem 264,5503-5509(1989)、pET载体(Novagen,Madison WI)等)。表达载体还可或备选地是适合在酵母***中表达的载体。可使用合适在酵母***中表达的任何载体。合适的载体包括，例如包含组成型或诱导型启动子，例如α因子、醇氧化酶和PGH的载体(综述于：F.Ausubel等人编,Current Protocols in MolecularBiology,GreenePublishing and Wiley InterScience New York(1987)和Grant等人,Methods inEnzymol 153,516-544(1987))。

表达载体还可或备选地是适合在哺乳动物细胞中表达的载体，例如，包含谷氨酰胺合成酶作为可选择标记的载体，例如描述于Bebbington(1992)Biotechnology(NY)10:169-175中的载体。

核酸和/或载体还可包含编码分泌/定位序列的核酸序列，所述序列可将多肽，例如新生的多肽链靶向周质空间或细胞培养基。这样的序列是本领域已知的，和包括分泌前导或信号肽。

表达载体可包含任何合适的启动子、增强子和其它表达促进元件或与其缔合。这样的元件的实例包括强表达启动子(例如人CMV IE启动子/增强子以及RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIV LTR启动子)、有效的多聚(A)终止序列、在大肠杆菌中质粒产物的复制起点、作为可选择标记的抗生素抗性基因和/或方便的克隆位点(例如，聚合接头)。核酸还可包含与组成型启动子相对的诱导型启动子，例如CMV IE。

在再一个方面，本公开涉及包含本文所述的载体的宿主细胞。因此，本发明还涉及产生本发明的双特异性抗体的重组真核或原核宿主细胞，例如转染瘤。

PD-L1-特异性抗体可在重组的真核或原核宿主细胞例如转染瘤中表达，其产生本文定义的本发明的抗体，或本文定义的本发明的双特异性抗体。VEGF-特异性抗体可同样地在重组的真核或原核宿主细胞例如转染瘤中表达，其产生本文定义的本发明的抗体或本文定义的本发明的双特异性抗体。

宿主细胞的实例包括酵母、细菌、植物和哺乳动物细胞，例如CHO、CHO-S、HEK，HEK293、HEK-293F、Expi293F、PER.C6或NS0细胞或淋巴细胞。例如，在一个实施方案中，宿主细胞可包含稳定整合至细胞基因组的第一和第二核酸构建体。在另一个实施方案中，本发明提供包含非整合核酸、例如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件的细胞，其包含上文所述的第一和第二核酸构建体。

在另一个方面，本发明涉及转基因非人动物或植物，其包含编码一组或两组人重链和人轻链的核酸，其中所述动物或植物产生本发明的双特异性抗体。

在再一个方面，本公开涉及杂交瘤，其产生用于本文定义的本公开的双特异性抗体的抗体。

在一个方面，本发明涉及表达载体，其包含

(i)核酸序列，其编码PD-L1抗原结合模块；

(ii)核酸序列，其编码VEGF抗原结合模块的重链和/或轻链；

(iii)核酸序列，其编码Fc区；或

(iv)核酸序列，其编码双特异性抗体的重链和/或轻链。

在一个方面，本公开涉及编码序列表中所列一种或多种氨基酸序列的核酸构建体。

在一个方面，本公开涉及产生根据本文公开的任一个实施方案的双特异性抗体的方法，包括培养本文公开的包含表达双特异性抗体的一种或多种表达载体的宿主细胞，和从培养基纯化所述抗体。在一个方面，本发明涉及包含上文定义的表达载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是重组真核、重组原核或重组微生物宿主细胞。

药物组合物

在一些方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种如本文所公开的双特异性抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。

组合物的组分

药物组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或药物。本发明的药物组合物还可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗组合施用，使得抗PD-L1/抗VEGF双特异性抗体增强对疫苗的免疫反应。药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体，凝胶或固体载体，水性介质，非水性介质，抗微生物剂，等渗剂，缓冲剂，抗氧化剂，麻醉剂，悬浮/分散剂，螯合剂，稀释剂，佐剂，赋形剂或无毒的辅助物质，本领域已知的各种组分的组合或更多。

合适的组分可以包括例如抗氧化剂，填充剂，粘合剂，崩解剂，缓冲剂，防腐剂，润滑剂，调味剂，增稠剂，着色剂，乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸，抗坏血酸，EDTA，硫代硫酸钠，铂，过氧化氢酶，柠檬酸，半胱氨酸，巯基甘油，巯基乙酸，巯基山梨糖醇，丁基甲基苯甲醚，丁基化羟基甲苯和/或丙基砷酸盐。如本发明所公开的，在包含还原抗体或其抗原结合片段的一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的含有本发明公开的组合物的抗体或抗原结合片段的溶剂中，其可被氧化。氧化还原可防止或减少结合亲和力的降低，从而增强抗体稳定性并延长保质期。因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的组合物。本发明进一步提供了多种方法，其中将抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸混合。从而，抗体或其抗原结合片段可以被防止氧化，以延长其保质期和/或增加活性。

为了进一步说明，药学上可接受的载体可以包括例如含水载体，例如氯化钠注射液，林格氏注射液，等渗右旋糖注射液，无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液，非水性载体如植物来源的固定油，棉籽油，玉米油，芝麻油或花生油，抑细菌剂或抑真菌浓度的抗微生物剂，等渗剂如氯化钠或葡萄糖，缓冲剂如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，抗氧化剂如硫酸氢钠，局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因，悬浮剂和分散剂如羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如聚山梨酯80(TWEEN-80)，隔绝剂或螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)，乙二醇，聚乙二醇，丙二醇，氢氧化钠，盐酸，柠檬酸或乳酸。用作载体的抗微生物剂可以添加到包含酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵的多剂量容器中的药物组合物中。合适的赋形剂可以包括例如水，盐水，右旋糖，甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，稳定剂，溶解度增强剂或诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。

施用、制剂和剂量

本发明的药物组合物可以通过各种途径体内施用至有需要的受试者，所述途径包括但不限于口服，静脉内，动脉内，皮下，肠胃外，鼻内，肌内，颅内，心内，心室内，气管内，口腔，直肠，腹膜内，皮内，局部，经皮和鞘内，或者通过植入或吸入。本发明组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于片剂，胶囊剂，粉剂，颗粒剂，软膏剂，溶液剂，栓剂，灌肠剂，注射剂，吸入剂和气雾剂。根据预期的应用和治疗方案可以选择合适的制剂和施用途径。

用于肠内施用的合适制剂包括硬或软的明胶胶囊，丸剂，片剂，包括包衣片剂，酏剂，混悬剂，糖浆剂或吸入剂及其控释剂型。

适用于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括活性成分溶解、悬浮于其中或以其他方式提供的(例如，在脂质体或其他微粒中)的水性或非水性、等渗、无热原、无菌液体(例如溶液，混悬液)。这些液体可以另外含有其它药学上可接受的成分，例如抗氧化剂，缓冲剂，防腐剂，稳定剂，抑菌剂，悬浮剂，增稠剂和使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水，醇，多元醇，甘油，植物油等。适用于此类制剂的等渗载体的实例包括氯化钠注射液，林格溶液或乳酸林格氏注射液。类似地，特定剂量方案(包括剂量，时间和重复)将取决于具体个体和个体的病史以及诸如药代动力学(例如半衰期，清除率等)的经验考虑。

施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且基于减少增殖或致瘤细胞的数量，维持这种肿瘤细胞的减少，减少肿瘤细胞的增殖或延迟转移的发展。在一些实施方案中，施用的剂量可以被调节或减少以控制潜在的副作用和/或毒性。或者，本发明治疗组合物的持续连续释放制剂可能是合适的。

本领域技术人员将会理解，合适的剂量可因患者而异。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性，施用，施用时间，化合物清除速率，治疗持续时间，其他联合使用的药物、化合物和/或材料，病症的严重程度，以及物种，患者的性别、年龄、体重、病况、一般健康状况和以前的病史。化合物的量和施用途径最终由医生、兽医或临床医师决定，但通常选择剂量以达到实现所需效果的作用部位处的局部浓度，而不会导致实质性的有害或不利副作用。

通常，本发明的抗体或其抗原结合部分可以以各种范围施用。这些包括每剂量约5μg/kg体重至约100mg/kg体重；每剂量约50μg/kg体重至约5mg/kg体重；每剂量约100μg/kg体重至约10mg/kg体重。其他范围包括每剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重和每剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重。在一些实施方案中，每剂量为至少约100μg/kg体重，至少约250μg/kg体重，至少约750μg/kg体重，至少约3mg/kg体重，至少约5mg/kg体重，至少约10mg/kg体重。

无论如何，本发明的抗体或其抗原结合部分优选根据需要施用于有需要的受试者。本领域技术人员可以确定施用频率，例如主治医生基于所治疗病况、所治疗受试者的年龄、所治疗病况的严重程度、所治疗受试者的一般健康状况等的考虑。

在某些优选的实施方案中，涉及本发明的抗体或其抗原结合部分的治疗过程将包含在数周或数月的时间内施用的多剂量的所选药物产品。更具体地说，本发明的抗体或其抗原结合部分可以每天，每两天，每四天，每周，每十天，每两周，每三周，每月，每六周，每两个月，每十周或每三个月施用。就此而言，可以理解的是，可以基于患者响应和临床实践来改变剂量或者调整间隔。

在给予一次或多次施用的个体中也可凭经验确定所公开的治疗组合物的剂量和方案。例如，可给予个体增量剂量的如本文所述产生的治疗组合物。在选定的实施方案中，剂量可分别根据经验确定或观察到的副作用或毒性逐渐增加或减少或减轻。为了评估所选择的组合物的功效，可以如前所述跟踪特定疾病、病症或病况况的标志物。对于癌症，这些包括通过触诊或视觉观察直接测量肿瘤大小，通过X射线或其他成像技术间接测量肿瘤大小；通过直接肿瘤活组织检查和肿瘤样本的显微镜检查评估的改善；测量根据本文所述方法鉴定的间接肿瘤标志物(例如用于***癌的PSA)或致瘤性抗原，疼痛或***减轻；与肿瘤相关的言语、视力、呼吸或其他失能的改善；食欲增加；或通过接受的测试测量的生活质量的提高或生存期的延长。本领域技术人员将明白，剂量将根据个体、肿瘤病况的类型、肿瘤病况的阶段、肿瘤病况是否已开始转移至个体中的其他位置以及过去使用的治疗和并行使用的治疗而变化。

用于肠胃外施用(例如静脉内注射)的相容制剂将包含浓度为约10μg/ml至约100mg/ml的本文公开的抗体或其抗原结合部分。在某些选定的实施方案中，抗体或其抗原结合部分的浓度将包括20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml或1mg/ml。在其他优选的实施方案中，抗体或其抗原结合部分的浓度将包括2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml，6mg/ml，8mg/ml，10mg/ml，12mg/ml，14mg ml，16mg/ml，18mg/ml，20mg/ml，25mg/ml，30mg/ml，35mg/ml，40mg/ml，45mg/ml，50mg/ml，60mg/ml，70mg/ml，80mg/ml，90mg/ml或100mg/ml。

本发明的应用

在一些方面，本发明提供了治疗受试者病症的方法，其包括向需要治疗的患者(例如人)施用治疗有效量的如本文公开的抗体或其抗原结合部分。例如，这种疾病是一种癌症。

可以使用本公开提供的方法治疗或预防涉及PD-L1和/或VEGF的多种癌症，无论是恶性的还是良性的，以及是否是原发性的或继发性的。这些癌症可以是实体癌或血液恶性肿瘤。这些癌症的实例包括肺癌如支气管癌(例如鳞状细胞癌，小细胞癌，大细胞癌和腺癌)，肺泡细胞癌，支气管腺瘤，软骨性错构瘤(非癌性)和肉瘤(癌性)；心脏癌如粘液瘤，纤维瘤和横纹肌瘤；骨癌例如骨软骨瘤，软骨瘤，软骨母细胞瘤，软骨样软骨瘤，骨样骨瘤，巨细胞瘤，软骨肉瘤，多发性骨髓瘤，骨肉瘤，纤维肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，尤因氏肿瘤(尤因氏肉瘤)和网织细胞肉瘤；脑癌例如神经胶质瘤(例如多形性成胶质细胞瘤)，间变性星形细胞瘤，星形细胞瘤，少突神经胶质瘤，成神经管细胞瘤，脊索瘤，神经鞘瘤，室管膜瘤，脑膜瘤，垂体腺瘤，松果体瘤，骨瘤，血管母细胞瘤，颅咽管瘤，脊索瘤，生殖细胞瘤，畸胎瘤，皮样囊肿和血管瘤；消化***中的癌症如结肠癌，平滑肌瘤，表皮样癌，腺癌，平滑肌肉瘤，胃腺癌，肠脂肪瘤，肠神经纤维瘤，肠纤维瘤，大肠息肉和结肠直肠癌；肝癌如肝细胞腺瘤，血管瘤，肝细胞癌，纤维板层癌，胆管癌，肝母细胞瘤和血管肉瘤；肾癌如肾腺癌，肾细胞癌，高肾上腺瘤和肾盂的移行细胞癌；膀胱癌；血液***癌症如急性淋巴细胞白血病(急性淋巴细胞性白血病)，急性骨髓性(髓细胞性，骨髓，成髓细胞性，骨髓单核细胞性)白血病，慢性淋巴细胞性白血病(例如Sezary综合征和毛细胞性白血病)，慢性髓细胞性(髓性，骨髓性，粒细胞性)淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，B细胞淋巴瘤，蕈样霉菌病和骨髓增殖性疾病(包括骨髓增生性疾病，如真性红细胞增多症，骨髓纤维化，血小板增多症和慢性粒细胞白血病)；皮肤癌如基底细胞癌，鳞状细胞癌，黑素瘤，卡波西肉瘤和佩吉特氏病；头颈部癌症；与眼相关的癌症，如成视网膜细胞瘤和眼内黑素癌；男性生殖***癌症如良性***增生，***癌和睾丸癌(例如***瘤，畸胎瘤，胚胎癌和绒毛膜癌)；乳腺癌；女性生殖***癌症如子宫癌(子宫内膜癌)，***(***)，卵巢癌(卵巢肿瘤)，外阴癌，***癌，输卵管癌和***；甲状腺癌(包括***状，滤泡状，间变性或髓样癌)；嗜铬细胞瘤(肾上腺)；甲状旁腺的非癌性生长；胰腺癌；和血液学癌症例如白血病，骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。在具体的实施方案中，癌症是结肠癌。

在一些实施方案中，癌症的实例包括但不限于B细胞癌，包括B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中间级别扩散性NHL；免疫母细胞NHL；高级别淋巴母细胞NHL；高级别小型非切割细胞NHL；大块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，以及与瘢痣病相关的异常血管增生，水肿(例如与脑肿瘤相关的)，B细胞增殖性病症和Meigs'综合征，更具体的例子包括但不限于复发或难治性NHL，前线低级别NHL，III/IV级NHL，化疗耐受性NHL，前体Bly成淋巴细胞性白血病和/或淋巴瘤，小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞白血病和/或幼淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞幼淋巴细胞淋巴瘤，免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞淋巴瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，结外边缘区-MALT淋巴瘤，***边缘区淋巴瘤，毛细胞白血病，浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤，低级/滤泡性淋巴瘤，中级/滤泡性NHL，套细胞淋巴瘤，滤泡中心淋巴瘤(包括侵袭性前线NHL和侵袭性复发NHL)，自体干细胞移植后复发或复发的NHL，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤，高级别免疫母细胞NHL，高级成淋巴细胞性NHL，高级别小非裂解性细胞NHL，庞大疾病NHL，伯基特淋巴瘤，前体(外周)大颗粒淋巴细胞白血病，蕈样肉芽肿和/或塞扎里综合征，皮肤(皮肤)淋巴瘤，间变性大细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤。

在一些实施方案中，癌症的实例进一步包括但不限于B细胞增殖性病症，其进一步包括但不限于淋巴瘤(例如B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL))和淋巴细胞白血病。这种淋巴瘤和淋巴细胞白血病包括例如a)滤泡性淋巴瘤，b)小的未***细胞淋巴瘤/伯基特淋巴瘤(包括地方性伯基特淋巴瘤，散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特淋巴瘤)，c)边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区B细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT)，结节边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)，d)套细胞淋巴瘤(MCL)，e)大细胞淋巴瘤(包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)细胞淋巴瘤，免疫母细胞性淋巴瘤，原发性纵隔B细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)，f)毛细胞白血病，g)淋巴细胞淋巴瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，h)急性淋巴细胞白血病(ALL)，慢性淋巴细胞白血病CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，B细胞幼淋巴细胞性白血病，i)浆细胞瘤，浆细胞性骨髓瘤，多发性骨髓瘤，浆细胞瘤和/或j)霍奇金氏病。

在一些其他实施方案中，病症是自身免疫性疾病。可以用抗体或其抗原结合部分治疗的自身免疫性疾病的实例包括自身免疫性脑脊髓炎，红斑狼疮和类风湿性关节炎。抗体或其抗原结合部分也可用于治疗或预防感染性疾病，炎症性疾病(例如变应性哮喘)和慢性移植物抗宿主病。

与化疗组合使用

抗体或其抗原结合部分可以与抗癌剂、细胞毒性剂或化学治疗剂组合使用。

术语“抗癌剂”或“抗增殖剂”意指可用于治疗细胞增殖性病症例如癌症的任何药剂，并且包括但不限于细胞毒性剂，细胞抑制剂，抗血管生成剂，放射疗法和放射治疗剂，靶向抗癌剂，BRM，治疗性抗体，癌症疫苗，细胞因子，激素疗法，放射疗法和抗转移剂和免疫治疗剂。应该理解的是，在如上所述的选定实施方案中，此类抗癌剂可以包含缀合物并且可以在施用之前与公开的位点特异性抗体结合。更具体而言，在一些实施方案中，将选择的抗癌剂连接至工程化抗体的不配对半胱氨酸以提供如本文所述的工程化缀合物。因此，这样的工程化缀合物被明确地考虑在本发明的范围内。在其他实施方案中，所公开的抗癌剂将与包含如上所述的不同治疗剂的位点特异性缀合物组合施用。

如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指对细胞有毒并降低或抑制细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。在一些实施方案中，该物质是源自活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实例包括但不限于，细菌(例如，白喉毒素、假单胞菌内毒素和外毒素，葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin)A)，真菌(例如α-八叠球菌素(sarcin)，局限曲霉素(restrictocin))，植物(相思豆毒蛋白、蓖麻毒素、蒴莲根毒素、槲寄生素、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草素、白树毒素、momoridin、天花粉蛋白、大麦毒素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、Phytolacca mericana蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、石碱草(Saponaria officinalis)抑制剂、白树毒素、mitegellin、局限曲霉素、酚霉素、新霉素和单端孢霉烯族化合物)或动物(例如细胞毒性RNA酶，如胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段和/或变体)的小分子毒素或酶促活性毒素。

为了本发明的目的，“化学治疗剂”包括非特异性降低或抑制癌细胞的生长、增殖和/或存活的化学化合物(例如细胞毒性剂或细胞抑制剂)。这些化学药剂通常针对细胞生长或***所需的细胞内过程，因此对于通常快速生长和***的癌细胞特别有效。例如，长春新碱使微管解聚，从而抑制细胞进入有丝***。通常，化学治疗剂可以包括抑制或被设计用于抑制癌细胞或可能变成性或产生致瘤后代(例如TIC)的细胞的任何化学药剂。这些药剂通常是组合使用的，并且通常是最有效的，例如，在诸如CHOP或FOLFIRI的方案中。

可以与本发明的位点特异性构建体组合使用的抗癌剂(作为位点特异性缀合物的组分或未缀合状态)的实例包括但不限于烷化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺、多聚乙酰(acetogenins)、喜树碱、苔藓抑素、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、多拉司他汀、多卡米星、艾榴素(eleutherobin)、水鬼蕉碱、沙克迪因(sarcodictyin)、海绵素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔类抗生素、dynemicin、双膦酸盐、埃斯波霉素、色素蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡拉宾辛(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素类(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、

多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、博地霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗-代谢物、埃罗替尼、威罗菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依鲁替尼、恩杂鲁胺、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗-肾上腺素、叶酸补充剂如弗林酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、贝斯布希(bestrabucil)、比生群、依达曲沙、迪夫法明(defofamine)、秋水仙胺、地吖醌、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋铵、爱波喜龙、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美坦生类化合物(maytansinoids)、米托胍腙、米托蒽醌、莫丹摩尔(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基肼、丙卡巴肼、

多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)、雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；卡西托欣(gacytosine)；***糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；

吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱，

长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸；类视色素；卡培他滨；考布他汀；甲酰四氢叶酸；奥沙利铂；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制剂(其减少细胞增殖)，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这一定义中还包括的是用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，诸如抗***和选择性***受体调节剂，抑制调节肾上腺中的***产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，和抗-雄激素；以及曲沙他滨(1，3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、核酶诸如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗，

rIL-2；

拓扑异构酶1抑制剂；

rmRH；长春瑞滨和埃斯波霉素，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

与放射疗法组合使用

本发明还提供了抗体或其抗原结合部分与放射疗法(即，用于在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，例如γ-照射，X-射线，UV-照射，微波，电子发射等)的组合。还考虑了使用放射性同位素至肿瘤细胞的定向递送的联合疗法，并且所公开的缀合物可以与靶向的抗癌剂或其他靶向手段结合使用。通常，放射疗法在约1周至约2周的时间段内以脉冲方式施用。放射疗法可以对患有头颈癌的受试者施用约6至7周。任选地，放射疗法可以作为单剂量或作为多个顺序剂量施用。

药物包装和试剂盒

还提供了包含含有一个或多个剂量的抗体或其抗原结合部分的一个或多个容器的药物包装和试剂盒。在一些实施方案中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的组合物，所述组合物包含例如抗体或其抗原结合部分，具有或不具有一种或多种其他试剂。对于其他实施方案，这种单位剂量以一次性使用的预充式注射用注射器供应。在其他实施方案中，单位剂量中包含的组合物可以包含盐水、蔗糖或类似物；缓冲液，如磷酸盐等；和/或配制在稳定和有效的pH范围内。或者，在一些实施方案中，组合物可以作为冻干粉末提供，其可以在加入合适的液体(例如无菌水或盐溶液)后重建。在某些优选的实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。一种或多种容器上或与容器相关联的任何标签指示封装的组合物用于治疗选择的肿瘤疾病病况。

本发明还提供了用于产生抗体以及任选地一种或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单元的试剂盒。该试剂盒包括容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，小瓶，注射器等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料，并且包含药学有效量的所公开的缀合或非缀合形式的抗体。在其他优选实施例中，一种或多种容器包括无菌存取口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。这样的试剂盒通常在合适的容器中包含抗体的药学上可接受的制剂，并且任选地在相同或不同的容器中包含一种或多种抗癌剂。试剂盒还可以含有其他药学上可接受的制剂，用于诊断或组合治疗。例如，除了本发明的抗体或其抗原结合部分之外，这样的试剂盒可以含有任何一种或多种抗癌剂，例如化学治疗剂或放射治疗剂；抗血管生成剂；抗转移剂；靶向抗癌剂；细胞毒性剂；和/或其他抗癌剂。

更具体地说，试剂盒可以具有含有所公开的抗体或其抗原结合部分的单个容器，其含有或不含另外的组分，或者它们可以具有用于每种所需试剂的不同容器。在提供用于缀合的组合治疗剂的情况下，可以按摩尔当量组合或一种组分多于另一种的方式预混合单一溶液。或者，试剂盒的抗体和任何任选的抗癌剂可以在施用于患者之前分开保存在不同的容器中。试剂盒还可以包含用于容纳无菌药学上可接受的缓冲液或其他稀释剂例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器装置。

当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，液体溶液优选为水溶液，特别优选无菌水溶液或盐水溶液。然而，试剂盒的组分可以作为干粉提供。当试剂或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。可以设想溶剂也可以提供于另一个容器中。

如上简要所述，所述试剂盒还可含有向患者施用抗体或其抗原结合部分和任何任选组分的工具，例如一种或多种针，I.V.袋或注射器，或者甚至滴眼器、移液管或其他类似装置，通过其可以将制剂注射或引入动物体内或将其施用于身体的患病区域。本发明的试剂盒通常还包括用于容纳小瓶或类似物的装置以及用于商业销售的其他紧密封闭的部件，例如注射或吹塑塑料容器，其中放置并且保持所需的小瓶和其他装置。

序列表概述

本申请附带有包含许多氨基酸序列的序列表。下表A提供了所包含的序列的概述。

如本文中公开的一种示例性抗VEGF/抗PD-L1双特异性抗体，称为W3256-U15T2.G6-1.uIgG1(在整篇说明书中可缩写为W3256)。

表A

SEQ ID NO.	描述
		1	PD-L1结合模块的CDR1的氨基酸序列
2	PD-L1结合模块的CDR2的氨基酸序列
		3	PD-L1结合模块的CDR3的氨基酸序列
4	VEGF结合模块的重链CDR1的氨基酸序列
		5	VEGF结合模块的重链CDR2的氨基酸序列
6	VEGF结合模块的重链CDR3的氨基酸序列
		7	VEGF结合模块的轻链CDR1的氨基酸序列
8	VEGF结合模块的轻链CDR2的氨基酸序列
		9	VEGF结合模块的轻链CDR3的氨基酸序列
10	PD-L1结合模块的VHH的氨基酸序列
		11	VEGF结合模块的VH的氨基酸序列
12	VEGF结合模块的VL的氨基酸序列
		13	W3256抗体的重链的氨基酸序列
14	W3256抗体的轻链的氨基酸序列

实施例

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。这些实施例并旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。

实施例1

材料、基准抗体和细胞系的准备

1.1材料的准备

表1中提供了实施例中使用的可商购获得的材料的信息。

表1

1.2抗原制备

编码人VEGF(Uniport编号：P15692)、小鼠VEGF(Uniport编号：Q00731)和人PD-L1的胞外结构域序列(Uniport编号：Q9NZQ7)、小鼠PD-L1(Uniport编号：Q9EP73)、人PD-1(Uniport编号：Q15116)和小鼠PD-1(Uniport编号：Q02242)的DNA序列由Sangon Biothech(中国上海)合成，然后亚克隆到经修饰的pcDNA3.3表达载体中，在C末端带有不同标签(例如6xhis、人Fc或小鼠Fc)。

用纯化的表达载体转染Expi293细胞(Thermo Fisher Scientific，A14527)。将细胞培养5天，并收集上清液使用Ni-NTA柱(GE Healthcare，175248)、蛋白A柱(GEHealthcare，175438)或蛋白G柱(GE Healthcare，170618)进行蛋白质纯化。通过SDS-PAGE和SEC对获得的人VEGF、人PD-L1、小鼠PD-L1、人PD-1和小鼠PD-1进行质控，然后在-80℃保存。

1.3基准抗体(BMK Ab)的产生

在Sangon Biothech(中国上海)或Genewiz(中国苏州)合成了编码抗VEGF抗体贝伐单抗(命名为WBP325-BMK3或WBP325-BMK3.uIgG1，序列来自Drug Bank，Drug Bank编号：DB00112)的片段的DNA序列，然后与人IgG1的Fc区一起亚克隆到经修饰的pcDNA3.3表达载体。

通过用人PD-L1的胞外域和小鼠PD-L1的胞外域交替免疫羊驼来产生抗PD-L1 VHH抗体(W3156-AP3R2-1A3-z12)，并分离PBMC用于噬菌体文库的构建。在淘选、筛选和测序后，鉴定出独特的阳性VHH片段(专利申请号PCT/CN2020/117351中公开的SEQ ID No:4)。

将Roche开发的抗PD-L1抗体Atezolizumab(命名为W315-BMK8.uIgG1K(RKNA)或缩写为W315-BMK8)用作对照抗体。

为了产生WBP325-BMK3，将含有重组VH和VL基因的质粒共转染到Expi293细胞中。将细胞培养5天，并收集上清液使用蛋白A柱(GE Healthcare，175438)或蛋白G柱(GEHealthcare，170618)进行蛋白质纯化。通过SDS-PAGE和SEC分析获得的抗体，然后在-80℃保存。

1.4稳定的细胞系/细胞池的建立

表达PD-L1的细胞系

使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific，11668019)或PlasFect(Bioline，46026)，将CHO-K1或293F细胞用含有编码全长人PD-L1或小鼠PD-L1或食蟹猴PD-L1的基因的表达载体转染。在含有适当选择标志物的培养基中培养细胞。通过有限稀释获得人PD-L1高表达稳定细胞系(WBP315.CHO-K1.hPro1.C11)，小鼠PD-L1高表达稳定细胞系(WBP315.293F.mPro1.C1)和食蟹猴PD-L1高表达稳定细胞系(WBP315.293F.cPro1.2A)。

将人PD-L1或小鼠PD-L1或食蟹猴PD-L1的基因分别***表达载体pcDNA 3.3。然后将质粒分别转染至CHO-K1细胞或293细胞。简言之，对于CHO-K1细胞，在转染前一天，将5x10⁵个CHO-K1细胞接种到6孔组织培养板的一个孔中，并在5％CO2和37℃下孵育。用3ml新鲜的非选择性培养基(F12-K，10％FBS)培养细胞。在1.5ml管中制备转染试剂，包括4μg DNA与10μg Lipofectamine 2000混合，以使最终体积在Opti-MEM培养基中为200μl。将移液管中的溶液逐滴加入细胞中。转染后6-8小时，用PBS洗涤细胞，并加入3ml新鲜的非选择性培养基。转染后24-48小时，用胰蛋白酶收获表达细胞，并接种到T75烧瓶中的选择性培养基(F12-K，10％FBS，10μg/ml杀稻瘟素)中。对于293F细胞，将20μg DNA与50μl PlasFect混合以在Opti-MEM培养基中使最终体积为200μl。将该混合物加到20ml(1×10⁶/ml)悬浮的293F细胞中，并在125ml烧瓶中的Freestyle293培养基中培养。转染后48小时，加入杀稻瘟素作为选择标志物。选择两三遍后，用抗PD-L1抗体检测细胞。通过有限稀释分离稳定的单细胞克隆，并使用抗PD-L1抗体通过FACS进行筛选。

表达靶标的细胞系

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自ScienceCell(货号：8000)，并在含有碱性培养基、5％FBS、1％内皮细胞生长因子(ECGS，ScienceCell，1052)的内皮细胞培养基(ECM，ScienceCell，货号：1001)中培养。在37℃和5％CO2的培养箱中培养细胞。为了长期保存，将细胞在补充有5％(v/v)DMSO的完全生长培养基中冷冻并保存在液氮气相中。

实施例2

抗PD-L1/VEGF双特异性抗体的生成

2.1表达载体的构建

将通过柔性G4S接头连接的编码VHH抗体W3156-AP3R2-1A3-z12的DNA序列置于WBP325-BMK3(贝伐单抗)的轻链的N末端。使用与WBP325-BMK3(贝伐单抗)的序列相同的序列构建重链。将重组DNA序列分别克隆到经修饰的pcDNA3.3表达载体中。所构建的抗体命名为W3256-U15T2.G6-1.uIgG1(在整个公开中可缩写为“W3256”)。

如上所述，W3256-U15T2.G6-1.uIgG1的重链包含WBP325-BMK3的可变重链区(贝伐单抗)和人IgG1的恒定重链区(CH1-CH3)。W3256-U15T2.G6-1.uIgG1的轻链由WBP325-BMK3(贝伐单抗)的可变轻链区和人IgG1的恒定轻链区(CL)以及在N末端的VHH抗体W3156-AP3R2-1A3-z12构成，如图1所示。W3256抗体的具体序列在下表2-4中列出。

表2

表3

表4

2.2转染、表达和纯化

根据制造商的说明，使用Expi293表达***试剂盒(ThermoFisher-A14635)将重链和轻链表达质粒共转染入Expi293细胞。转染后5天，收集上清液，并使用Protein A柱(GEHealthcare-17543802)进行蛋白纯化。抗体浓度通过NanoDrop测量。通过SDS-PAGE和HPLC-SEC评估蛋白质的纯度。表达和纯化后获得双特异性抗体，包括W3256-U15T2.G6-1.uIgG1。

2.3产生用于体内研究(包括内毒素控制和测试)的双特异性抗体

根据制造商的说明，使用Expi293表达***试剂盒(ThermoFisher-A14635)将W3256-U15T2.G6-1.uIgG1表达质粒转染到Expi293细胞中。转染后五天，收集上清液，并在内毒素控制的条件下使用Protein A柱(GE Healthcare-17543802)进行蛋白纯化。使用内毒素检测试剂盒(GenScript-L00350)确认了低内毒素水平(低于10EU/mg)。

通过NanoDrop测量抗体浓度，W3256-U15T2.G6-1.uIgG1的产率为44.8mg/l。通过SDS-PAGE(图2)和HPLC-SEC(图3)评估蛋白质的纯度。根据HPLC-SEC，蛋白A一步纯化后，W3256-U15T2.G6-1.uIgG1的纯度为93.43％。

实施例3

双特异性抗体的体外表征

3.1差示扫描荧光法(DSF)

使用7500快速实时PCR***(Applied Biosystems)进行DSF测定。简言之，将19μl双特异性抗体溶液与1μl 62.5X SYPRO Orange溶液(ThermoFisher-S6650)混合，然后添加到96孔板中。将板以2℃/min的速率从26℃加热至95℃，并收集所得的荧光数据。通过其操作软件自动分析数据，并通过获取所得荧光数据相对于温度的负导数的最大值来计算Th。T_on可以大致确定为负导数图开始从转变前基线降低的温度。

如图4所示，W3256抗体的T_h1值为65.7℃。

3.2人/食蟹猴VEGF结合(ELISA)

通过结合ELISA测定法测试抗体与人VEGF抗原(WBP325-hPro1，Sino Biological，11066-HNAB)的结合。由于食蟹猴VEGF的氨基酸序列与人VEGF相同，因此该结合结果代表人VEGF的结合和食蟹猴VEGF的结合。简言之，将96孔ELISA板(Nunc MaxiSorp，ThermoFisher，442404)在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(20mM Na₂CO3、180mM NaHCO₃，pH9.2)中用0.25μg/ml人VEGF于4℃包被过夜。用溶解于PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白(Pierce)进行1小时封闭步骤后，将W3256-U15T2.G6-1.UIgG1在PBS中的系列稀释液在室温在平板上孵育2小时。孵育后，将板用每孔300μL的含0.5％(v/v)Tween 20的PBS洗涤3次。加入100ng/ml山羊抗人IgGFc-HRP(Bethyl，#A80-304P)并在室温在板上孵育1小时。洗涤6次后，添加四甲基联苯胺(TMB)底物(Sigma-860336-5G)进行检测。大约8分钟后，通过每孔添加100μl的2M HCl终止反应。用多孔板读数器(

M5^e)在450nm处测量孔的吸光度。

W3256在人VEGF上显示出与WBP325-BMK3.uIgG1可比的结合能力，EC₅₀为约0.095nM(图5)。

3.3人PD-L1结合(FACS)

将工程化的人PD-L1表达细胞(WBP315.CHO-K1.hPro1.C11)以1×10⁵细胞/孔接种在U型底96孔板中。将W3256-U15T2.G6-1.UIgG1的系列稀释液添加至细胞。将板在4℃孵育1小时。洗涤后，将FITC标记的山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，109-095-008)添加到每个孔中，并将板在4℃孵育1小时。通过流式细胞仪测试抗体与细胞的结合，并通过FlowJo分析均值荧光强度(MFI)。

W3256在人PD-L1上还显示了与W3156-AP3R2-1A3-z12-hIgG1可比的结合能力，EC₅₀为约0.128nM(图6)。

3.4人VEGF/人PD-L1双重结合(ELISA)

为了测试双特异性抗体是否可以结合VEGF和PD-L1两者，开发了如下ELISA测定法。将96孔ELISA板(Nunc MaxiSorp，ThermoFisher)在4℃用1μg/ml抗原-1(VEGF，WBP325-hPro1，Sino Biological)或1μg/ml抗原-2(PD-L1.ECD.mFc，W3153-hPro1.ECD.mFc)在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中包被过夜。封闭1小时后，将W3256-U15T2.G6-1.UIgG1在酪蛋白缓冲液中的系列稀释液在板上于室温孵育1小时。孵育后，将板用每孔300μL的含0.5％(v/v)Tween 20的PBS洗涤3次。将0.5μg/ml抗原-2.Biotin(PD-L1-ECD，WBP315-hPro1.ECD.mFc)或0.5μg/ml抗原-1.Biotin(VEGF，WBP325-hPro1.his)加入板中并孵育1小时。洗涤板3次后，加入HRP标记的检测二抗并在板上室温孵育1小时。洗涤板6次后，加入四甲基联苯胺(TMB)底物(Sigma-860336-5G)进行检测。大约10分钟后，通过添加每孔100μL的2M HCl终止反应。用多孔板读数器(

M5^e)在450nm处测量孔的吸光度。

结果表明，W3256与VEGF的结合不会影响随后的PD-L1结合(图7)，反之亦然(图8)。

3.5跨物种结合(FACS/ELISA)

食蟹猴PD-L1结合(FACS)

将工程化的食蟹猴PD-L1表达细胞(WBP315.293F.cPro1.2A)以1×10⁵细胞/孔的密度接种在U型底96孔板中。将W3256-U15T2.G6-1.UIgG1的系列稀释液添加至细胞。将板在4℃孵育1小时。洗涤后，将FITC标记的山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，109-095-008)添加到每个孔中，并将板在4℃孵育1小时。通过流式细胞术测试抗体与细胞的结合，并通过FlowJo分析均值荧光强度(MFI)。

小鼠VEGF结合(ELISA)

抗体与小鼠VEGF抗原(WBP325-mPro1，Sino Biological，50159-MNAB)的结合通过与上文描述的人VEGF结合相同的ELISA测定法进行，只不过包被蛋白为100μL 0.25μg/mL的小鼠VEGF。

小鼠PD-L1结合(FACS)

将工程化的小鼠PD-L1表达细胞(WBP315.293F.mPro1.C1)以1×10⁵细胞/孔的密度接种到U型底96孔板中。将不同抗体的系列稀释液添加到细胞中。将板在4℃孵育1小时。洗涤后，将FITC标记的山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，109-095-008)添加到每个孔中，并将板在4℃孵育1小时。通过流式细胞术测试W3256-U15T2.G6-1.UIgG1在细胞上的结合，并通过FlowJo分析均值荧光强度(MFI)。

食蟹猴VEGF的氨基酸序列与人VEGF相同，因此，W3256也具有与食蟹猴VEGF的结合活性。还评估了W3256与食蟹猴PD-L1、小鼠VEGF和小鼠PD-L1的跨物种结合活性。图9、图10和图11显示了它们与VEGF或PD-L1的结合活性。W3256在食蟹猴PD-L1上显示与亲本抗体可比的结合能力，EC₅₀为约2.618nM(图9)。W3256不能与小鼠VEGF结合(图10)。W3256在小鼠PD-L1上还显示出与亲本抗体可比的结合能力，EC₅₀为约1.687nM(图11)。

3.6与VEGF和PD-L1的结合亲和力(SPR)

使用SPR技术来测量抗体对VEGF或PD-L1的ECD的结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)。因此确定了亲和常数(KD)。

Biacore T200，S系列传感器芯片CM5，胺偶联试剂盒和10x HBS-EP购自GEHealthcare。将抗体捕获到固定在CM5-生物传感器芯片(GE Healthcare Inc.)上的抗人FcIgG(Jackson，109-005-098)表面上。用HBS-EP+缓冲液(GE Healthcare Inc.)作为运行缓冲液和稀释缓冲液在25℃实施测定。注入连续稀释的PD-L1抗原或VEGF抗原(W315-hPro1.ECD.his或W325-hPro1.his)和运行缓冲液用于结合阶段和随后的解离阶段检测。通过注射pH 1.5的10mM甘氨酸达到芯片表面的再生。

W3256的亲和常数(KD)是根据SPR技术测量的。同时还测量了结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)。每个相互作用的最终数据都从参考通道和缓冲通道数据中扣除。分析实验数据，如图12和图13所示。抗体的动力学亲和力结果列于表5。

表5.抗体的动力学亲和力结果

3.7配体竞争测定(ELISA)

人VEGFR1竞争测定

通过竞争性ELISA测定了对VEGF与人VEGF受体1(W325-hpro1R1.ECD.hFc，SinoBiological，10136-H02H)结合的抑制作用。将96孔ELISA板(Nunc MaxiSorp，ThermoFisher，442404)在4℃用2μg/mL W325-hpro1R1.ECD.His在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(20mM Na₂CO₃，180mM NaHCO₃，PH9.2)中包被过夜。所有孔用每孔300μL的PBS/0.5‰Tween-20(v/v)洗涤3次，测定中随后的所有洗涤步骤均相同。然后将孔用200μL/孔的50％酪蛋白(Thermo SCIENTIFIC，37528)封闭1小时，然后在洗涤步骤后，将系列稀释的抗体和0.02μg/ml生物素标记的人VEGF(W325-hPro1.Biotin，ACRO Biosystems，VE5-H8210)混合物加入孔中，并在25℃孵育2小时。将板洗涤3次，然后加入在PBS/50％酪蛋白中1:10000稀释的过氧化物酶连接的链霉亲和素(Jackson，016-030-084)。将板在25℃孵育1小时，然后像之前一样洗涤6次。将100μL/孔的四甲基联苯胺(TMB)底物(Sigma，860336)添加到所有孔中8分钟，然后用100μL 2M HCl终止反应。人VEGF-生物素与W325-hpro1R1.ECD.hFc结合的程度通过用多孔平板读数器(

M5^e)测量OD₄₅₀来确定。使用GraphPad Prism 5软件通过四参数非线性回归分析获得结合的IC₅₀值。

W3256显示出与亲本抗体可比的与hVEGFR1的竞争结合能力，其结合VEGF的IC₅₀为约3.86nM(图14)。

小鼠VEGFR1竞争测定

通过竞争性ELISA评估抗体阻断VEGF结合小鼠VEGF受体1(W325-mpro1R1.ECD.hFc.his(R&D，471-F1)的作用。小鼠VEGFR1竞争ELISA方法类似于人VEGFR1竞争ELISA，只不过在96孔ELISA板上预包被的蛋白是2μg/ml的W325-mpro1R1.ECD.hFc.his，封闭缓冲液是PBS/2％BSA，而W325-hPro1.Biotin的浓度是0.44μg/ml。

W3256显示出与亲本抗体可比的与mVEGFR1的竞争能力(图16)，其结合VEGF的IC₅₀为约31nM。

人PD-1竞争测定

通过基于FACS的竞争测定法测量W3256与人PD-1的竞争。将表达人PD-L1的CHO-K1细胞(WBP315.CHO-K1.hPro1.C11)以1×10⁵细胞/孔的密度接种到96孔U型底板中。将测试抗体的系列稀释液与5μg/ml带小鼠Fc标签的人PD-1预混合，然后添加到细胞中，并在4℃孵育1小时。洗涤后，加入PE标记的抗小鼠IgG，并在4℃与细胞孵育45分钟。将细胞洗涤两次，并通过流式细胞仪测量细胞的MFI，并通过FlowJo进行分析。

W3256显示出与亲本抗体可比的竞争能力，其阻断hPD-1与PD-L1结合的IC₅₀为约0.048nM(图15)。

小鼠PD-1竞争测定

将表达小鼠PD-L1的CHO-K1细胞(WBP315.293F.mPro1.C1)以1×10⁵细胞/孔接种到96孔U型底板中。将测试抗体的系列稀释液与5μg/ml带小鼠Fc标签的鼠PD-1预混合，然后添加到细胞中，并在4℃孵育1小时。洗涤后，加入PE标记的抗小鼠IgG，并在4℃与细胞孵育1小时。将细胞洗涤两次，并通过流式细胞仪测量细胞的MFI，并通过FlowJo进行分析。

W3256显示出与亲本抗体可比的竞争能力，其阻断小鼠PD-1与PD-L1结合的IC₅₀为约1.687nM(图17)。

3.8HUVEC细胞增殖测定

评估了W3256在VEGF诱导的HUVEC增殖中的生物学活性。HUVEC细胞常规在ECM+5％FBS+1％ECGS中培养。用胰蛋白酶收集近汇合的细胞，用ECM+1％FBS+0.05％ECGS稀释至1×10⁵细胞/mL。将细胞以5000个细胞/孔的密度接种在96孔透明底部黑色平板(Greiner，655090)中。加入系列稀释的抗体以及50ng/mL的人VEGF(WBP325-hPro1，Sino Biological，11066-HNAB)。将板放回培养箱中4天，然后使用CellTiter Glo(Promega，G7573)评估细胞活力。将不添加配体的孔用作配体刺激的细胞生长的对照。通过在减去背景(无配体)发光后，比较有或没有添加抗体(仅配体)的发光值，计算出测试抗体在抑制配体刺激的细胞生长上的效果。使用GraphPad Prism 5软件，使用四参数非线性回归分析来获得增殖抑制IC₅₀值。

W3256以浓度依赖性方式有效阻断VEGF诱导的HUVEC增殖，IC₅₀为约12nM，最大抑制率为101％(图18)。

3.9报告基因测定

通过胰蛋白酶收获常规培养的CHOK1-OKT3-PD-L1细胞，并以20000个细胞/孔的密度接种在96孔透明底部黑色平板(Greiner，655090)中。添加了系列稀释的抗体，以及整合了报告信号NFAT-RE-Luc2p和表达全长PD-1的Jurkat细胞。将平板放回培养箱中4小时，然后添加50μl One-glo荧光素酶测定缓冲液/底物混合物。在多孔板读数器M5e中测量发光。

W3256在报告基因测定中显示了功能(图19)，表明该抗体诱导PD-1信号传导途径。

3.10混合淋巴细胞反应(MLR)测定

使用MLR来测试PD-L1抗体对细胞因子、人IFN-γ分泌和活化的人CD4⁺T细胞增殖的激动作用。

使用Ficoll-Paque PLUS梯度离心从健康供体中新鲜分离出人外周血单核细胞(PBMC)。在补充有100U重组人IL-2(SL PHARM)的完全RPMI-1640(含10％FBS和1％PS)中培养分离的PBMC。使用人单核细胞富集试剂盒根据制造商的说明分离单核细胞。在补充有800U/ml重组人GM-CSF和50μg/ml IL-4的完全RPMI-1640培养基中，将细胞浓度调整为2×10⁶细胞/ml。将细胞培养5至7天以分化为树突细胞(DC)。每2-3天通过用补充有细胞因子的新鲜培养基替换一半培养基来补充细胞因子。在MLR前18至24小时，将1μg/ml LPS加入培养物中以诱导DC的成熟。根据制造商的方案使用人CD4⁺T细胞富集试剂盒分离人类CD4⁺T细胞。

使用完全RPMI-1640培养基在96孔圆底平板(Nunc，163320)中建立MLR。将CD4⁺T细胞、各种浓度的抗体和成熟的DC添加到平板中。将平板在37℃、5％CO₂孵育。在第5天测定IFN-γ的产生。

使用匹配的抗体对通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量人IFN-γ。将重组人IFN-γ(PeproTech，300-02)用作标准品。将平板预先包被对人IFN-γ具有特异性的捕获抗体(Pierce，M700A)。封闭后，将标准品或样品吸移到每个孔中，并在环境温度孵育2小时。除去未结合的物质后，将对IFN-γ具有特异性的缀合有生物素的检测抗体(Pierce，M701B)加入孔中并分别孵育1小时。然后将缀合有链霉亲和素的辣根过氧化物酶(HRP)(Invitrogen，SNN1004)添加至孔中，在环境温度孵育30分钟。通过加入TMB底物显色，然后用2M HCl终止。使用Microplate分光光度计在450和540nm读取吸光度。

图20显示了在混合淋巴细胞反应测定中抗体对hCD4⁺T细胞IFN-γ分泌的影响。结果表明，W3256在MLR中能以浓度依赖性方式诱导IFN-γ的分泌。

实施例4

体内抗肿瘤效果研究

4.1小鼠体内的药代动力学研究

从上海SLAC或BK Laboratory Co.,LTD.购买了雄性C57BL/6小鼠(6-8周，18-22g)，并在特定的无病原体条件下且可以自由获取食物和水的WuXi Biologics(中国上海)的动物设施中进行饲养。

在单次静脉内注射等摩尔浓度的W3256抗体后0、0.5、6、24、48、72、120、168小时收集雄性C57BL/6小鼠(n＝5)的血样。使用人IgG ELISA定量法和双抗原结合ELISA法测量血清抗体浓度。

根据总的IgG结合结果，通过静脉内注射路径以11.5mg/kg的剂量注射时，W3256的半衰期为129小时(图21)，在双抗原结合PK测定中，通过静脉内注射路径以11.5mg/kg的剂量注射时，W3256的半衰期为104个小时(图22)。

4.2PBMC-RKO小鼠模型的功效

在补充有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养基中，在37℃和5％CO₂条件下以单层培养形式体外维持RKO肿瘤细胞。通过胰蛋白酶-EDTA处理每周两次常规地将肿瘤细胞传代培养。收获在指数生长期生长的细胞并计数以进行肿瘤接种。

雌性NCG小鼠(6-10周龄)购自上海SLAC或Laboratory Co.,LTD.，并在特定的无病原体条件下且可以自由获取食物和水的WuXi Biologics(中国上海)的动物设施中进行饲养。

每只小鼠皮下接种含50％基质凝胶的0.2ml PBS中的RKO肿瘤细胞(2x 10⁶)以形成肿瘤，并在第0天腹膜内注射4x 10⁶个PBMC(Hemacare)。治疗从第7天开始。

主要终点是看是否能够延缓肿瘤生长或治愈小鼠。使用卡尺每周两次测量肿瘤大小，并使用以下公式以mm³表示体积：V＝0.5a x b²，其中a和b分别代表肿瘤的长直径和短直径。

提供每个时间点各组肿瘤体积的统计数据汇总，包括均值和均值的标准误(SEM)。各组之间肿瘤体积差异的统计分析和药物相互作用的分析是在最终剂量后(开始给药后第28天)的最佳治疗时间点获得的数据上进行的。进行双向ANOVA分析以比较各组之间的肿瘤体积，然后进行事后多重比较Dunnett的t检验(均与IgG组比较)。使用SPSS 17.0或Prism 5分析所有数据。p<0.05被认为具有统计学意义。

W3256显示了在NCG小鼠的PBMC-RKO结直肠癌模型中的抗肿瘤效果，显著优于W315-BMK8且与W325-BMK3可比(图23)。

本领域技术人员可以认识和理解本专利描述，在不脱离其本质或基本特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，其他变化应该被理解为在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。

序列表

<110> 甫康（上海）健康科技有限责任公司

<120> 一种双特异性抗PD-L1/VEGF抗体及其用途

<130> IDC216003

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1

<400> 1

Gly His Phe Ser Asn Leu Ala Val Asn

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2

<400> 2

Gly Ile Leu Trp Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3

<400> 3

Gly Thr Asn

1

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

<400> 4

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2

<400> 5

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys

1 5 10 15

Arg

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<400> 6

Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR1

<400> 7

Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2

<400> 8

Phe Thr Ser Ser Leu His Ser

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR3

<400> 9

Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 10

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly His Phe Ser Asn Leu Ala

20 25 30

Val Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala

35 40 45

Gly Ile Leu Trp Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asn Ala Glu Asn Met Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Thr Gly Thr Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 11

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH VEGF

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL VEGF

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

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130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

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290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

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450

<210> 14

<211> 335

<212> PRT

<213> LC

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly His Phe Ser Asn Leu Ala

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Val Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala

35 40 45

Gly Ile Leu Trp Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asn Ala Glu Asn Met Leu Tyr Leu

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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser

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Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

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Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys

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Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His

165 170 175

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

180 185 190

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

195 200 205

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Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

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Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

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Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

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Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

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Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

325 330 335

Claims (24)

1.一种双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含与VEGF抗原结合模块联合的PD-L1抗原结合模块，其中：

所述PD-L1抗原结合模块包含：

包含SEQ ID NO:1的互补决定区1(CDR1)、包含SEQ ID NO:2的CDR2、和包含SEQ ID NO:3的CDR3；和

所述VEGF抗原结合模块包含：

包含SEQ ID NO:4的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:5的HCDR2、包含SEQ IDNO:6的HCDR3、包含SEQ ID NO:7的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:8的LCDR2、以及包含SEQ ID NO:9的LCDR3。

2.权利要求1的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述抗PD-L1抗原结合模块包含可变域，该可变域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10至少85％、90％、或95％相同的氨基酸序列。

3.权利要求1或2的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述VEGF抗原结合模块包含：

重链可变域，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11至少85％、90％、或95％相同的氨基酸序列；和

轻链可变域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12至少85％、90％、或95％相同的氨基酸序列。

4.前述权利要求中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述PD-L1抗原结合模块融合于所述VEGF抗原结合模块的N末端。

5.前述权利要求中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述PD-L1抗原结合模块来自单域抗体(sdAb)，例如VHH抗体。

6.权利要求5的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述VHH衍生自骆驼科动物，包括羊驼(alpaca)和美洲驼(llama)。

7.权利要求5或6的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述PD-L1抗原结合模块可操作地连接于所述VEGF抗原结合模块的轻链或重链的N末端，任选地经由接头。

8.权利要求7的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述接头包含1至4个拷贝的GGGGS(G4S)或由其组成。

9.前述权利要求中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含重链和轻链，其中：

所述重链包含如VH-CH1-铰链-Fc中可操作连接的域，其中VH-CH1来自所述VEGF抗原结合模块；和

所述轻链包含如VHH-VL-CL中可操作连接的域，其中VHH来自所述PD-L1抗原结合模块且VL-CL来自所述VEGF抗原结合模块。

10.权利要求9的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述Fc区是人IgG Fc区，优选为人IgG1 Fc区。

11.前述权利要求中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中重链包含SEQ IDNO:13，且轻链包含SEQ ID NO:14。

12.前述权利要求中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述双特异性抗体是人源化抗体。

13.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-12中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分的核酸序列。

14.一种载体，其包含权利要求13的核酸分子。

15.一种宿主细胞，其包含权利要求13的核酸分子或权利要求14的载体。

16.一种药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分以及药学可接受的载体。

17.一种产生权利要求1-12中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分的方法，包括以下步骤：

-在权利要求15的宿主细胞中表达权利要求1-12中任一项的抗体或其抗原结合部分；和

-从该宿主细胞分离所述抗体或其抗原结合部分。

18.权利要求1-12中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于调控受试者中免疫应答的药物中的用途。

19.权利要求1-12中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于抑制受试者中肿瘤细胞生长的药物中的用途。

20.权利要求1-12中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于诊断、预防或治疗受试者中癌症的药物中的用途。

21.权利要求20的用途，其中所述癌症选自结肠癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、***、肾癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、***癌、食道癌、胃癌、淋巴瘤、黑素瘤、肝癌以及头颈癌。

22.权利要求20或21的用途，其中所述癌症为结肠癌或结直肠癌。

23.权利要求19-22中任一项的用途，其中所述双特异性抗体或其抗原结合部分与化疗剂、放疗和/或用于癌症免疫治疗的其他药剂组合施用。

24.一种试剂盒，其包含权利要求1-12中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分。

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