CN113209081B - 一种抑制具核梭杆菌生物膜形成的组合物在制备治疗口腔疾病药物中的应用 - Google Patents

一种抑制具核梭杆菌生物膜形成的组合物在制备治疗口腔疾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

具核梭杆菌(Fusobactrium nucleatum)是导致龋齿、牙周炎、牙髓炎、牙周‑牙髓联合病变及根尖炎的主要致病菌之一，并且具核梭杆菌除了会引起口腔疾病外，也能促进结直肠癌、不良妊娠结局、骨髓炎等疾病的发生。本发明公布了一种能够抑制具核梭杆菌生物膜形成的组合物，该组合物将生物膜抑制剂N‑(3‑环丁内酯)‑4‑溴苯丁酰胺与氟化钠联合使用，通过干扰群体感应减少生物膜的形成，从而降低细菌耐药性，达到防治多种口腔疾病的作用。

Description

一种抑制具核梭杆菌生物膜形成的组合物在制备治疗口腔疾 病药物中的应用
技术领域
本发明属于口腔微生物技术领域，具体涉及将生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺和氟化钠联合应用于抑制具核梭杆菌生物膜形成，及其在防治龋齿、牙周炎、种植牙周围炎和根尖炎等口腔疾病中的应用。
背景技术
具核梭杆菌（Fusobactrium nucleatum）是龈下致病菌群之一。研究发现，具核梭杆菌在牙菌斑生物膜的形成过程中起着重要作用，也是牙周炎的主要致病菌(Gholizadehet al., 2017)。研究发现，具核梭杆菌能够促进造成龋病的细菌和引起牙周疾病的细菌的共聚集反应(富饶等, 2005)。在牙菌斑生物膜的形成过程中，具核梭杆菌由于菌体细长，黏附能力强，因此可作为早期和晚期定植细菌的连接桥梁，能够促进口腔细菌的共聚(毛旭虎等, 2019)。具核梭杆菌是通过分解代谢氨基酸来产生能量，因此，它可以在牙周疾病中长期存在。同时，它的代谢产物为丁酸，可抑制牙龈细胞的增殖过程。具核梭杆菌还可以表达多种黏附素，如RadD等，这介导了细菌生物膜组织行为及其与宿主细胞的相互作用（KaplanCW, et al., 2010）。具核梭杆菌与其他细菌的共聚现象，在生物膜形成过程中发挥着至关重要的作用，大大增强了口腔细菌及其生物膜致病性。这种共聚作用受到QS***的调控，高水平的AIs能够刺激具核梭杆菌的生长，进而造成龈下菌斑的形成及成熟，从而导致牙周疾病。
具核梭杆菌也是导致牙周炎、牙髓炎、牙周-牙髓联合病变及根尖炎的主要致病菌之一(谢晓婷等, 2017)。此外，研究发现，具核梭杆菌除了会引起口腔疾病外，也能促进结直肠癌(Kostic et al., 2012)、不良妊娠结局(Han et al., 2004)、骨髓炎(Gregory etal., 2015)等疾病的发生。
本发明意外地发现，与单独使用生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺相比，将生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺与氟化钠联用组成的组合物具有更显著地抑制具核梭杆菌生物膜形成的效果。该组合物可以用于制备治疗龋齿、牙周炎、牙髓炎、牙周-牙髓联合病变及根尖炎以及降低结直肠癌、不良妊娠结局和骨髓炎等疾病发生的药物。
参考文献：
[1] Gholizadeh, P., Eslami, H., and Kafil, H. S. 2017. Carcinogenesismechanisms of Fusobacterium nucleatum. Biomed Pharmacother, 89: 918-925.
[2] 富饶, 李德懿. 2005. 牙周病和龋病致病菌的共聚及共聚抑制. 临床口腔医学杂志(01): 10-12.
[3] 毛旭虎, 童亚楠. 2019. 具核梭杆菌研究进展. 第三军医大学学报, 41(19): 1867-1872.
[4] Kaplan CW, Ma X, Paranjpe A, et al. 2010. Fusobacterium nucleatumouter membrane proteins Fap2 and RadD induce cell death in human lymphocytes.Infect Immun.Nov;78(11):4773-8.
[5] 谢晓婷, 王以玲, 肖水清. 2017. 具核梭杆菌的致病性与其可引起的口腔疾病. 中国医学创新, 14(10): 145-148.
[6] Kostic, A. D., Gevers, D., Pedamallu, C. S., et al. 2012. Genomicanalysis identifies association of Fusobacterium with colorectal carcinoma.Genome Res, 22(2): 292-298.
[7] Han, Y. W., Redline, R. W., Li, M., et al. 2004. Fusobacteriumnucleatum induces premature and term stillbirths in pregnant mice:implication of oral bacteria in preterm birth. Infect Immun, 72(4): 2272-2279.
[8] Gregory, S. W., Boyce, T. G., et al. 2015. Fusobacteriumnucleatum Osteomyelitis in 3 Previously Healthy Children: A Case Series andReview of the Literature. J Pediatric Infect Dis Soc, 4(4): e155-159.
发明内容
本发明的目的旨在提供一种抑制具核梭杆菌生物膜形成的组合物在制备治疗口腔疾病药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供了一种抑制具核梭杆菌生物膜形成的组合物，所 述组合物含有N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺和防龋齿化合物，所述的N-(3-环丁内酯）-4- 溴苯丁酰胺的结构式为
Figure 339298DEST_PATH_IMAGE001
。
所述的防龋齿化合物包括：①含氟化合物，包括氟化钠、氟化钾、氟化铝、氟化钙、单氟磷酸钠和氢氟酸十六胺等。②中药提取物，包括厚朴酚、丹皮酚、茶多酚、五倍子和蜂胶等。③生物活性物质，包括溶菌酶、葡聚糖酶等。优选的，所述的防龋齿化合物为氟化钠。
本发明的另一目的是提供所述组合物在制备治疗口腔疾病药物中的应用，其特征在于，所述的口腔疾病可以为龋齿、牙周炎、牙髓炎、牙周-牙髓联合病变及根尖炎。
本发明的另一目的是提供所述组合物在制备治疗口腔疾病药物中的应用，其特征在于，所述组合物作为牙膏、漱口水、消毒液、口腔喷雾或含片中的添加成分。
本发明的有益效果：本发明意外地发现，与单独使用生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺相比，将生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺与氟化钠联用组成的组合物具有更显著地抑制具核梭杆菌生物膜形成的效果。该组合物可以用于制备治疗龋齿、牙周炎、牙髓炎、牙周-牙髓联合病变及根尖炎以及降低结直肠癌、不良妊娠结局和骨髓炎等疾病发生的药物。
附图说明
图1不同浓度氟化钠对具核梭杆菌生物膜形成的影响
图2本发明的组合物对具核梭杆菌生物膜形成的影响
具体实施方式
实施例1 生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺与氟化钠联用对具核梭杆菌正常生长的影响
挑取已复苏的具核梭杆菌，接种到脑心浸液肉汤（Brain Heart Infusion Broth，BHI）液体培养基中培育24h后，用BHI培养基将菌液浓度稀释到2.0×107 CFU/mL。往具核梭杆菌菌液中加入终浓度为0.15%的氟化钠溶液，添加到96孔板内，150 μL /孔，以不含生物膜抑制剂的菌液（含有终浓度为0.1%的DMSO）作为对照组。将96孔板放置到厌氧培养袋中，于37℃培育24 h。培养结束后，使用酶标仪在600 nm处检测其OD值，每组做3个平行孔。
按照上述方法培养得到具核梭杆菌菌液，将生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺和氟化钠混合加入菌液中，其中生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺的终浓度为0、10 μM和100 μM，氟化钠的终浓度为0和0.15%，组合后的不同菌液添加到96孔板内，150 μL/孔，于37℃的恒温培养箱培育24h后，使用酶标仪检测600 nm处的OD值，测得不同浓度的生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺和氟化钠联用后对具核梭杆菌生长的影响。每组做3个平行孔。
数据采用mean ± SD表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
表1为生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺和氟化钠联用对具核梭杆菌生长的影响。从表1中可以看出，单独使用生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺对具核梭杆菌的生长没有抑制作用，并且与单独使用NaF相比，生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺与NaF联用后，对具核梭杆菌的抑菌率并没有提升。
表1. 本发明的组合物对具核梭杆菌生长的影响
Figure 76310DEST_PATH_IMAGE002
*：与正常组相比，P<0.05;NS: not significant (p>0.05; independent samplet-test)
实施例2生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺与氟化钠联用对具核梭杆菌生物膜形成的影响
按照实施例1的步骤培养具核梭杆菌，待培养结束后，将96孔板内的菌液吸掉，每孔加入280 μL无菌水洗涤2次，以除去游离的菌体，之后用干净的滤纸将孔内残留的液体吸干，往每孔中加入1%的结晶紫溶液150 μL，染色15min。染色结束后，将孔内的结晶紫溶液吸掉，加入280 μL无菌水洗涤3次，用干净的滤纸将孔内残留的液体吸干。向每孔中加入33%的乙酸溶液150 μL，溶解生物膜-结晶紫复合物后，用酶标仪检测经不同浓度生物膜抑制剂处理后细菌生物膜总生物量，每组做3个平行孔。
按照上述方法培养具核梭杆菌，待培养结束后，使用结晶紫染色方法处理，用酶标仪测定经不同浓度生物膜抑制剂和氟化钠联合处理后细菌生物膜总生物量，每组做3个平行孔。
数据采用mean±SD表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
从图1中可以看出，单独使用NaF时，NaF浓度的增加反而进一步促进了具核梭杆菌生物膜的形成。
从图2中可以看出，当生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺的浓度为10 μM，氟化钠浓度为0.10%时，对具核梭杆菌生物膜形成的抑制率达到53.49%；当生物膜抑制剂的浓度为100 μM，氟化钠浓度为0.15%时，对具核梭杆菌生物膜形成的抑制率达到56.49%，联用均显著高于单独使用NaF或单独使用生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺的抑菌率。因此，与单独使用生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺相比，联合应用生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺和NaF后，能显著提高对具核梭杆菌生物膜形成的抑制效果。
本发明发现生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺与NaF联合应用后，能显著提高生物膜抑制剂N-(3-环丁内酯）-4-溴苯丁酰胺对具核梭杆菌生物膜形成的抑制率。因此，本发明的组合物可以减缓具核梭杆菌的成膜效应并降低病原菌耐药性，可在一定程度上预防龋齿、牙周炎、牙髓炎、牙周-牙髓联合病变及根尖炎等口腔疾病，具有广阔的应用前景。

Claims (1)

1.一种组合物在制备抑制具核梭杆菌生物膜形成药物中的应用，其特征在于所述组合物含有质量比为1：46 .15～1：307 .69的N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺和氟化钠，N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺结构式为
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
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