CN113201457A - 一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法 - Google Patents

一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法，属于检测样品处理技术领域，包括如下步骤：(1)将动物胃组织置于处理液中，振荡，制得混悬液一；(2)取混悬液一置于液体培养基中，振荡，制得混悬液二；混悬液二用于平板涂布。处理液组成如下：氯化钠45～114mM，氯化钾1.7～4.7mM，氯化钙0.4～1.1mM，无水硫酸镁0.2～0.7mM，磷酸氢二钠0.12～0.31mM，磷酸二氢钾0.1～0.4mM，碳酸氢钠180～301mM，溶剂为水。本发明用于评价动物胃内是否成功定植幽门螺杆菌，结果判定快速、简便、确切、稳定、可靠。

Description

一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法
技术领域
本发明属于检测样品处理技术领域，具体涉及一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)位列于2017年世界卫生组织国际癌症研究机构公布的一类致癌物清单中，是由诺贝尔奖获得者罗宾.奥伦(J.Robin Warren)和巴利.马歇尔(Barry Marshall)在1983年从慢性胃炎和消化性溃疡患者的胃黏膜中分离培养获得。幽门螺杆菌属于螺杆菌科、螺杆菌属，呈弧形或螺旋形(亦有少数呈球形体)、单极、多鞭毛、末端钝圆，大小约为(2.5～4.0)μm×(0.5～1.0)μm，无荚膜、也无芽孢，革兰氏染色为阴性；其对生长条件十分苛刻，对环境氧、生长湿度、培养基等要求比较高。分离培养生长的幽门螺杆菌菌落形态似针尖样细小、圆形、灰白色略显透明、表面光滑湿润。
目前人用幽门螺杆菌疫苗还未上市，其开发需要必不可少的动物模型支撑的临床前研究。幽门螺杆菌临床前研究动物模型主要集中在鼠胃模型，自幽门螺杆菌悉尼菌株(Sydney Strain 1,SS1)在小鼠胃中成功定植以来，通过此模型来进行相关研究的报道已有很多。
通常评价动物胃中幽门螺杆菌的定植情况是通过平板培养来实现的(微生物鉴定的金标准为分离培养)，目前动物胃中幽门螺杆菌的培养鉴定方法有：(1)将解剖好的胃组织用生理盐水或PBS洗涤，后将胃组织直接涂抹于平板上；(2)将解剖好的胃组织放入生理盐水或培养基中，采用匀浆器进行组织匀浆，后取匀浆液或对匀浆液进行稀释后进行涂平板。上述培养方法鉴定幽门螺杆菌存在漏检，且动物胃中杂菌多，在培养后的平板上不易通过肉眼直接鉴别出幽门螺杆菌；同时，由于杂菌的存在，易将杂菌鉴定为幽门螺杆菌。上述问题会造成动物胃中幽门螺杆菌定植情况鉴定结果呈假阴性或假阳性，不利于快速、确切评价是否定植成功幽门螺杆菌。因此，开发出简便、直观、稳定的检测动物胃中幽门螺杆菌的方法是进一步研究幽门螺杆菌相关药物的前提。
发明内容
本发明公开了一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法，可大大降低检测中杂菌的存活，使幽门螺杆菌定植结果判定更为确切、稳定。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于幽门螺杆菌培养检测前处理的处理液，该处理液组成如下：
氯化钠45～114mM，氯化钾1.7～4.7mM，氯化钙0.4～1.1mM，无水硫酸镁0.2～0.7mM，磷酸氢二钠0.12～0.31mM，磷酸二氢钾0.1～0.4mM，碳酸氢钠180～301mM，溶剂为水。
优选地，处理液组成如下：
氯化钠102～108.8mM，氯化钾4～4.3mM，氯化钙0.9～1.0mM，无水硫酸镁0.6mM，磷酸氢二钠0.3mM，磷酸二氢钾0.3mM，碳酸氢钠181.7～226.2mM，溶剂为水。
一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法，包括如下步骤：
(1)将动物胃组织置于上述处理液中，振荡，制得混悬液一；
(2)取混悬液一置于液体培养基中，振荡，制得混悬液二；所述混悬液二用于平板涂布。
优选地，步骤(1)中每克动物胃组织所用处理液用量为0.9～1.7mL。
优选地，步骤(1)中所述振荡为2000～6000r/min处理2～3min；
步骤(2)中所述振荡为2000～6000r/min处理5～10s。
进一步优选地，步骤(1)(2)中振荡速度为3000～3500r/min。
优选地，步骤(2)中混悬液一与液体培养基体积比为1：(9-25)。
优选地，动物包括Balb/c小鼠、C57小鼠、沙鼠或SD大鼠。
优选地，取混悬液二10～200μL涂布于改良型Skirrow平板，在三气培养箱中培养3～7天；对改良型Skirrow平板培养结果进行菌落形态、快速尿素酶实验及快速革兰氏染色镜检鉴定实验，判定其定植是否成功，鉴定实验方法可参考文献(Kai Y,Liu,Fang C,Du,etal.Efficacy andpharmacological mechanism ofpronase-enhanced low-doseantibiotics for Helicobacterpylori eradication.Antimicrobial agents andchemotherapy,2014,58(6):3348-3353)。
综上所述，通过本发明方法对感染幽门螺杆菌的动物进行定植检测，可大大降低平板中杂菌的存活，使幽门螺杆菌平板培养近乎纯培养，降低根据培养平板鉴定幽门螺杆菌的难度，降低平板培养检测的假阳性或假阴性，使鉴定结果更确切、稳定，同时节约鉴定所需时间，有利于通过大批量动物进行幽门螺杆菌相关研究或药物开发，为直观、客观评价幽门螺杆菌定植提供了新的方法。
附图说明
图1所示为Balb/c小鼠胃幽门螺杆菌检测经前处理后平板培养结果；
图2所示为编号2-1的Balb/c小鼠胃幽门螺杆菌检测经前处理后平板培养结果；
图3所示为Balb/c小鼠胃幽门螺杆菌检测不经前处理平板培养结果；
图4所示为编号4-1的Balb/c小鼠胃幽门螺杆菌检测不经前处理后平板培养结果；
图5所示为蒙古沙鼠胃幽门螺杆菌检测经前处理后平板培养结果；
图6所示为编号B-1的蒙古沙鼠胃幽门螺杆菌检测经前处理后平板培养结果；
图7所示为蒙古沙鼠胃幽门螺杆菌检测不经前处理平板培养结果；
图8所示为编号D-1的蒙古沙鼠胃幽门螺杆菌检测不经前处理后平板培养结果；
图9所示为SD大鼠胃幽门螺杆菌检测经前处理后平板培养结果；
图10所示为编号II-1的SD大鼠胃幽门螺杆菌检测经前处理后平板培养结果；
图11所示为SD大鼠胃幽门螺杆菌检测不经前处理平板培养结果；
图12所示为编号IV-1的SD大鼠胃幽门螺杆菌检测不经前处理后平板培养结果；
图13所示为图2、4、6、8、10、12局部放大图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1.实验材料
幽门螺杆菌悉尼菌株SS1由中国食品药品检定研究院提供，其余试剂及材料均为市售。
改良型Skirrow液体培养基组成为氯化钠0.5％，胰蛋白胨0.25％，
Figure BDA0003033762700000051
蛋白胨1.5％，酵母提取物0.5％，葡萄糖0.6％，胎牛血清12mL/100mL，万古霉素0.5mg/100mL，多粘菌素0.019mg/100mL，磺胺增效剂0.25mg/100mL，两性霉素B 0.1mg/100mL。
改良型Skirrow平板培养基组成为氯化钠0.5％，胰蛋白胨0.25％，
Figure BDA0003033762700000052
蛋白胨1.5％，酵母提取物0.5％，琼脂粉1.75％，葡萄糖0.6％，脱纤维绵羊血5mL/100mL，万古霉素0.5mg/100mL，多粘菌素0.019mg/100mL，磺胺增效剂0.25mg/100mL，两性霉素B 0.1mg/100mL。
SK液体培养基组成为
Figure BDA0003033762700000053
蛋白胨1.5％，胰蛋白胨0.25％，酵母提取物0.5％，氯化钠0.5％，溶剂为水。
2.实验方法
鼠饲养条件均为：普通级环境中饲养，温度为22±4℃，湿度为55±10％，一周换1次垫料，每日光照为12小时白昼交替，24小时换气通风，每周定期对环境消毒，饲料为常规饲料，水为纯水仪制备后经高压灭菌获得，自由进食进水。鼠自购买后随机分组，10只/笼。过渡饲养1天以上进行感染实验。
幽门螺杆菌培养采用三气培养箱，培养条件为5％氧气、85％氮气、10％二氧化碳，培养温度为37℃。
感染前对幽门螺杆菌进行液体复苏培养，从-80℃冰箱中取出幽门螺杆菌SS1菌株接种于改良型Skirrow液体培养基中，后在三气培养箱中培养24～48h，培养转速为250rpm。
在感染前24h给鼠断食断水；用生理盐水将幽门螺杆菌SS1菌液感染浓度调整为1×109CFU/mL，0.4mL/只口服灌胃感染鼠，感染后2h恢复食水。将经感染后鼠饲养4周；宰杀前，将鼠断食断水24h。在不违背动物伦理道德下，对鼠进行颈椎脱臼处死；用75％酒精棉球对鼠腹部进行擦拭消毒，用手术剪剪开鼠腹腔，将胃取出；将鼠全胃沿胃大弯剪开，并剪碎，用于进行实施例及对比例培养检测前处理，并培养检测。
幽门螺杆菌定植判定标准：当改良型Skirrow平板上有一个或者一个以上的菌落生长时，进行菌落形态鉴定、快速尿素酶实验、快速革兰氏染色镜检。当菌落形态鉴定和快速尿素酶实验均为阳性或快速革兰氏染色镜检阳性，则判定该菌落为幽门螺杆菌，同时判定幽门螺杆菌在动物胃内感染定植成功；当菌落形态鉴定和快速尿素酶实验均为阴性或快速革兰氏染色镜检阴性，则判定该菌落不是幽门螺杆菌，同时判定幽门螺杆菌在动物胃内感染定植不成功。
具体地，菌落形态鉴定标准：将平板上生长出直径为0.1mm～0.5mm、呈透明针尖样大小的特征性菌落判定为幽门螺杆菌阳性，用“+”号表示；在平板上没有长出或者不是上述形态的菌落时，则判定为幽门螺杆菌阴性，用“-”号表示；当平板上长出疑似幽门螺杆菌菌落形态的菌时，用“*”表示。
快速尿素酶实验鉴定标准：在平板菌落上滴上适量尿素酶溶液，菌落若变为红色，即此菌落尿素触酶阳性，此菌落则被判定为幽门螺杆菌阳性，用“+”号表示；若菌落尿素触酶反应不变为红色或不变色时，则判定此菌落为幽门螺杆菌阴性，用“-”号表示；当菌落尿素触酶反应颜色变为红色不明显时，则判定此菌落为疑似幽门螺杆菌，用“*”表示；若未进行此项检测，用“/”号表示。
快速革兰氏染色镜检鉴定标准：对菌落形态、快速尿素酶实验存疑时进行镜检，镜检标准：菌为紫色，形态为螺旋形弯曲、末端钝圆时，则判定此菌落中含有幽门螺旋杆菌，用“+”号表示；反之，若镜检菌不为紫色，且形态没有螺旋形弯曲、末端钝圆时，则判定为幽门螺杆菌阴性，用“-”号表示；若未进行此项检测，用“/”号表示。
实施例1
6周龄雌性Balb/c小鼠，14只，随机分为7组，每组2只，口服灌胃幽门螺杆菌SS1进行感染。
宰杀前配制处理液，各组处理液组成如下：
第一组：氯化钠108.8mM，氯化钾4.3mM，氯化钙1.0mM，无水硫酸镁0.6mM，磷酸氢二钠0.3mM，磷酸二氢钾0.3mM，碳酸氢钠596.5mM，溶剂为水。小鼠编号为①-1、①-2。
第二组：氯化钠108.8mM，氯化钾4.3mM，氯化钙1.0mM，无水硫酸镁0.6mM，磷酸氢二钠0.3mM，磷酸二氢钾0.3mM，碳酸氢钠448.4mM，溶剂为水。小鼠编号为①-3、①-4。
第三组：氯化钠108.8mM，氯化钾4.3mM，氯化钙1.0mM，无水硫酸镁0.6mM，磷酸氢二钠0.3mM，磷酸二氢钾0.3mM，碳酸氢钠300.3mM，溶剂为水。小鼠编号为①-5、①-6。
第四组：氯化钠108.8mM，氯化钾4.3mM，氯化钙1.0mM，无水硫酸镁0.6mM，磷酸氢二钠0.3mM，磷酸二氢钾0.3mM，碳酸氢钠226.0mM，溶剂为水。小鼠编号为①-7、①-8。
第五组：氯化钠108.8mM，氯化钾4.3mM，氯化钙1.0mM，无水硫酸镁0.6mM，磷酸氢二钠0.3mM，磷酸二氢钾0.3mM，碳酸氢钠181.7mM，溶剂为水。小鼠编号为①-9、①-10。
第六组：氯化钠108.8mM，氯化钾4.3mM，氯化钙1.0mM，无水硫酸镁0.6mM，磷酸氢二钠0.3mM，磷酸二氢钾0.3mM，碳酸氢钠152.1mM，溶剂为水。小鼠编号为①-11、①-12。
将小鼠全胃组织(0.25g左右)剪碎放入0.4mL处理液中，在室温、3000r/min的条件下振荡2min，振荡后获得混悬液一。吸取混悬液一50μL于0.75mL SK液体培养基中，3000r/min振荡5s，振荡后获得混悬液二。取混悬液二50μL涂布于改良型Skirrow平板，每只鼠涂布2块平板。将涂布混悬液二的改良型Skirrow平板在三气培养箱中培养4天。
Balb/c小鼠胃内幽门螺杆菌定植判定结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003033762700000081
第一组(①-1和①-2)、第二组(①-3和①-4)中平板上未生长出任何细菌，即胃内细菌均被处理液杀死，即处理液对胃酸缓冲较强，悬浮液一呈碱性，即碳酸氢钠含量过高。第六组(①-11和①-12)中平板上生长出菌落过多(相比第五组)，不易快速鉴别出，即胃内杂菌未被处理液充分杀死，即处理液对胃酸缓冲较弱，悬浮液一呈酸性，即碳酸氢钠含量过低。第三组(①-5和①-6)、第四组(①-7和①-8)、第五组(①-9和①-10)中平板上生长出的杂菌较少，幽门螺杆菌能从平板上鉴别出，即胃内杂菌部分被缓冲液杀死，即处理液对胃酸缓冲较适中，即悬浮液一呈中性或者弱碱性。其中，第三组和第四组中平板上生长出的杂菌比第五组少，同时悬浮液一呈弱碱性。
实施例2
6周龄雌性Balb/c小鼠，10只，随机分为5组，每组2只，口服灌胃幽门螺杆菌SS1进行感染。
宰杀前配制处理液，处理液组成如下：氯化钠108.8mM，氯化钾4.3mM，氯化钙1.0mM，无水硫酸镁0.6mM，磷酸氢二钠0.3mM，磷酸二氢钾0.3mM，碳酸氢钠181.8mM，溶剂为水。
将小鼠全胃组织剪碎放入0.4mL处理液中，在室温、3000r/min的条件下振荡2min，振荡后获得混悬液一。吸取混悬液一50μL于不同体积的SK液体培养基中，3000r/min振荡5s，振荡后获得混悬液二。取混悬液二50μL涂布于改良型Skirrow平板，每只鼠涂布2块平板。将涂布混悬液二的改良型Skirrow平板在三气培养箱中培养4天。
不同体积的SK液体如下：
第一组SK液体体积为150μL，小鼠编号为②-1、②-2。
第二组SK液体体积为300μL，小鼠编号为②-3、②-4。
第三组SK液体体积为450μL，小鼠编号为②-5、②-6。
第四组SK液体体积为600μL，小鼠编号为②-7、②-8。
第五组SK液体体积为750μL，小鼠编号为②-9、②-10。
Balb/c小内幽门螺杆菌定植判定结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003033762700000101
第一组(②-1、②-2)、第二组(②-3、②-4)中平板生长杂菌较多，幽门螺杆菌不易从平板上鉴别出，即SK液体体积过少。第四组(②-7、②-8)、第五组(②-9、②-10)中平板生长杂菌较少，幽门螺杆菌易从平板上鉴别出，但平板上幽门螺杆菌生长出的菌落数比第三组少。
实施例3
6周龄雌性Balb/c小鼠，8只，随机分为4组，每组2只，口服灌胃幽门螺杆菌SS1进行感染。
宰杀前配制处理液，处理液组成如下：氯化钠108.8mM，氯化钾4.3mM，氯化钙1.0mM，无水硫酸镁0.6mM，磷酸氢二钠0.3mM，磷酸二氢钾0.3mM，碳酸氢钠181.8mM，溶剂为水。
将小鼠全胃组织剪碎放入0.4mL处理液中，在室温、3000r/min的条件下进行第一次振荡，振荡后获得混悬液一。吸取混悬液一50μL于0.45mL的SK液体培养基中，3000r/min振荡，第二次振荡后获得混悬液二。取混悬液二50μL涂布于改良型Skirrow平板，每只鼠涂布2块平板。将涂布混悬液二的改良型Skirrow平板在三气培养箱中培养4天。
不同振荡时间如下：
第一组第一次振荡时间为1min，第二次振荡时间为5s，小鼠编号为③-1、③-2。
第二组第一次振荡时间为3min，第二次振荡时间为10s，小鼠编号为③-3、③-4。
第三组第一次振荡时间为4min，第二次振荡时间为15s，小鼠编号为③-5、③-6。
第四组第一次振荡时间为5min，第二次振荡时间为20s，小鼠编号为③-7、③-8。Balb/c小内幽门螺杆菌定植判定结果如表3所示。
表3
Figure BDA0003033762700000111
第三组(③-5、③-6)和第四组(③-7、③-8)中平板上无菌落生长，即第一次和第二次振荡时间过长，造成幽门螺杆菌和其它杂菌的损失。第一组(③-1、③-2)中平板上菌落生长较多，但幽门螺杆菌在平板上生长菌落数较少，由于幽门螺杆菌在胃内生长于胃粘膜下，即振荡时间过短，幽门螺杆菌未从胃粘膜层释放出来。
实施例4
6周龄雌性Balb/c小鼠，20只，随机分为2组，口服灌胃幽门螺杆菌SS1进行感染。
宰杀前配制处理液，处理液组成如下：氯化钠108.8mM，氯化钾4.3mM，氯化钙1.0mM，无水硫酸镁0.6mM，磷酸氢二钠0.3mM，磷酸二氢钾0.3mM，碳酸氢钠181.8mM，溶剂为水。
将小鼠全胃组织剪碎放入0.4mL处理液中，在室温、3000r/min的条件下振荡3min，振荡后获得混悬液一。吸取混悬液一50μL于0.45mL SK液体培养基中，3000r/min振荡10s，振荡后获得混悬液二。取混悬液二50μL涂布于改良型Skirrow平板，每只鼠涂布2块平板。将涂布混悬液二的改良型Skirrow平板在三气培养箱中培养4天。
Balb/c小鼠胃内幽门螺杆菌平板培养结果如图1所示，其中，编号2-1的Balb/c小鼠胃内幽门螺杆菌平板培养结果如图2所示。
Balb/c小鼠胃内幽门螺杆菌定植判定结果如表4、5所示。
表4
Figure BDA0003033762700000121
表5
Figure BDA0003033762700000122
由于采用检测前处理方法，杂菌较少，能直接从培养平板进行幽门螺杆菌菌落形态鉴定和快速尿素酶实验，且结果均为阳性，故未进行快速革兰氏染色镜检。根据培养平板幽门螺杆菌菌落形态学和尿素触酶结果，判定Balb/c小鼠胃内幽门螺杆菌定植均成功，成功率为100％。
对比例1
6周龄雌性Balb/c小鼠，20只，随机分为2组，口服灌胃幽门螺杆菌SS1进行感染。
将小鼠全胃组织剪碎放入0.4mL生理盐水中，在室温振荡10s，振荡后获得混悬液三。取混悬液三50μL涂布于改良型Skirrow平板，每只鼠涂布2块平板。将涂布混悬液三的改良型Skirrow平板在三气培养箱中培养4天。
Balb/c小鼠胃内幽门螺杆菌平板培养结果如图3所示，其中编号4-1的Balb/c小鼠胃内幽门螺杆菌平板培养结果如图4所示。
Balb/c小鼠胃内幽门螺杆菌定植鉴定结果如表6、7所示。
表6
Figure BDA0003033762700000131
表7
Figure BDA0003033762700000132
由于未采用检测前处理方法，培养平板上生长菌落很多，几乎都为杂菌，从培养平板进行幽门螺杆菌菌落形态鉴定很困难且耗时长，同时快速尿素酶实验受杂菌干扰，尿素酶溶液变为黄色或变色不明显，其结果疑似幽门螺杆菌菌落占大多数。从疑似幽门螺杆菌菌落挑取数十个进行细菌快速革兰氏染色镜检。根据培养平板上菌落形态、快速尿素酶实验、细菌快速革兰氏染色镜检结果，判定Balb/c小鼠胃内幽门螺杆菌定植是否成功，成功率为50％。
实施例5
6周龄雌性蒙古沙鼠，20只，随机分为2组，口服灌胃幽门螺杆菌SS1进行感染。
宰杀前配制处理液，处理液组成如下：氯化钠108.8mM，氯化钾4.3mM，氯化钙1.0mM，无水硫酸镁0.6mM，磷酸氢二钠0.3mM，磷酸二氢钾0.3mM，碳酸氢钠181.8mM，溶剂为水。
将蒙古沙鼠全胃组织(0.5g左右)剪碎放入0.6mL处理液中，在室温、3500r/min的条件下振荡3min，振荡后获得混悬液一。吸取混悬液一75μL于0.675mL SK液体培养基中，振荡10s，振荡后获得混悬液二。取混悬液二75μL涂布于改良型Skirrow平板，每只鼠涂布2块平板。将涂布混悬液二的改良型Skirrow平板在三气培养箱中培养4天。
蒙古沙鼠胃内幽门螺杆菌平板培养结果如图5所示，其中，编号B-1的蒙古沙鼠胃内幽门螺杆菌平板培养结果如图6所示。
蒙古沙鼠胃内幽门螺杆菌定植检测判定如表8、9所示。
表8
Figure BDA0003033762700000141
表9
Figure BDA0003033762700000151
由于采用检测前处理方法，杂菌较少，能直接从培养平板进行幽门螺杆菌菌落形态鉴定和快速尿素酶实验，且结果均为阳性，故未进行快速革兰氏染色镜检。根据培养平板幽门螺杆菌菌落形态和尿素触酶结果，判定蒙古沙鼠胃内幽门螺杆菌定植均成功，成功率为100％。
对比例2
6周龄蒙古沙鼠，20只，随机分为2组，口服灌胃幽门螺杆菌SS1进行感染。
将蒙古沙鼠全胃组织剪碎放入0.6mL生理盐水中，在室温振荡10s，振荡后获得混悬液三。取混悬液三75μL涂布于改良型Skirrow平板，每只鼠涂布2块平板。将涂布混悬液三的改良型Skirrow平板在三气培养箱中培养4天。
蒙古沙鼠胃内幽门螺杆菌平板培养结果如图7所示，其中，编号D-1的蒙古沙鼠胃内幽门螺杆菌平板培养结果如图8所示。
蒙古沙内幽门螺杆菌定植鉴定结果如表10、11所示。
表10
Figure BDA0003033762700000152
Figure BDA0003033762700000161
表11
Figure BDA0003033762700000162
由于未采用检测前处理方法，培养平板上生长菌落很多，几乎都为杂菌，从培养平板进行幽门螺杆菌菌落形态学鉴定很困难且耗时长，同时快速尿素酶实验受杂菌干扰，尿素酶溶液变为黄色或变色不明显，其结果疑似幽门螺杆菌菌落占大多数。从疑似幽门螺杆菌菌落挑取数十个进行细菌快速革兰氏染色镜检。根据培养平板上菌落形态、快速尿素酶实验、细菌快速革兰氏染色镜检结果，判定蒙古沙鼠胃内幽门螺杆菌定植是否成功，成功率为70％。
实施例6
6周龄SD大鼠，20只，随机分为2组，口服灌胃幽门螺杆菌SS1进行感染。
宰杀前配制处理液，处理液组成如下：氯化钠102mM，氯化钾4mM，氯化钙0.9mM，无水硫酸镁0.6mM，磷酸氢二钠0.3mM，磷酸二氢钾0.3mM，碳酸氢钠226.2mM，溶剂为水。
将SD大鼠全胃组织(1g左右)剪碎放入1mL处理液中，在室温、4000r/min的条件下振荡3min，振荡后获得混悬液一。吸取混悬液一100μL于0.9mL SK液体培养基中，振荡10s，振荡后获得混悬液二。取混悬液二100μL涂布于改良型Skirrow平板，每只鼠涂布2块平板。将涂布混悬液二的改良型Skirrow平板在三气培养箱中培养4天。
SD大鼠胃内幽门螺杆菌平板培养结果如图9所示，其中编号II-1的SD大鼠胃内幽门螺杆菌平板培养结果如图10所示。
SD大鼠胃内幽门螺杆菌定植检测判定如表12、13所示。
表12
Figure BDA0003033762700000171
表13
Figure BDA0003033762700000172
由于采用检测前处理方法，杂菌较少，能直接从培养平板进行幽门螺杆菌菌落形态鉴定和快速尿素酶实验，且结果均为阳性，故未进行快速革兰氏染色镜检。根据培养平板幽门螺杆菌菌落形态和尿素触酶结果，判定SD大鼠胃内幽门螺杆菌定植均成功，成功率为100％。
对比例3
6周龄SD大鼠，20只，随机分为2组，口服灌胃幽门螺杆菌SS1进行感染。
将剪碎SD大鼠全胃组织放入1mL生理盐水中，在室温振荡10s，此振荡后液体为混悬液三。取混悬液三100μL涂布于改良型Skirrow平板，每只鼠涂布2块平板。将涂布混悬液三的改良型Skirrow平板在三气培养箱中培养4天。
SD大鼠胃内幽门螺杆菌平板培养结果如图11所示，其中，编号IV-1的SD大鼠胃内幽门螺杆菌平板培养结果如图12所示。
SD大内幽门螺杆菌定植鉴定结果如表14、15所示。
表14
Figure BDA0003033762700000181
表15
Figure BDA0003033762700000182
由于未采用检测前处理方法，培养平板上生长菌落很多，几乎都为杂菌，从培养平板进行幽门螺杆菌菌落形态鉴定很困难且耗时长，同时快速尿素酶实验受杂菌干扰，尿素酶溶液变为黄色或变色不明显，其结果疑似幽门螺杆菌菌落占大多数。从疑似幽门螺杆菌菌落挑取数十个进行快速革兰氏染色镜检。根据培养平板上菌落形态、快速尿素酶实验、细菌快速革兰氏染色镜检结果，判定SD大鼠胃内幽门螺杆菌定植是否成功，成功率为40％。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种用于幽门螺杆菌培养检测前处理的处理液，其特征在于，所述处理液组成如下：
氯化钠45～114mM，氯化钾1.7～4.7mM，氯化钙0.4～1.1mM，无水硫酸镁0.2～0.7mM，磷酸氢二钠0.12～0.31mM，磷酸二氢钾0.1～0.4mM，碳酸氢钠180～301mM，溶剂为水。
2.一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将动物胃组织置于权利要求1所述处理液中，振荡，制得混悬液一；
(2)取混悬液一置于液体培养基中，振荡，制得混悬液二；所述混悬液二用于平板涂布。
3.根据权利要求2所述的一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法，其特征在于，
步骤(1)中每克动物胃组织所用处理液用量为0.9～1.7mL。
4.根据权利要求2所述的一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法，其特征在于，
步骤(1)中所述振荡为2000～6000r/min处理2～3min；
步骤(2)中所述振荡为2000～6000r/min处理5～10s。
5.根据权利要求2所述的一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法，其特征在于，
步骤(2)中混悬液一与液体培养基体积比为1：(9-25)。
6.根据权利要求2所述的一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法，其特征在于，
所述动物包括Balb/c小鼠、C57小鼠、沙鼠或SD大鼠。
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Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2182805A1 (en) * 1994-12-13 1996-06-20 Welfide Corporation Helicobacter pylori-colonized mongolian gerbil, process for preparation thereof, medium for separating helicobacter pylori, and method of screening anti-helicobacter pylori-activesubstance by using the same
WO2001088183A2 (en) * 2000-05-18 2001-11-22 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Method for the isolation of helicobacter pylori
WO2002045727A1 (en) * 2000-12-08 2002-06-13 Plbio Co., Ltd. Lactic acid bacteria inhibiting adhesion of helicobacter pylori to gastric mucosa
US7235397B1 (en) * 2000-04-14 2007-06-26 Gensys, Inc. Methods and compositions for culturing spirochete and treating spirochetal diseases
CN101911930A (zh) * 2010-08-20 2010-12-15 温州医学院 一种用于胃活检组织标本幽门螺杆菌培养用运送液及其制备方法和应用
CN103436468A (zh) * 2013-08-11 2013-12-11 杭州致远医学检验所有限公司 一种幽门螺杆菌快速生长添加剂及其制备方法
CN104561241A (zh) * 2015-01-09 2015-04-29 天津市宝坻区人民医院 胃液幽门螺旋杆菌感染检测方法
CN105602849A (zh) * 2014-09-05 2016-05-25 杭州致远医学检验所有限公司 幽门螺杆菌分离培养的样本组织的专用保存、运输培养基
RU2642588C1 (ru) * 2017-03-14 2018-01-25 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Вятский государственный университет" Иммунохроматографическая тест-система для выявления патогенных штаммов helicobacter pylori
US20200268769A1 (en) * 2016-01-21 2020-08-27 Dexcel Pharma Technologies Ltd. Methods for treating helicobacter infection
CN113425717A (zh) * 2021-04-22 2021-09-24 成都欧林生物科技股份有限公司 一种提高口服幽门螺杆菌疫苗效力的药剂及其应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2182805A1 (en) * 1994-12-13 1996-06-20 Welfide Corporation Helicobacter pylori-colonized mongolian gerbil, process for preparation thereof, medium for separating helicobacter pylori, and method of screening anti-helicobacter pylori-activesubstance by using the same
US7235397B1 (en) * 2000-04-14 2007-06-26 Gensys, Inc. Methods and compositions for culturing spirochete and treating spirochetal diseases
WO2001088183A2 (en) * 2000-05-18 2001-11-22 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Method for the isolation of helicobacter pylori
WO2002045727A1 (en) * 2000-12-08 2002-06-13 Plbio Co., Ltd. Lactic acid bacteria inhibiting adhesion of helicobacter pylori to gastric mucosa
CN101911930A (zh) * 2010-08-20 2010-12-15 温州医学院 一种用于胃活检组织标本幽门螺杆菌培养用运送液及其制备方法和应用
CN103436468A (zh) * 2013-08-11 2013-12-11 杭州致远医学检验所有限公司 一种幽门螺杆菌快速生长添加剂及其制备方法
CN105602849A (zh) * 2014-09-05 2016-05-25 杭州致远医学检验所有限公司 幽门螺杆菌分离培养的样本组织的专用保存、运输培养基
CN104561241A (zh) * 2015-01-09 2015-04-29 天津市宝坻区人民医院 胃液幽门螺旋杆菌感染检测方法
US20200268769A1 (en) * 2016-01-21 2020-08-27 Dexcel Pharma Technologies Ltd. Methods for treating helicobacter infection
RU2642588C1 (ru) * 2017-03-14 2018-01-25 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Вятский государственный университет" Иммунохроматографическая тест-система для выявления патогенных штаммов helicobacter pylori
CN113425717A (zh) * 2021-04-22 2021-09-24 成都欧林生物科技股份有限公司 一种提高口服幽门螺杆菌疫苗效力的药剂及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUWAHARA, H等: "Helicobacter pylori urease suppresses bactericidal activity of peroxynitrite via carbon dioxide production", 《INFECTION AND IMMUNITY》 *
郭刚等: "幽门螺杆菌沙鼠感染模型的定量分析研究", 《第三军医大学学报》 *
陈洁等: "外膜蛋白疫苗对幽门螺杆菌感染的免疫保护作用", 《胃肠病学》 *

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