CN113194948A - Il-31介导性疾病的预防或治疗剂及医药组合物 - Google Patents

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坂田大治
宇留野武人
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Abstract

一种IL‑31介导性疾病的预防或治疗剂，其包含神经激肽B信号阻断剂。

Description

IL-31介导性疾病的预防或治疗剂及医药组合物
技术领域
本发明涉及一种IL-31介导性疾病的预防或治疗剂及医药组合物。
本申请基于在2018年11月15日在日本申请的日本特愿2018-215017号及在2019年8月6日在日本申请的日本特愿2019-144913号要求优先权，并且将它们的内容援引于此。
背景技术
白细胞介素-31(IL-31)是在各种的人组织中表达的细胞因子，并且有报道显示其与特应性皮炎等慢性皮肤瘙痒症有关联(例如参照非专利文献1及2)。
特应性皮炎是有痒感的湿疹反复加重和减轻的慢性疾病。其患者大多对变应原的反应亢进。近年来，特应性皮炎的患者数增加，并且特应性皮炎明显损害患者的生活质量，因此开发特应性皮炎的治疗方法成为当务之急。
进而，若对小鼠的皮内施用IL-31，则引起抓挠行为。小鼠的抓挠行为可以作为特应性皮炎的、由痒感引起的抓挠行为的模型进行利用。
已知特应性皮炎的重症度与血清IL-31的水平相关。另外，有报道显示抗IL-31受体抗体的施用可抑制特应性皮炎的痒感。基于这些见解，认为在特应性皮炎中引起痒感的原因物质是IL-31。
另外，也有报道显示：IL-31除诱发瘙痒外还诱导其他炎症性细胞因子的表达，从而介导各种疾病的病态。作为IL-31介导的疾病，报道有特应性皮炎、特应性皮炎的瘙痒症、皮肌炎、皮肌炎的瘙痒症、慢性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎、皮肤T细胞淋巴瘤的瘙痒症、结节性痒疹、慢性多形性痒疹、色素性荨麻疹及大疱性类天疱疮等(例如参照非专利文献1～8)。据报道，皮肌炎是伴有皮疹的自身免疫性的炎症性肌疾病，皮肤症状的重症度和痒感相关，在伴有痒感的病变皮肤中，IL-31及IL-31受体的表达亢进(非专利文献3)。皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T cell lymphoma；CTCL)是在皮肤中产生的恶性淋巴瘤的一组，是肿瘤的源性细胞为T细胞的疾病。据报道，在CTCL中，疾病的发展程度及瘙痒症的重症度与病变皮肤中的IL-31及IL-31受体的表达量及血清IL-31的水平相关(非专利文献4)。据报道，就结节性痒疹及过敏性接触性皮炎而言，在皮肤组织中确认到IL-31的表达亢进(非专利文献5及6)，另外，就色素性荨麻疹而言，血清IL-31水平与疾病重症度及瘙痒症相关(非专利文献7)。而且，据报道，在疱疹样皮炎患者及大疱性类天疱疮患者中，血清及组织中的IL-31水平增加，并且在这些患者的病变部位的皮肤组织中确认到许多IL-31阳性细胞(非专利文献8)。
发明人以前已经明确了如下内容：在胞质***蛋白8(Dock8)基因缺损、转入重排的T细胞受体(TCR)的转基因小鼠中，来自CD4+T细胞的IL-31的产生亢进(例如参照非专利文献9)。
此处，作为重排的TCR，可以利用AND。AND是与MHC II类I-Eκ分子形成了复合体的、识别由moth cytochrome(MCC)的第88位～103位氨基酸构成的肽(序列号1)的TCR。另一方面，表达AND的T细胞在表达I-Ab分子的小鼠胸腺中正常地分化·成熟，但是，AND TCR对I-Ab分子显示较高的自身反应性。
在表达I-Ab分子的C57BL/6小鼠的遗传背景中，Dock8敲除且转基因(Dock8-/-ANDTg)小鼠显示亢进的抓挠行为及皮炎的症状。由此，Dock8-/-AND Tg小鼠可以用作特应性皮炎等IL-31介导性疾病模型非人动物。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Furue M,et al.Emerging role of interleukin-31 andinterleukin-31 receptor in pruritus in atopic dermatitis.Allergy 73:29–36,2018.
非专利文献2：Bagci IS,Ruzicka T.IL-31:A new key player in dermatologyand beyond.J Allergy Clin Immunol.141:858-866,2018.
非专利文献3：Kim HJ,et al.Itch in dermatomyositis:the role ofincreased skin interleukin-31.Br J Dermatol.179:669-678,2018.
非专利文献4：Nattkemper LA.et al.Cutaneous T-cell Lymphoma andPruritus:The Expression of IL-31and its Receptors in the Skin.Acta DermVenereol.96:894–898,2016.
非专利文献5：Sonkoly E,et al.IL-31:a new link between T cells andpruritus in atopic skin inflammation.J Allergy Clin Immunol.117:411-417,2006.
非专利文献6：Neis MM,et al.Enhanced expression levels of IL-31correlate with IL-4and IL-13in atopic and allergic contact dermatitis.JAllergy Clin Immunol.118:930-937,2006.
非专利文献7：Lange M,et al.interleukin-31polymorphisms and serum IL-31level in patients with mastocytosis:correlation with clinical presentationand pruritus.Acta Derm Venereol.97:47-53,2017.
非专利文献8：Bonciani D,et al.Serum levels and tissue expression ofinterleukin-31in dermatitis herpetiformis and bullous pemphigoid.J DermatolSci.87:210-212,2017.
非专利文献9：Yamamura K et al.,The transcription factor EPAS1 linksDOCK 8deficiency to atopic skin inflammation via IL-31 induction.NatureCommunications 8:13946,2017.
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，IL-31被认为是在特应性皮炎等炎症性疾病中的、引起痒感的代表性因子。然而，针对IL-31引起痒感的机制，尚未完全阐明。因此，本发明的目的在于明确IL-31引起痒感的分子机制、提供预防或治疗特应性皮炎等IL-31介导性疾病的技术。
用于解决课题的手段
本发明包含以下方式。
[1]一种IL-31介导性疾病的预防或治疗剂，其包含神经激肽B信号阻断剂。
[2]根据[1]所述的预防或治疗剂，其中，上述IL-31介导性疾病为特应性皮炎、特应性皮炎的瘙痒症、皮肌炎、皮肌炎的瘙痒症、慢性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎、皮肤T细胞淋巴瘤的瘙痒症、结节性痒疹、慢性多形性痒疹、色素性荨麻疹或大疱性类天疱疮。
[3]根据[1]所述的预防或治疗剂，其中，上述IL-31介导性疾病为特应性皮炎。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的预防或治疗剂，其中，上述神经激肽B信号阻断剂为神经激肽3受体拮抗剂。
[5]根据[4]所述的预防或治疗剂，其中，上述拮抗剂为下式通式(1)、(2)或(3)所示的化合物或其盐或者它们的溶剂合物。
Figure BDA0003061922500000041
[式(1)中，
Ar表示哌啶基；吡啶-2-基；苯基；或者被卤素原子、甲基或碳原子数1～4的烷氧基取代的苯基；
R1表示甲基；R11表示氢原子；或者R1及R11一起表示-(CH2)3-基或-(CH2)2O-基；
R2表示羟基；C1-7烷氧基；C1-7酰氧基；氰基；-NR6R4基；-NR3COR4基；-NR3COOR8基；-NR3SO2R9基；-NR3CONR10R12基；C1-7酰基；C1-7烷氧基羰基；-CONR10R12基；-CH2OH基；C1-7烷氧基甲基；C1-7酰氧基甲基；C1-7烷基氨基羰基氧基甲基；-CH2NR13R14基；-CH2NR3COR4基；-CH2NR3COOR8基；-CH2NR3SO2R9基；或-CH2NR3CONR10R12基；或者，R2与其所键合的碳原子及其相邻的哌啶环的碳原子之间形成双键；或者，Ar及R2与它们所键合的哌啶环一起形成下式(1a)或(1b)所示的基团；
Figure BDA0003061922500000051
R3表示氢原子或C1-4烷基；R4表示氢原子、C1-7烷基、苯基、苄基、吡啶基、无取代的C3-7环烷基、或被1个以上的甲基取代的C3-7环烷基；或者，R3及R4一起表示-(CH2)n-基(其中，n为3或4。)；
T表示亚甲基、羰基、-COO-基、或-CONR5-基；A表示单键、亚甲基、亚乙基、亚丙基、或亚乙烯基；或者，-T-A-表示-SO2-基；
Z表示苯基、或者被1个以上的卤素原子、C1-4烷基、C1-4烷氧基或硝基取代的苯基；
R5表示氢原子或C1-4烷基；
R6表示氢原子或C1-7烷基；R7表示氢原子、C1-7烷基、C3-7环烷基甲基、苄基或苯基；或者，R6及R7与它们所键合的氮原子一起构成选自由氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基及氮杂环庚烷(perhydroazepine)基组成的组中的杂环；
R8表示C1-7烷基或苯基；
R9表示C1-7烷基；氨基或者被1或2个C1-7烷基取代的氨基；苯基；被选自由卤素原子、C1-7烷基、三氟甲基、羟基、C1-7烷氧基、羧基、C1-7烷氧基羰基、C1-7烷基羰基氧基、氰基、硝基、氨基及被1或2个C1-7烷基取代的氨基组成的组中的1或多个基团(其中，在所选择的基团为多个的情况下，多个基团彼此可以互为相同或不同。)取代的苯基；
R10表示氢原子或C1-7烷基；R12表示氢原子、C1-7烷基、C3-7环烷基、C3-7环烷基甲基、羟基、C1-4烷氧基、苄基或苯基；或者，R10及R12与它们所键合的氮原子一起构建选自由氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基及氮杂环庚烷基组成的组中的杂环；
R13表示氢原子或C1-7烷基；
R14表示氢原子、C1-7烷基、C3-7环烷基甲基或苄基；
n3为2或3。
其中，在Ar为苯基、R2为羟基、-T-A-Z为苯甲酰基的情况下，R1不为甲基；在Ar为苯基、R2为-NHCOCH3基、-T-A-Z为苯甲酰基的情况下，R1及R11不一起形成-(CH2)3-基；在Ar为苯基、R2为羟基、-T-A-Z为3-甲氧基苄基的情况下，R1及R11不一起形成-(CH2)3-基；在Ar为苯基、R2为-NHCOCH3基、-T-A-Z为苄基氧基羰基的情况下，R1不为甲基。]
Figure BDA0003061922500000061
[式(2)中：
Y为下式(2a)或(2b)所示的基团；
Figure BDA0003061922500000062
Ar2表示可以根据需要被取代的苯基、萘基或C5-7环二烯基(Cyclo alkadienyl)；或者可以根据需要被取代的具有芳香族特性的、包含5～12个环原子且在环中或各环中包含选自硫原子、氧原子及氮原子中的至多4个杂原子的单杂环基或稠杂环基；
R100表示直链或支链的C1-8烷基、C3-7环烷基、C4-7环烷基烷基、可以根据需要被取代的苯基或苯基C1-6烷基、可以根据需要被取代的包含选自氧原子及氮原子中的至多4个杂原子的5五元杂芳环、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、C1-6烷基氨基烷基、二C1-6烷基氨基烷基、C1-6酰基氨基烷基、C1-6烷氧基烷基、C1-6烷基羰基、羧基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷氧基羰基C1-6烷基、氨基羰基、C1-6烷基氨基羰基、二C1-6烷基氨基羰基、或者卤代C1-6烷基；或者，在成环为Ar2的情况下，形成基-(CH2)p-(其中，p为2或3。)；
R101及R102可以相同或不同，独立地为氢原子、C1-6直链或支链的烷基、或者一起形成-(CH2)n1-基(其中，n1为3、4或5。)；或者，R101与R100一起形成基-(CH2)q-(其中，q为2、3、4或5。)；
R110为R103或(R405)q1；
R111为R104或者下式(2c)或(2g)所示的基团；
Figure BDA0003061922500000071
R112为R105或下式(2d)所示的基团；
Figure BDA0003061922500000072
R401选自氢原子、C1-4烷基、C3-6环烷基及C1-4烷基OC(O)-；
A2为苯基或C3-7环烷基；
R402各自独立地选自氢原子、-OH、-NH2、-CN、卤素原子、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6烷氧基及C1-6烷氧基C1-6烷基；
n2为1、2或3；
R403各自独立地选自氢原子、-OH、-NH2、-NO2、-CN、卤素原子、C1-6烷基、C1-6烷氧基及C1-6烷氧基C1-6烷基；
m为1、2或3；
r1为0、1、2或3；
r2为1、2或3；
R404及R409选自C1-4烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C3-7环烷基及E-(CH2)b-，其中，E选自-NR406R407、-SR406、-SOC1-6烷基、-SO2C1-6烷基、N+(O-)R406R407、-NR406SO2R407、芳基及具有1、2、3或4个氮原子的N-或C-连接的五或六元芳香族或非芳香族的杂环式环或者其N-氧化物，而且，b为0、1、2、3、4或5；
R405各自独立地选自氢原子、-OH、-CN、卤素、-R406、-OR406、-NR406R407、-SR406、-SOR406及-SO2R406；
q1为1、2或3；
其中，
R406及R407各自独立地选自氢原子、C1-6直链或支链烷基、C2-6直链或支链烯基或炔基、及具有0、1或2个双键或三键的C3-7碳环式基，其中，该基团为非取代，或者被选自-OH、＝O、-NH2、-CN、卤素原子、芳基及C1-3烷氧基中的1个或1个以上的基团取代；
R408选自氢原子、C1-5直链或支链烷基、及C3-5环烷基，该基团为非取代，或者被选自-OH、＝O、-NH2、-CN、卤素、芳基及C1-3烷氧基中的1个或1个以上的基团取代；
而且，在R404为E-(CH2)b-、并且该E为N或C连接的五或六元芳香族或非芳香族的杂环式环或者其N-氧化物的情况下，该E为非取代，或者独立地选自-OH、＝O、-NH2、-CN、卤素原子、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷基-CO-、-NR406R407、芳基及具有1、2、3或4个氮原子的N-或C-连接的五或六元芳香族或非芳香族的杂环式环或者其N-氧化物；
而且，在R401、R402、R403或R404为烷基、环烷基、烷氧基或烷氧基烷基的情况下，该基团为非取代，或者各自独立地具有选自-OH、-NH2、-CN、苯基及卤素中的1、2、3、4或5个取代基；
R103及R104可以相同或不同，独立地为选自氢原子、C1-6直链或支链的烷基、C1-6烯基、芳基、C1-6烷氧基、羟基、卤素原子、硝基、氰基、羧基、羧基酰胺基、磺酰胺基、C1-6烷氧基羰基、三氟甲基、酰基氧基、邻苯二甲酰亚胺基、氨基、单-及二-C1-6烷基氨基、-O(CH2)r-NW2基(其中，r为2、3或4，W为氢原子或C1-6烷基、或者其与相邻的氮形成下述基团：
Figure BDA0003061922500000081
[式(2e)或(2f)中，V及V1独立地表示氢原子或氧原子，u为0、1或2。]。)、-O(CH2)t-OE2基(其中，t为2、3或4，E为氢原子或C1-6烷基。)、羟基烷基、氨基烷基、单-或二-烷基氨基烷基、酰基氨基、烷基磺酰基氨基、氨基酰基氨基、以及单-或二-烷基氨基酰基氨基；在喹啉核中可以存着至多4个R103取代基；或者，在成环为作为芳基的R105情况下，R104形成-(CH2)e-基(其中，e为1、2或3。)；
R105表示支链或直链的C1-6的烷基、C3-7的环烷基、C4-7的环烷基烷基、可以根据需要被取代的芳基、或者可以根据需要被取代的具有芳香族特性的、包含5～12个环原子且在环中或各环中包含选自硫原子、氧原子及氮原子中的至多4个杂原子的单杂环基或稠杂环基；
X表示氧原子、硫原子或＝N-C≡N。]
Figure BDA0003061922500000091
[式(3)中，
R301为氢原子、氟原子或甲基，
R301’为氢原子，
R302为氢原子、氟原子、氯原子或甲氧基，
R302’为氢原子或氟原子，
R303为氢原子、氟原子、氯原子、甲基、三氟甲基或腈基，
R304为甲基、乙基、正丙基、羟基乙基、甲氧基乙基、三氟甲基、二氟甲基或氟甲基，
R305为甲基、乙基、甲氧基甲基、三氟甲基、二氟甲基、氟甲基、1-氟乙基、1,1-二氟乙基或2,2,2-三氟乙基，
X1为氮原子且X2为硫原子或氧原子，或者X1为硫原子且X2为氮原子，
Figure BDA0003061922500000101
对应于X1及X2而表示单键或双键，
Figure BDA0003061922500000102
表示式(3)的化合物的(R)-镜像异构体或外消旋化合物。]
[6]根据[5]所述的预防或治疗剂，其中，上述式(1)所示的化合物为奥沙奈坦(Osanetant)。
[7]根据[5]所述的预防或治疗剂，其中，上述式(1)所示的化合物为SSR-146977。
[8]根据[5]所述的预防或治疗剂，其中，上述式(1)所示的化合物为SSR-241586。
[9]根据[5]所述的预防或治疗剂，其中，上述式(1)所示的化合物为CS-003。
[10]根据[5]所述的预防或治疗剂，其中，上述式(2)所示的化合物为他奈坦(Talnetant)。
[11]根据[5]所述的预防或治疗剂，其中，上述式(2)所示的化合物为帕维奈坦(Pavinetant)。
[12]根据[5]所述的预防或治疗剂，其中，上述式(2)所示的化合物为SB-235375。
[13]根据[5]所述的预防或治疗剂，其中，上述式(3)所示的化合物为非唑奈坦(Fezolinetant)。
[14]根据[1]～[3]中任一项所述的预防或治疗剂，其中，上述神经激肽B信号阻断剂为速激肽加工酶的抑制剂或速激肽加工酶的分解促进剂。
[15]根据[14]所述的预防或治疗剂，其中，上述抑制剂为前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 1、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 2、羧肽酶E、或肽酰甘氨酸α酰胺化单加氧酶的抑制剂。
[16]根据[1]～[3]中任一项所述的预防或治疗剂，其中，上述神经激肽B信号阻断剂为神经激肽B(NKB)、神经激肽3受体、速激肽加工酶、胃泌素释放肽(GRP)或GRP受体的表达抑制剂。
[17]根据[1]～[3]中任一项所述的预防或治疗剂，其中，上述神经激肽B信号阻断剂为表达神经激肽3受体或GRP受体的神经细胞的除去剂。
[18]根据[17]所述的预防或治疗剂，其中，上述除去剂为结合有细胞毒性物质的、GRP、针对GRP受体的特异性结合物质、NKB或针对神经激肽3受体的特异性结合物质。
[19]根据[18]所述的预防或治疗剂，其中，上述细胞毒性物质为核糖体钝化蛋白或白喉毒素。
[20]根据[19]所述的预防或治疗剂，其中，上述核糖体钝化蛋白为皂草素(Saporin)、蓖麻毒素(Ricin)或相思子毒素(Abrin)。
[21]一种IL-31介导性疾病的预防或治疗用医药组合物，其包含[1]～[20]中任一项所述的预防或治疗剂及药学上可允许的载体。
[22]一种特应性皮炎的预防或治疗用医药组合物，其包含[1]～[20]中任一项所述的预防或治疗剂及药学上可允许的载体。
发明效果
根据本发明，可以提供预防或治疗特应性皮炎等IL-31介导性疾病的技术。
附图说明
图1(a)是实验例1中的、向野生型C57BL/6小鼠的髓腔内分别注射胃泌素释放肽(GRP)-皂草素或利钠多肽b(natriuretic polypeptide b，Nppb)-皂草素后对这些小鼠施用IL-31并对这些小鼠的抓挠行为进行分析得到的结果。图1(b)是实验例1中的、向野生型C57BL/6小鼠的髓腔内注射GRP-皂草素后对脊髓中的GRPR mRNA的表达量进行分析得到的结果。图1(c)是实验例1中的、向野生型C57BL/6小鼠的髓腔内注射Nppb-皂草素后对脊髓中的NPRA的mRNA的表达量进行分析得到的结果。图1(d)是实验例1中的、向野生型C57BL/6小鼠的髓腔内注射GRP-皂草素或Nppb-皂草素后摘取脊髓并使用抗GRPR抗体及抗NPRA抗体进行免疫染色得到的结果。
图2(a)是表示实验例2中的、野生型C57BL/6小鼠的IL-31基因的结构、靶向载体(Targeting Vector)的结构、通过同源重组***Neo Cassette后的基因结构及通过翻转酶(Flippase)除去Neo Cassette后的结构的图。图2(b)是实验例2中的、利用2％的琼脂糖凝胶将各PCR产物进行电泳得到的图。以野生型C57BL/6小鼠的基因组作为模板的PCR产物的长度为300bp，以基因敲入小鼠的基因组作为模板的PCR产物的长度为550个碱基对。
图3(a)是实验例3中的、通过苏木精染色对各基因型的小鼠的皮肤组织进行分析得到的图。图3(b)是实验例3中的、对各基因型的小鼠的抓挠行为进行分析得到的图。图3(c)是实验例3中的、对各基因型的小鼠的血清中的IL-31的浓度进行分析得到的结果。图3(d)是实验例3中的、对各基因型的小鼠的背根神经节(DRG)中Tac2的mRNA的表达量进行分析得到的结果。
图4(a)是实验例4中的、用IL-31刺激DRG神经细胞后对各基因的mRNA的表达量进行分析得到的结果。图4(b)是实验例4中的、用NKB刺激DRG神经细胞后对各基因的表达量进行分析得到的结果。
图5(a)是实验例5中的、Dock8-/-AND Tg小鼠的DRG中抗NKB抗体及抗IL-31RA抗体的免疫染色的结果。图5(b)是实验例5中的、Dock8-/-AND Tg小鼠的DRG中抗NKB抗体及抗TRPV1抗体的免疫染色的结果。
图6(a)是示意性表示实验例6中的、小鼠Tac2基因和被该基因编码的NKB蛋白的图。图6(b)是实验例6中的、通过PCR和电泳来判别Tac2基因变异小鼠Δ4及Δ15的Tac2基因型的图。图6(c)是表示实验例6中的、2种变异的基因组序列和所转录的mRNA编码的氨基酸序列的图。
图7(a)是实验例7中的、针对向Tac2-/-(Δ4)小鼠施用组胺后的抓挠行为进行分析得到的结果。图7(b)是实验例7中的、针对向Tac2-/-(Δ4)小鼠施用氯喹(chloroquine)后的抓挠行为进行分析得到的结果。图7(c)是实验例7中的、针对向Tac2-/-(Δ4)小鼠施用PAR2激动剂后的抓挠行为进行分析得到的结果。图7(d)是实验例7中的、针对向Tac2-/-(Δ4)小鼠施用IL-31后的抓挠行为进行分析得到的结果。
图8(a)是实验例7中的、针对向Tac2-/-(Δ15)小鼠施用组胺后的抓挠行为进行分析得到的结果。图8(b)是实验例7中的、针对向Tac2-/-(Δ15)小鼠施用IL-31后的抓挠行为进行分析得到的结果。
图9(a)是实验例7中的、建立表达Tac或不表达Tac的(Tac2-/-(Δ4))Dock8-/-ANDTg小鼠并对皮肤的组织进行比较得到的结果。图9(b)是实验例7中的、建立表达Tac或不表达Tac的(Tac2-/-(Δ4))Dock8-/-AND Tg小鼠并对抓挠行为进行比较得到的结果，图9(c)是实验例7中的、建立表达Tac或不表达Tac的(Tac2-/-(Δ4))Dock8-/-AND Tg小鼠并对血清中的IL-31水平进行比较得到的结果。
图10(a)表示实验例8中的、对Tac2-/-(Δ4)小鼠向髓腔内注射NKB并对抓挠行为进行分析得到的结果。图10(b)表示实验例8中的、注射GRP-皂草素或Nppb-皂草素并将表达GRPR或NPRA的神经细胞除去后、再注射NKB并对抓挠行为进行分析得到的结果。
图11(a)是实验例9中的、利用抗NK3R抗体及抗TRPV1抗体对脊髓背角进行免疫染色得到的结果。图11(b)是实验例9中的、对C57BL/6小鼠施用IL-31后用抗NK3R抗体及抗c-fos抗体进行免疫染色得到的结果。图11(c)是实验例9中的、在奥沙奈坦注射后施用IL-31并对抓挠行为进行分析得到的结果。图11(d)是实验例9中的、在奥沙奈坦注射后施用组胺并对抓挠行为进行分析得到的结果。图11(e)是实验例9中的、在奥沙奈坦注射后施用氯喹并对抓挠行为进行分析得到的结果。图中的白色圆形图标及黑色圆形图标是对各小鼠的测定值绘制得到的图。
图12(a)是实验例9中的、在非唑奈坦施用后施用IL-31并对抓挠行为进行分析得到的结果。图12(b)是实验例9中的、在非唑奈坦施用后施用组胺并对抓挠行为进行分析得到的结果。图12(c)是实验例9中的、在非唑奈坦施用后施用氯喹并对抓挠行为进行分析得到的结果。图中的白色圆形图标及黑色圆形图标是对各小鼠的测定值绘制得到的图。
图13(a)是实验例9中的、在他奈坦施用后施用IL-31并对抓挠行为进行分析得到的结果。图13(b)是实验例9中的、在他奈坦施用后施用氯喹并对抓挠行为进行分析得到的结果。图中的黑色圆形图标、黑色方形图标及黑色三角形图标是对各小鼠的测定值绘制得到的图。
图14(a)是实验例9中的、在帕维奈坦施用后施用IL-31并对抓挠行为进行分析得到的结果。图14(b)是实验例9中的、在帕维奈坦施用后施用氯喹并对抓挠行为进行分析得到的结果。图中的黑色圆形图标、黑色方形图标及黑色三角形图标是对各小鼠的测定值绘制得到的图。
图15(a)是实验例9中的、在SSR-146977施用后施用IL-31并对抓挠行为进行分析得到的结果。图15(b)是实验例9中的、在SSR-146977施用后施用氯喹并对抓挠行为进行分析得到的结果。图中的黑色圆形图标、黑色方形图标及黑色三角形图标是对各小鼠的测定值绘制得到的图。
图16(a)是实验例9中的、在SSR-241586施用后施用IL-31并对抓挠行为进行分析得到的结果。图16(b)是实验例9中的、在SSR-241586施用后施用氯喹并对抓挠行为进行分析得到的结果。图中的黑色圆形图标、黑色方形图标及黑色三角形图标是对各小鼠的测定值绘制得到的图。
图17(a)是实验例9中的、在CS-003施用后施用IL-31并对抓挠行为进行分析得到的结果。图17(b)是实验例9中的、在CS-003施用后施用氯喹并对抓挠行为进行分析得到的结果。图中的黑色圆形图标、黑色方形图标及黑色三角形图标是对各小鼠的测定值绘制得到的图。
图18(a)是实验例9中的、在SB-235375施用后施用IL-31并对抓挠行为进行分析得到的结果。图18(b)是实验例9中的、在SB-235375施用后施用氯喹并对抓挠行为进行分析得到的结果。图中的黑色圆形图标、黑色方形图标及黑色三角形图标是对各小鼠的测定值绘制得到的图。
具体实施方式
[预防或治疗剂]
在一个实施方式中，本发明提供包含神经激肽B信号阻断剂的IL-31介导性疾病的预防或治疗剂。在一个实施方式中，本发明还可以提供以神经激肽B信号阻断剂作为有效成分的IL-31介导性疾病的预防或治疗剂。
(IL-31介导性疾病)
在本发明中，IL-31介导性疾病是指IL-31参与疾病的发病或疾病的发展的疾病。IL-31介导性包括如下情况：通过IL-31的直接作用而参与疾病的发病或疾病的发展的情况，而且还包括如下情况：IL-31作用于体组织或体细胞，结果产生、表达或游离、或者活化出新的生物分子，并且因该生物分子而使得疾病发病或发展。
作为IL-31介导性疾病，可列举例如特应性皮炎、特应性皮炎的瘙痒症、皮肌炎、皮肌炎的瘙痒症、慢性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎、皮肤T细胞淋巴瘤的瘙痒症、结节性痒疹、慢性多形性痒疹、色素性荨麻疹及大疱性类天疱疮等，但是并不限定于此。据报道，在这些疾病中，病变组织中IL-31及IL-31受体的表达亢进、血清IL-31的水平比健康人高、并且这些现象与疾病症状相关。
就IL-31介导性疾病而言，通过抑制体内的IL-31的产生，另外在IL-31产生后通过消除IL-31的作用，从而能够预防或治疗该疾病或与该疾病相伴的症状。IL-31的作用是通过IL-31与IL-31受体的结合来向细胞内传递刺激而发挥的。因此，通过抑制IL-31与IL-31受体的结合，从而可以消除IL-31的作用。因此，例如可以使用抗IL-31抗体或抗IL-31受体抗体。有报道显示：IL-31受体通过形成IL-31受体A与制瘤素M(Oncostatin M)受体的异源二聚体(heterodimer)来发挥功能，而抗IL-31受体A抗体抑制特应性皮炎及特应性皮炎的瘙痒症(Kabashima K,et al.Nemolizumab in patients with moderate-to-severeatopic dermatitis:Randomized,phase II,long-term extension study.J AllergyClin Immunol.142:1121-1130,2018)。
为了消除IL-31的作用，也可通过IL-31受体刺激来抑制参与IL-31介导性疾病的生物分子的产生、表达或游离、或者活化来实现。所述活化包括如下情况，即，无活性或低活性的生物分子活化或高活化、该生物分子的功能增强。
(神经激肽B信号)
迄今为止，发明人明确了Dock8-/-AND Tg小鼠显示亢进的抓挠行为、血中的IL-31的浓度上升。另外，正如在实施例中所详细叙述那样，发明人明确了在该小鼠的背根神经节中速激肽2(Tac2)基因的表达量上升至约23倍。
Tac2基因编码作为神经肽的前体的前速激肽原-3(PPT-3)。PPT-3被加工酶翻译后修饰，成为成熟型的神经激肽B(neurokinin B、NKB)。NKB被神经激肽受体3(NK3R)接受。
发明人明确了如下内容：随着IL-31的浓度上升，NKB的表达量上升，NKB将表达NK3R的神经细胞活化，接着，表达胃泌素释放肽(GRP)的神经细胞活化，进而表达GRP受体的神经细胞活化，由此引起小鼠的抓挠行为。
在本说明书中，在NKB引起抓挠行为的过程中，将发挥功能的分子及神经回路称作神经激肽B信号。
通过阻断上述的神经激肽B信号，从而可以抑制因IL-31的浓度上升引起的抓挠行为。另外，通过阻断神经激肽B信号，从而可以预防或治疗IL-31介导性疾病。
神经激肽B信号阻断剂可以是抑制PPT-3、加工酶、NKB、NK3R、GRP、GRP受体等的功能的药剂。
另外，神经激肽B信号阻断剂也可以是抑制PPT-3、加工酶、NKB、NK3R、GRP、GRP受体等的表达量的药剂，还可以是除去NK3R受体或表达GRP受体的神经细胞的药剂。
(拮抗剂)
神经激肽B信号阻断剂可以是NK3R的拮抗剂(拮抗药)。神经激肽B信号阻断剂也可以称作NK3R信号阻断剂。另外，NK3R拮抗剂也可以称作NK3R阻断剂(阻断药)。
NKB对NK3R的亲和性最高，NK3R主要通过与NKB结合而被活化。
正如后面在实施例中所述那样，发明人明确了IL-31的施用使NKB的表达上升、并且引起抓挠行为。另外，发明人明确了该抓挠行为通过作为NK3R拮抗剂的、奥沙奈坦、非唑奈坦、他奈坦、帕维奈坦、SSR-146977、SB-235375、SSR-241586及CS-003而得到抑制。
即，通过抑制NK3R的活化，从而可以抑制因IL-31的浓度上升所引起的抓挠行为。另外，通过抑制NK3R的活化，从而可以预防或治疗IL-31介导性疾病。
作为抑制NK3R的活化的因子，可列举低分子化合物、肽及针对NK3R的抗体等。
在一个实施方式中，本发明提供上述NK3R拮抗剂为上述式(1)、(2)或(3)所示的化合物或其盐或者它们的溶剂合物的、IL-31介导性疾病的预防或治疗剂。
上述式(1)中，烷基或烷氧基可以为直链状，也可以为支链状。另外，卤素原子是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子，优选为氟原子、氯原子或碘原子。
另外，酰基可以是甲酰基或碳原子数1～6的烷基羰基。
作为上述式(1)、(2)或(3)所示的化合物的盐，为无机酸盐及有机酸盐，可列举适于上述式(1)、(2)或(3)所示化合物的分离或结晶化的盐。作为上述式(1)所示的化合物的盐，更具体而言，可列举例如：苦味酸盐及草酸盐；与具有光学活性的酸形成的盐，例如扁桃酸盐及樟脑磺酸盐；药学上可允许的盐等。
作为上述式(1)、(2)或(3)所示的化合物的药学上可允许的盐，可列举盐酸盐、溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸二氢盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、马来酸盐、富马酸盐、2-萘磺酸盐、苯磺酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐、羟基乙磺酸盐、对甲苯磺酸盐等。
上述式(1)、(2)或(3)所示的化合物可以是外消旋体(racemic body)，也可以是纯净的对映异构体(enantiomer)。
上述式(1)所示的化合物可以是奥沙奈坦(Osanetant)。奥沙奈坦是N-[1-[3-[(3R)-1-苯甲酰基-3-(3,4-二氯苯基)哌啶-3-基)丙基)-4-苯基哌啶-4-基]-N-甲基乙酰胺的国际通用名(INN)，是具有下式(4)所示的化学结构的化合物。另外，下式(4)的化合物的CAS号为160492-56-8。
Figure BDA0003061922500000181
上述式(1)所示的化合物可以是SSR-146977。SSR-146977是N-[1-[3-[1-苯甲酰基-3(R)-(3,4-二氯苯基)哌啶-3-基]丙基]-4-苯基哌啶-4-基]-N’，N’-二甲基脲，是具有下式(5)所示的化学结构的化合物。另外，下式(5)的化合物的CAS号为264618-44-2。
Figure BDA0003061922500000182
上述式(1)所示的化合物可以是SSR-241586。SSR-241586是(+)-1’-[2-[4-苯甲酰基-2(R)-(3,4-二氯苯基)吗啉-2-基]乙基]-N,N-二甲基-1,4’-联哌啶-4’-甲酰胺，是具有下式(6)所示的化学结构的化合物。另外，下式(6)的化合物的CAS号为1239279-30-1。
Figure BDA0003061922500000183
上述式(1)所示的化合物可以是CS-003。CS-003是1’-[2-[2-(R)-(3,4-二氯苯基)-4-(3,4,5-)三甲氧基苯甲酰基]吗啉-2-基]乙基]螺[苯并[c]噻吩-1(3H)-4’-哌啶]2(S)-氧化物，是具有下式(7)所示的化学结构的化合物。另外，下式(7)的化合物的CAS号为191672-52-3。
Figure BDA0003061922500000191
上述式(2)所示的化合物可以是他奈坦(Talnetant)。他奈坦是N-(α-乙基苄基)-3-羟基-2-苯基喹啉-4-甲酰胺，是具有下式(8)所示的化学结构的化合物。另外，下式(8)所示的化合物的CAS号为174636-32-9。
Figure BDA0003061922500000192
上述式(2)所示的化合物可以是帕维奈坦(Pavinetant)。帕维奈坦是3-(甲烷砜酰胺)-2-苯基-N-[1S]-1-苯基丙基]喹啉-4-甲酰胺，是下式(9)所示的化合物。另外，下式(9)所示的化合物的CAS号为941690-55-7。
Figure BDA0003061922500000193
上述式(2)所示的化合物可以是SB-235375。SB-235375是2-[2-苯基-4-[N-[1(S)-苯基丙基]氨甲酰基]喹啉-3-基氧基]乙酸，是下式(10)所示的化合物。另外，下式(10)所示的化合物的CAS号为224961-34-6。
Figure BDA0003061922500000201
上述式(3)所示的化合物可以是非唑奈坦(Fezolinetant)。非唑奈坦是(4-氟苯基)-[(8R)-8-甲基-3-(3-甲基-1,2,4-噻二唑-5-基)-6,8-二氢-5H-[1,2,4]***并[4,3-a]吡嗪-7-基]-甲酮，是下式(11)所示的化合物。另外，下式(11)所示的化合物的CAS号为1629229-37-3。
Figure BDA0003061922500000202
(速激肽加工酶)
小鼠Tac2基因编码前速激肽原-3(PPT-3)。PPT-3被翻译后修饰而合成神经激肽B(NKB)。
认为该翻译后修饰以如下方式进行。作为前体的PPT-3在2个赖氨酸残基或精氨酸残基连续的位置被切断。该切断被激素原转化酶(Prohormone convertase，PC)催化。
PC构成前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin(PCSK)家族。PCSK家族由PCSK1～9构成。其中，PCSK1及PCSK2是对体内肽进行加工的主要的酶。
在PCSK1及PCSK2的表达量下降的小鼠的神经组织中，神经激肽A的浓度下降。
用羧肽酶除去位于被切断的肽的C末端的、赖氨酸残基及精氨酸残基。其中，该反应中主要涉及的酶为羧肽酶E(CPE)。
已除去碱性肽的肽在C末端具有甘氨酸残基。该C末端的甘氨酸残基的α位的氨基被肽酰甘氨酸α酰胺化单加氧酶(Peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenase，PAM)酰胺化。
在人类中，PAM被PAM基因编码。PAM由肽酰甘氨酸α羟化单加氧酶(peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase，PHM)结构域和肽酰α羟基甘氨酸α酰胺化裂解酶(peptidyl-alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyase，PAL)结构域构成。
PHM结构域将位于肽的C末端的甘氨酸残基氢氧化。接着，PAL结构域除去已被氢氧化的甘氨酸残基。通过一系列的反应，甘氨酸被切断，肽的C末端被酰胺化。
人PPT-3及小鼠PPT-3具有序列号2所示的、NKB的氨基酸序列。另外，人PPT-3及小鼠PPT-3具有与加工相关的上述的碱性氨基酸残基和甘氨酸残基。
由此认为人PPT-3及小鼠PPT-3的翻译后修饰基于相同机制来进行。
为了使NKB具有活性，需要利用PCSK及CPE进行切断、以及利用PAM进行酰胺化。即，通过抑制这些酶的活性，从而可以抑制NKB的作用。
神经激肽B信号阻断剂可以是速激肽加工酶的抑制剂或速激肽加工酶的分解促进剂。速激肽加工酶的抑制剂或速激肽加工酶的分解促进剂可以通过抑制NKB的作用来抑制因IL-31的浓度上升所致的抓挠行为。因此，为了预防或治疗IL-31介导性疾病，可以使用速激肽加工酶的抑制剂。
作为速激肽加工酶，可列举例如前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 1(PCSK1)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 2(PCSK2)、羧肽酶E(CPE)、肽酰甘氨酸α酰胺化单加氧酶(PAM)等，但并不限定于此，只要是与速激肽的加工有关的酶即可。
速激肽加工酶的抑制剂可以是低分子化合物，也可以是肽，另外，还可以是针对速激肽加工酶的抗体等。
(表达抑制剂)
在一个实施方式中，本发明提供一种IL-31介导性疾病的预防或治疗剂，其是神经激肽B信号阻断剂，是神经激肽B、神经激肽3受体、速激肽加工酶、GRP或GRP受体的表达抑制剂。
作为表达抑制剂，可列举例如siRNA、shRNA等。通过施用针对编码与NKB信号有关的蛋白质的基因的表达抑制剂，从而可以使上述任一因子的表达量下降、阻断NKB信号。其结果可以抑制因IL-31的浓度上升引起的抓挠行为。另外，通过这些表达抑制剂的施用，可以预防或治疗IL-31介导性疾病。
(神经细胞的除去)
在一个实施方式中，本发明提供一种IL-31介导性疾病的预防或治疗剂，其是表达神经激肽3受体或GRP受体的神经细胞的除去剂。
上述的神经细胞的除去剂可以为结合有细胞毒性物质的、GRP、针对GRP受体的特异性结合物质、神经激肽B或针对神经激肽3受体的特异性结合物质。
作为细胞毒性物质，可列举例如核糖体钝化蛋白(ribosomeinactivatingprotein、RIP)、白喉毒素等。作为RIP，可列举例如皂草素、蓖麻毒素、相思子毒素等。
已经与细胞毒性物质结合的GRP被GRP受体表达神经细胞捕捉，并通过内吞作用(endocytosis)被吞入细胞内。同样，已经与细胞毒性物质结合的神经激肽B被神经激肽3受体(NK3R)表达神经细胞捕捉，并通过内吞作用被吞入细胞内。接着，吞入有细胞毒性物质的神经细胞死亡、被除去。
正如后面在实施例中所述那样，发明人通过对小鼠施用GRP-皂草素(使皂草素与GRP接合(conjugate)而成的)、对表达GRP受体的神经细胞诱导细胞死亡，从而除去了神经细胞。其结果表明在除去了表达GRP受体的神经细胞的小鼠中可抑制由IL-31及NKB的施用而引起的抓挠行为。
即，通过除去表达GRP受体或NK3R的神经细胞，可以阻断神经激肽B信号。其结果可抑制因IL-31的浓度上升而引起的抓挠行为。
另外，上述的神经细胞的除去剂可以是在被特异性地捕捉至靶神经细胞的表面的蛋白上结合细胞毒性物质而成的物质。作为被捕捉至靶神经细胞的表面的蛋白，例如可以是与靶神经细胞特异性表达的受体结合的配体，也可以是针对靶神经细胞特异性表达且存在于细胞表面的蛋白的特异性结合物质。作为特异性结合物质，可列举抗体、抗体片断或适体(aptamer)等。作为抗体，可列举例如抗GRP受体抗体、抗NK3R抗体等。
[医药组合物]
在一个实施方式中，本发明提供包含上述的IL-31介导性疾病的预防或治疗剂及药学上可允许的载体的、IL-31介导性疾病预防或治疗用医药组合物。
本实施方式的医药组合物可以是口服使用的剂型，也可以是非口服使用的剂型。作为口服使用的剂型，可列举例如片剂、胶囊剂、酏剂(elixir)、微囊剂等。作为非口服使用的剂型，可列举例如注射剂、吸入剂、栓剂、皮肤外用剂、贴剂等。
作为在药学上可允许的载体，可列举例如：灭菌水、生理食盐水等溶剂；明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、***胶等粘合剂；结晶纤维素等赋形剂；海藻酸等膨化剂等。
医药组合物可以还包含添加剂。作为添加剂，可列举：硬脂酸镁等润滑剂；蔗糖、乳糖、糖精等甜味剂；薄荷、梨叶白珠(Gaultheria adenothrix)油等香味剂；苄醇、苯酚的稳定剂；磷酸盐、乙酸钠等缓冲剂；苯甲酸苄酯、苄醇等增溶剂；抗氧化剂；防腐剂等。
医药组合物可以通过适当组合上述载体及添加剂并以通常被认可的制药实践中所要求的单位用量形态进行混合来形成制剂。
例如，除髓腔内注射、动脉内注射、静脉内注射、皮下注射等之外，还可以通过鼻腔内施用、经支气管施用、肌内施用、经皮施用或口服施用等本领域技术人员公知的方法来对患者施用。施用量根据患者的体重、年龄、患者的症状、施用方法等而变动，但就本领域技术人员而言，可适当选择适当的施用量。
IL-31介导性疾病、例如特应性皮炎的预防或治疗剂的施用量根据特应性皮炎的预防或治疗剂的种类、患者的症状等而变动，在口服施用的情况下，认为通常成人(以体重60kg计)以每天约0.1～500mg、优选约1.0～250mg、更优选约1.0～100mg左右的量按照1天1次或分成数次进行施用较为合适。
在非口服施用的情况下，其施用量因IL-31介导性疾病、例如特应性皮炎的预防或治疗剂的种类、患者的症状、施用部位、施用方法等而发生变动，但在进行全身施用的情况下，认为通常成人(以体重60kg计)以每天约0.1～500mg、优选约1.0～250mg、更优选约1.0～100mg左右的量按照1天1次或分成数次进行施用较为合适。在进行局部施用的情况下，认为通常成人(以体重60kg计)以每天约0.001～10mg、优选约0.01～5mg、更优选约0.02～2mg左右的量按照1天1次或分成数次进行施用较为合适。
[其他实施方式]
在一个实施方式中，本发明提供一种IL-31介导性疾病的预防或治疗方法，其包括对需要治疗的患者施用有效量的神经激肽B信号阻断剂的步骤。
在一个实施方式中，本发明提供用于预防或治疗IL-31介导性疾病的神经激肽B信号阻断剂。
在一个实施方式中，本发明提供用于制造IL-31介导性疾病的预防或治疗剂的神经激肽B信号阻断剂。
在上述的各实施方式中，上述神经激肽B信号阻断剂可以是神经激肽3受体拮抗剂。上述神经激肽B信号阻断剂可以是速激肽加工酶的抑制剂或速激肽加工酶的分解促进剂。上述神经激肽B信号阻断剂也可以是神经激肽B(NKB)、神经激肽3受体、速激肽加工酶、胃泌素释放肽(GRP)或GRP受体的表达抑制剂。上述神经激肽B信号阻断剂还可以是表达神经激肽3受体或GRP受体的神经细胞的除去剂。
上述神经激肽3受体拮抗剂可以是上述通式(1)、(2)或(3)所示的化合物或其盐或者它们的溶剂合物。上述通式(1)所示的化合物可以是上述式(4)、(5)、(6)或(7)所示的化合物，上述通式(2)所示的化合物可以是上述式(8)、(9)或(10)所示的化合物，上述通式(3)所示的化合物可以是上述式(11)所示的化合物。
上述抑制剂可以是前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 1、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 2、羧肽酶E、或肽酰甘氨酸α酰胺化单加氧酶的抑制剂。
上述除去剂可以是结合有细胞毒性物质的、GRP、针对GRP受体的特异性结合物质、NKB或针对神经激肽3受体的特异性结合物质。上述细胞毒性物质可以是核糖体钝化蛋白或白喉毒素。上述核糖体钝化蛋白可以是皂草素、蓖麻毒素或相思子毒素。
实施例
以下，利用实施例对本发明进行说明，但本发明并不受以下的实施例限定。
[材料及方法]
(小鼠)
Tac2-/-小鼠通过基于CRISPR/Cas9***进行的基因组编辑来制作。使用CHOPCHOP网页设计工具(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)，在小鼠Tac2基因的外显子4内选择了靶位点。合成序列号3和序列号4所示的寡核苷酸以及BbsI连接衔接子(LigationAdapter)。序列号5和序列号6所示的序列是指导序列(guide sequence)。为了使sgRNA和Cas9蛋白共表达，合成这两个核苷酸，并使其退火，通过连接而***至利用BbsI消化的px330载体。将所制作的px330载体(浓度5ng/μL、Dulbecco's PBS(杜氏磷酸缓冲液))注射至在M2培养基(sigma公司)中进行体外(in vitro)受精的C57BL/6小鼠受精卵的前核中。使所注射的生殖细胞在CZB培养基中且在37℃、5％CO2的环境下生长至二细胞期胚胎成熟为止。接着，将24个～36个胚胎移植至雌性ICR小鼠的输卵管中。使用序列6和序列7所示的引物，进行PCR，通过TA克隆、DNA测序，鉴定了幼仔小鼠的基因型。使具有所需变异(Δ4及Δ15)的幼仔小鼠与C57BL/6小鼠或Dock8-/-AND Tg小鼠交配。
关于IL31-/-小鼠的制作，首先，基于pNT1.1载体，在紧接起始密码子后***增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)和侧翼为翻转酶识别靶的新霉素抗性基因盒(flippase recognition target(FRT)-flanked neomycin resistantcassette(neo))，制作成靶向载体。将该靶向载体通过电穿孔(electroporation)导入胚性干细胞(ES细胞)。通过显微注射(microinjection)将正确导入了载体的ES克隆注入胚泡中，使所得的雄性嵌合体(chimera)个体与雌性C57BL/6小鼠交配。将变异的杂合小鼠与CAG-FLPe转基因小鼠(RBRC01834)交配，除去了neo。除去了neo的变异小鼠在与Dock8+/-ANDTg小鼠或Dock8+/-Osmr+/-小鼠交配之前，与C57BL/6小鼠回交5次以上。Osmr是编码制瘤素M受体(Oncostatin M receptor、OSMR)的基因，OSMR与IL-31受体α构成异源二聚体而将IL-31信号传导至细胞内。
所有小鼠均在九州大学的动物设施内的专门的无病原体的环境中饲养。作为实验的对照，使用了周龄、性别一致的同窝仔。动物实验的方法受到九州大学的动物实验伦理委员会认可。
(神经的除去)
通过对L3/4部位髓腔内施用GRP-皂草素、Nppb-皂草素及仅皂草素(分别为2μg/5μL、Advanced Targeting Systems)，从而除去表达GRP受体和Nppb受体的脊髓的神经细胞。在注射毒物2周后，将小鼠用于实验。
(抓挠行为的测量)
为了在实验之前使其熟习环境，而将小鼠在亚克力制盒(11cm×14cm×20cm)中放置最少1小时。接着，将50μL的溶解于已灭菌的生理食盐水中的瘙痒引起物质皮内注射至小鼠的肩部，用摄像机对这些小鼠的行动进行拍摄。重放摄像机来确定所指定的时间内的抓挠行为的总次数。在小鼠的抓挠行为时，小鼠将后脚伸向瘙痒的部位，并将头部向后脚倾斜，快速地移动数次后脚，将后脚返回地面。将这一系列的动作计数为一次抓挠行为。作为瘙痒引起物质，使用IL-31(1μg/50μl；PeproTech)、SLIGRL-NH2(100μg/50μl；BACHEM)、氯喹(100μg/50μl；和光纯药)及组胺(100μg/50μl；和光纯药)。
在若干实验中，研究了NK3R拮抗剂对小鼠的抓挠行为的作用。作为NK3R拮抗剂或具有NK3R拮抗剂的活性的化合物，使用了奥沙奈坦(Axon Medchem)、他奈坦(Namiki商事)、帕维奈坦(Namiki商事)、非唑奈坦(Haoyuan ChemExpress)、SSR-146977(Tocris)、SSR-241586(WuXi AppTec)、SB-235375(WuXi AppTec)及CS-003(WuXi AppTec)。在皮内注射瘙痒引起物质的45分之前，对小鼠施用了与小鼠的体重对应的规定量的这些化合物。使奥沙奈坦溶解于包含0.1％Tween-20的磷酸缓冲液(PBS)，再按照5mg/kg进行了腹腔内注射。使他奈坦及帕维奈坦溶解于10％二甲基亚砜(DMSO)、40％聚乙二醇300、5％Tween-80及45％生理食盐水的混合液中，再按照30mg/kg进行了腹腔内注射。使非唑奈坦溶解于包含10％DMSO的PBS中，再按照10mg/kg进行了口服施用。使SSR-146977溶解于包含0.1％乙醇的PBS中，再按照0.3mg/kg进行了腹腔内注射。使SSR-241586溶解于0.01％Tween-80水溶液中，再按照3mg/kg进行了腹腔内注射。使SB-235375溶解于PBS中，再按照3mg/kg进行了口服施用。使CS-003溶解于包含5％葡萄糖的PBS中，再按照3mg/kg进行了静脉内注射。
(组织学和免疫组织化学)
将皮肤组织用4％(w/v)的低聚甲醛固定，再包埋于石蜡块中。利用苏木精和曙红对厚度为3μm的切片进行染色，用光学显微镜进行了观察。在dorsal root ganglion(DRG、背根神经节)和脊髓的免疫组织化学分析中，将小鼠用异氟烷麻醉后，从心脏依次灌流PBS及4％低聚甲醛。回收DRG和脊髓组织，在4℃下固定一夜后，浸渍于30％蔗糖-PBS中，防止组织的冻伤损害。利用OCT包埋剂(Sakur Fintech)对组织样品进行包埋，使其在干冰上冻结。使用恒冷切片机(cryostat)制作厚度为10μm的切片，在室温下将切片用G-block(Genostaff、GB-01)封闭30分钟，在4℃下与一级抗体(primary antibody)孵育一夜。用与荧光色素缀合(conjugate)的二级抗体(Thermo Fisher Scientific)检出一级抗体。在各染色中使用了DAPI(1：5000、同仁化学研究所)。所有的图像是使用激光扫描共聚焦显微镜(FV3000、Olympus)取得的。作为一级抗体，使用了家兔抗神经激肽B抗体(1：500；NOVUS，NB300-201)、家兔抗NK3R抗体(1：50；NOVUS，NB300-102)、家兔抗TRPV1抗体(1：500；Millipore，AB9554)、抗IL-31RA抗体(1：100；R&D Systems，AF2107)、小鼠抗c-fos抗体(1：1000；EnCor，MCA-2H2)、家兔抗GRPR抗体(1：50；LSBio，LS-A831-50)及家兔抗NPRA抗体(1：50；LSBio，LS-C164506)。
(微阵列分析)
总RNA使用ISOGEN(NIPPON GENE)进行分离，使用Low Input Quick Amp LabelingKit(AgilentTechnologies)，扩增cRNA，并进行了标记。使cRNA与44K 60-meroligomicroarray(Whole Mouse Genome oligo DNA Microarray Kit Ver 2.0；AgilentTechnologies)杂交。使用安捷伦扫描仪(Agilent scanner)，对已杂交的微阵列载玻片进行扫描。使用Feature Extraction Software version 9.5.1.1(AgilentTechnologies)，算出杂交的相对强度和杂交的背景值。按照AgilentTechnologies推荐的方法，根据杂交强度和靶点位置算出信号强度的原始数据和探针的标志(flag)值。为了鉴定实验样品中的、表达量上升或减少的基因，基于各个探针的标准化的信号强度来算出Z-分数和比率。将Z-分数大于2.0、比率大于1.5的基因判断为表达量上升的基因，将Z-分数小于-2.0、比率小于0.66的基因判断为表达量下降的基因。
(统计处理)
使用GraphPad Prism，进行了统计处理。首先，通过KS-检验(Kolmogorov-Smirnovtest)对数据是否遵循正态分布进行了研究。在对两组数据进行比较的情况下，使用双尾未配对学生t检验(two-tailed unpaired Student’s t test)，对参数的数据进行了分析。在对多组数据进行比较的情况下，使用单向(one-way)ANOVA后，再使用邦弗朗尼事后检验(Bonferroni post hoc test)，对参数的数据进行了分析。在对两组数据进行比较的情况下，使用曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)，对非参数的数据进行了分析。认为0.05以下的P值有意义。
(实时PCR)
使用ISOGEN(NIPPON GENE)，从各个组织分离总RNA。利用RNase-free DNaseI(Thermo Fisher Scientific)对总RNA进行了处理。使用Oligo(dT)Primer(寡聚胸腺嘧啶引物)(Thermo Fisher Scientific)和SuperScriptIII逆转录酶(Thermo FisherScientific)对该RNA样品进行逆转录，通过PCR进行扩增。实时PCR使用SYBR Green PCRMaster Mix(Applied Biosystems)并利用Cfx Connecttm Thermal Cycler(Bio-Rad)来进行。靶基因的表达量以Hprt基因的表达量作为标准。分析使用装置附带的CFX Manager(ver3.1)。
[实验例1]
(传递痒感的神经回路)
对被IL-31活化的、传递瘙痒感觉的神经回路进行了分析。大多引起痒感的物质在脊髓神经中由利钠多肽b(Nppb)或胃泌素释放肽(GRP)介导而传递瘙痒感觉。
为了除去表达GRP受体或Nppb受体的神经细胞，分别向野生型的C57BL/6小鼠的髓腔内注射缀合有皂草素的GRP或Nppb(GRP-皂草素、Nppb-皂草素)，在2周后对这些小鼠施用IL-31，并对各小鼠的抓挠行为进行分析。
皂草素是核糖体钝化蛋白(ribosome-inactivating protein、RIP)的一种。
靶神经细胞中表达的受体的配体与RIP缀合而成的蛋白被靶神经细胞捕捉，并通过内吞作用被吞入细胞内。所吞入的与RIP缀合的蛋白抑制翻译并杀灭靶神经细胞。
图1(a)是向野生型C57BL/6小鼠的髓腔内分别注射GRP-皂草素或Nppb-皂草素后对这些小鼠施用IL-31、并对这些小鼠的抓挠行为进行分析得到的结果。图1(a)中，Blank表示向髓腔内仅注射皂草素得到的结果。IL-31(-)表示IL-31非施用组的结果，IL-31(+)表示IL-31施用组的结果。图1(a)～(c)中，“＊”表示在p＜0.05时具有显著性差异，“＊＊”表示在p＜0.01时具有显著性差异。
由髓腔内注射实验的结果可知：通过注射GRP-皂草素，可抑制被IL-31诱导的抓挠行为。但是，在注射了Nppb-皂草素的情况下，不能抑制抓挠行为。
接下来，通过对GRP受体(GRPR)或NPP受体A(NPRA)的mRNA及蛋白的表达量进行分析，从而确认到GRP-皂草素及Nppb-皂草素是否分别除去了表达GRPR及NPRA的神经。
GRPR及NPRA基因的mRNA的表达量按照以下方式进行了分析。首先，从小鼠摘取注射后的脊髓，从所摘取的脊髓中分离总RNA，以总RNA作为模板进行了逆转录反应。接着，进行定量PCR，并对各基因的表达量进行了分析。
图1(b)及(c)是向野生型C57BL/6小鼠的髓腔内分别注射GRP-皂草素或Nppb-皂草素后对脊髓中的GRPR及NPRA的mRNA的表达量进行分析得到的结果。
由对GRPR及NPRA的mRNA的表达量进行分析得到的结果确认到：通过注射GRP-皂草素或Nppb-皂草素，使得脊髓中的GRPR及NPRA的mRNA的表达量下降。
GRPR及NPRA的蛋白的表达量按照以下方式进行了分析。从小鼠摘取注射后的脊髓，由所摘取的脊髓制作切片。使用抗GRPR抗体及抗NPRA抗体，对所制作的切片进行了免疫组织化学分析。
图1(d)是向髓腔内注射GRP-皂草素或Nppb-皂草素后摘取脊髓并使用抗GRPR抗体及抗NPRA抗体进行免疫染色得到的结果。图1(d)中，比例尺显示10μm。
由对GRPR蛋白及NPRA蛋白的表达量进行分析得到的结果确认到：通过注射GRP-皂草素或Nppb-皂草素，使得脊髓中的GRPR及NPRA蛋白的表达量下降。
综合以上结果确认到：通过注射GRP-皂草素或Nppb-皂草素，除去了表达GRPR及NPRA的神经细胞。另外明确了：因施用IL-31引起的抓挠行为不是由Nppb介导的，而是由GRP介导的。
[实验例2]
(IL-31变异小鼠的制作)
为了对IL-31的功能进行分析，制作了IL-31基因缺损的小鼠。如上述那样，在紧接IL-31基因的外显子1之后***被FRT夹持的Neo Cassette。图2(a)是示意性表示IL-31基因、靶向载体及重组后的基因结构的图。
图2(a)中，WT等位基因是野生型C57BL/6小鼠的IL-31的基因结构的示意图，靶向载体是靶向载体的结构的示意图，重组等位基因是同源重组后的基因结构的示意图，KI等位基因是利用翻转酶除去Neo Cassette后的基因结构的示意图。
使用序列号9、10及11所示的引物并通过PCR判别了野生型C57BL/6小鼠和除去了neo的小鼠的基因型。图2(b)是利用2％的琼脂糖凝胶对各PCR产物进行电泳得到的图。图2(b)中，w/w表示野生型等位基因的基因型，KI/w表示野生型等位基因和KI等位基因杂合的基因型，KI/KI表示KI等位基因纯合的基因型。
以野生型C57BL/6小鼠的基因组作为模板的PCR产物的长度为300bp，以除去了IL-31基因的、基因敲入小鼠的基因组作为模板的PCR产物的长度为550个碱基对。由该结果确认到得到了基因敲入小鼠。
[实验例3]
(Dock8-/-AND Tg小鼠的分析)
对Dock8-/-AND Tg小鼠的皮炎及抓挠行为进行分析。另外，对在Dock8-/-AND Tg小鼠的背根神经节中表达量上升的基因进行了分析。
首先，通过HE染色对具有Dock8+/-Osmr+/+IL31+/+、Dock8-/-Osmr+/-IL31+/+、Dock8-/-Osmr-/-IL31+/+及Dock8-/-Osmr+/+IL31-/-的基因型的AND Tg小鼠的皮肤组织进行了分析。图3(a)是通过苏木精染色对各基因型的小鼠的皮肤组织进行分析得到的图。Osmr是编码制瘤素M受体(Oncostatin M receptor、OSMR)的基因，OSMR与IL-31受体α构成异源二聚体而将IL-31信号传导至细胞内。
由对皮肤组织进行分析得到的结果可知：Dock8基因缺损的AND Tg小鼠引起特应性皮炎样的皮炎，但该皮炎因Osmr或IL31基因的缺损而消失。
接着，对具有Dock8+/-Osmr+/+IL31+/+、Dock8-/-Osmr+/-IL31+/+、Dock8-/-Osmr-/-IL31+/+及Dock8-/-Osmr+/+IL31-/-的基因型的AND Tg小鼠的抓挠行为进行了分析。图3(b)是对各基因型的小鼠的抓挠行为进行分析得到的图。
由对抓挠行为进行分析得到的结果可知：Dock8基因缺损的AND Tg小鼠显示抓挠行为，但该抓挠行为因Osmr或IL31基因的缺损而消失。
进而，对具有Dock8+/-Osmr+/+IL31+/+、Dock8-/-Osmr+/-IL31+/+、Dock8-/-Osmr-/-IL31+/+及Dock8-/-Osmr+/+IL31-/-的基因型的AND Tg小鼠的血清中的、IL-31的浓度进行了分析。图3(c)是对各基因型的小鼠的血清中的、IL-31的浓度进行分析得到的结果。
由对IL-31的浓度进行分析得到的结果可知：Dock8基因缺损的AND Tg小鼠的血清中的IL-31的浓度上升，但该浓度的上升因IL-31基因的缺损而消失。
接着，使用微阵列对Dock8-/-AND Tg小鼠的背根神经节(dorsal root ganglion、DRG)中的表达量比Dock8+/-AND Tg小鼠的DRG中的表达量高的基因进行了分析。
由微阵列的分析结果可知：已知的信号传递因子及神经传递物质等的mRNA的表达量上升。其中之一为编码神经激肽B的Tac2。
接着，对具有Dock8+/-Osmr+/+IL31+/+、Dock8-/-Osmr+/-IL31+/+、Dock8-/-Osmr-/-IL31+/+及Dock8-/-Osmr+/+IL31-/-的基因型的AND Tg小鼠的DRG中的、Tac2的mRNA的表达量进行了分析。图3(d)是对各基因型的小鼠的DRG中的、Tac2的mRNA的表达量进行分析得到的结果。图3(b)～(d)中，与Dock8+/-Osmr+/+IL31+/+的数据相比，“＊”表示在p＜0.05时具有显著性差异，“＊＊”表示在p＜0.01时具有显著性差异。
Tac2的mRNA的表达量按照以下方式进行了分析。首先，从各基因型的小鼠的DRG中分离总RNA，以总RNA作为模板进行了逆转录反应。接着，进行定量PCR，对Tac2基因的mRNA的表达量进行了分析。
其结果表明：在Dock8基因缺损的AND Tg小鼠的DRG中，Tac2的mRNA的表达量上升至23倍。另外表明：该表达量的上升因Osmr或IL31基因的缺损而消失。
综合以上结果可知：在Dock8-/-AND Tg小鼠中，IL-31蛋白的产生量上升，IL-31蛋白通过包含OSMR的IL-31受体蛋白使Tac2基因的表达量上升。
[实验例4]
(由IL-31及NKB刺激引起的基因表达变化)
对由施用IL-31或NKB引起的、Tac2、Grp及Nppb的表达量变化进行了分析。首先，在体外通过施用IL-31蛋白对从野生型的C57BL/6小鼠中分离的DRG神经细胞进行刺激，并对Tac2、Grp及Nppb的mRNA的表达量进行了分析。图4(a)是施用IL-31后对各基因的mRNA的表达量进行分析得到的结果。
由对Tac2、Grp及Nppb的mRNA的表达量进行分析得到的结果可知：通过施用IL-31，使得Tac2和Grp的mRNA的表达量上升，但Nppb的表达量未上升。
接着，在体外通过神经激肽B(NKB)对从野生型的C57BL/6小鼠中分离的DRG神经细胞进行刺激，并对Grp及Nppb的mRNA的表达量进行了分析。图4(b)是施用NKB后对各基因的表达量进行分析得到的结果。
由对Grp及Nppb的mRNA的表达量进行分析得到的结果可知：通过NKB的刺激，使得Grp的mRNA的表达量上升。根据该结果认为NKB在GRP的上游发挥功能。
[实验例5]
(Dock8-/-AND Tg小鼠的DRG中的NKB的表达)
通过免疫染色对Dock8-/-AND Tg小鼠的DRG中的NKB和IL-31受体A(IL-31RA)的表达进行了分析。
从Dock8-/-AND Tg小鼠中分离DRG，制作切片。使用抗NKB抗体及抗IL-31RA抗体对所制作的切片进行了免疫组织化学分析。图5(a)是利用抗NKB抗体及抗IL-31RA抗体进行免疫染色的结果。
图5(a)中，“DAPI”表示DAPI染色的结果，“NKB”表示利用抗NKB抗体进行免疫染色的结果，“IL-31RA”表示利用抗IL-31RA抗体进行免疫染色的结果，“Merge”表示将利用抗NKB抗体进行的免疫染色、利用抗IL-31RA抗体进行的免疫染色及DAPI染色重叠的结果。比例尺显示100μm。
免疫染色的结果表明：在Dock8-/-AND Tg小鼠的DRG中，NKB在IL-31RA蛋白表现的细胞中表达。
接着，通过免疫染色对Dock8-/-AND Tg小鼠的DRG中的、NKB和瞬时受体电位阳离子通道香草酸亚型1(Transient receptor potential cation Channel vanilloid subtype1，TRPV1)蛋白的表达进行了分析。
TRPV1在感知痒感的感觉神经细胞中表达，该感觉神经细胞将神经轴突伸向脊髓背角的外层板I(outer layer lamina I)。
NKB及TRPV1的表达按照以下方式进行了分析。从Dock8-/-AND Tg小鼠中分离DRG，制作切片。使用抗NKB抗体及抗TRPV1抗体对所制作的切片进行了免疫组织化学分析。图5(b)是表示Dock8-/-AND Tg小鼠的DRG中的、NKB和TRPV1的表达的图。
图5(b)中，“DAPI”表示DAPI染色的结果，“NKB”表示利用抗NKB抗体进行免疫染色的结果，“TRPV1”表示利用抗TRPV1抗体进行免疫染色的结果，“Merge”表示将利用抗NKB抗体进行的免疫染色和利用抗TRPV1抗体进行的免疫染色重叠的结果。
免疫染色的结果表明：在Dock8-/-AND Tg小鼠的DRG中，在TRPV1表达的细胞的一部分中NKB表达。
[实验例6]
(Tac2基因变异小鼠的制作)
为了对Tac2基因的功能进行分析，使用CRISPR/Cas9核酸酶，制作了Tac2基因缺损的小鼠(Tac2-/-)。
图6(a)是示意性表示小鼠Tac2基因和被该基因编码的蛋白的图。成熟型且具有活性的Tac2蛋白被外显子6编码，该Tac2蛋白是由前体肽经过加工而合成的。在基于CRISPR/Cas9***的基因组编辑中使用的向导RNA设计在外显子4的内部。
通过上述基因组编辑，制作2个***的变异小鼠(Δ4及Δ15)。在PCR中，使用序列号7和序列号8所示的序列的引物。电泳使用MultiNA微芯片电泳***(MCE-202、岛津制作所)来进行。图6(b)是通过PCR和电泳来判别Tac2基因缺损小鼠的Tac2的基因型(Δ4及Δ15)的图。
图6(c)是表示2种变异的基因组序列和所转录的mRNA编码的氨基酸序列的图。缺失部位用Δ4(缺失4个碱基)及Δ15(缺失15个碱基)表示。图6(c)中，用实线表示编码序列，用框(box)表示剪接供体序列(splice donor sequence)。
按照以下方式来确定被转录的mRNA序列。首先，从各个变异小鼠的DRG神经细胞中分离总RNA，通过逆转录反应得到cDNA。使用序列号12和序列号13所示引物，通过PCR使这些cDNA扩增。通过TA克隆对扩增产物进行克隆，并对cDNA序列进行了分析。
2种变异均在外显子4具有缺失突变、并且在氨基酸序列引起移码(frameshift)。因此可知：变异的基因不编码成熟型肽序列。
[实验例7]
(Tac2变异小鼠的分析)
使用Tac2变异小鼠(Δ4及Δ15)，对在因施用IL-31而诱导的痒感的传递中Tac2基因编码的NKB蛋白发挥的作用进行了分析。
对Tac2-/-(Δ4)小鼠和Tac2+/-小鼠皮内注射了作为瘙痒引起物质的、组胺、氯喹、SLIGRL-NH2(PAR2激动剂)或IL-31。将结果示于图7中。
图7(a)是针对向Tac2-/-(Δ4)小鼠施用组胺后的抓挠行为进行分析得到的结果。图7(b)是针对向Tac2-/-(Δ4)小鼠施用氯喹后的抓挠行为进行分析得到的结果。图7(c)是针对向Tac2-/-(Δ4)小鼠施用PAR2激动剂(SLIGRL-NH2)后的抓挠行为进行分析得到的结果。图7(d)是针对向Tac2-/-(Δ4)小鼠施用IL-31后的抓挠行为进行分析得到的结果。图7(a)～(d)中，“＊”表示在p＜0.05时具有显著性差异。
据过去报道所示，对于Tac2-/-(Δ4)小鼠和Tac2+/-小鼠而言，组胺、氯喹及PAR2激动剂(SLIGRL-NH2)的施用引起了抓挠行为。对于Tac2+/-小鼠而言，IL-31的施用引起了抓挠行为，但是对于Tac2-/-(Δ4)小鼠而言，IL-31的施用几乎未引起抓挠行为。
对Tac2-/-(Δ15)小鼠和Tac2+/-小鼠进行了与上述同样的实验。将对抓挠行为进行分析得到的结果示于图8中。图8(a)是针对向Tac2-/-(Δ15)小鼠施用组胺后的抓挠行为进行分析得到的结果。图8(b)是针对向Tac2-/-(Δ15)小鼠施用IL-31后的抓挠行为进行分析得到的结果。
可知：对于Tac2-/-(Δ15)小鼠而言，与Tac2-/-(Δ4)小鼠的情况同样，组胺的施用引起了抓挠行为，但是IL-31的施用几乎未引起抓挠行为。
通过将Tac2-/-(Δ4)小鼠与Dock8-/-AND Tg小鼠交配，建立表达Tac2或不表达Tac2的(Tac2-/-(Δ4))Dock8-/-AND Tg小鼠，并对皮肤组织、抓挠行为及血清中的IL-31水平进行了分析。将结果示于图9中。
图9(a)是将皮肤组织在表达Tac2或不表达Tac2的Dock8-/-AND Tg小鼠间进行比较得到的结果，图9(b)是将抓挠行为在表达Tac2或不表达Tac2的Dock8-/-AND Tg小鼠间进行比较得到的结果，图9(c)是将血清IL-31水平在表达Tac2或不表达Tac2的Dock8-/-AND Tg小鼠间进行比较得到的结果。图9(a)～(c)中，“＊”表示在p＜0.05时具有显著性差异。可知：即使没有Tac2，IL-31的水平也无变化，但是皮炎及抓挠行为得到显著地改善。
[实验例8]
(神经激肽B的作用机序)
接着，为了确定NKB发挥功能的部位，对Tac2-/-(Δ4)小鼠髓腔内注射NKB并对抓挠行为进行了分析。图10(a)是对Tac2-/-(Δ4)小鼠髓腔内注射NKB并对抓挠行为进行分析得到的结果。
可知在对Tac2-/-(Δ4)小鼠髓腔内注射NKB蛋白时引起抓挠行为。该结果显示：NKB引起抓挠行为而不会使末梢神经活化。
接着，对因施用NKB引起抓挠行为的神经回路进行了分析。向野生型C57BL/6小鼠的髓腔内注射GRP-皂草素或Nppb-皂草素，在2周后注射NKB，并对抓挠行为进行了分析。
图10(b)是注射GRP-皂草素或Nppb-皂草素后注射NKB、并对抓挠行为进行分析得到的结果。图10(a)、(b)中，“＊”表示在p＜0.05时具有显著性差异，“＊＊”表示在p＜0.01时具有显著性差异。
除去了表达GRP受体的神经细胞的小鼠在NKB的施用后不显示抓挠行为，但是除去了表达Nppb受体的神经细胞的小鼠在NKB的施用后显示抓挠行为。该结果表明：NKB在GRP的上游发挥功能、是传递由IL-31诱导的痒感的神经传递物质。
[实验例9]
(NK3R的分析)
对NK3R的功能和局部存在情况进行了分析。
NK3R及TRPV1的表达按照以下方式进行了分析。从小鼠中摘取脊髓背角，由所摘取的脊髓背角制作切片。使用抗NK3R抗体及抗TRPV1抗体，对所制作的切片进行了免疫组织化学分析。图11(a)是对脊髓背角中的NK3R及TRPV1的表达进行分析得到的结果。图11(a)中，比例尺显示100μm。
可知：NK3R主要在处于脊髓背角的outer layer lamina I的神经细胞中表达。
接着，针对由IL-31诱导的痒感是否是由神经激肽3受体(Neurokinin 3receptor，NK3R)介导，进行了分析。
对于施用IL-31后在表达处于脊髓背角的NK3R的神经细胞中c-fos的活化进行了分析。将结果示于图11(b)中。
图11(b)中，“DAPI”是利用DAPI进行染色的图，“NK3R”是利用抗NK3R抗体进行免疫染色的图，“c-fos”是利用抗c-fos抗体进行免疫染色的图，“Merge”是将利用DAPI、抗NK3R抗体及抗c-fos抗体进行的免疫染色重叠的图。其结果表明：在表达NK3R的神经细胞中，通过施用IL-31，使得c-fos活化。比例尺显示10μm。
接着，向野生型C57BL/6小鼠的腹腔内注射作为NK3R的选择性拮抗剂且为抗精神病药的奥沙奈坦，然后，对于对由IL-31、组胺或氯喹诱导的抓挠行为带来的影响进行了分析。
图11(c)表示在奥沙奈坦注射后施用IL-31并对抓挠行为进行分析得到的结果。图11(d)表示在奥沙奈坦注射后施用组胺并对抓挠行为进行分析得到的结果。图11(e)表示在奥沙奈坦注射后施用氯喹并对抓挠行为进行分析得到的结果。图11(c)、(d)及(e)中，“＊”表示在p＜0.05时具有显著性差异，“＊＊”表示在p＜0.01时具有显著性差异。
其结果表明：奥沙奈坦的施用使得由IL-31引起的抓挠行为的频率下降，但是并未使由组胺及氯喹引起的抓挠行为的频率下降。
与奥沙奈坦同样，向野生型C57BL/6小鼠口服施用作为NK3R的选择性拮抗剂的非唑奈坦后，分析了对由IL-31、组胺或氯喹诱导的抓挠行为带来的影响。
图12(a)表示在口服施用非唑奈坦后施用IL-31并对抓挠行为进行分析得到的结果。图12(b)表示在非唑奈坦施用后施用组胺并对抓挠行为进行分析得到的结果。图12(c)表示在非唑奈坦施用后施用氯喹并对抓挠行为进行分析得到的结果。
其结果表明：非唑奈坦的施用使得由IL-31引起的抓挠行为的频率下降，但是并未使由组胺及氯喹引起的抓挠行为的频率下降。表明可得到与施用奥沙奈坦的情况同样的结果。
进而，对野生型C57BL/6小鼠施用其他的NK3R的选择性拮抗剂，即，他奈坦、帕维奈坦、SSR-146977及SB-235375，然后，分析了对由IL-31或氯喹诱导的抓挠行为带来的影响。
图13(a)表示在他奈坦注射后施用IL-31并对抓挠行为进行分析得到的结果。图13(b)表示在他奈坦注射后施用氯喹并对抓挠行为进行分析得到的结果。图14(a)表示在帕维奈坦注射后施用IL-31并对抓挠行为进行分析得到的结果。图14(b)表示在帕维奈坦注射后施用氯喹并对抓挠行为进行分析得到的结果。图15(a)表示在SSR-146977注射后施用IL-31并对抓挠行为进行分析得到的结果。图15(b)表示在SSR-146977注射后施用氯喹并对抓挠行为进行分析得到的结果。图18(a)表示在口服施用SB-235375后施用IL-31并对抓挠行为进行分析得到的结果。图18(b)表示在口服施用SB-235375后施用氯喹并对抓挠行为进行分析得到的结果。
图13、14、15及18所示的结果表明：NK3R的选择性拮抗剂他奈坦、帕维奈坦、SSR-146977及SB-235375的施用并未使由氯喹引起的抓挠行为的频率下降，但是使得由IL-31引起的抓挠行为的频率下降。这些结果与在施用奥沙奈坦及非唑奈坦的情况下得到的结果相同。
进而，对野生型C57BL/6小鼠施用CS-003(是针对神经激肽3受体(NK3R)的拮抗剂并且也是针对神经激肽1受体(NK1R)及神经激肽2受体(NK2R)的拮抗剂)、以及SSR-241586(是针对NK3R及NK2R的拮抗剂)，然后，分析了对由IL-31或氯喹诱导的抓挠行为带来的影响。
图16(a)表示在SSR-241586注射后施用IL-31并对抓挠行为进行分析得到的结果。图16(b)表示在SSR-241586注射后施用氯喹并对抓挠行为进行分析得到的结果。图17(a)表示在CS-003注射后施用IL-31并对抓挠行为进行分析得到的结果。图16(b)表示在CS-003注射后施用氯喹并对抓挠行为进行分析得到的结果。
图16及17所示的结果表明：作为NK3R的非选择性拮抗剂并且还具有作为NK3R拮抗剂的活性的化合物并未使由氯喹引起的抓挠行为的频率下降，但是使得由IL-31引起的抓挠行为的频率下降。
予以说明，在图12～图18的各图中，“＊”表示在p＜0.05时具有显著性差异，“＊＊”表示在p＜0.01时具有显著性差异。
综上表明：通过施用IL-31，使得表达NK3R的神经细胞活化。另外，NK3R的药理学上的抑制是选择性地抑制由IL-31引起的抓挠行为。
产业上的可利用性
根据本发明，可以提供包含神经激肽B信号阻断剂作为有效成分的IL-31介导性疾病的预防或治疗剂。
序列表
<110> 国立大学法人九州大学
国立大学法人富山大学
<120> IL-31介导性疾病的预防或治疗剂及医药组合物
<130> QP180030-PC
<150> JP2018-215017
<151> 2018-11-15
<150> JP2019-144913
<151> 2019-08-06
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 烟草天蛾
<400> 1
Ala Asn Glu Arg Ala Asp Leu Ile Ala Tyr Leu Lys Gln Ala Thr Lys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Asp Met His Asp Phe Phe Val Gly Leu Met
1 5 10
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于CRISPR的互补寡核苷酸1
<400> 3
caccgagtgc tgagcaaggc tagcg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于CRISPR的互补寡核苷酸2
<400> 4
aaaccgctag ccttgctcag cactc 25
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 化脓性链球菌
<400> 5
gagtgctgag caaggctagc g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 化脓性链球菌
<400> 6
cgctagcctt gctcagcact c 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 7
ctctccccta caaggactct ga 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 8
ccaatctaat cttcagaacg cc 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 9
agcgggcctt cctcactctc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 10
gggcaccgga ggacaagctg 20
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 11
ccttgatgcc gttcttctgc ttgtc 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 12
agggagggag ggctcagtaa ggac 24
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 13
ccaacaggag gaccttacag gcagg 25
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 来自图6的序列
<400> 14
aaagtgctga gcaaggctag cgtgggtagg acgaggctct g 41
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 来自图6的序列
<400> 15
gcctgccttc aacaggacca aaggagacat ca 32
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 来自图6的序列
<400> 16
aaagtgctga gcaaggcgtg ggtaggacga ggctctg 37
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 来自图6的序列
<400> 17
aaagtgctga gcaaggctag gctctg 26
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 来自图6的序列
<400> 18
Lys Val Leu Ser Lys Ala Ser Val
1 5
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 来自图6的序列
<400> 19
Gly Pro Lys Glu Thr Ser
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 来自图6的序列
<400> 20
Lys Val Leu Ser Lys Ala Trp
1 5
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 来自图6的序列
<400> 21
Asp Gln Arg Arg His His
1 5
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 来自图6的序列
<400> 22
Lys Val Leu Ser Lys
1 5
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 来自图6的序列
<400> 23
Asp Gln Arg Arg His His
1 5

Claims (22)

1.一种IL-31介导性疾病的预防或治疗剂，其包含神经激肽B信号阻断剂。
2.根据权利要求1所述的预防或治疗剂，其中，所述IL-31介导性疾病为特应性皮炎、特应性皮炎的瘙痒症、皮肌炎、皮肌炎的瘙痒症、慢性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎、皮肤T细胞淋巴瘤的瘙痒症、结节性痒疹、慢性多形性痒疹、色素性荨麻疹或大疱性类天疱疮。
3.根据权利要求1所述的预防或治疗剂，其中，所述IL-31介导性疾病为特应性皮炎。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的预防或治疗剂，其中，所述神经激肽B信号阻断剂为神经激肽3受体拮抗剂。
5.根据权利要求4所述的预防或治疗剂，其中，所述拮抗剂为下式通式(1)、(2)或(3)所示的化合物或其盐或者它们的溶剂合物，
Figure FDA0003061922490000011
式(1)中，
Ar表示哌啶基；吡啶-2-基；苯基；或者被卤素原子、甲基或碳原子数1～4的烷氧基取代的苯基；
R1表示甲基；R11表示氢原子；或者R1及R11一起表示-(CH2)3-基或-(CH2)2O-基；
R2表示羟基；C1-7烷氧基；C1-7酰氧基；氰基；-NR6R4基；-NR3COR4基；-NR3COOR8基；-NR3SO2R9基；-NR3CONR10R12基；C1-7酰基；C1-7烷氧基羰基；-CONR10R12基；-CH2OH基；C1-7烷氧基甲基；C1-7酰氧基甲基；C1-7烷基氨基羰基氧基甲基；-CH2NR13R14基；-CH2NR3COR4基；-CH2NR3COOR8基；-CH2NR3SO2R9基；或-CH2NR3CONR10R12基；或者，R2与其所键合的碳原子及其相邻的哌啶环的碳原子之间形成双键；或者，Ar及R2与它们所键合的哌啶环一起形成下式(1a)或(1b)所示的基团；
Figure FDA0003061922490000021
R3表示氢原子或C1-4烷基；R4表示氢原子、C1-7烷基、苯基、苄基、吡啶基、无取代的C3-7环烷基、或被1个以上的甲基取代的C3-7环烷基；或者，R3及R4一起表示-(CH2)n-基，其中，n为3或4；
T表示亚甲基、羰基、-COO-基、或-CONR5-基；A表示单键、亚甲基、亚乙基、亚丙基、或亚乙烯基；或者，-T-A-表示-SO2-基；
Z表示苯基、或者被1个以上的卤素原子、C1-4烷基、C1-4烷氧基或硝基取代的苯基；
R5表示氢原子或C1-4烷基；
R6表示氢原子或C1-7烷基；R7表示氢原子、C1-7烷基、C3-7环烷基甲基、苄基或苯基；或者，R6及R7与它们所键合的氮原子一起构成选自由氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基及氮杂环庚烷基组成的组中的杂环；
R8表示C1-7烷基或苯基；
R9表示下述基团：
C1-7烷基；
氨基或者被1或2个C1-7烷基取代的氨基；
苯基；
被选自由卤素原子、C1-7烷基、三氟甲基、羟基、C1-7烷氧基、羧基、C1-7烷氧基羰基、C1-7烷基羰基氧基、氰基、硝基、氨基及被1或2个C1-7烷基取代的氨基组成的组中的1或多个基团取代的苯基，其中，在所选择的基团为多个的情况下，多个基团彼此可以互为相同或不同；
R10表示氢原子或C1-7烷基；R12表示氢原子、C1-7烷基、C3-7环烷基、C3-7环烷基甲基、羟基、C1-4烷氧基、苄基或苯基；或者，R10及R12与它们所键合的氮原子一起构建选自由氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基及氮杂环庚烷基组成的组中的杂环；
R13表示氢原子或C1-7烷基；
R14表示氢原子、C1-7烷基、C3-7环烷基甲基或苄基；
n3为2或3；
其中，在Ar为苯基、R2为羟基、-T-A-Z为苯甲酰基的情况下，R1不为甲基；在Ar为苯基、R2为-NHCOCH3基、-T-A-Z为苯甲酰基的情况下，R1及R11不一起形成-(CH2)3-基；在Ar为苯基、R2为羟基、-T-A-Z为3-甲氧基苄基的情况下，R1及R11不一起形成-(CH2)3-基；在Ar为苯基、R2为-NHCOCH3基、-T-A-Z为苄基氧基羰基的情况下，R1不为甲基；
Figure FDA0003061922490000031
式(2)中：
Y为下式(2a)或(2b)所示的基团；
Figure FDA0003061922490000032
Ar2表示可以根据需要被取代的苯基、萘基或C5-7环二烯基；或者可以根据需要被取代的具有芳香族特性、包含5～12个环原子且在环中或各环中包含选自硫原子、氧原子及氮原子中的至多4个杂原子的单杂环基或稠杂环基；
R100表示直链或支链的C1-8烷基、C3-7环烷基、C4-7环烷基烷基、可以根据需要被取代的苯基或苯基C1-6烷基、可以根据需要被取代的包含选自氧原子及氮原子中的至多4个杂原子的五元杂芳环、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、C1-6烷基氨基烷基、二C1-6烷基氨基烷基、C1-6酰基氨基烷基、C1-6烷氧基烷基、C1-6烷基羰基、羧基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷氧基羰基C1-6烷基、氨基羰基、C1-6烷基氨基羰基、二C1-6烷基氨基羰基、或者卤代C1-6烷基；或者，在成环为Ar2的情况下，形成基-(CH2)p-，其中，p为2或3；
R101及R102可以相同或不同，独立地为氢原子、C1-6直链或支链的烷基、或者一起形成-(CH2)n1-基，其中，n1为3、4或5；或者，R101与R100一起形成基-(CH2)q-，其中，q为2、3、4或5；
R110为R103或(R405)q1；
R111为R104或者下式(2c)或(2g)所示的基团；
Figure FDA0003061922490000041
R112为R105或下式(2d)所示的基团；
Figure FDA0003061922490000042
R401选自氢原子、C1-4烷基、C3-6环烷基及C1-4烷基OC(O)-；
A2为苯基或C3-7环烷基；
R402各自独立地选自氢原子、-OH、-NH2、-CN、卤素原子、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6烷氧基及C1-6烷氧基C1-6烷基；
n2为1、2或3；
R403各自独立地选自氢原子、-OH、-NH2、-NO2、-CN、卤素原子、C1-6烷基、C1-6烷氧基及C1-6烷氧基C1-6烷基；
m为1、2或3；
r1为0、1、2或3；
r2为1、2或3；
R404及R409选自C1-4烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C3-7环烷基及E-(CH2)b-，其中，E选自-NR406R407、-SR406、-SOC1-6烷基、-SO2C1-6烷基、N+(O-)R406R407、-NR406SO2R407、芳基及具有1、2、3或4个氮原子的N-或C-连接的五或六元芳香族或非芳香族的杂环式环或者其N-氧化物，而且，b为0、1、2、3、4或5；
R405各自独立地选自氢原子、-OH、-CN、卤素、-R406、-OR406、-NR406R407、-SR406、-SOR406及-SO2R406；
q1为1、2或3；
其中，
R406及R407各自独立地选自氢原子、C1-6直链或支链烷基、C2-6直链或支链烯基或炔基、及具有0、1或2个双键或三键的C3-7碳环式基，其中，该基团为非取代，或者被选自-OH、＝O、-NH2、-CN、卤素原子、芳基及C1-3烷氧基中的1个或1个以上的基团取代；
R408选自氢原子、C1-5直链或支链烷基、及C3-5环烷基，该基团为非取代，或者被选自-OH、＝O、-NH2、-CN、卤素、芳基及C1-3烷氧基中的1个或1个以上的基团取代；
而且，在R404为E-(CH2)b-、并且该E为N或C连接的五或六元芳香族或非芳香族的杂环式环或者其N-氧化物的情况下，该E为非取代，或者独立地选自-OH、＝O、-NH2、-CN、卤素原子、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷基-CO-、-NR406R407、芳基、及具有1、2、3或4个氮原子的N-或C-连接的五或六元芳香族或非芳香族的杂环式环或者其N-氧化物；
而且，在R401、R402、R403或R404为烷基、环烷基、烷氧基或烷氧基烷基的情况下，该基团为非取代，或者各自独立地具有选自-OH、-NH2、-CN、苯基及卤素中的1、2、3、4或5个取代基；
R103及R104可以相同或不同，独立地选自氢原子、C1-6直链或支链的烷基、C1-6烯基、芳基、C1-6烷氧基、羟基、卤素原子、硝基、氰基、羧基、羧基酰胺基、磺酰胺基、C1-6烷氧基羰基、三氟甲基、酰基氧基、邻苯二甲酰亚胺基、氨基、单-及二-C1-6烷基氨基、-O(CH2)r-NW2基、-O(CH2)t-OE2基、羟基烷基、氨基烷基、单-或二-烷基氨基烷基、酰基氨基、烷基磺酰基氨基、氨基酰基氨基、以及单-或二-烷基氨基酰基氨基；在喹啉核中可以存在至多4个R103取代基；或者，在成环为作为芳基的R105的情况下，R104形成-(CH2)e-基；
在-O(CH2)r-NW2基中，r为2、3或4，W为氢原子或C1-6烷基、或者其与相邻的氮形成下述基团：
Figure FDA0003061922490000061
或者
Figure FDA0003061922490000062
式(2e)或(2f)中，V及V1独立地表示氢原子或氧原子，u为0、1或2，
在-O(CH2)t-OE2基中，t为2、3或4，E为氢原子或C1-6烷基，
在-(CH2)e-基中，e为1、2或3，
R105表示支链或直链的C1-6的烷基、C3-7的环烷基、C4-7的环烷基烷基、可以根据需要被取代的芳基、或者可以根据需要被取代的具有芳香族特性、包含5～12个环原子且在环中或各环中包含选自硫原子、氧原子及氮原子中的至多4个杂原子的单杂环基或稠杂环基；
X表示氧原子、硫原子或＝N-C≡N；
Figure FDA0003061922490000063
式(3)中，
R301为氢原子、氟原子或甲基，
R301为氢原子，
R302为氢原子、氟原子、氯原子或甲氧基，
R302为氢原子或氟原子，
R303为氢原子、氟原子、氯原子、甲基、三氟甲基或腈基，
R304为甲基、乙基、正丙基、羟基乙基、甲氧基乙基、三氟甲基、二氟甲基或氟甲基，
R305为甲基、乙基、甲氧基甲基、三氟甲基、二氟甲基、氟甲基、1-氟乙基、1,1-二氟乙基或2,2,2-三氟乙基，
X1为氮原子且X2为硫原子或氧原子，或者X1为硫原子且X2为氮原子，
Figure FDA0003061922490000071
对应于X1及X2而表示单键或双键，
Figure FDA0003061922490000072
表示式(3)的化合物的(R)-镜像异构体或外消旋化合物。
6.根据权利要求5所述的预防或治疗剂，其中，所述式(1)所示的化合物为奥沙奈坦。
7.根据权利要求5所述的预防或治疗剂，其中，所述式(1)所示的化合物为SSR-146977。
8.根据权利要求5所述的预防或治疗剂，其中，所述式(1)所示的化合物为SSR-241586。
9.根据权利要求5所述的预防或治疗剂，其中，所述式(1)所示的化合物为CS-003。
10.根据权利要求5所述的预防或治疗剂，其中，所述式(2)所示的化合物为他奈坦。
11.根据权利要求5所述的预防或治疗剂，其中，所述式(2)所示的化合物为帕维奈坦。
12.根据权利要求5所述的预防或治疗剂，其中，所述式(2)所示的化合物为SB-235375。
13.根据权利要求5所述的预防或治疗剂，其中，所述式(3)所示的化合物为非唑奈坦。
14.根据权利要求1～3中任一项所述的预防或治疗剂，其中，所述神经激肽B信号阻断剂为速激肽加工酶的抑制剂或速激肽加工酶的分解促进剂。
15.根据权利要求14所述的预防或治疗剂，其中，所述抑制剂为前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 1、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 2、羧肽酶E、或肽酰甘氨酸α酰胺化单加氧酶的抑制剂。
16.根据权利要求1～3中任一项所述的预防或治疗剂，其中，所述神经激肽B信号阻断剂为神经激肽B(NKB)、神经激肽3受体、速激肽加工酶、胃泌素释放肽(GRP)或GRP受体的表达抑制剂。
17.根据权利要求1～3中任一项所述的预防或治疗剂，其中，所述神经激肽B信号阻断剂为表达神经激肽3受体或GRP受体的神经细胞的除去剂。
18.根据权利要求17所述的预防或治疗剂，其中，所述除去剂为结合有细胞毒性物质的、GRP、针对GRP受体的特异性结合物质、NKB或针对神经激肽3受体的特异性结合物质。
19.根据权利要求18所述的预防或治疗剂，其中，所述细胞毒性物质为核糖体钝化蛋白或白喉毒素。
20.根据权利要求19所述的预防或治疗剂，其中，所述核糖体钝化蛋白为皂草素、蓖麻毒素或相思子毒素。
21.一种IL-31介导性疾病的预防或治疗用医药组合物，其包含权利要求1～20中任一项所述的预防或治疗剂及药学上可允许的载体。
22.一种特应性皮炎的预防或治疗用医药组合物，其包含权利要求1～20中任一项所述的预防或治疗剂及在药学上可允许的载体。
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