CN113189291B - 一种自然水系水质状况评估方法及其应用 - Google Patents

一种自然水系水质状况评估方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113189291B
CN113189291B CN202110483266.6A CN202110483266A CN113189291B CN 113189291 B CN113189291 B CN 113189291B CN 202110483266 A CN202110483266 A CN 202110483266A CN 113189291 B CN113189291 B CN 113189291B
Authority
CN
China
Prior art keywords
water quality
water
index
quality condition
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110483266.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113189291A (zh
Inventor
徐梁
刘伟
柳曹敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Lvxi Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Lvxi Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Lvxi Biotechnology Co ltd filed Critical Guangzhou Lvxi Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110483266.6A priority Critical patent/CN113189291B/zh
Publication of CN113189291A publication Critical patent/CN113189291A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113189291B publication Critical patent/CN113189291B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/18—Water
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种自然水系水质状况评估方法及其应用，包括如下步骤：(1)测定待测水系的水体中及底泥中各功能基因的绝对拷贝数；(2)将所述各基因的绝对拷贝数代入水质指标模型，获得水质指标的代表参数Xi；(3)将所述代表参数Xi带入自然水系综合水质状况评价模型获得综合水质状况指数Q，依据Q值确定水体水质状况。该方法基于水体功能基因丰度来评价水质状况，克服了传统的水质状况的综合评价方法在分子生物学层面上的空缺，评价角度新颖，评价结果客观、合理和可靠，对样品检测无时限性要求。

Description

一种自然水系水质状况评估方法及其应用
技术领域
本发明属于环境监测领域，具体涉及一种淡水水系水质状况评估方法及其应用。
背景技术
随着社会经济的快速发展，自然水体的污染问题也越来越受到关注。尤其是伴随着工业的进步，自然水体也越来越容易受到污染。在自然水体中，生活废水以及农业肥料中的氮磷废水会通过地表径流等方式进入江河湖泊中，另有少量的偷排、暗排工业废水的情况也在不断加剧自然水体的污染程度，造成大量自然水体水质下降，水体生态环境受到破坏。据统计，由于上述原因造成的黑臭水体或富营养化已屡见不鲜，可见，自然水体的污染形势依然十分严峻。
河流水质状况评价是对自然水体的水污染情况进行综合评价的重要手段，也是合理治理、保护和利用河流的基础工作，在水污染治理领域具有重要参考意义。相关技术中常用的河流水污染评价的方法主要有：单因子评价法、综合污染指数法、水污染指数法以及综合水质标识指数法等，但这些评价方法都是基于对水体各项水质指标的测定，相对得到的结论较为宏观。在生物学层面上，相关技术中常用的评价方法主要是生物完整性指数法(IBI)，分为了F-IBI(鱼类)、B-IBI(底栖动物)、A-IBI(固着藻类)、P-IBI(浮游生物)、AP-IBI(水生植物)以及基于微生物学的M-IBI(微生物)，从生物学角度来对不同特征水体进行综合评价，但其结论同样是较为宏观，可参考意义不大。而在分子分子生物学层面上，目前尚未有对于河流水质状况的综合评价方法。
因此，开发一种能够多方面、准确有效的评价自然水系水质状况的评估方法对于自然水系水质状况监测以及环境治理具有极为重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种自然水系水质状况评估方法，能够综合分子生物学层面和宏观指标，通过特定的公式量级关系，准确的反映出水体水质状况，从而弥补现有技术中的水质状况的综合评价方法在分子生物学层面上的空缺。
本发明的第一个方面，提供一种自然水系水质状况评估方法，包括如下步骤：
(1)测定待测水系的水体中及底泥中各功能基因的绝对拷贝数；
(2)将所述各基因的绝对拷贝数代入水质指标模型，获得水质指标的代表参数Xi；
(3)将所述代表参数Xi代入自然水系综合水质状况评价模型获得综合水质状况指数Q，依据Q值确定水体水质状况。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中的功能基因的绝对拷贝数的测定具体操作步骤如下：
①采集待测水系的水体样品及对应位置的底泥沉积物样品，水体样品为水系(如河流)中部水深至少0.5m处的水体，底泥沉积物样品为取自水体样品取样点下方的表层泥层(泥层取样深度至少5cm)；
②提取步骤①获得的水体样品和底泥沉积物样品中的gDNA；
③通过构建质粒的方式利用qPCR技术测定各基因拷贝数。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中所述水质指标模型的公式为：
其中，所述水质指标模型公式中，Xi为第i种水质指标代表参数；
ci为第i种水质指标的模型的常数；
aij为第i种水质指标模型中第j种基因类型所代表的相关系数；
bij为第i种水质指标模型中第j种基因类型的绝对拷贝数；
n为指标种类数量。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(3)中所述自然水系综合水质状况评价模型的公式为：
其中，在自然水系综合水质状况评价模型公式中，Xi为的第i种水质指标代表参数；
Yi为指标i对应GB3838-2002中的III类地表水的指标i的限值；
XDO为DO的水质指标代表参数；
YDO为DO对应GB3838-2002中的III类地表水的DO限值；
Q为综合水质状况指数；
n为指标种类数量。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(3)中Q与水体水质状况的对应关系为：
本发明中得到的综合水质状况指数Q可类比《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)和《污水综合排放标准》(GB8978-1996)中的相关指标，其中，本发明中的优对应I类水，良为II与III类水，中为VI与V类水，差为V类水与一级A排放标准之间的水体，极差为大于一级A排放标准的水质。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述功能基因包括nirS、nirK、napA、narG、nosZ以及amoA基因。
当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，合理调整所需的功能基因，使其达到最佳使用效果，可使用的功能基因包括但不限于nirS、nirK、napA、narG、nosZ以及amoA基因。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中所述水质指标包括无机铵氮含量、总氮、总磷、化学需氧量、溶解氧含量。
当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，合理调整所需的水质指标，使其达到最佳使用效果，可使用的水质指标包括但不限于无机铵氮含量、总氮、总磷、化学需氧量、溶解氧含量。
本发明的第二个方面，提供一组功能基因引物组，该引物组靶向nirS、nirK、napA、narG、nosZ以及amoA基因。
nirS、nirK、napA、narG、nosZ以及amoA基因为自然水系中具有水质调节和污染物降解能力的微生物的特征性基因，针对与该功能基因的引物可以有效检测出样品中该类微生物的丰度及生长情况。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述引物组的核苷酸序列为：
nirS-F：5'-GTSAACGTSAAGGARACSGG-3'(SEQ ID NO.1)；
nirS-R：5'-GASTTCGGRTGSGTCTTGA-3'(SEQ ID NO.2)；
nirK-F：5'-ATCATGGTSCTGCCGCG-3'(SEQ ID NO.3)；
nirK-R：5'-GCCTCGATCAGRTTGTGGTT-3'(SEQ ID NO.4)；
napA-F：5'-AACCAGCATACBCGYGGCGT-3'(SEQ ID NO.5)；
napA-R：5'-ACCGGCCAGCGCAGRCCGCG-3'(SEQ ID NO.6)；
narG-F：5'-GAAGAYGAGAAGATCCGCTT-3'(SEQ ID NO.7)；
narG-R：5'-TCCTGVGCGTGGTACATCAT-3'(SEQ ID NO.8)；
nosZ-F：5'-CGGYTGGGGSMWKACCAA-3'(SEQ ID NO.9)；
nosZ-R：5'-AAYGANCARYTGATCCGYAT-3'(SEQ ID NO.10)；
amoA-F：5'-GCAGGAGAYTAYATCTTCTA-3'(SEQ ID NO.11)；
amoA-R：5'-GCCATCCATCTGTAWGTCCA-3'(SEQ ID NO.12)。
本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的评估方法、本发明第二个方面所述的功能基因引物组在水环境治理中的应用。
水体中，功能微生物对污染物的降解具有重要作用，是水体自净的一个重要组分部分，而微生物对污染物的降解是依靠其含有的功能基因来负责调控的，因此，功能基因的丰度与水体水质之间存在一定的相关性。利用实时荧光PCR技术能够通过扩增目的基因片段得到目的基因的绝对拷贝数，以此可以测定出水体中各功能基因的丰度，反映河流水质状况，从而弥补传统水质状况的综合评价方法在分子生物学层面上的空缺。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述水环境为淡水自然水系。
在本发明的一些优选实施方式中，所述水环境为河流和湖泊。
本发明的有益效果是：
1.本发明中的自然水系水质状况评估方法主要基于水体功能基因丰度来评价水质状况，能克服传统的水质状况的综合评价方法在分子生物学层面上的空缺。
2.本发明中的自然水系水质状况评估方法选用与各水质指标具有相关性的水体及底泥中功能基因拷贝数作为各水质指标模型中的自变量，并依据相关性大小系数大小和多元回归分析构建了各水质指标模型，该水质指标模型能够基于比值法与国家环境质量指标进行类比，从而将各水质指标参数换算为河流综合水质状况指数并确定其评价标准，方法准确，操作难度低。
3.本发明中的自然水系水质状况评估方法与常规水质检测方法相比，无需要求对样品进行现场检测，可以将样品过滤后进行长时间冻存再进行检测，且评价角度新颖，评价结果客观、合理和可靠。
附图说明
图1为本发明实施例中的取样地点示意图；
图2为水样和底泥样品的gDNA电泳图，其中S1～S6为水样，N1～N6为底泥样品；
图3为本发明实施例中的功能基因(napA、narG)的电泳图，其中1～4泳道为napA，5～8泳道为narG；
图4为本发明实施例中的功能基因(nirS、nirK)的电泳图；
图5为本发明实施例中的功能基因(nosZ)的电泳图；
图6为本发明实施例中的功能基因(amoA)电泳图；
图7为本发明实施例中的方法与常规方法的Q值对比。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
一种自然水系水质状况评估方法
具体实施步骤如下：
(1)测定待测水系的水体中及底泥中各功能基因的绝对拷贝数。
其中，步骤(1)中的功能基因的绝对拷贝数的测定具体操作步骤如下：
①采集待测水系的水体样品及对应位置的底泥沉积物样品，水体样品为水系(如河流)中部水深至少0.5m处的水体，底泥沉积物样品为取自水体样品取样点下方的表层泥层(泥层取样深度至少5cm)。
②提取步骤①获得的水体样品和底泥沉积物样品中的gDNA。gDNA的提取方法可采用任意常规技术手段，在本发明实施例中，采用改良CTAB法提取水体样品中的gDNA，采用“溶菌酶-SDS-一次沉淀法”提取底泥沉积物样品中的gDNA。
③各基因拷贝数的测定：
步骤③中主要测定的基因为nirS、nirK、napA、narG、nosZ以及amoA基因，检测方法可采用任意常规技术手段，在本发明实施例中，发明人通过构建nirS、nirK、napA、narG、nosZ以及amoA基因的质粒载体，利用Nanodrop 2000微量分光光度计测定所获得的各质粒载体的DNA浓度(OD260)，结合质粒的总长度，利用公式1计算出基因的初始拷贝数。
其中，nirS、nirK、napA、narG、nosZ以及amoA基因的质粒载体的构建方法可参考本领域中常规的质粒构建方法，在本发明实施例中，采用的质粒构建方法具体为：
以步骤②提取的gDNA为模板，以表1所示引物，利用PCR扩增出含有目的基因片段的PCR产物，通过电泳验证其正确性，对正确条带进行切胶回收。从凝胶中回收纯化DNA，将纯化后的DNA片段与pMD18-T质粒进行重组，将目的基因导入质粒体内，将转化后的质粒导入到DH5α感受态细胞内，并对其进行平板筛选，对所获得的阳性菌落进行摇菌扩繁后，提取感受态细胞中的质粒，对所提质粒进行PCR-电泳验证后，对含有正确条带的质粒进行测序，并将其序列在NCBI上进行Blast比对，验证其是否为目的基因序列。
公式1具体为：
表1各基因质粒载体PCR扩增引物
(2)将各基因拷贝数代入各水质指标模型，获得各水质指标的代表参数Xi。
在本发明实施例中，步骤(2)中的各水质指标模型，属于多元线性回归模型，其自变量为水质指标相关的各基因拷贝数，其系数与常数是由水质指标与各基因拷贝数的Pearson相关性以及多元回归分析结果来确定的。
其意义在于：其可以基于理化指标与功能基因丰度之间的相关性，通过多元回归分析的方法将理化指标与功能基因丰度联系起来，并通过综合各个指标并与国家水环境质量标准进行比较，从而在分子生物学层面上，通过测定各功能基因的绝对拷贝数来确定水体的综合水质。
具体的模型公式(公式2)为：
其中，在公式2中，Xi为第i种水质指标代表参数；
ci为第i种水质指标的模型的常数；
aij为第i种水质指标模型中第j种基因类型所代表的相关系数；
bij为第i种水质指标模型中第j种基因类型的绝对拷贝数；当其表示水体样品中的拷贝数时，单位为copies/mL；当其表示底泥沉积物样品中的拷贝数时，单位为copies/g；
n为指标种类数量。
各水质指标模型中具体的常数ci以及各基因类型的相关系数aij如表2所示。
表2各水质指标模型中的常数和相关系数
其中，nirSs、nirKs、nosZs、napAs、narGs、amoAs分别为水体样品中各基因的系数，nirSn、nirKn、nosZn、napAn、narGn、amoAn分别为底泥沉积物样品中各基因的系数，“/”表示系数为0。
NH4 +-N代表无机铵氮含量，TN代表总氮，TP代表总磷，COD代表化学需氧量，DO代表溶解氧含量。
(3)将代表参数Xi带入自然水系综合水质状况评价模型获得综合水质状况指数Q，依据Q值确定水体水质状况。
其中，自然水系综合水质状况评价模型是基于各项水质指标的代表参数，可参考《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)中所规定的五类水以及《污水综合排放标准》(GB8978-1996)中对于各水质指标的限值计算得到。
综合水质状况指数Q的具体计算公式(公式3)为：
其中，在公式3中，Xi为的第i种水质指标代表参数(由公式2计算得出，DO除外)；
Yi为指标i对应《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)中的III类地表水的指标i的限值(DO除外)；
XDO为DO的水质指标代表参数；
YDO为DO对应《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)中的III类地表水的DO限值；
Q为综合水质状况指数；
n为指标种类数量。
通过综合水质状况指数Q，可以确定水体水质状况，其中，综合水质状况指数Q与水体水质状况的具体关系如表3所示。
Q值 Q≤0.37 0.37<Q≤1 1<Q≤2.1 2.1<Q≤6.5 Q>6.5
水质状况 优 良 中 差 极差
表3水质状况评价标准
根据表3可知，综合水质状况指数Q越小，表示该水体的水质状况越好，Q值越大，表示水体水质状况越差。类比《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)和《污水综合排放标准》(GB8978-1996)，本实施例中的优对应I类水，良为II与III类水，中为VI与V类水，差为V类水与一级A排放标准之间的水体，极差为大于一级A排放标准的水质。
自然水系水质状况评估方法的应用
为了验证本发明实施例中的自然水系水质状况评估方法的有效性和准确性，发明人使用该方法与传统方法进行实地对比验证。
(1)实验地点选择：
在本实施例中，采样点选择具有珠江流域特征的佛山市解放涌(地理坐标为111.996-112.976°E，23.12-23.2°N)，于2020年9月21日分别在其上游、中上游、中游、中下游、下游五个位置采集水样及浅层底泥，具***置参见图1。
佛山市解放涌位于佛山市南海区北部的狮山镇，河流全长约10.6公里，其上游水来自北江干流，下游水流向西南涌，属于珠江水系的分支之一。该段河流所存在的支流较少，河流上游到下游周边存在居民区、农田区以及工业园区，其中，中游至下游段存在印刷厂、建材厂、橡塑厂以及饮品加工厂等大范围的工业园区，因此，采用等距离选取上游、中上游、中游、中下游、下游五个点的水样能够很好的体现出河水在空间位置上的水质差异。
(2)样品采集：
在5个采样点采用便携式水样采集器在河流中间位置以及湖泊远岸边采集0.5m水深的水样200mL，每个采样点采集3份样品(即共600mL)。采用同样的方式，利用便携式底泥采样器采集对应水样点下的表层底泥500mL。
采集完水样后，于当天内取200mL用0.25μm微孔滤膜过滤，滤膜置于-80℃冰箱保存，剩余水样冷冻保存，底泥样品置于-80℃保存。
(3)水样样品测定：
在采样现场，根据上述实施例中的方法，对每个采集点的其中两份水样采用便携式多参数水质分析仪(hq40d)测定水样水温、溶解氧的数据，采样完成后在实验室对pH、DO、COD、TP、TN以及NH4 +-N等常规指标进行测定，所有常规指标的测定方法均按照国家水质指标测定标准来执行，测定结果如表4所示。
表4样品水质监测值
(4)样品基因拷贝数的测定：
①水样gDNA的提取：
本实施例采用改良CTAB法对水样gDNA进行提取，具体步骤可按照本领域常规操作进行。
②底泥样品gDNA的提取：
由于底泥样品中含有较多石英、黏土以及腐殖酸等物质，水样gDNA的提取方法无法适用于底泥样品的提取，因此，本实施例采用“溶菌酶-SDS-一次沉淀法”提取底泥样品中的gDNA。
具体步骤为：
称取0.6g底泥样品，加入1.2mL的2％CTAB抽提液(2g CTAB粉末、8.182gNaCl晶体、10mL 1mol/L Tris-HCl溶液、4mL 0.5mol/L EDTA溶液，加水定容至100mL)，涡旋振荡5min。加入溶菌酶(终浓度2mg/L)，37℃条件下250rpm摇床混匀1h，加入10％SDS(终浓度2％(v/v))。65℃水浴2h，其中，每15min轻轻摇匀一次。8000rpm离心10min，收集上清，加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液萃取(按体积比计，苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)。4℃条件下12000rpm离心10min，吸取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液萃取(按体积比计，氯仿：异戊醇＝24：1)。4℃条件下12000rpm离心10min，吸取上清，加入0.6倍体积的预冷异丙醇，-20℃条件下沉淀DNA 2h。4℃条件下10000rpm离心10min，弃上清，向沉淀中加入200μL的70％预冷过的乙醇进行洗涤(可重复多次)，4℃条件下10000rpm离心5min，弃上清，室温干燥，加入100μL TE缓冲液溶解，即得gDNA，置于-20℃保存。
③构建基因载体：
利用步骤②得到的gDNA构建基因载体。
具体步骤为：对步骤②得到的gDNA进行PCR扩增，得到纯化的DNA扩增产物(图2～6)，其中，各基因的PCR反应程序如表5所示。
表5各基因的PCR反应程序
基因 预变性 变性 退火 延伸 彻底延伸 循环次数
nirS 95℃5min 95℃30s 57℃30s 72℃60s 72℃6min 30
nirK 95℃5min 95℃30s 57℃30s 72℃60s 72℃6min 30
napA 95℃5min 95℃30s 56℃30s 72℃60s 72℃6min 35
narG 95℃5min 95℃30s 56℃30s 72℃60s 72℃6min 35
nosZ 95℃5min 95℃30s 57℃60s 72℃60s 72℃6min 30
amoA 95℃5min 95℃30s 57℃60s 72℃60s 72℃6min 35
将纯化的DNA片段(DNA扩增产物)与pMD18-T质粒载体进行重组，连接完成后利用热激法将质粒导入到大肠杆菌DH5α感受态细胞内，对阳性菌落进行摇菌扩大培养，采用质粒小量快速提取试剂盒提取菌液中所含质粒。
④计算基因拷贝数：
测定步骤③所得质粒载体的DNA浓度(OD260)，结合质粒的总长度，采用公式2计算出基因的初始拷贝数。采用染料法进行实时荧光定量PCR，得到质粒载体CT值，依据质粒载体CT值及初始拷贝数绘制各基因的标准曲线，将各个检测样品测得的CT值代入对应的标准曲线，得出检测样品中各个基因的绝对拷贝数。
具体步骤为：
将获得的质粒使用TE缓冲液进行梯度稀释(稀释倍数分别为10、102、103、104、106、108倍)，采用染料法进行实时荧光定量PCR，得到质粒载体CT值，依据质粒载体CT值及初始拷贝数绘制各基因的标准曲线。将各个检测样品测得的CT值代入对应的标准曲线，得出检测样品中各个基因的绝对拷贝数。
因拷贝数如表6所示。
表6待测样品中各基因的绝对拷贝数
基因 上游 中上游 中游 中下游 下游
nirSs 8.42×106 6.36×105 1.94×106 9.13×106 5.98×106
nirSn 1.66×108 2.47×109 1.50×109 7.15×109 1.76×108
nirKs 2.68×104 1.33×104 2.59×104 4.94×104 2.79×104
nirKn 6.98×107 4.86×107 1.57×107 4.97×106 1.06×106
nosZs 2.62×105 7.32×104 1.22×105 6.27×105 4.24×105
nosZn 3.74×107 1.11×108 4.78×107 4.67×108 5.09×106
napAs 1.40×104 3.08×105 2.14×105 3.90×104 2.14×104
napAn 7.71×106 7.09×106 3.05×106 5.91×106 2.54×106
narGs 1.77×104 1.78×103 3.63×103 3.89×104 9.83×103
narGn 3.12×104 9.90×105 4.12×105 2.00×106 3.53×104
amoAs 3.23×104 7.18×104 6.10×104 3.32×104 3.03×104
amoAn 1.56×107 1.08×108 1.73×107 9.59×106 1.58×107
其中，水样(标注s)拷贝数单位为copies/mL，底泥样品(标注n)的拷贝数单位为copies/g。
(5)水质指标的代表参数Xi的确定：
将表6所示数据带入公式2中，计算水质指标的代表参数Xi，计算结果如表7所示。
表7样品点的各水质指标代表参数Xi
i所代表指标 上游 中上游 中游 中下游 下游
NH4 +-N 2.39 1.21 2.31 4.37 2.49
TN 3.91 2.90 3.80 5.57 3.95
TP 0.49 0.46 0.36 1.25 0.30
COD 33.86 53.98 48.47 34.32 32.81
DO 3.57 5.60 3.98 2.46 3.13
(6)构建各水质指标模型：
根据上述实施例的记载，各水质指标模型的自变量为水质指标相关的各基因拷贝数，其系数与常数是由水质指标与各基因拷贝数的pearson相关性以及多元回归分析结果来确定的。因此，将各样品点的各基因拷贝数与水质指标进行peaarson相关性分析，得到如表8所示的水体与各基因拷贝数之间的相关性。
表8水样各功能基因拷贝数与水质指标的相关性
nirS nirK napA narG nosZ amoA
NH4 +-N -0.197 0.825** -0.194 0.606* -0.166 0.055
TN -0.194 0.777** -0.319 0.815** -0.274 0.000
TP 0.705* -0.007 0.052 -0.387 0.777** 0.000
COD 0.323 0.051 -0.058 -0.362 0.348 0.525*
DO -0.419 -0.323 -0.079 0.268 -0.504* -0.274
其中，**表示在0.01水平(双侧)上显著相关。
*在0.05水平(双侧)上显著相关。
底泥样品与各基因拷贝数之间的相关性如表9所示。
表9底泥样品各功能基因拷贝数与水质指标的相关性
nirS nirK napA narG nosZ amoA
NH4 +-N 0.119 -0.316 0.346 0.078 -0.116 0.119
TN 0.085 -0.213 0.684* 0.249 -0.235 0.211
TP 0.793** 0.221 -0.219 -0.121 0.931** -0.460
COD 0.206 0.217 -0.190 0.328 0.203 -0.288
DO -0.382 -0.111 0.096 0.064 -0.384 0.642*
其中，**表示在0.01水平(双侧)上显著相关。
*在0.05水平(双侧)上显著相关。
将水体样品或底泥样品中与各水质指标相关的基因作为各水质指标模型中的系数参考基因，与同一指标相关的各基因按照Pearson系数绝对值大小进行归一化处理，以此来体现各基因对水质指标的贡献度。
在获得了各基因拷贝数与水质指标的相关性后，利用SPSS软件分别对各水质指标与相关的功能基因拷贝数进行多元回归分析。在进行多元回归分析之前，先对因变量(NH4 +-N、TN、TP、COD以及DO)进行正态分布检验，确定因变量为随机变量且符合正态分布后方可进行回归分析。其中，采用Shapiro-Wilk来进行正态分布检验，各水质指标的正态分布检验结果如表10所示。
表10各水质指标Shapiro-Wilk正态分布检验结果
水质指标 Sig.(显著性)
NH4 +-N 0.448
TN 0.297
TP 0.424
COD 0.769
DO 0.529
由表10可知，所有样品的NH4 +-N、TN、TP、COD以及DO的Sig值皆大于0.05，保留原假设，可以用于下一步的多元回归分析。
根据多元回归分析结果，确定各水质指标模型中具体的常数ci以及各基因类型的相关系数aij，结果如表11所示。
表11各水质指标模型中的常数和系数
(7)综合水质状况指数Q的计算：
基于各水质指标模型得到代表参数Xi，将其代入自然水系综合水质状况评价模型(公式3)，计算综合水质状况指数Q，并依据Q值确定水体水质状况。
同时，为了验证模型的正确性，以采用本实施例计算得到的Q值为Q1，按照现有技术,由理化指标测定所得的综合水质状况指数为Q2，将Q1与Q2值作对比，分析模型的正确性及适用性。
结果如图7所示。
以S1-S5分别表示取样点所在位置(S1-S5分别依次为：上游、中上游、中游、中下游、下游)，对比发现，基于本发明实施例中的各功能基因丰度计算出的Q值(Q1)与基于水质指标实测值计算出来的Q值(Q2)大小接近。根据两者的Q值情况，皆可以反映出，该河流各河段水质状况为：除中上游外，其他河段的水质状况皆为差，中下游段的水质状况最差。两者对于河流水质的评价结果高度一致，这说明了本发明实施例中的评价方法具有较高的适用性和准确性，能够从分子生物学层面来如实的反映河流的水质状况，能够从分子生物学层面来如实的反映河流的水质状况。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州绿曦生物科技有限公司
<120> 一种自然水系水质状况评估方法及其应用
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtsaacgtsa aggaracsgg 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gasttcggrt gsgtcttga 19
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atcatggtsc tgccgcg 17
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcctcgatca grttgtggtt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaccagcata cbcgyggcgt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
accggccagc gcagrccgcg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaagaygaga agatccgctt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcctgvgcgt ggtacatcat 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cggytggggs mwkaccaa 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 10
aaygancary tgatccgyat 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gcaggagayt ayatcttcta 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gccatccatc tgtawgtcca 20

Claims (3)

1.一种自然水系水质状况评估方法，包括如下步骤：
（1）测定待测水系的水体中及底泥中各功能基因的绝对拷贝数；
（2）将所述各功能基因的绝对拷贝数代入水质指标模型，获得水质指标的代表参数Xi；
（3）将所述代表参数Xi带入自然水系综合水质状况评价模型获得综合水质状况指数Q，依据Q值确定水体水质状况；
其中，步骤（2）中所述水质指标模型的公式为：
其中，所述水质指标模型公式中，Xi为第i种水质指标代表参数；
ci为第i种水质指标的模型的常数；
aij为第i种水质指标模型中第j种基因类型所代表的相关系数；
bij为第i种水质指标模型中第j种基因类型的绝对拷贝数；
n为指标种类数量；
其中，步骤（3）中所述自然水系综合水质状况评价模型的公式为：
其中，在自然水系综合水质状况评价模型公式中，Xi为第i种水质指标代表参数；
Yi为指标i对应GB3838-2002中的III类地表水的指标i的限值；
XDO为DO的水质指标代表参数；
YDO为DO对应GB3838-2002中的III类地表水的DO限值；
Q为综合水质状况指数；
n为指标种类数量；
步骤（3）中Q与水体水质状况的对应关系为：
步骤（1）中所述功能基因为nirS、nirK、napA、narG、nosZ以及amoA基因；
靶向所述功能基因的引物组的核苷酸序列为：
nirS-F：5'-GTSAACGTSAAGGARACSGG-3'；
nirS-R：5'-GASTTCGGRTGSGTCTTGA-3'；
nirK-F：5'-ATCATGGTSCTGCCGCG-3'；
nirK-R：5'-GCCTCGATCAGRTTGTGGTT-3'；
napA-F：5'-AACCAGCATACBCGYGGCGT-3'；
napA-R：5'-ACCGGCCAGCGCAGRCCGCG-3'；
narG-F：5'-GAAGAYGAGAAGATCCGCTT-3'；
narG-R：5'-TCCTGVGCGTGGTACATCAT-3'；
nosZ-F：5'-CGGYTGGGGSMWKACCAA-3'；
nosZ-R：5'-AAYGANCARYTGATCCGYAT-3'；
amoA-F：5'-GCAGGAGAYTAYATCTTCTA-3'；
amoA-R：5'-GCCATCCATCTGTAWGTCCA-3'；
步骤（2）中所述水质指标为无机铵氮含量、总氮、总磷、化学需氧量和溶解氧含量。
2.权利要求1所述的评估方法在水环境治理中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水环境为淡水自然水系。
CN202110483266.6A 2021-04-30 2021-04-30 一种自然水系水质状况评估方法及其应用 Active CN113189291B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110483266.6A CN113189291B (zh) 2021-04-30 2021-04-30 一种自然水系水质状况评估方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110483266.6A CN113189291B (zh) 2021-04-30 2021-04-30 一种自然水系水质状况评估方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113189291A CN113189291A (zh) 2021-07-30
CN113189291B true CN113189291B (zh) 2023-10-27

Family

ID=76983388

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110483266.6A Active CN113189291B (zh) 2021-04-30 2021-04-30 一种自然水系水质状况评估方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113189291B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116758976B (zh) * 2023-08-21 2023-12-19 中国建筑设计研究院有限公司 一种功能微生物定量贡献的识别方法
CN117230160A (zh) * 2023-09-19 2023-12-15 中国水利水电科学研究院 一种河流沉积物温室气体n2o释放潜力的评价方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8048623B1 (en) * 2002-04-24 2011-11-01 The University Of North Carolina At Greensboro Compositions, products, methods and systems to monitor water and other ecosystems
CN104017897A (zh) * 2014-06-24 2014-09-03 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 一种水体生物污染的溯源方法
CN104899475A (zh) * 2015-05-21 2015-09-09 上海大学 利用水体沉积物中微生物多样性指标评价水质的方法
CN104962620A (zh) * 2015-06-10 2015-10-07 宁波大学 一种基于微生物群落的生态健康评价方法
CN107436346A (zh) * 2017-08-02 2017-12-05 江苏省环境监测中心 一种河流水生态健康评估技术方法
CN111398539A (zh) * 2020-03-09 2020-07-10 上海交通大学 一种基于大数据和分子生物技术的水质微生物指示方法
CN111680890A (zh) * 2020-05-21 2020-09-18 河南省政院检测研究院有限公司 一种适用于河长制的地表水环境质量评价方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8048623B1 (en) * 2002-04-24 2011-11-01 The University Of North Carolina At Greensboro Compositions, products, methods and systems to monitor water and other ecosystems
CN104017897A (zh) * 2014-06-24 2014-09-03 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 一种水体生物污染的溯源方法
CN104899475A (zh) * 2015-05-21 2015-09-09 上海大学 利用水体沉积物中微生物多样性指标评价水质的方法
CN104962620A (zh) * 2015-06-10 2015-10-07 宁波大学 一种基于微生物群落的生态健康评价方法
CN107436346A (zh) * 2017-08-02 2017-12-05 江苏省环境监测中心 一种河流水生态健康评估技术方法
CN111398539A (zh) * 2020-03-09 2020-07-10 上海交通大学 一种基于大数据和分子生物技术的水质微生物指示方法
CN111680890A (zh) * 2020-05-21 2020-09-18 河南省政院检测研究院有限公司 一种适用于河长制的地表水环境质量评价方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
徐雪红.水污染程度指标与方法.《健康太湖指标体系研究》.河海大学出版社,2011, *
微生物固定化技术对污水中微生物丰度变化的影响;邸攀攀 等;《生态与农村环境学报》;20151231;第31卷(第6期);第944-947页 *
潘乃礼 等.水质综合评价指数.《地下水水质现状和预测评价的理论与方法》.1995, *
生态修复工程对城市内河水体细菌多样性的影响;唐方园等;《环境工程学报》;20160105(第01期);第445-454页 *
邸攀攀 等.微生物固定化技术对污水中微生物丰度变化的影响.《生态与农村环境学报》.2015,第31卷(第6期), *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113189291A (zh) 2021-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113189291B (zh) 一种自然水系水质状况评估方法及其应用
CN104899475B (zh) 利用水体沉积物中微生物多样性指标评价水质的方法
Reitter et al. Seasonal dynamics in the number and composition of coliform bacteria in drinking water reservoirs
CN102925581B (zh) 一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法
Feng et al. Microbial communities and sediment nitrogen cycle in a coastal eutrophic lake with salinity and nutrients shifted by seawater intrusion
CN105132553A (zh) 对水产养殖环境沉积物中反硝化微生物的定量方法
CN111944914A (zh) 一种基于抗性基因及毒力因子基因评价水体健康风险的方法
CN116947220A (zh) 一种基于潜流微生物群落修复水体生态环境的方法
Sun et al. Community structure and distribution of planktonic ammonia-oxidizing archaea and bacteria in the Dongjiang River, China
Klammer et al. Dynamics of bacterial abundance, biomass, activity, and community composition in the oligotrophic Traunsee and the Traun River (Austria)
Dumouchelle et al. Chemical and biological quality of water in Grand Lake St. Marys, Ohio, 2011-12, with emphasis on cyanobacteria
Liu et al. Bacterial community structure analysis of sediment in the Sagami River, Japan using a rapid approach based on two-dimensional DNA gel electrophoresis mapping with selective primer pairs
Meiyerani et al. 16S rRNA Gen Analysis of Plastic Destruction Bacteries, South Sumatra, Indonesia.
Hasbi et al. Heavy Metal Uptake Capacity By Floating Plant Island in Sail River Pekanbaru
Sivri et al. Distribution of enteric bacteria by means of GIS and detection of Escherichia coli with uidA gene in Kapıdağ Peninsula of Marmara Sea
Lee Molecular assessment of benthic diatom assemblages in Delaware’s inland bays
CN112580913A (zh) 基于灰色关联分析法的雨水回用水质评价方法
CN116970719B (zh) 一种间接检测水中镉污染的方法
Luo et al. Analyzing the algal bloom risk and its relationship with environmental variables in urban landscape water
Baptista et al. Bacterial biomass production in an estuarine system: high variability of leucine conversion factors and changes in bacterial community structure during incubation
Lü et al. Spatiotemporal heterogeneity of nitrogen transformation potentials in a freshwater estuarine system
CN117314209A (zh) 一种用于动态采煤沉陷水域水生态环境质量评价方法
Lokoska et al. Water quality of Lake Dojran from biological and physical-chemical aspects
Zemskaya et al. Ecology of estuarine waters in small rivers of Southern Baikal in 2018
Klick et al. Bacterial diversity in agricultural drainage ditches shifts with increasing urea-N concentrations

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant