CN113186339A - 一组用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的InDel标记及其应用 - Google Patents
一组用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的InDel标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一组用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的InDel标记及其应用，该InDel标记包括InDel‑1标记和InDel‑2标记，其中，InDel‑1标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，InDel‑2标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明针对InDel‑1和InDel‑2标记设计两组InDel引物对，并对InDel‑1对应引物对所扩增的PCR扩增产物进行电泳检测，对InDel‑2对应引物对所扩增的PCR扩增产物进行测序，根据结果预测山桃抗/感桃蚜性状。本发明对2个杂交群体共计224份待测单株进行分子标记基因型准确率验证，结果表明，验证准确率达96.88％。这说明利用本发明的核苷酸***缺失(InDel)标记进行桃蚜抗性的鉴定，具有迅速、便捷、低成本等优点，能够在生产中实现大规模应用。
Description
技术领域
本发明涉及一组用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的InDel标记、引物对及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
桃蚜是桃树生产上重要的害虫，春季2月中旬至3月中旬，越冬卵孵化的桃蚜幼虫只有取食桃和山桃的叶片才能成活长大，因此对早期桃树萌发的新梢和幼叶造成直接危害。受桃蚜侵食后的植物幼叶向反面横卷或不规则卷曲，阻碍叶片的营养吸收，使叶片营养恶化，甚至黄落。蚜虫***在叶片上的蜜露易诱发霉污病，干扰植物的光合作用；幼果被桃蚜叮咬后，果实畸形、品质下降。由于近年来烟碱类杀虫剂的广泛使用，桃蚜已经对其产生抗药性，防治难度增加；另外，广谱型杀虫剂的大量使用对授粉昆虫和天敌昆虫也产生严重危害，并对果园的生态环境造成破坏。因此挖掘抗性资源、开发与抗性性状紧密连锁的分子标记、培育抗桃蚜新品种是桃育种研究工作的重要环节。
有关抗桃蚜性状与分子标记定位的研究，国内外学者均有所涉及。目前的研究发现桃树对蚜虫的抗性分为两类，一种是单基因显性控制的抗性，另一种是多基因控制的抗性。法国科学家Sauge发现，垂枝花桃(weeping flower peach，WFP)和砧木品种‘Rubira’对桃蚜的抗性分别由Rm1和Rm2两个单显性基因控制，两者对桃蚜的抗性均为排趋性，表现为蚜虫在人工接种3-4天内离开寄主植物，并且在蚜虫感染2-3天内，蚜虫侵食的部位出现红色超敏坏死病斑。牛良发现，粉寿星(P.persica var.densa Makino)对蚜虫的抗性是由单基因Rm3显性控制的。Rm1、Rm2和Rm3都定位在桃1号染色体的狭窄区间(Rm1位于43.62～46.50Mb区间内，Rm2位于45.08～46.23Mb区间内，Rm3位于45.66～46.12Mb区间内)。与单基因控制的抗性相比，多基因控制的抗性更难被克服而且效果更持久。2012年，法国科学家Sauge鉴定出山桃(P.davidiana)单株P1908对蚜虫的抗性为韧皮部特异抗生性，对寄生蚜虫的取食和繁殖能力产生影响，这种抗性是由多基因控制的数量性状，8个数量性状位点(QTL)分布在7个连锁群上，其中主效抗性位点MP.SD-3.1位于3号染色体的分子标记AG106(31-38cM)附近。王力荣等通过对郑州的国家果树种质桃资源圃中的419份桃属资源进行抗桃蚜鉴定也发现山桃类品种的抗性最强。因此以山桃为抗性来源构建杂交群体，培育抗桃蚜新品种，对桃育种研究工作有重要意义。而开发与抗性性状紧密连锁的分子标记，在实生苗期就淘汰与抗性性状无关的植株，能够减小选择群体，降低选育成本，提高选育效率。
目前，已有的连锁标记距离抗桃蚜的基因距离较远，在杂交后代的早期鉴定中准确率较低。所以，开发准确性高、操作便捷的分子标记显得很有必要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一组用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的InDel标记、引物对及其应用，该标记在鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜(抗/感)性状时具有很高的准确性。
为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：
一组用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的InDel标记，包括InDel-1标记和InDel-2标记，其中，InDel-1标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，InDel-2标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的技术方案之一是：一种扩增InDel标记的引物对，包括InDel-1引物对和InDel-2引物对，两组引物对的上下游引物均是根据***缺失位点的上下游序列进行设计。
所述InDel-1引物对的F端引物序列如SEQ ID NO.3所示，R端引物序列如SEQ IDNO.4所示；
所述InDel-2引物对的F端引物序列如SEQ ID NO.5所示，R端引物序列如SEQ IDNO.6所示。
本发明的技术方案之一是：一种InDel标记在山桃杂交群体抗/感桃蚜性状分子标记辅助选择育种方面的应用。
本发明的技术方案之一是：一种利用InDel标记鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的方法，包括以下步骤：
(1)提取DNA：采集待测山桃的叶片，提取基因组DNA，作为PCR扩增的模板；
(2)PCR扩增：以上述提取的DNA为模板，分别用InDel-1引物对和InDel-2引物对进行PCR扩增，以获得相应的PCR扩增产物；
(3)基因型鉴定：对InDel-1引物对扩增所得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对InDel-2引物对扩增所得的PCR扩增产物进行测序，根据检测结果预测山桃抗/感桃蚜性状。
当InDel-1引物对扩增所得的PCR扩增产物含有89bp的DNA片段，或者InDel-2引物对扩增所得的PCR扩增产物在对应于Lovell基因组组装的Scaffold 3的第24761660碱基处为A时，则待测山桃为山桃杂交群体中抗桃蚜材料；
当InDel-1引物对扩增所得的PCR扩增产物仅有一条113bp的DNA片段，并且InDel-2引物对扩增所得的PCR扩增产物在对应于Lovell基因组组装的Scaffold 3的第24761660碱基处为TTTCCGGCC时，则待测山桃为山桃杂交群体中感桃蚜材料。
本发明的技术方案之一是：一种用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的试剂盒，包括InDel-1引物对和InDel-2引物对。
本发明的技术方案之一是：一种试剂盒在山桃杂交群体抗/感桃蚜性状分子标记辅助选择育种方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明以橡皮油桃×帚形山桃杂交后代F2群体中的179株单株为材料进行BSA定位，用35个InDel进一步加密，定位到950kb的区间，结合抗蚜单株和感蚜单株接种蚜虫后的基因表达数据，筛选到Prupe.3G275300和Prupe.3G262100，在这两条基因的启动子上分别发现了InDel-1(桃基因组第3条染色体的第25387879与第25387902bp之间)和InDel-2(桃基因组第3条染色体的第24761660与第24761668bp之间)。
本发明针对InDel-1和InDel-2标记设计两组InDel引物对，并对InDel-1对应引物对所扩增的PCR扩增产物进行电泳检测，对InDel-2对应引物对所扩增的PCR扩增产物进行测序，根据结果预测山桃抗/感桃蚜性状。
本发明对2个杂交群体共计224份待测单株进行分子标记基因型准确率验证，结果表明，验证准确率达96.88％。这说明利用本发明的核苷酸***缺失(InDel)标记进行桃蚜抗性的鉴定，具有迅速、便捷、低成本等优点，能够在生产中实现大规模应用。
附图说明
图1为实施例3中InDel-1对应的引物对扩增的PCR扩增产物部分电泳图。
图2为实施例3中InDel-2对应的引物对扩增的PCR扩增产物部分测序图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1：核苷酸***缺失(InDel)标记的获得
本发明以橡皮油桃×帚形山桃杂交后代F2群体中的179株单株为材料进行BSA定位，用35个Indel进一步加密，定位到950kb的区间，结合抗蚜单株和感蚜单株接种蚜虫后的基因表达数据，筛选到Prupe.3G275300和Prupe.3G262100，在这两条基因的启动子上分别发现了InDel-1(桃基因组第3条染色体的第25387879与第25387902bp之间)和InDel-2(桃基因组第3条染色体的第24761660与第24761668bp之间)。
实施例2：利用InDel标记鉴定山桃杂交群体抗桃蚜的方法
1、DNA提取
采用改良的CTAB法提取待测山桃样品组织(叶片)DNA，DNA样品体积不小于30μl。用紫外分光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，计算DNA含量和OD260/280的比值。DNA样品纯度OD260/280值应在1.8-2.0之间，浓度稀释至10ng/μl左右。
2、引物设计
InDel-1和InDel-2根据缺失位点上下游参考序列(InDel-1约170bp，InDel-2约690bp)设计引物，具体见下表1。
表1 ***位点两端序列信息
注：灰底部分的核苷酸序列为缺失片段序列，其余部分的核苷酸序列为缺失片段上下游参考序列。
引物由生物技术公司合成后，用ddH2O溶解并稀释到10μM。引物序列见表2。
表2 引物序列
3、PCR扩增
(1)PCR扩增体系，见表3。
表3 PCR扩增体系
将上述配制好的体系转移到PCR管或板中，放入PCR仪器，进行PCR扩增，扩增程序如表4。
表4 PCR扩增程序
4、基因型鉴定
配制3％琼脂糖凝胶，对InDel-1引物对扩增所得的PCR扩增产物进行电泳，130V电压，电泳60-70min，观察条带情况，对InDel-2引物对扩增所得的PCR扩增产物进行测序，根据检测结果预测山桃抗/感桃蚜性状，判断标准如下：
当InDel-1引物对扩增所得的PCR扩增产物含有89bp的DNA片段，或者InDel-2引物对扩增所得的PCR扩增产物在对应于Lovell基因组(Prunus persica Genome v2.0.a1)组装的Scaffold 3的第24761660碱基处为A时，则待测山桃为山桃杂交群体中抗桃蚜材料；
当InDel-1引物对扩增所得的PCR扩增产物仅有一条113bp的DNA片段，并且InDel-2引物对扩增所得的PCR扩增产物在对应于Lovell基因组组装的Scaffold 3的第24761660碱基处为TTTCCGGCC时，则待测山桃为山桃杂交群体中感桃蚜材料。
实施例3：2个杂交群体利用发明的一组InDel标记进行表现性的盲测验证
1、试验材料的选择
以郑州果树研究所资源圃中种植的常规桃品种为实验材料，从中选取调查过表现型性状的2个山桃杂交群体，共224份单株，具体见表5。
表5 供试杂交群体的名称及群体大小信息
注：帚形山桃为抗桃蚜野生种质，南一区西29-13为抗桃蚜优系，橡皮油桃为感蚜育成品种，Sweet dream为感蚜育成品种。
2、利用本发明一组InDel标记的鉴定方法
利用本发明一组InDel标记，对2个山桃杂交群体共224份单株抗/感桃蚜性状进行盲测鉴定，具体的鉴定方法参照实施例2中的方法。
3、杂交群体中分型结果对表型预测准确性
从表6鉴定结果可以看出，利用本发明一组InDel标记对杂交群体进行表型预测时，抗/感桃蚜性状的鉴定准确率达到96.88％，InDel-1对应的PCR扩增产物部分电泳图见图1，InDel-2对应的PCR扩增产物部分测序图见图2。因此证明本发明的一组InDel标记鉴定准确率高，能够作为分子标记应用在山桃杂交群体抗/感桃蚜辅助育种中。另外，该标记可操作性强，操作步骤简单。
表6 InDel标记在山桃杂交群体中的分型结果
序列表
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 一组用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的InDel标记及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 169
<212> DNA
<213> 山桃(AmygdalusdavidianaCarr.C.deVos)
<400> 1
aacacgaaac gtaacataca gcaacaccag agatgagaca tgacgccacg cccctcctcc 60
tcctcctcct cctcctcctc ctcctcctgc tgctcagtgt tttcaaattt taaaaaattg 120
aacgtatcct tgcatgaccg cgcgtttact aaagaaacgc gacccgcgt 169
<210> 2
<211> 684
<212> DNA
<213> 山桃(AmygdalusdavidianaCarr.C.deVos)
<400> 2
ctacatggcg ctgtcaatat gttatgttat gcataagact actggaatgt tcttttactt 60
tcatgttctg cacttcattc atcttccaag tttttttcaa aaaaatgacg gaataatatt 120
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taaaaaaatt ctaaatttgt aaggaccaca cggcaccttg atgccggatt ttctttcgtg 540
gggcccccgg atggtgagtt ttgtcacaaa acttcgtgtt acatgcgatg tattaccctt 600
taatggtgtt ttactatacc gtccccgttt gccacgctag tttacttgta taccctataa 660
tacttccatt cacctctctc cacg 684
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tgagggaaaa gtagagaacg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
taaaacttca gacacggatc 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
catggcgctg tcaatatgtt atg 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
cgtggagaga ggtgaatgga a 21
Claims (8)
1.一组用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的InDel标记，其特征在于，所述InDel标记包括InDel-1标记和InDel-2标记，其中，InDel-1标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，InDel-2标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种扩增如权利要求1所述InDel标记的引物对，其特征在于，所述引物对包括InDel-1引物对和InDel-2引物对，两组引物对的上下游引物均是根据***缺失位点的上下游序列进行设计。
3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述InDel-1引物对的F端引物序列如SEQ ID NO.3所示，R端引物序列如SEQ ID NO.4所示；
所述InDel-2引物对的F端引物序列如SEQ ID NO.5所示，R端引物序列如SEQ ID NO.6所示。
4.一种如权利要求1所述InDel标记在山桃杂交群体抗/感桃蚜性状分子标记辅助选择育种方面的应用。
5.一种利用权利要求1所述InDel标记鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取DNA：采集待测山桃的叶片，提取基因组DNA，作为PCR扩增的模板；
(2)PCR扩增：以上述提取的DNA为模板，分别用权利要求2或3所述的InDel-1引物对和InDel-2引物对进行PCR扩增，以获得相应的PCR扩增产物；
(3)基因型鉴定：对InDel-1引物对扩增所得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对InDel-2引物对扩增所得的PCR扩增产物进行测序，根据检测结果预测山桃抗/感桃蚜性状。
6.根据权利要求5所述的利用InDel标记鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的方法，其特征在于，
当InDel-1引物对扩增所得的PCR扩增产物含有89bp的DNA片段，或者InDel-2引物对扩增所得的PCR扩增产物在对应于Lovell基因组组装的Scaffold 3的第24761660碱基处为A时，则待测山桃为山桃杂交群体中抗桃蚜材料；
当InDel-1引物对扩增所得的PCR扩增产物仅有一条113bp的DNA片段，并且InDel-2引物对扩增所得的PCR扩增产物在对应于Lovell基因组组装的Scaffold 3的第24761660碱基处为TTTCCGGCC时，则待测山桃为山桃杂交群体中感桃蚜材料。
7.一种用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的引物对。
8.一种如权利要求7所述试剂盒在山桃杂交群体抗/感桃蚜性状分子标记辅助选择育种方面的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202110680930.6A CN113186339A (zh) | 2021-06-18 | 2021-06-18 | 一组用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的InDel标记及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN202110680930.6A Pending CN113186339A (zh) | 2021-06-18 | 2021-06-18 | 一组用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的InDel标记及其应用 |
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2021
- 2021-06-18 CN CN202110680930.6A patent/CN113186339A/zh active Pending
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