CN113186338A - 用于进行被子植物物种鉴定的通用引物及其应用 - Google Patents
用于进行被子植物物种鉴定的通用引物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于进行被子植物物种鉴定的通用引物及其应用。本发明利用被子植物大***的数据(涵盖了69个目，541个科)，对rbcL和matK两个核心条形码的引物进行了优化，将每个基因拆分为4段，每段长度约为400bp，可直接利用高通量测序技术测通。与此同时，本发明通过对被子植物大***叶绿体基因组数据的挖掘，开发了四个新的叶绿体基因组高变区ndhF2、ndhF3、rpoB1和rpoB5并设计了可直接用于高通量测序的通用引物。本发明为DNA条形码技术的发展和应用，如在被子植物物种鉴定，辅助进行利用土壤中的植物信息进行物证溯源等奠定了技术基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于进行被子植物物种鉴定的通用引物及其应用，所设计引物适用于高通量测序平台。
背景技术
DNA条形码技术(DNA barcoding)是一项利用标准的、有足够变异的、片段长度适中的、易于扩增的一个或多个DNA片段的序列差异信息进行物种快速、准确鉴别或鉴定的技术。传统分类学鉴定的方法存在主观性强、需要具备专业的分类学学术背景、所需形态形状往往不能同时出现、对于植物残骸无法准确鉴定等诸多限制。
DNA条形码技术能够快速、准确地鉴定物种，是对传统分类方法鉴定物种的重要补充，随着这项技术的发展，其在植物准确鉴定、法医和刑侦领域(如植物物证鉴定)的应用逐渐增多，具有较强的应用前景。
2003年加拿大研究者Paul Hebert首次提出“DNA barcode”概念，并将其应用于鳞翅目昆虫的分类学研究中。经过大量研究者探索和研究，线粒体COI基因(细胞色素c氧化酶I基因)中的部分高变区域(一段约650bp的DNA片段)被最终确定为研究动物分类***、快速鉴定及其他相关研究的国际通用DNA条形码。不同于动物，植物因其本身的特殊性导致了其比较复杂的情况，利用一段DNA序列解决所有植物鉴定问题几无可能，目前尚无理性的唯一植物DNA条形码定论。国际生物条形码联盟(CBOL)初步建议matK、rpoC1、rpoB、accD、nhdJ和ycf5为植物DNA通用条形码，但accD、ndhJ和ycf5因不是所有类群均含有被剔除。Kress等于2005年提出将ITS、trnH-psbA、rbcL三个片段作为植物通用DNA条形码。最终在2009年的第三届国际DNA条形码大会上决定将叶绿体基因片段rbcL和matK作为植物DNA标准条形码的核心DNA条形码，同时建议将ITS(Internal Transcribed Spacer)和叶绿体基因间隔区trnH-psbA作为植物DNA条形码的补充条码。
随着二代测序技术的蓬勃发展，利用高通量测序技术获取DNA条码技术将增加数据的获取效率和减少数据获取成本。将高通量测序技术应用于DNA条形码的获取的需求愈发迫切。受限于目前高通量测序技术的测序读长(测序平台最长只能完成600bp片段的测序(Illumina PE300和Ion Torrent S5 chip600))，这个测序读长远远低于rbcL，matK等植物核心DNA条形码的长度，不能通过这项技术获得完整的植物DNA条形码数据，因此严重阻碍了DNA条形码技术发展和应用的步伐。
发明内容
本发明的目的是提供用于进行被子植物物种鉴定的通用引物及其应用。
为了实现上述目的，本发明首先提供了用于进行被子植物物种鉴定的特异引物对。
本发明提供的用于进行被子植物物种鉴定的特异引物对为如下引物对中的至少一种：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12；
所述引物对1由引物1-F和引物1-R组成；所述引物对2由引物2-F和引物2-R组成；所述引物对3由引物3-F和引物3-R组成；所述引物对4由引物4-F和引物4-R组成；所述引物对5由引物5-F和引物5-R组成；所述引物对6由引物6-F和引物6-R组成；所述引物对7由引物7-F和引物7-R组成；所述引物对8由引物8-F和引物8-R组成；所述引物对9由引物9-F和引物9-R组成；所述引物对10由引物10-F和引物10-R组成；所述引物对11由引物11-F和引物11-R组成；所述引物对12由引物12-F和引物12-R组成；
所述引物1-F为序列表中序列1所示的单链DNA分子；
所述引物1-R为序列表中序列2所示的单链DNA分子；
所述引物2-F为序列表中序列3所示的单链DNA分子；
所述引物2-R为序列表中序列4所示的单链DNA分子；
所述引物3-F为序列表中序列5所示的单链DNA分子；
所述引物3-R为序列表中序列6所示的单链DNA分子；
所述引物4-F为序列表中序列7所示的单链DNA分子；
所述引物4-R为序列表中序列8所示的单链DNA分子；
所述引物5-F为序列表中序列9所示的单链DNA分子；
所述引物5-R为序列表中序列10所示的单链DNA分子；
所述引物6-F为序列表中序列11所示的单链DNA分子；
所述引物6-R为序列表中序列12所示的单链DNA分子；
所述引物7-F为序列表中序列13所示的单链DNA分子；
所述引物7-R为序列表中序列14所示的单链DNA分子；
所述引物8-F为序列表中序列15所示的单链DNA分子；
所述引物8-R为序列表中序列16所示的单链DNA分子；
所述引物9-F为序列表中序列17所示的单链DNA分子；
所述引物9-R为序列表中序列18所示的单链DNA分子；
所述引物10-F为序列表中序列19所示的单链DNA分子；
所述引物10-R为序列表的序列20所示的单链DNA分子；
所述引物11-F为序列表的序列21所示的单链DNA分子；
所述引物11-R为序列表的序列22所示的单链DNA分子；
所述引物12-F为序列表的序列23所示的单链DNA分子；
所述引物12-R为序列表的序列24所示的单链DNA分子。
上述特异引物对中，每个所述引物对中的各条引物的摩尔比均为1:1。
为了实现上述目的，本发明又提供了上述特异引物对在如下m1)-m6)中任一种中的应用：
m1)制备被子植物物种鉴定的产品；
m2)制备被子植物物种辅助鉴定的产品；
m3)制备物证溯源的产品；
m4)被子植物物种鉴定；
m5)被子植物物种辅助鉴定；
m6)物证溯源。
为了实现上述目的，本发明还提供了含有上述特异引物对的试剂盒。
进一步的，所述试剂盒还包括用于PCR扩增的其它试剂和用于PCR扩增产物测序的试剂。
更进一步的，所述用于PCR扩增的其它试剂包括10×PCR Buffer(Mg2+)、dNTP、TaqDNA polymerase。
所述用于PCR扩增产物测序的试剂包括用于高通量测序文库构建的试剂(如
Fast DNA Library Prep Set for Ion TorrentTM kit(New England BioLabs)试剂盒中的试剂)和用于高通量测序的试剂(如基于Illumina Hiseq系列平台进行高通量测序所需的试剂)。
为了实现上述目的，本发明还提供了上述试剂盒的制备方法。
本发明提供的上述试剂盒的制备方法包括将上述特异引物对中的各条引物分别单独包装的步骤。
上述试剂盒在如下m1)-m6)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：
m1)制备被子植物物种鉴定的产品；
m2)制备被子植物物种辅助鉴定的产品；
m3)制备物证溯源的产品；
m4)被子植物物种鉴定；
m5)被子植物物种辅助鉴定；
m6)物证溯源。
为了实现上述目的，本发明还提供了DNA片段。
本发明提供的DNA片段为如下n1)-n4)中的任一种：
n1)以待测植物的rbcL基因为模板，采用上述引物对1或引物对2或引物对3或引物对4扩增得到的DNA片段；
n2)以待测植物的matK基因为模板，采用上述引物对5或引物对6或引物对7或引物对8扩增得到的DNA片段；
n3)以待测植物的ndhF基因为模板，采用上述引物对9或引物对10扩增得到的DNA片段；
n4)以待测植物的rpoB基因为模板，采用上述引物对11或引物对12扩增得到的DNA片段。
上述DNA片段在如下m1)-m6)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：
m1)制备被子植物物种鉴定的产品；
m2)制备被子植物物种辅助鉴定的产品；
m3)制备物证溯源的产品；
m4)被子植物物种鉴定；
m5)被子植物物种辅助鉴定；
m6)物证溯源。
上述任一所述应用中，所述物证溯源为利用土壤中的植物信息进行物证溯源。
为了实现上述目的，本发明最后提供了一种被子植物物种的鉴定或辅助鉴定方法。
本发明提供的被子植物物种的鉴定或辅助鉴定方法包括如下步骤：以待测植物(类群)基因组DNA为模板，采用上述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行测序，得到PCR扩增产物序列；将所述PCR扩增产物序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，并根据比对结果确定待测植物所属物种。
上述方法中，将所述PCR扩增产物序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，并根据比对结果确定待测植物所属物种的方法包括如下步骤：将该待测植物(该类群)属水平的所有相应基因的数据下载后与所述PCR扩增产物序列数据合并，并进行精细比对，比对后构建***发育树，通过***发育树的分支结构判定其种属归属。在实际应用中，针对不同的待测植物(类群)进行鉴定时，可根据实际情况选择不同种类或数量的特异引物对进行鉴定，所选用的特异引物对数量越多，物种鉴定的成功率越高。
上述方法中，所述测序的平台为高通量测序平台。
上述任一所述特异引物对或应用或方法中，所述被子植物可为本领域技术人员公知的任一种被子植物。在本发明的具体实施例中，所述被子植物为如下任一种：一叶萩、醉鱼草、野百合、毛地黄、弹裂碎米荠、小叶南烛、粘毛鼠尾草、杨叶木姜子、茶、豆茶决明、紫菀、北乌头、低矮薹草、攀茎钩藤、见血青、玉兰。
本发明的有益效果如下：
1、利用本发明提供的特异引物对，可开发鉴定被子植物物种的通用试剂盒，推动植物DNA条形码在社会服务中的应用。
2、本发明通过分析被子植物大***的叶绿体基因组数据(共计包括492个狭义的科)，找到了rbcL和matK相对保守的区域，对其进行了优化并扩大了其扩增长度，rbcL基因引物由原来的838bp扩增长度延长至1428bp，matK基因引物由原来的827bp扩增长度延长至1492bp，大大增加了可用数据的长度，进而增加了其鉴别和鉴定物种的能力。
3、本发明通过对被子植物大***数据的深度挖掘，找到了11个可用于被子植物的高变DNA条形码，经后续引物验证和多次序列调整，综合片段分辨率和引物通用性两大因素，保留了其中的4个条形码ndhF2、ndhF3、rpoB1和rpoB5用于后续的研究，为后续DNA条形码的应用提供了新的选择。
本发明利用被子植物大***的数据(涵盖了69个目，541个科)，对rbcL和matK两个核心条形码的引物进行了优化，将每个基因拆分为4段，每段长度约为400bp，可直接利用高通量测序技术测通。与此同时，本发明通过对被子植物大***叶绿体基因组数据的挖掘，开发了四个新的叶绿体基因组高变区ndhF2、ndhF3、rpoB1和rpoB5并设计了可直接用于高通量测序的通用引物。本发明为DNA条形码技术的发展和应用，如在被子植物物种鉴定，辅助进行利用土壤中的植物信息进行物证溯源等奠定了技术基础。
附图说明
图1为本发明的技术流程。
图2为引物验证扩增结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中用于引物验证的植物样品材料名称均记载于《中国植物志》(作者：中国科学院中国植物志编辑委员会)中，每个植物样品材料在文献中的相关介绍的网址链接如表1所示。
表1、样品材料的名称及其相关介绍的网址链接
实施例1、用于进行被子植物物种鉴定的通用引物设计
本发明的用于进行被子植物物种鉴定的通用引物的设计流程如图1所示。
一、样品采集
根据最新的APGIII***确定了被子植物科水平的材料名录，在此基础上通过在NCBI中搜索现有数据库中的叶绿体基因组情况，对已有叶绿体基因组的科利用NCBI现有数据库中的数据，不再重复取样；对没有该科任何现有叶绿体基因组的科，先通过野外采集获取新鲜材料，如果采集新鲜材料困难较大，选择中国科学院植物研究所标本馆(PE)相应物种标本，在不影响标本整体保存情况基础上取少量叶片用于后续的DNA提取工作。
二、DNA提取
对于需要补充采样点样品进行了补充采集，采集得到的样品经65℃烘干2小时后，研磨成粉末状，利用mCTAB法进行DNA的提取工作。
三、超声打断
对于新获得的总DNA，先利用2％琼脂糖凝胶检测其片段大小情况，根据实际情况将总DNA利用超声打断为400-500bp左右的片段用于后续的Ilumina测序文库构建和测序工作。
四、高通量测序文库构建和测序
对超声打断后的DNA样品利用
Fast DNA Library Prep Set for IonTorrentTM kit(New England BioLabs)试剂盒进行高通量测序文库的构建。经检测合格的文库送至北京贝瑞和康生物科技服务有限公司用Illumina Hiseq2000采用150PE进行高通量数据的获取。
五、叶绿体基因组组装及注释
高通量数据下机后，利用Spades默认参数进行了叶绿体基因组的组装，组装后的样品利用Plann和Sequin软件进行注释，所有样品的基因组序列比对工作利用mafft软件进行初步比对，在利用Mega软件进行人工检查和校正。
六、rbcL和matK片段引物优化
将rbcL和matK这两个片段的完整基因及其两端部分多余区域特异性截取出来，利用Dnasp 5.0对数据进行核苷酸多态性估计，根据多态性结果中的pi值(pi值越高，序列的变异越大，反之则越小)，在pi值较低的区域进行通用引物设计，引物的设计原则与标准引物设计原则相同。最终优化得到的rbcL和matK片段通用引物序列信息如表2所示。
表2、rbcL和matK通用引物序列信息
| 基因 | 正向引物(3'-5') | 反向引物(3'-5') | 扩增长度 |
| rbcL1 | TGGATTYAAAGCKGGTGTTAAAGA | ATGRGGYGGKCCTTGGAAAGTTTT | 427bp |
| rbcL2 | TTCCATTGTRGGWAATGTATTTGG | TTSATCATTTCTTCRCATGTACC | 402bp |
| rbcL3 | ATCAAAGGRCATTAYTTGAATGC | AGAACACCYGGTAKAGARACCCAA | 422bp |
| rbcL4 | TTGAAAAAGAYCGAAGYCGYGGTAT | GATCTCYTTCCATACYTCACAAGC | 335bp |
| matK1 | ACTTMTYTTTCRGGARTATATTTA | TTTGAACCAAKATTTCYARATG | 422bp |
| matK2 | AATTATGTGTYAGATRTAYTAATACC | TCCATAGAAATRTRTTCGYTCAARAA | 318bp |
| matK3 | TCCGTAAMCAATCYTCTYATTTAC | GCAKTATCTATTAKAAATGMATTYTC | 397bp |
| matK4 | CTCGAYTTTYTGGGYTATYTTT | TCTTCYTCCGTAARRAATTCTTC | 422bp |
注：R为A/G兼并碱基，Y为C/T兼并碱基，M为A/C兼并碱基，K为G/T兼并碱基，S为G/C兼并碱基，W为A/T兼并碱基。
七、新高变区开发
利用Dnasp 5.0对数据进行核苷酸多态性估计，根据多态性结果中的pi值筛选出变异较高的基因片段，共筛选出如下11个高变的区域：ndhF1、ndhF2、ndhF3、ndhF4、ndhF5、ndhF6、rpoB1、rpoB2、rpoB3、rpoB4和rpoB5。将ndhF1、ndhF2、ndhF3、ndhF4、ndhF5、ndhF6、rpoB1、rpoB2、rpoB3、rpoB4和rpoB5这11个片段及其两端部分多余区域特异性截取出来，利用Dnasp 5.0对数据进行核苷酸多态性估计，根据多态性结果中的pi值，在pi值较低的区域进行通用引物设计，引物设计原则同上。新开发的高变区引物序列信息如表3所示。
表3、新开发高变区引物序列信息
注：R为A/G兼并碱基，Y为C/T兼并碱基，M为A/C兼并碱基，K为G/T兼并碱基。
实施例2、引物通用性验证
一、引物验证样品材料
为验证引物的通用性，通过对进化关系较远的科属物种共计16份样品进行PCR，通过PCR扩增的成功率来判断其通用性。用于验证引物通用性的植物样品材料信息见表4。
表4、引物验证样品材料信息
二、引物验证方法
1、提取用于引物通用性检验的植物样品材料的DNA。
2、以浓度调整至10ng/μl的步骤1提取的DNA溶液作为模板，分别使用实施例1中表2和表3中的引物对进行PCR扩增，获取PCR扩增产物。
PCR扩增体系(10μl)：10×PCR Buffer(Mg2+)1μl、2mM dNTP 1μl，5μM正向引物0.5μl，5uM反向引物0.5μl，10ng/μl基因组DNA 1μl，5U/μlTaq DNA polymerase 0.1μl，ddH2O5.9μl。
PCR扩增仪器：Eppendorf公司的Master S仪。
PCR扩增程序：94℃，4min预变性；94℃变性30s、50℃退火40s、72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存样品。
3、将步骤2的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，通过统计各引物对的扩增成功率判断引物的通用性。扩增成功率公式＝扩增出目的片段长度条带的样品数/总样品数。
PCR验证结果如图2和表5所示。结果显示：表2中的8个引物对的通用性均较好，扩增成功率均在75％以上，最高可达100％。表3中的11个引物对经引物验证和多次序列调整，综合片段分辨率和引物通用性两大因素，选择了两个高变区内部引物通用性较好，pi值较高的区域：ndhF2、ndhF3、rpoB1和rpoB5。扩增ndhF2、ndhF3、rpoB1和rpoB5区域的引物对的扩增成功率均在87.5％以上。
最终本发明确定的可用于被子植物物种鉴定的通用引物共有12对引物，引物序列信息如表6所示，其中rbcL基因4对，matK基因4对，ndhF基因2对，rpoB基因2对，这12对引物均具有较高的引物通用性，可用于被子植物物种鉴定。
表5、引物扩增成功率
表6、用于被子植物物种鉴定的12对引物通用引物
注：R为A/G兼并碱基，Y为C/T兼并碱基，M为A/C兼并碱基，K为G/T兼并碱基，S为G/C兼并碱基，W为A/T兼并碱基。
在实际应用中，对被子植物进行物种鉴定时，可以待测植物(类群)基因组DNA为模板，采用表6中的12对特异引物对中的至少一种进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行测序，得到PCR扩增产物序列；将所述PCR扩增产物序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，然后将该待测植物(类群)属水平的所有相应基因的数据下载后与PCR扩增产物序列数据合并，并进行精细比对，比对后构建***发育树，通过***发育树的分支结构判定其种属归属。在针对不同的植物类群进行鉴定时，可根据实际情况选择不同种类或数量的引物对进行鉴定，所选用的引物对数量越多，物种鉴定的成功率越高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>中国科学院植物研究所
<120>用于进行被子植物物种鉴定的通用引物及其应用
<160>24
<170>PatentIn version 3.5
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<222>(12)
<223>r = a或g
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)
<223>r = a或g
<400>9
acttmtyttt crggartata ttta 24
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(17)
<223>y = c或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)
<223>r = a或g
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tttgaaccaa katttcyara tg 22
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<220>
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<220>
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<222>(16)
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aattatgtgt yagatrtayt aatacc 26
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<220>
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<223>r = a或g
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tccatagaaa trtrttcgyt caaraa 26
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<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)
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<220>
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gcaktatcta ttakaaatgm attytc 26
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tcttcytccg taarraattc ttc 23
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tatttgagat tttttgytta ta 22
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catrgtrgca gcrtgtataa gagc 24
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<212>DNA
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<220>
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<222>(14)
<223>y = c或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)
<223>y = c或t
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atgtatggtt accygatgcy atgga 25
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(15)
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<222>(18)
<223>y = c或t
<400>20
gaatargcat gagtratyaa atg 23
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<213>Artificial Sequence
<220>
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<222>(6)
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<222>(13)
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<222>(23)
<223>r = a或g
<400>21
atgggmgaaa atygagttat ttrgg 25
<210>22
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)
<223>y = c或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)
<223>r = a或g
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)
<223>y = c或t
<400>22
tcccatgcaa yagtcagraa ytcttg 26
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)
<223>r = a或g
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)
<223>y = c或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)
<223>r = a或g
<400>23
tagacargat atgccytatt trcaa 25
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<220>
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<222>(3)
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<221>misc_feature
<222>(18)
<223>k = g或t
<400>24
ccyctaaggg gttgttgkgt aac 23
Claims (10)
1.用于进行被子植物物种鉴定的特异引物对，为如下特异引物对中的至少一种：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12；
所述引物对1由引物1-F和引物1-R组成；所述引物对2由引物2-F和引物2-R组成；所述引物对3由引物3-F和引物3-R组成；所述引物对4由引物4-F和引物4-R组成；所述引物对5由引物5-F和引物5-R组成；所述引物对6由引物6-F和引物6-R组成；所述引物对7由引物7-F和引物7-R组成；所述引物对8由引物8-F和引物8-R组成；所述引物对9由引物9-F和引物9-R组成；所述引物对10由引物10-F和引物10-R组成；所述引物对11由引物11-F和引物11-R组成；所述引物对12由引物12-F和引物12-R组成；
所述引物1-F为序列表中序列1所示的单链DNA分子；
所述引物1-R为序列表中序列2所示的单链DNA分子；
所述引物2-F为序列表中序列3所示的单链DNA分子；
所述引物2-R为序列表中序列4所示的单链DNA分子；
所述引物3-F为序列表中序列5所示的单链DNA分子；
所述引物3-R为序列表中序列6所示的单链DNA分子；
所述引物4-F为序列表中序列7所示的单链DNA分子；
所述引物4-R为序列表中序列8所示的单链DNA分子；
所述引物5-F为序列表中序列9所示的单链DNA分子；
所述引物5-R为序列表中序列10所示的单链DNA分子；
所述引物6-F为序列表中序列11所示的单链DNA分子；
所述引物6-R为序列表中序列12所示的单链DNA分子；
所述引物7-F为序列表中序列13所示的单链DNA分子；
所述引物7-R为序列表中序列14所示的单链DNA分子；
所述引物8-F为序列表中序列15所示的单链DNA分子；
所述引物8-R为序列表中序列16所示的单链DNA分子；
所述引物9-F为序列表中序列17所示的单链DNA分子；
所述引物9-R为序列表中序列18所示的单链DNA分子；
所述引物10-F为序列表中序列19所示的单链DNA分子；
所述引物10-R为序列表的序列20所示的单链DNA分子；
所述引物11-F为序列表的序列21所示的单链DNA分子；
所述引物11-R为序列表的序列22所示的单链DNA分子；
所述引物12-F为序列表的序列23所示的单链DNA分子；
所述引物12-R为序列表的序列24所示的单链DNA分子。
2.如权利要求1所述的特异引物对，其特征在于：每个所述特异引物对中的各条引物的摩尔比为1:1。
3.权利要求1或2所述的特异引物对在如下m1)-m6)中任一种中的应用：
m1)制备被子植物物种鉴定的产品；
m2)制备被子植物物种辅助鉴定的产品；
m3)制备物证溯源的产品；
m4)被子植物物种鉴定；
m5)被子植物物种辅助鉴定；
m6)物证溯源。
4.含有权利要求1或2所述的特异引物对的试剂盒。
5.权利要求4所述试剂盒的制备方法，包括将权利要求1或2所述特异引物对中的各条引物分别单独包装的步骤。
6.权利要求4所述的试剂盒在如下m1)-m6)中任一种中的应用：
m1)制备被子植物物种鉴定的产品；
m2)制备被子植物物种辅助鉴定的产品；
m3)制备物证溯源的产品；
m4)被子植物物种鉴定；
m5)被子植物物种辅助鉴定；
m6)物证溯源。
7.DNA片段，为如下n1)-n4)中的任一种：
n1)以待测植物的rbcL基因为模板，采用权利要求1中引物对1或引物对2或引物对3或引物对4扩增得到的DNA片段；
n2)以待测植物的matK基因为模板，采用权利要求1中引物对5或引物对6或引物对7或引物对8扩增得到的DNA片段；
n3)以待测植物的ndhF基因为模板，采用权利要求1中引物对9或引物对10扩增得到的DNA片段；
n4)以待测植物的rpoB基因为模板，采用权利要求1中引物对11或引物对12扩增得到的DNA片段。
8.权利要求7所述的DNA片段在如下m1)-m6)中任一种中的应用：
m1)制备被子植物物种鉴定的产品；
m2)制备被子植物物种辅助鉴定的产品；
m3)制备物证溯源的产品；
m4)被子植物物种鉴定；
m5)被子植物物种辅助鉴定；
m6)物证溯源。
9.一种被子植物物种的鉴定或辅助鉴定方法，包括如下步骤：以待测植物基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行测序，得到PCR扩增产物序列；将所述PCR扩增产物序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，并根据比对结果确定待测植物所属物种。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述测序的平台为高通量测序平台。
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