CN113186308B - 一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性rt-pcr试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性rt-pcr试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性RT‑PCR试剂盒及其使用方法，属于生物技术领域。该试剂盒包括A液(RT‑PCR缓冲液、RT‑DNA聚合酶和灭菌双蒸水)、B液(引物对、探针)、阴性质控标准品和阳性质控标准品组成，其中包括用于检测布鲁氏菌的特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2以及探针seq ID No.3，以及检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性的特异性引物对seq ID No.4和seq ID No.5以及探针seq ID No.6。该RT‑PCR试剂盒实用性强，耗时短，可重复性好，通过RT‑PCR扩增后，能够快速、有效、直观的鉴别临床样品中是否含有阿米卡星耐药性的布鲁氏菌。

Description

一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性RT-PCR试剂盒及其使用 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性RT-PCR试剂盒及其使用方法
背景技术
布鲁氏菌(Brucella)是一种兼性胞内寄生菌，属于“B类生物***药剂”，通过寄生于宿主的免疫***造成宿主持续性感染，并且能引起全球性人畜共患病—布鲁氏菌病(以下简称布病)。布病影响公共卫生安全，其主要表现为发热、多汗、乏力、关节疼痛等，严重者使患者丧失劳动能力，最终影响经济发展[1]。《中华人民共和国传染病防治法》将布鲁氏菌病与“非典”、炭疽、艾滋病、狂犬病等均归为乙类传染病。常见引起人间布病感染的布鲁氏菌主要是羊种(B.melitensis)、牛种(B.abortus)、猪种(B.suis)和犬种(B.canis)。据统计，全球人间布鲁氏菌病发病率年平均超过50万例，一些流行国家每百万人口的布鲁氏菌发病率超过100[2]，中东地区每百万人口的布鲁氏菌病发病率均在200以上，叙利亚发病率最高(1603.4)，但据世界卫生组织(WHO)调查表明，实际发病率是报告的10-25倍[3]。我国布鲁氏菌病首次报道于内蒙古[4]，人间布鲁氏菌病疫情于1957-1963年和1969-1971年出现两次流行高峰。自20世纪90年代中期开始，布鲁氏菌病疫情在国内再次肆虐，并从北方扩展到南方[5]，全国32省市自治区均有病例报道[6]。现有的研究表明，我国布鲁氏菌病主要分布于内蒙古、新疆等畜牧业发达的省市及自治区，农牧民、兽医、屠宰工等感染和发病率较高。
布鲁氏菌药物敏感性检测需要在生物安全三级实验室内进行，长期以来，我国在布鲁氏菌耐药性检测方面所做工作不多。目前的研究表明，世界范围内出现了部分利福平耐药布鲁氏菌菌株[7]。阿米卡星作为部分地区治疗布病的药物，如果患者感染的布鲁氏菌菌株存在阿米卡星抗性，则严重影响患者的布病治疗。本方法利用布鲁氏菌分离株阿米卡星耐药表型和基因型的相关性，分析其基因组水平的阿米卡星耐药机制，结合RT-PCR方法，通过筛选确实可行的耐药基因检测序列，用于布鲁氏菌阿米卡星抗性的检测。本发明涉及仪器常见，成本较低，无需经过测序，通过目测荧光扩增曲线即可确定菌株的阿米卡星抗性，方法可应用于临床鉴别，切实为我国布鲁氏菌药物敏感性水平提供技术保障。
参考文献
1.Nelson-Jones A.Brucellosis[J].Postgrad Med J,1952.28(324):529-34.https://doi.org/10.1136/pgmj.28.324.529
2.Bukhari E E.Pediatric brucellosis.An update review for the newmillennium[J].Saudi Med J,2018.39(4):336-341.https://doi.org/10.15537/ smj.2018.4.21896
3.Hasanjani Roushan M R and Ebrahimpour S.Human brucellosis:Anoverview[J].Caspian J Intern Med,2015.6(1):46-7.
4.Zia S H and Wang F L.Brucellosis in north China；a clinical,etiological and epidemiological study[J].Am J Trop Med Hyg,1949.29(6):925-36.https://doi.org/10.4269/ajtmh.1949.s1-29.925
5.Piao D R,Liu X,Di D D,et al.Genetic polymorphisms identify inspecies/biovars of Brucella isolated in China between 1953and 2013by MLST[J].BMC Microbiol,2018.18(1):7.https://doi.org/10.1186/s12866-018-1149-0
6.Li Y J,Li X L,Liang S,et al.Epidemiological features and riskfactors associated with the spatial and temporal distribution of humanbrucellosis in China[J].BMC Infect Dis,2013.13:547.https://doi.org/10.1186/ 1471-2334-13-547
7.Barbosa Pauletti R,Reinato Stynen A P,Pinto da Silva Mol J,etal.Reduced Susceptibility to Rifampicin and Resistance to MultipleAntimicrobial Agents among Brucella abortus Isolates from Cattle in Brazil[J].PLoS One,2015.10(7):e0132532.https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0132532。
发明内容
发明人通过常见布鲁氏菌病治疗药物耐药试验检测发现某分离株存在阿米卡星抗性。通过全基因组测序，发明人获得了该分离株的全基因组序列。通过全基因组序列比对，获得阿米卡星抗性基因，根据此基因本发明设计特异性引物对seq ID No.4和seq IDNo.5，以及针对该基因的特异性探针seq ID No.6，结合布鲁氏菌鉴定引物seq ID No.1和seq ID No.2以及探针seq ID No.3，结合两组探针扩增结果，可以鉴定布鲁氏菌阿米卡星抗性菌株。以上是提出本发明的技术依据。
本发明的目的是提供一种能够快速、有效鉴别临床样品中布鲁氏菌阿米卡星抗性菌株，用于解决布鲁氏菌病临床和防控过程中快速鉴定阿米卡星抗性菌株的问题，该试剂盒能够快速、直观的鉴定阿米卡星抗性布鲁氏菌。本发明涉及仪器常见，无需经过测序，目测即可确定是否为阿米卡星抗性布鲁氏菌感染，方法可应用于临床鉴定。
为实现本发明的目的，采用如下技术方案：
该PCR试剂盒由A液、B液、阳性质控标准品和阴性质控标准品组成；所述A液包括RT-PCR缓冲液、各浓度2.5mM的dNTP液、5mM的Mg2+溶液、2.5U/μl的RT-DNA聚合酶和灭菌双蒸水，每750μL的A液对应包括RT-PCR缓冲液75μL、dNTP液75μL、Mg2+溶液75μL、RT-DNA聚合酶25μL、灭菌双蒸水500μL；所述B液包括用于检测布鲁氏菌的特异性引物对seq ID No.1和seqID No.2以及探针seq ID No.3，以及检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性的特异性引物对seq IDNo.4和seq ID No.5以及探针seq ID No.6，B液中各引物及各探针浓度均为0.2μM，溶剂为水，各引物及各探针分别为：
seq ID No.1：5’-AATGCGATCAAGTCGGGCG-3’
seq ID No.2：5’-TGCCATCATAAAGGCCGGTG-3’
seq ID No.3：5’FAM-TGCCATCATAAAGGCCGGTG-3’BHQ-1
seq ID No.4：5’-AACTGTTCGCCAGGCTCAAG-3’
seq ID No.5：5’-AAGCGGCCATTTTCCACCAT-3’
seq ID No.6：5’VIC-TCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTT-3’BHQ-2
所述阳性质控标准品由耐药菌株(阿米卡星抗性布鲁氏菌菌株)调整比浊度，其菌含量约为1.5×105CFU/mL，经80℃热灭活60min；
所述阴性质控标准品由灭菌双蒸水。
一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性RT-PCR试剂盒及其使用方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的基因组DNA，经核酸浓度检测仪Nanodrop检测浓度高于1ng/μL。所述待测样品包括但不限于血液、血清、奶样、组织样本、气溶胶样本。可以根据待测样本选择相应的商品化试剂盒或提取试剂。
(2)以提取的样本基因组DNA为模板，将A液和B液按比例混合，再加入模板，同时进行阳性质控标准品、阴性质控标准品对照，进行荧光定量检测；荧光定量检测仪以LightCycler 480仪器为例；至少三个测试样品：一个A液+B液+待测试提取的DNA模板，一个A液+B液+阳性质控标准品，一个A液+B液+阴性质控标准品；
上述三个测试样品的PCR扩增体系为25μL/样品，具体包括：15μL A液，7μL B液，3μL待测试提取的DNA模板或阳性质控标准品或阴性质控标准品；
两步法进行RT-PCR，荧光定量扩增程序为：95℃30s，95℃5s、60℃30s，40个循环；
(3)结果判定：其中步骤(2)阳性质控标准品对应的样品的FAM和VIC信号均存在扩增曲线，CT值在32-35之间，步骤(2)阴性质控标准品对应的样品的FAM和VIC信号不存在扩增曲线，则试验成功；否则试验失败，需重做；
(4)步骤(3)试验成功后，对应的待测试提取的DNA模板的样品的FAM和VIC信号：待测试提取的DNA模板的FAM信号存在扩增曲线，而VIC信号不存在扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌但不存在阿米卡星耐药性；FAM信号存在扩增曲线，且VIC信号存在扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌且存在阿米卡星耐药性；FAM信号不存在扩增曲线，而VIC信号存在扩增曲线，则待测样品为非布鲁氏菌但存在阿米卡星耐药性；FAM信号不存在扩增曲线，且VIC信号不存在扩增曲线，则待测样品为非布鲁氏菌且无阿米卡星耐药性。
本发明所述的试剂盒及其使用方法，其直接目的是鉴定阿米卡星耐药性布鲁氏菌，而非获取疾病诊断结果。
本发明提供一种能够快速、有效、直观的鉴别样品中是否存在阿米卡星耐药性布鲁氏菌株的RT-PCR试剂盒及其使用方法，用于解决布鲁氏菌病临床和防控过程中阿米卡星耐药性的问题，该试剂盒能够快速、直观的鉴别样品中是否存在阿米卡星耐药性布鲁氏菌株。本发明涉及仪器常见，无需经过测序，目测即可确定是否为阿米卡星耐药性布鲁氏菌，该试剂盒完全可以推广应用，有助于推动布鲁氏菌病的诊断、药物敏感性筛查和防控。
附图说明
图1试剂盒检测梯度稀释阿米卡星耐药性布鲁氏菌株。A为FAM信号检测结果，扩增曲线从左至右分别为105-102CFU/μL；B为VIC信号检测结果，扩增曲线从左至右分别为105-102CFU/μL。
图2试剂盒检测阿米卡星敏感性布鲁氏菌菌株。A为FAM探针检测结果，扩增曲线从左至右分别为阿米卡星耐药性菌株样品、阿米卡星敏感性菌株样品、阿米卡星耐药性菌株稀释样品和阳性质控标准品；B为VIC信号检测结果，扩增曲线从左至右分别为阿米卡星耐药性菌株样品、阿米卡星耐药性菌株稀释样品和阳性质控标准品，阿米卡星敏感性菌株样品VIC信号没有扩增曲线。
具体实施方式
下述实施例用于进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例均按照常规试验条件与方法进行，或者按照制造厂商所建议的试验条件。
1.试验材料
经肉汤稀释法鉴定的阿米卡星耐药性和阿米卡星敏感性布鲁氏菌株等，均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所复苏、传代和保存。
荧光定量用的PCR Buffer、dNTP Mixture(2.5mM)，探针用DNA聚合酶均购自宝生物(大连)有限公司，
Figure BDA0002868899940000031
Genomic DNA Purification Kit基因组提取试剂盒购自美国Promega公司，PCR引物及探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，荧光定量用八排管购自美国Bio-Rad公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
2.试验仪器
RT-PCR扩增仪(LoChe公司)
细菌比浊仪(梅里埃公司)。
实施例1
RT-PCR检测试剂盒的组装
(1)配制RT-PCR反应液
a.设计特异性扩增引物及探针，送交生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体引物序列为：
seq ID No.1：5’-AATGCGATCAAGTCGGGCG-3’
seq ID No.2：5’-TGCCATCATAAAGGCCGGTG-3’
seq ID No.3：5’FAM-TGCCATCATAAAGGCCGGTG-3’BHQ-1
seq ID No.4：5’-AACTGTTCGCCAGGCTCAAG-3’
seq ID No.5：5’-AAGCGGCCATTTTCCACCAT-3’
seq ID No.6：5’VIC-TCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTT-3’BHQ-2
b.RT-PCR液的配制：
所述A液包括RT-PCR缓冲液、dNTP液、Mg2+溶液RT-DNA聚合酶和灭菌双蒸水，所述B液包括用于检测布鲁氏菌的特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2以及探针seq IDNo.3，以及检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性的特异性引物对seq ID No.4和seq ID No.5以及探针seq ID No.6。
(2)阳性质控标准品的制备：
所述阳性质控标准品由阿米卡星耐药性布鲁氏菌调整比浊度为0.5McF(1.5×108CFU/mL)经80℃热灭活60min，体积为500μL。
(3)阴性质控标准品的制备：
阴性质控标准品为灭菌双蒸水，体积为500μL。
(4)PCR扩增及荧光检测
PCR扩增体系为25μL/样品，具体包括：15μL A液，7μL B液，3μL阳性质控标准品/阴性质控标准品/提取的DNA模板。
荧光定量扩增程序为：95℃30s，95℃5s、60℃30s，40个循环。
(4)结果判定：阳性质控标准品FAM和VIC信号存在扩增曲线，CT值为32-35之间，阴性质控标准品未存在扩增曲线，否则试验失败，需重做。
对于待测样品而言，FAM信号存在扩增曲线，而VIC信号不存在扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌但不存在阿米卡星抗性；
对于待测样品而言，FAM信号存在扩增曲线，且VIC信号存在扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌且存在阿米卡星抗性；
对于待测样品而言，FAM信号不存在扩增曲线，而VIC信号存在扩增曲线，则待测样品为非布鲁氏菌但存在阿米卡星抗性；
对于待测样品而言，FAM信号不存在扩增曲线，且VIC信号不存在扩增曲线，则待测样品为非布鲁氏菌且无阿米卡星抗性。
实施例2布鲁氏菌阿米卡星耐药性RT-PCR试剂盒检测最低菌含量
(1)划线培养阿米卡星抗性布鲁氏菌菌株48h后，利用比浊仪调整菌株比浊度为0.5McF(约为1×108CFU/mL)。取1μL菌液进行10倍梯度稀释，最终低菌含量为105-101CFU/μL。
(2)使用基因组提取试剂盒提取待测样本的基因组DNA，经核酸浓度检测仪检测浓度高于1ng/μL。
(3)以提取的待测样本DNA为模板，将模板、A液和B液按比例混合，同时进行阴性质控标准品对照，进行RT-PCR扩增。
荧光定量扩增程序为：95℃30s，95℃5s、60℃30s，40个循环。
PCR扩增体系为25μL/样品，具体包括：15μL A液，7μL B液，3μL阳性质控标准品/阴性质控标准品/提取的DNA模板。
(3)结果判定：阴性质控标准品没有扩增曲线。
由于检测样品为布鲁氏菌阿米卡星耐药性菌株及稀释样本，因此FAM和VIC信号均存在扩增曲线。从图1结果来看，检测含菌量为102CFU/μL的样品时，FAM和VIC信号检测CT值均为33左右。以上结果表明，试剂盒中的FAM和VIC信号检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性菌株没有问题，最低检测菌含量为102CFU/μL。以上结果还表明，FAM和VIC探针扩增效率相似，其扩增CT值差异不显著。
实施例3试剂盒检测阿米卡星未知的布鲁氏菌菌株
采用本发明的RT-PCR试剂盒对阿米卡星未知的布鲁氏菌菌株进行检测，并设阴性对照。
试剂盒检测阿米卡星未知布鲁氏菌可行性结果见图2。荧光扩增曲线表明，阴性质控标准品未存在扩增曲线，阳性质控标准品FAM和VIC信号均存在扩增曲线，且CT值为34.16(符合CT值在32-35之间)，表明本次试验对照成立。检测结果表明，样品1为阿米卡星耐药性布鲁氏菌株，其FAM和VIC信号均存在扩增曲线；样品2为阿米卡星耐药性稀释样品，为样品1的10倍稀释样品(人为稀释操作)；样品3为阿米卡星敏感性布鲁氏菌株，其FAM探针存在扩增曲线且VIC探针未存在扩增曲线，并经过验证，本发明方法精准可靠。
Figure BDA0002868899940000061
Figure BDA0002868899940000071
序列表
<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120>一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性RT-PCR试剂盒及其使用方法
<160>6
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>“人工序列”
<400>1
aatgc gatca agtcg ggcg 19
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tgcca tcata aaggc cggtg 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tgcca tcata aaggc cggtg 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
aactg ttcgc caggc tcaag 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
aagcg gccat tttcc accat 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
acgtg accca tggcg atgcc tgctt 20

Claims (4)

1.一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性RT-PCR试剂盒，其特征在于，该PCR试剂盒由A液、B液、阳性质控标准品和阴性质控标准品组成；所述A液包括RT-PCR缓冲液、各浓度2.5 mM的dNTP液、5 mM 的Mg2+溶液、2.5 U/μl 的RT-DNA聚合酶和灭菌双蒸水，每750 μL的A液对应包括RT-PCR缓冲液75 μL、dNTP液75 μL、Mg2+溶液75 μL、RT-DNA聚合酶25 μL、灭菌双蒸水500μL；所述B液包括用于检测布鲁氏菌的特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2以及探针seq ID No.3，以及检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性的特异性引物对seq ID No.4和seq IDNo.5以及探针seq ID No.6，B液中各引物及各探针浓度均为0.2 μM，溶剂为水，各引物及各探针分别为：
seq ID No.1：5’- AATGCGATCAAGTCGGGCG -3’
seq ID No.2：5’- TGCCATCATAAAGGCCGGTG -3’
seq ID No.3：5’FAM- TGCCATCATAAAGGCCGGTG -3’BHQ-1
seq ID No.4：5’- AACTGTTCGCCAGGCTCAAG -3’
seq ID No.5：5’- AAGCGGCCATTTTCCACCAT -3’
seq ID No.6：5’VIC- TCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTT -3’BHQ-2
所述阳性质控标准品由耐药菌株调整比浊度，其菌含量约为1.5×105 CFU/mL，经80℃热灭活60 min；
所述阴性质控标准品由灭菌双蒸水。
2.权利要求1所述的一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性RT-PCR试剂盒的非疾病诊断治疗目的的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待测样本的基因组DNA，经核酸浓度检测仪Nanodrop检测浓度高于1ng/μL；（2）以提取的样本基因组DNA为模板，将A液和B液按比例混合，再加入模板，同时进行阳性质控标准品、阴性质控标准品对照，进行荧光定量检测；荧光定量检测仪以LightCycler 480仪器为例；至少三个测试样品：一个A液+B液+待测试提取的DNA模板，一个A液+B液+阳性质控标准品，一个A液+B液+阴性质控标准品；
上述三个测试样品的PCR扩增体系为25μL/样品，具体包括：15 μL A液，7 μL B液，3 μL待测试提取的DNA模板或阳性质控标准品或阴性质控标准品；
两步法进行RT-PCR，荧光定量扩增程序为：95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s，40个循环；
（3）结果判定：其中步骤（2）阳性质控标准品对应的样品的FAM和VIC信号均存在扩增曲线，CT值在32-35之间，步骤（2）阴性质控标准品对应的样品的FAM和VIC信号不存在扩增曲线，则试验成功；否则试验失败，需重做；
（4）步骤（3）试验成功后，对应的待测试提取的DNA模板的样品的FAM和VIC信号：待测试提取的DNA模板的FAM信号存在扩增曲线，而VIC信号不存在扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌但不存在阿米卡星耐药性；FAM信号存在扩增曲线，且VIC信号存在扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌且存在阿米卡星耐药性；FAM信号不存在扩增曲线，且VIC信号不存在扩增曲线，则待测样品为非布鲁氏菌且无阿米卡星耐药性。
3.按照权利可要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述待测样本选自血液、血清、奶样、组织样本、气溶胶样本任意一种。
4.按照权利可要求2所述的方法，其特征在于，最低检测菌含量为102 CFU/μL。
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