CN113186266B - 一种用于检测人cyp2d6基因拷贝数变异的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于检测人CYP2D6基因拷贝数变异的方法,包括:选取待测样本已知基因组内拷贝数确定的、不存在拷贝数变异的两个DNA序列作为内参基因,计算这两个内参基因的Ct值之差Ct0,判定样本的降解程度是否达到检测不准的程度;如果该Ct0达到了无法保证检测结果准确的阈值,则提示重新采样进行DNA提取;如果该Ct0在保证检测结果准确的阈值范围以内,则进行CYP2D6基因Ct值与其中一个内参基因Ct值的差值计算得到Ct1,进而判断待测样本CYP2D6拷贝数变异情况。根据本发明,排除了样本本身的质量问题,保证了CNV检测结果的准确性,而且操作方便快捷,既缩短了检测时间,又节省了测序带来的高昂成本。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,更具体地涉及一种用于检测人CYP2D6基因拷贝数变异的方法。
背景技术
CYP2D6担负着人类20%-30%药物的代谢任务。许多研究表明,CYP2D6酶活性与该基因的多态性存在非常高的关联性,活性受到诱导而改变的情况非常少。而CYP2D6拷贝数变异(CNV)与其活性密切相关。例如*5纯合突变为0拷贝,这种基因型的人CYP2D6酶活性极低,容易导致经CYP2D6代谢的药物蓄积,易发生不良反应。而携带CYP2D6 3拷贝(3CNV)及以上的人其酶活性又非常高,对经其代谢药物消除率很高,常规剂量的药物在这类人体内往往难以达到有效的血药浓度,从而表现出对药物的耐受。因此对CYP2D6拷贝数的准确检测对于判定CYP2D6的代谢活性型非常重要。
目前常见的用于检测CYP2D6 CNV的方法有荧光定量PCR法,一代测序法,二代测序法,还有长片段PCR电泳法,以及最近兴起的数字PCR方法。目前的荧光定量PCR法受限于判读阈值的界定等原因,部分情况下会出现同一人的样本,前后两次测定的CNV结果不一致情况。而一代测序和二代测序的方法对测序结果的拼接分析要求比较高,也不能保证最终拼接结果完全准确,同时测序方法程序繁琐,耗时和耗费都比较高。长片段PCR电泳法虽然准确性高,但是需要再PCR之后进行电泳检测,操作繁琐,费时。数字PCR方法与荧光定量PCR类似,虽然是绝对定量,但是也存在相同判读阈值的情况下,同一人的样本两次采样测定的CNV结果不一致情况,结果并不一定准确,并且耗费较高。
目前市场上还未出现针对CYP2D6拷贝数变异检测获得医疗器械注册证的生物产品,研发用试剂盒包括:Agena Veridose CYP2D6(MALD-TOF)、thermofish CYP2D6(荧光定量PCR)等产品。Agena产品同样存在实验步骤繁琐,环境要求高等劣势,而thermofish产品只采用一个内参基因进行校准,未考虑到样本质量(降解等原因导致判定不准)因素,可能存在不准确的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测人CYP2D6基因拷贝数变异的方法,从而解决现有技术中针对人CYP2D6拷贝数变异检测的方法存在准确度不高、程序繁琐、费时费力的问题。
为了解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:
提供一种人CYP2D6拷贝数变异检测的方法,用于非疾病诊断目的,所述方法包括以下步骤:A:选取待测样本已知基因组内拷贝数确定的、不存在拷贝数变异的两个DNA序列作为内参基因,针对人CYP2D6基因以及选取的这两个内参基因的序列特点,分别设计出相应的引物和探针;B:获得抽提的待测样本基因组DNA;C:在一个反应体系中,将所述引物和探针混合,加入反应液中;D:进行实时定量荧光PCR检测;E:通过计算这两个内参基因的Ct值之差Ct0,判定样本的降解程度是否达到检测不准的程度;如果该Ct0达到了无法保证检测结果准确的阈值,则提示重新采样进行DNA提取;如果该Ct0在保证检测结果准确的阈值范围以内,则进行CYP2D6基因Ct值与其中一个内参基因Ct值的差值计算得到Ct1,通过该Ct1判断待测样本CYP2D6拷贝数变异情况。
本发明主要要求保护的是一种通过同时设置两个内参基因以实现对样本降解程度判定、进而实现对待测样本CYP2D6拷贝数变异情况的准确判读的方法,以避免由于样本降解程度过高,也就是说样本质量问题导致CYP2D6基因拷贝数变异检测准确度不高的现象发生。而至于内参基因的选定,只要保证该内参基因在待测样本已知基因组内是拷贝数确定的、不存在拷贝数变异的DNA序列即可,因此本发明并不限定内参基因的具体种类。
应当理解的是,根据选取内参基因的不同,相应地其判定条件也各不相同,该判定条件是本领域技术人员根据试剂盒开发时大量样本的验证即可确定得到的,该判定条件的确定属于本领域技术人员根据常规技术手段就可以实现的。
还应当理解的是,步骤E中进行CYP2D6基因Ct值与其中一个内参基因Ct值的差值计算得到Ct1时,可任选一个内参基因,而针对不同的内参基因的判定阈值是不同的。但是,该阈值的选定也是本领域技术人员根据试剂盒开发时的大量样本的验证即可确定得到的。
根据本发明的一个优选方案,当内参基因为RPPH基因和TERT基因时,步骤E包括:计算RPPH基因减去TERT基因的CT差值为CT0,若-1.5≤CT0≤0,判定样本质量合格;若CT0>0,或<-1.5,则样本质量不合格;样本合格后,进行CYP2D6基因Ct值减去其中一个内参基因(TERT)Ct值的差值计算得到CT1,当CT1<-1时,判定为0拷贝变异,-1≤CT1<0.5时,判定为1拷贝变异,0.5≤CT1<1.4时,判定为2拷贝变异,CT1≥1.4,判定为3拷贝变异。
根据该优选方案,步骤A中设计的引物和探针如下:针对人CYP2D6基因的上游引物CYP2D6-F:5’-CACCAGGAAAGCAAAGACAC-3’;针对人CYP2D6基因的下游引物CYP2D6-R:5’-TGCAGCACTTCAGCTTCT-3’;针对内参基因人TERT基因片段的上游引物TERT-F:5’-AGGGTCCTCGCCTGTGTA-3’;针对内参基因人TERT基因片段的下游引物TERT-R:5’-CCCAGATTCGCCATTGTTCA-3’;针对内参基因人RPPH基因片段的上游引物RPPH-F:5’-CCGCCTCTGGCCCTAGT-3’;针对内参基因人RPPH基因片段的下游引物RPPH-R:5’-GCCACGAGCTGAGTGCGT-3’;识别人CYP2D6因突变的探针CYP2D6-Probe:5’-FAM-TGGGCCGGGGCTGTCCAGTG-BHQ1-3’;识别内参基因人TERT基因片段保守序列特异性的探针TERT-Probe:5’-CY5-CAGGGCACACCTTTGGTCACTCCA-BHQ3-3’;识别内参基因人RPPH基因片段保守序列特异性的探针TERT-Probe:5’-VIC-TGTCACTCCACTCCCATGTCCCTTGG-BHQ1-3’。
优选地,步骤C中使用的各引物的浓度为800~1000nM,各探针的浓度为200~300nM。
根据本发明的另一优选方案,当内参基因为β-globin基因和ALB基因时,计算β-globin基因减去ALB基因的CT差值为CT0,若0≤CT0≤0.9,判定样本质量合格;若CT0>0.9,或<0,则样本质量不合格;样本合格后,进行CYP2D6基因Ct值减去β-globin基因Ct值的差值计算得到CT1,若CT1<-0.5时为判定为0拷贝变异,-0.5≤CT1<1.0时,判定为1拷贝变异,1≤CT1<1.7时,判定为2拷贝变异,CT1≥1.7,判定为3拷贝变异。
步骤A中设计的引物和探针如下:针对人CYP2D6基因的上游引物CYP2D6-F:5’-CACCAGGAAAGCAAAGACAC-3’;针对人CYP2D6基因的下游引物CYP2D6-R:5’-TGCAGCACTTCAGCTTCT-3’;针对内参基因人ALB基因片段的上游引物ALB-F:5’-GGAGAAGGTCACTACTTGAAGAGATT-3’;针对内参基因人ALB基因片段的下游引物ALB-R:5’-CATGAGAGATTAGGATTCTAGTATTTGC-3’;针对内参基因人β-globin基因片段的上游引物β-globin-F:5’-GTGGATGAAGTTGGTGGTGAG-3’;针对内参基因人β-globin基因片段的下游引物β-globin-R:5’-TAACAGCATCAGGAGTGGACAG-3’;识别人CYP2D6因突变的探针CYP2D6-Probe:5’-FAM-TGGGCCGGGGCTGTCCAGTG-BHQ1-3’;识别内参基因人ALB基因片段保守序列特异性的探针ALB-Probe:5’-VIC-CTATATTCCTTCCCTTAATTAACTCTGTTT-MGB-3’;识别内参基因人β-globin基因片段保守序列特异性的探针β-globin-Probe:5’-CY5-AAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAG-BHQ1-3’。
优选地,步骤C中使用的各引物的浓度为800~1000nM,各探针的浓度为200~300nM。
正如本发明的背景技术部分所述,CYP2D6酶参与了大约25%常用药物的肝脏代谢,这些药物包括抗抑郁药,抗精神病药,抗心律失常药,阿片类药物和β-受体阻滞剂等,CYP2D6基因的拷贝数变异(如*5缺失,*36X2,*36+*10重排等)对其个体药物代谢起到关键影响。
通过推理和测试,发明人发现普通荧光定量PCR前后两次测定结果不一致是因为两次提取的DNA样本降解程度不一样。因为普通荧光定量PCR是通过CYP2D6基因的扩增信号与单个内参基因的扩增信号的比值来判断样本的CNV数值的。如果样本被降解到一定程度,那么含有CYP2D6基因的DNA片段的数量与内参基因DNA片段的数量的比值可能就与真实值存在较大的偏差,这时候通过荧光定量PCR检测出来的比值数可能落到其它CNV判读阈值内了,导致最终的判读结果不准确。
对此,本发明首次提出同时采用已知基因组内拷贝数确定的、不存在拷贝数变异的两个DNA序列作为内参基因,然后用这两个内参基因的Ct值之差,判定样本的降解程度是否达到检测不准的程度,如果Ct差值达到了无法保证检测结果准确的阈值,则提示重新采样进行DNA提取;如果Ct差值位于保证检测结果准确的阈值范围之内,则进行CYP2D6基因扩增Ct值与其中一个内参基因Ct值的差值计算,通过Ct差值判断样本的CNV数。本发明通过设置两个内参基因成功排除因样本DNA降解导致的检测结果不准确。
本发明的关键发明点即在于同时增加双内参作为评价样本合格的参数,避免由于样本质量问题产生误判的风险,在单管内实现了同时检测3个靶基因(包括CYP2D6基因和两个内参基因),在保证检测准确性、重现性、检测限等性能指标的前提下,最大程度的降低了试剂,耗材成本,简化实验人员操作,同时反应液中的UDG酶能够有效地防止气溶胶可能引起的假阳性扩增,进一步保证了临床样本检测拷贝数变异的准确性。
综上所述,根据本发明提供的一种用于检测人CYP2D6基因拷贝数变异的方法,排除了样本本身的质量问题,从而排除不可信结果,保证了人CYP2D6基因拷贝数变异检测结果的准确性,而且操作方便快捷,即节约了检测时间,又节省了测序带来的高昂成本。
附图说明
图1是案例一中立即提取的DNA样本单内参试剂盒检测结果;
图2是案例一中模拟运输后提取的DNA单内参试剂盒检测结果;
图3是案例一中立即提取的DNA样本双内参试剂盒1检测结果;
图4是案例一中模拟运输后提取的DNA双内参试剂盒1检测结果;
图5是案例二中立即提取的DNA样本双内参试剂盒1检测结果;
图6是案例二中模拟运输五天后提取的DNA样本双内参试剂盒1检测结果;
图7是案例二中立即提取的DNA样本双内参试剂盒2检测结果;
图8是案例二中模拟运输五天后提取的DNA样本双内参试剂盒2检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明做进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例1设计引物探针组合1
根据该优选实施例,本发明采用TaqMAN荧光定量方法针对CYP2D6外显子9区域特异性扩增,同时增加双内参TERT和RPPH作为评价样本合格的参数,避免由于样本质量问题产生误判的风险,在单管内实现对3个靶基因(2D6+TERT+RPPH)的同时检测。本发明分别针对人CYP2D6基因、TERT内参基因、RPPH内参基因设计引物和探针,其核苷酸序列如下表1所示,同时还示出了各引物、探针的优选使用浓度。
表1针对人CYP2D6拷贝数检测设计的引物探针组合1的序列
引物名称 | 序列 | 浓度nM |
CYP2D6-F(SEQ ID No.1) | CACCAGGAAAGCAAAGACAC | 900 |
CYP2D6-R(SEQ ID No.2) | TGCAGCACTTCAGCTTCT | 900 |
TERT-F(SEQ ID No.3) | AGGGTCCTCGCCTGTGTA | 900 |
TERT-R(SEQ ID No.4) | CCCAGATTCGCCATTGTTCA | 900 |
RPPH-F(SEQ ID No.5) | CCGCCTCTGGCCCTAGT | 900 |
RPPH-R(SEQ ID No.6) | GCCACGAGCTGAGTGCGT | 900 |
CYP2D6-Probe(SEQ ID No.7) | FAM-TGGGCCGGGGCTGTCCAGTG-BHQ1 | 250 |
TERT-Probe(SEQ ID No.8) | CY5-CAGGGCACACCTTTGGTCACTCCA-BHQ3 | 250 |
RPPH-Probe(SEQ ID No.9) | VIC-TGTCACTCCACTCCCATGTCCCTTGG-BHQ1 | 250 |
实施例2一种用于检测人CYP2D6拷贝数变异的双内参检测试剂盒1
1.主要组成成分
根据该优选实施例,提供一种用于检测人CYP2D6拷贝数变异的试剂盒,该试剂盒的主要组成成分如下表2所示。
表2试剂盒主要组成成分
2.检测必须但试剂盒不包含的组分
1.5ml离心管(用于配置PCR反应液和DNA提取),0.2mL PCR管或8联管或96孔板,带滤塞的吸头(1mL、200μL和10μL),DNA提取试剂盒(推荐Qiamp DNA Blood Mini Kit、英芮诚拭子/血斑提取试剂盒)。
3.适用仪器
适用于ABI7500型号的Real-time PCR扩增仪。
4.样本要求
4.1适用样本为EDTA抗凝的全血、口腔拭子和血卡;样本在4-10℃保存不超过7天,-20度保存不超过1年,避免反复冻融。
4.2使用商业化的试剂盒提取人基因组DNA,推荐使用Qiagen公司的Qiamp DNABlood Mini Kit(货号51104或51106)提取全血样本,英芮诚公司的拭子基因组DNA提取试剂盒(NSSDE-P-6004)提取唾液或拭子样本,英芮诚公司的血斑基因组DNA提取试剂盒(BSDE-P-5004)提取血卡样本,所提DNA用Nanodrop测定浓度和纯度,其DNA OD260/280在1.4-2.0,浓度大于10ng/μL,样本质量不合格不得用于检测,建议低于10ng/μL重新取样进行核酸提取,高于100ng/μL应适当稀释至规定浓度范围,提取完的DNA建议立即检测,否则请于-20度条件下保存,保存时间不超过6个月。
5.检验方法
5.1核酸提取
根据不同样本类型严格按照对应试剂盒说明书提取核酸。提取过程中应采取必要的标记方法,避免试剂漏加及样本混淆。
5.2试剂准备
将试剂从冰箱取出,室温融化,混匀,1000rpm快速离心20s,备用。
5.3反应体系配制
5.3.1根据检测样本数计算所需反应液,如样本数为N,则需做N+6反应,其中,三个阳性对照,两个空白对照,一个校准品。
5.3.2根据下表4计算所需各反应液的体积,并配置反应体系,反应体系混匀后3000rpm快速离心30秒,分装至PCR管中,每管19μL。
表3加样表
组分 | 拷贝数(μL) |
反应液A | 4 |
反应液I | 1 |
水 | 14 |
总体积 | 19 |
5.4加样
取1μL待测样本DNA(建议10-100ng)加入PCR反应管,盖上管盖,1000rpm离心,以排除管底气泡;阳性对照,空白对照,校准品使用试剂盒自带即可。
5.5上机检测
5.5.1打开荧光定量PCR仪,将含检测的样本的PCR管放入机器检测仓内。然后打开仪器控制软件。
5.5.2按照提示设置反应程序。
首次在检测机器上操作时,应先进行如下操作。
点击“advanced setting”,在实验属性中按照下表4设置反应程序。
表4反应程序
然后在反应板设置中,点击“定义基因和样本”,然后点击“添加新基因”按钮。然后将“基因1”重命名为“CYP2D6”,报告基团选择“FAM”,淬灭基团“None”;将“基因2”重命名为“RPPH”,报告基团选择“VIC”,淬灭基团“None”;将“基因3”重命名为“TERT”,报告基团选择“CY5”,淬灭基团“None”。
然后在反应程序中,反应体系改为“20μL”,按照下表5设置扩增程序。
表5扩增程序
然后点击“保存”按钮,选择“另存为模板”,保存为“CYP2D6-CNV”。然后关闭模板。
5.5.3如果检测所用机器已经完成了上述操作,请按照下述操作进行。
1)点击“打开”按钮,打开文件CYP2D6-CNV.edt。
2)打开文件后,在“反应板设置”中的“定义基因样本”处,添加设置待测样本名。然后点击“指定基因和样本”,在此面板中,按照实际样本放置位置。在“指定基因”栏中,结合样本检测项目(拷贝数鉴定)对应的基因和样本进行勾选,参比荧光染料中选择“无”。
3)完成所有设置后根据实验名称另存为eds文件,同时点击右上角的“Start”按钮,开始试验。
6结果分析
6.1反应程序运行完成后,进入分析界面,点击右上角的“分析设置”,将阈值设置为3000,基线设置“起始循环”为5,“终止循环”为18,然后点击“应用分析设置”。
6.2扩增图谱中选择“图型”为“△Rn VS循环数”,“图谱类型”为“线性图谱”,颜色为“基因”便于直接观察,也可菜单栏“导出”键将数据保存为.XLS/.TXT文件便于计算拷贝数变异和SNP分型鉴定。
7检验结果的解释
7.1拷贝数变异:计算两个内参基因的Ct值之差Ct0,判定样本的降解程度是否达到检测不准的程度;如果该Ct0达到了无法保证检测结果准确的阈值,则提示重新采样进行DNA提取;如果该Ct0在保证检测结果准确的阈值范围以内,则进行CYP2D6基因Ct值与其中一个内参基因Ct值的差值计算得到Ct1,通过该Ct1判断待测样本CYP2D6拷贝数变异情况。
实施例3设计引物探针组合2
为了验证即使选取不同双内参也可以提高对CYP2D6的检测准确性,本实施例选取了与实施例1不同的内参基因,并设计了引物探针组合2。
根据该优选实施例,采用TaqMAN荧光定量方法针对CYP2D6外显子9区域特异性扩增,同时增加双内参ALB和β-globin基因作为评价样本合格的参数,避免由于样本质量问题产生误判的风险,在单管内实现对3个靶基因(2D6+ALB+β-globin)的同时检测。该实施例分别针对人CYP2D6基因、ALB内参基因、β-globin内参基因设计引物和探针,其核苷酸序列如下表6所示,同时还示出了各引物、探针的优选使用浓度。
表6针对人CYP2D6拷贝数检测设计的引物探针组合2的序列
实施例4一种用于检测人CYP2D6拷贝数变异的双内参检测试剂盒2
该试剂盒2与试剂盒1的区别仅在于引物和探针序列的不同,通过将表1所示的引物和探针序列替换为表6所示的引物和探针序列即可获得该试剂盒2,其他组成部分以及检测方法均与实施例2基本相同,因此本文不再赘述。
案例一
张某某口腔拭子样本两份,其中一份采样后立即进行DNA提取,然后使用单内参的CYP2D6 CNV检测试剂(《人类CYP2D6基因检测试剂盒》)进行CYP2D6 CNV的检测,其判读标准为:Ct差值<0时为判定为0CNV,0≤Ct差值<1.2时,判定为1CNV,1.2≤Ct差值<3时,判定为2CNV,3≤Ct差值,判定为3CNV。检测结果为内参基因CYP2D6 Ct值与CYP2D6内参基因Ct值之差为3.03(如图1所示),因此应判读为CYP2D6为3拷贝。另外一份样本模拟运输条件,两天后进行DNA提取,然后使用同一试剂盒进行CYP2D6 CNV的检测,结果为CYP2D6 Ct值与内参基因Ct值之差为2.92(如图2所示),根据判定标准应判读为CYP2D6为2拷贝。通过该实验证明出现了同一人的样本,对CYP2D6 CNV定量检测结果不一致,导致出现错误结论的问题。
使用本发明实施例2设计的双内参CYP2D6 CNV检测试剂盒1,对上述两个DNA样本进行检测,其判读标准为:Ct差值<-1时为判定为0CNV,-1≤Ct差值<0.5时,判定为1CNV,0.5≤Ct差值<1.4时,判定为2CNV,1.4≤Ct差值,判定为3CNV。立即抽提DNA的样本两个内参基因(RPPH和TERT)的Ct值之差(RPPH基因的CT值减去TERT基因的CT值所得差值)为-0.92,样本符合判读条件,进入判读,CYP2D6与其中一个内参基因的Ct值之差(即CYP2D6基因的Ct值减去TERT基因的Ct值所得差值)3.02,应判读为CYP2D6为3拷贝(如图3所示)。另外一份模拟运输条件提取的DNA样本两个内参基因的Ct值之差为-1.59(如图4所示),不符合判读条件,样本应按照要求进行重新提取,或者重新采样,提取DNA。这样就避免了因样本本身质量问题,而导致的检测结果出错的情况发生。
案例二采用双内参方法设计的试剂盒1与试剂盒2的对比
取李某的口腔拭子样本两份,与案例一采用相同的处理:其中一份采样后立即进行DNA提取,另外一份样本模拟运输条件,两天后进行DNA提取。对这两份DNA使用实施例2中设计的双内参试剂盒1,对这两份样本进行检测。第一份样本的检测结果显示两内参之差(RPPH基因的CT值减去TERT基因的CT值所得差值)为-0.88,样本符合判读条件(允许判读区间为-1.5~0),进入判读。内参基因TERT与CYP2D6的Ct值之差(CYP2D6基因的Ct值减去TERT基因的Ct值所得差值)为1.27,根据标准应该判读为2CNV(如图5所示)。
另外一份样本模拟运输条件,五天后进行DNA提取,然后仍然采用我们设计的双内参试剂盒1进行检测。结果显示两内参之差为0.58,不在允许判读区,无法进行判读,需要重新采样检测(如图6所示)。事实上,如果不考虑双内参,如果直接按照内参基因TERT与CYP2D6的Ct值之差判断度的话,这个样本会被判读为3CNV(Ct值之差为2.72)。所以,在没有双内参的预先判定时,本检测的结果就是错误的,会误导后续判断。
为了进一步验证不同双内参均可以提高对CYP2D6的检测准确性,本实施例还使用实施例4提供的双内参检测试剂盒2对上述两个DNA样本进行检测。立即抽提DNA的样本两个内参基因的Ct值之差(β-globin基因的CT值减去ALB基因的CT值之差)为0.58,样本符合判读条件(允许判读区间为0~0.9),进入判读,CYP2D6基因的Ct值减去β-globin基因的Ct值所得差值为1.19(我们设计的试剂的判断标准为:Ct差值<-0.5时为判定为0CNV,-0.5≤Ct差值<1.0时,判定为1CNV,1.0≤Ct差值<1.7时,判定为2CNV,1.7≤Ct差值,判定为3CNV),应判读为CYP2D6为2拷贝(如图7所示)。
另外一份模拟运输条件的样本,使用我们设计的双内参试剂盒2进行检测。结果显示两内参之差为1.04,不在允许判读区,无法进行判读,需要重新采样检测(如图8所示)。事实上,如果不考虑双内参,如果直接按照内参基因β-globin与CYP2D6的Ct值之差判断度的话,这个样本会被判读为0CNV(Ct值之差为-0.13)。效果与双内参试剂盒1相似。
以上所述的,仅为本发明的较佳实施例,并非用以限定本发明的范围,本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰,皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海康黎诊断技术有限公司
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<213> 人工序列
<400> 6
gccacgagct gagtgcgt 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgggccgggg ctgtccagtg 20
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cagggcacac ctttggtcac tcca 24
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgtcactcca ctcccatgtc ccttgg 26
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggagaaggtc actacttgaa gagatt 26
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
catgagagat taggattcta gtatttgc 28
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gtggatgaag ttggtggtga g 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
taacagcatc aggagtggac ag 22
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctatattcct tcccttaatt aactctgttt 30
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tag 33
Claims (2)
1.一种用于检测人CYP2D6基因拷贝数变异的方法,用于非疾病诊断目的,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
A:选取待测样本已知基因组内拷贝数确定的、不存在拷贝数变异的两个DNA序列作为内参基因,针对人CYP2D6基因以及选取的这两个内参基因的序列特点,分别设计出相应的引物和探针;
B:获得抽提的待测样本基因组DNA;
C:在一个反应体系中,将所述引物和探针混合,加入反应液中;
D:进行实时定量荧光PCR检测;
E:通过计算这两个内参基因的Ct值之差Ct0,判定样本的降解程度是否达到检测不准的程度;如果该Ct0达到了无法保证检测结果准确的阈值,则提示重新采样进行DNA提取;如果该Ct0在保证检测结果准确的阈值范围以内,则进行CYP2D6基因Ct值与其中一个内参基因Ct值的差值计算得到Ct1,通过该Ct1判断待测样本CYP2D6拷贝数变异情况;
当内参基因为RPPH基因和TERT基因时,步骤E包括:计算RPPH基因的 CT值减去TERT基因的 CT值所得差值为CT0,若-1.5≤CT0≤0,判定样本质量合格;若CT0>0,或<-1.5,则样本质量不合格;样本合格后,计算CYP2D6基因的Ct值减去TERT基因的Ct值所得差值为CT1,当CT1<-1时,判定为0 拷贝变异,-1≤CT1<0.5时,判定为1拷贝变异,0.5≤CT1<1.4时,判定为2拷贝变异;
步骤A中设计的引物和探针如下:
针对人CYP2D6基因的上游引物CYP2D6-F:5’-CACCAGGAAAGCAAAGACAC-3’;
针对人CYP2D6基因的下游引物CYP2D6-R:5’-TGCAGCACTTCAGCTTCT-3’;
针对内参基因人TERT基因片段的上游引物TERT-F:5’-AGGGTCCTCGCCTGTGTA-3’;
针对内参基因人TERT基因片段的下游引物TERT-R:5’-CCCAGATTCGCCATTGTTCA-3’;
针对内参基因人RPPH基因片段的上游引物RPPH-F:5’-CCGCCTCTGGCCCTAGT-3’;
针对内参基因人RPPH基因片段的下游引物RPPH-R:5’-GCCACGAGCTGAGTGCGT-3’;
识别人CYP2D6基因突变的探针CYP2D6-Probe:5’-FAM-TGGGCCGGGGCTGTCCAGTG-BHQ1-3’;
识别内参基因人TERT基因片段保守序列特异性的探针TERT-Probe:5’-CY5-CAGGGCACACCTTTGGTCACTCCA-BHQ3-3’;
识别内参基因人RPPH基因片段保守序列特异性的探针RPPH-Probe:5’-VIC-TGTCACTCCACTCCCATGTCCCTTGG-BHQ1-3’;
步骤C中使用的各引物的浓度为800~1000nM,各探针的浓度为200~300nM。
2.一种用于检测人CYP2D6基因拷贝数变异的方法,用于非疾病诊断目的,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
A:选取待测样本已知基因组内拷贝数确定的、不存在拷贝数变异的两个DNA序列作为内参基因,针对人CYP2D6基因以及选取的这两个内参基因的序列特点,分别设计出相应的引物和探针;
B:获得抽提的待测样本基因组DNA;
C:在一个反应体系中,将所述引物和探针混合,加入反应液中;
D:进行实时定量荧光PCR检测;
E:通过计算这两个内参基因的Ct值之差Ct0,判定样本的降解程度是否达到检测不准的程度;如果该Ct0达到了无法保证检测结果准确的阈值,则提示重新采样进行DNA提取;如果该Ct0在保证检测结果准确的阈值范围以内,则进行CYP2D6基因Ct值与其中一个内参基因Ct值的差值计算得到Ct1,通过该Ct1判断待测样本CYP2D6拷贝数变异情况;
当内参基因为β-globin基因和ALB基因时,计算β-globin基因的CT值减去ALB基因的CT值所得差值为CT0,若0≤CT0≤0.9,判定样本质量合格;若CT0>0.9,或<0,则样本质量不合格;样本合格后,进行CYP2D6基因的Ct值减去β-globin基因的Ct值所得差值为CT1,若CT1<-0.5时为判定为0 拷贝变异,-0.5≤CT1<1.0时,判定为1拷贝变异,1≤CT1<1.7时,判定为2拷贝变异;
步骤A中设计的引物和探针如下:
针对人CYP2D6基因的上游引物CYP2D6-F:5’-CACCAGGAAAGCAAAGACAC-3’;
针对人CYP2D6基因的下游引物CYP2D6-R:5’-TGCAGCACTTCAGCTTCT-3’;
针对内参基因人ALB基因片段的上游引物ALB-F:5’- GGAGAAGGTCACTACTTGAAGAGATT-3’;
针对内参基因人ALB基因片段的下游引物ALB-R:5’-CATGAGAGATTAGGATTCTAGTATTTGC-3’;
针对内参基因人β-globin基因片段的上游引物β-globin-F:5’-GTGGATGAAGTTGGTGGTGAG-3’;
针对内参基因人β-globin基因片段的下游引物β-globin-R:5’-TAACAGCATCAGGAGTGGACAG-3’;
识别人CYP2D6因突变的探针CYP2D6-Probe:5’-FAM-TGGGCCGGGGCTGTCCAGTG-BHQ1-3’;
识别内参基因人ALB基因片段保守序列特异性的探针ALB-Probe:5’-VIC-CTATATTCCTTCCCTTAATTAACTCTGTTT-MGB-3’;
识别内参基因人β-globin基因片段保守序列特异性的探针β-globin-Probe:5’-CY5-AAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAG-BHQ1-3’;
步骤C中使用的各引物的浓度为800~1000nM,各探针的浓度为200~300nM。
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