CN113186215B

CN113186215B - 一种来源于拟杆菌的高活性、热稳定性肝素酶i及其应用

Info

Publication number: CN113186215B
Application number: CN202110388232.9A
Authority: CN
Inventors: 田丰伟; 于雷雷; 张川; 翟齐啸; 王晨; 肖越; 赵建新; 张灏; 陈卫
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-04-10
Filing date: 2021-04-10
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2041-04-10
Also published as: CN113186215A

Abstract

本发明公开了一种来源于拟杆菌的高活性、热稳定性肝素酶I及其应用，属于微生物技术领域。本发明本发明提供了一种来源于Bacteroides nordii诺迪拟杆菌的肝素酶I BnHepI；来源于Bacteroides finetgoldii细沟拟杆菌的肝素酶I BfHepI，具有很好的热稳定性，其中，本发明中发现BnHepI的最适反应pH为8，最适反应温度为40℃；该酶具有较高的酶活，在最适条件下的最高酶活可达360.45IU/mg。同时，该肝素酶具有良好的热稳定性，50℃下的半衰期为10.6min，40℃下的半衰期为244min。表明该重组酶具有较大的工业应用潜力。

Description

一种来源于拟杆菌的高活性、热稳定性肝素酶I及其应用

技术领域

本发明涉及一种来源于拟杆菌的高活性、热稳定性肝素酶I及其应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

肝素(Heprain)是一种特异性质多分散的混合硫酸化多糖，广泛分布于哺乳动物组织中，以共价键形式和蛋白质结合。目前商业肝素主要是从牛肺和猪小肠黏膜中提，结构复杂且具有多种重要的生物学功能，一般在临床上用于血栓，心血管等疾病的治疗。低分子量肝素(Low molecular heparin，LMWH)是肝素通过某些物理化学方法裂解而产生的一小段肝素，与蛋白质或细胞结合的能力有所下降，但抗凝活性显著增加。与正常肝素相比，低分子肝素可降低抗因子IIa的活性，极大程度地减小了出血的危险性。目前制备低分子肝素有物理、化学、生物和合成方法。其中，生物酶解法由于具备条件温和、选择性强、污染小等优点，现已成为一种新兴的方法。

肝素酶I(GenBank:AAO79780.1)是一类能够裂解肝素类结构物质、制备低分子肝素的多糖裂解酶，来源比较广泛，主要存在于原核生物肝素黄杆菌中，还包括一些拟杆菌和芽孢杆菌等。肝素酶I首先发现于肝素黄杆菌，可选择性地剪切硫酸化肝素聚糖中葡萄糖胺和糖醛酸之间α(1-4)糖苷键。根据肝素酶I的各个来源的氨基酸序列以及蛋白结构特点，肝素酶I被划分为糖苷水解酶PLs的13家族。目前肝素酶I主要应用于低分子肝素的制备、体外循环中肝素的消除、肝素确切结构的解析、以及在体外诊断试剂方面用于凝血试验和血小板实验。

从自然界中得到的不同的产肝素酶微生物，所产肝素酶也多种多样，用于酶解肝素得到的产物也各不相同，目前研究和应用最广泛的是来自肝素黄杆菌的肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III，他们分别是分子量大约为43、78、66kDa的单体蛋白质，等电点均在9.0左右。肝素酶的发现为肝素结构研究和质量检测起了重要的推动作用，其中产自肝素黄杆菌的酶I、II、III已经用于肝素类质量检测和低分子肝素生产。随着对低分子肝素的研究不断深入。人们发现，低分子肝素除了具有抗凝活性外，还对肿瘤、炎症、产科妊娠等疾病具有广泛作用，针对低分子肝素的不同药理活性进行新药开发具有广阔的前景。

但肝素的结构高度复杂，具有某种药理作用的活性位点在整个混合物中较少，而且容易受其它近似结构干扰，由此对药物开发带来干扰。而肝素酶对肝素的酶切位点比较专一，由此可分离得到较大量结构相同的片段，有利于药物开发。

研究最多的是肝素酶I，但是目前肝素酶的热稳定性很差，导致其无法很好地适应工业化应用。这已经是阻碍酶法制备低分子肝素的瓶颈。因此，寻找热稳定性好的新型肝素酶，具有重要意义。

虽然，公开号为CN109666666B的中国发明专利当中公开了一种肝素酶I，但是其来源于多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)，其原始酶的半衰期仅为6min，虽然该专利基于分子动力学的酶柔性分析提供了一种提高了肝素酶I热稳定性的突变体，但是突变酶的构建需要使用计算机进行分子动力学模拟和虚拟突变筛选，需要的门槛较高，难以实现广泛的推广。因此寻找挖掘热稳定性好的原始酶肝素酶I，仍然具有重要的意义。

发明内容

技术问题：

本发明要解决的技术问题是：提供一种热稳定性高的肝素酶I及其应用，更新肝素酶I家族的菌株来源信息，以及挖掘筛选出具有热稳定性的肝素酶I，解决目前工业上肝素酶I热稳定性差的瓶颈；同时提供一种能够生产该肝素酶I的重组菌及一种生产低分子肝素的方法。

技术方案

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种编码肝素酶I的基因，所述肝素酶I的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，本发明所阐述的肝素酶I为具有更好的热稳定性，对延长肝素酶I的货架周期，提高其在催化工艺中的操作稳定性和重复利用批次，降低生产成本等，具有重要意义，提高肝素酶I在工业上的应用价值。

在本发明的一种实施方式中，基因序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的肝素酶I分别命名为BnHepI和BfHepI。

在本发明的一种实施方式中，所述BnHepI来源于Bacteroides nordii诺迪拟杆菌FTJS11K9；所述BfHepI来源于Bacteroides finetgoldii细沟拟杆菌FNMHLBE3K7。

在本发明的一种实施方式中，所述肝素酶BnHepI的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述肝素酶BfHepI的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述肝素酶I分别为BfHepI和BnHepI，分子量分别为42.3KDa，41.8KDa。

本发明还提供了携带上述肝素酶I的基因的重组载体。

本发明还提供了携带上述肝素酶I的基因，或上述重组载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞为真菌或细菌。

本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了上述编码肝素酶I的基因。

在本发明的一种实施方式中，以pET-SUMO或pUC19为表达载体。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌基因工程菌，是以大肠杆菌BL21或BL21Rosetta为表达宿主，优选地，宿主为大肠杆菌BL21。

本发明还提供了一种构建上述重组大肠杆菌的方法，所述方法为：

(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示肝素酶BnHepI或肝素酶BfHepI。

(2)以pET-SUMO为表达载体，将扩增得到的肝素酶I基因连接到表达载体上，构建重组表达载体pET-SUMO-BfHepI，pET-SUMO-BnHepI，将上述重组表达质粒转化大肠杆菌BL21，筛选阳性转化子并测序验证。

本发明提供了一种上述肝素酶I的生产方法，所述方法为，将上述重组大肠杆菌添加至种子培养基中，在37℃、220rpm条件下培养至OD600＝0.6，得到种子液；将制备得到的种子液按照1％(v/v)的比例转入发酵培养基中，28℃培养并加入终浓度为0.6mMisopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)，诱导表达10-12h，转速200rpm。

本发明提供了一种低分子肝素的制备方法，所述方法为：将上述肝素酶，或上述重组细胞，或上述重组大肠杆菌添加至含有肝素的反应体系中进行反应。

在本发明的一种实施方式中，所述低分子肝素是指：通过肝素酶裂解之后得到的分子量小的肝素片段；低分子肝素是由普通肝素解聚制备而成的一类分子量较低的肝素的总称，平均分子量4000～6000KDa，肝素的分子量在12000KDa以上。

在本发明的一种实施方式中，所述反应温度为30～40℃。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系为50mmol/L醋酸钠，5mmol/L醋酸钙，5mmol/L肝素钠，pH 7.4。

本发明还提供了一种肝素的裂解方法，其特征在于，所述方法为：将上述肝素酶，或上述重组细胞，或上述重组大肠杆菌添加至含有肝素的反应体系中进行反应。

本发明还提供了上述方法制备得到的低分子肝素。

本发明还提供上述肝素酶I，或上述重组细胞，或上述重组大肠杆菌在制备含有低分子肝素的产品中的应用。

有益效果

1、本发明提供了一种来源于Bacteroides nordii诺迪拟杆菌FTJS11K9的肝素酶IBnHepI；来源于Bacteroides finetgoldii细沟拟杆菌FNMHLBE3K7的肝素酶I BfHepI具有很好的热稳定性，而热稳定性好的肝素酶对延长肝素酶I的货架周期，提高其在催化工艺中的操作稳定性和重复利用批次，降低生产成本等，具有重要的意义，提高肝素酶在工业上的应用价值；同时该肝素酶I BnHepI和肝素酶I BfHepI肝素酶具有较高的酶活性，酶活分别为360.45IU/mg、303.84IU/mg；在50℃下的半衰期分别是10.6min、7.9min。在40℃下的半衰期分别是244min、184min该酶在工业上具有很大的应用潜力。

2、本发明方法利用生物信息学技术手段，深入挖掘人体肠道微生物的CAZymes基因，可以快速构建相关的酶的基因文库。在此基础上通过基因工程技术可以得到蛋白质文库。基于本发明方法可以快速获得新型性能优良的肝素酶I，同时也为其他新型酶的挖掘提供可行性思路。

3、本发明提供了一种具有良好热稳定性肝素酶I，对于低分子肝素的生产，热稳定性的肝素酶可以适当提高反应温度，缩短整个生产的周期；此外肝素酶的价格相当昂贵，热稳定性的肝素酶，在整个生产过程中持续时间更长，减少使用的酶量，节省生产成本。

附图说明

图1：本发明中含有四种肝素酶I的超声裂解上清液的SDS-PAGE图；其中，M、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为170KD，130KD，100KD，70KD，55KD，40KD，35KD，25KD，15KD；Lane 1，3，5，7：分别是BcHepI，BeHepI，BfHepI，BnHepI的超声裂解上清；Lane 2，4，6，8：分别是BcHepI，BeHepI，BfHepI，BnHepI的超声裂解的沉淀。

图2：本发明中含有四种肝素酶I的纯酶液的SDS-PAGE图；其中，M蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为170KD，130KD，100KD，70KD，55KD，40KD，35KD，25KD，15KD；Lane1，3，5，7：分别是BcHepI，BeHepI，BfHepI，BnHepI的超声裂解上清；Lane2，4，6，8：分别是BcHepI，BeHepI，BfHepI，BnHepI纯化之后的条带。

图3：本发明中四种肝素酶I BcHepI，BeHepI，BfHepI，BnHepI的酶学性质最适温度。

图4：本发明中四种肝素酶I BcHepI，BeHepI，BfHepI，BnHepI的酶学性质最适pH。

图5：本发明中底物浓度对四种肝素酶I BcHepI，BeHepI，BfHepI，BnHepI的酶促反应速率的影响。

图6：本发明中四种肝素酶I BcHepI，BeHepI，BfHepI，BnHepI在40℃和50℃下的热稳定曲线图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。

下述实施例中所涉及的突变引物、DNA聚合酶、DpnI酶、DNA和蛋白质Maker等均购自Thermo公司。测序由苏州金唯智公司完成。质粒提取，PCR产物切胶回收试剂盒等均购自全式金公司。纯化用的Co柱可以购自GE公司。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB液体培养基：NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L。

发酵培养基：NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

肝素酶I酶活测定方法，步骤如下：

酶活测定采用232nm的光吸收法，以肝素钠为底物测定肝素酶I的活性，反应体系为：1.5mL的离心管中加入100μL的底物缓冲液，所述底物缓冲液为50mmol/L醋酸钠，5mmol/L醋酸钙，5mmol/L肝素钠的混合物，金属浴中40℃恒温孵育10min，加入稀释纯化脱盐后的浓度为25ug/ml的酶液10μL，反应10min，立即加入0.06mol/L盐酸1mL终止反应；在12000r/min条件下离心5min，取上清液测定其在232nm的吸光值。

一个酶活力单位指在30℃，1min内产生1μmol的△4,5不饱和糖醛酸反应效力。

实施例1：目的基因肝素酶I的获得

根据《分子克隆实验指南》提供的方法从培养36小时的Bacteroides clarus(克拉鲁斯拟杆菌FFJLY22K22)，Bacteroides eggerthii(埃氏拟杆菌FSDTAHCKB9)，Bacteroidesfinetgoldii(细沟拟杆菌FNMHLBE3K7)，和Bacteroides nordii(诺迪拟杆菌FTJS11K9)中提取总的DNA，将其送去进行全基因组测序并进行基因功能注释。通过生信技术分析拟杆菌的CAZymes基因，根据CAZy家族的分类确定Bacteroides clarus(克拉鲁斯拟杆菌FFJLY22K22)，Bacteroides eggerthii(埃氏拟杆菌FSDTAHCKB9)，Bacteroidesfinetgoldii(细沟拟杆菌FNMHLBE3K7)，和Bacteroides nordii(诺迪拟杆菌FTJS11K9)中的肝素酶I基因BcHepI(核苷酸序列SEQ ID NO.3所示)，BeHepI(核苷酸序列SEQ ID NO.4所示)，BfHepI(核苷酸序列SEQ ID NO.2所示)和BnhepI(核苷酸序列SEQ ID NO.1所示)。

分别将BcHepI，BeHepI，BfHepI和BnhepI核苷酸序列进行全合成构建到pUC-19载体上，成功构建测序重组测序质粒pUC-19-BcHepI，pUC-19-BeHepI，pUC-19-BfHepI和pUC-19-BnHepI。以构建的质粒为模板进行聚合酶链式反应，得到目的基因BcHepI，BeHepI，BfHepI和BnhepI基因序列，反应所用引物、组分和扩增条件如表1所示：

表1：引物序列

表2 PCR反应体系

补水至25μL。反应体系可按需求相应放大。

反应条件：95℃,3min预变性；98℃,10s，退火，58℃,15s，变性，72℃,2min，延伸，第二步到第四步进行30个循环；72℃,5min；12℃。利用omega公司提供的凝胶纯化试剂盒纯化目的DNA片段即可获得带有pET-SUMO同源臂的目的基因DNA。

实施例2：大肠杆菌重组菌的构建

具体步骤如下：

(1)将pET-SUMO质粒和实施例1制备得到的目的基因，进行Xho I和BamH I双酶切，回收酶切片段。使用Vazyme的ClonExpress II One Step Cloning Kitchen试剂盒进行同源重组连接，带有pET-SUMO同源臂的目的基因DNA和双酶切的pET-SUMO质粒，制备得到连接产物。

(2)将制备得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过质粒提取和PCR筛选阳性克隆，并进行测序鉴定。所构建的含有肝素酶I基因的大肠杆菌表达质粒命名为pET-SUMO-BcHepI，pET-SUMO-BeHepI，pET-SUMO-BfHepI，pET-SUMO-BnHepI。

(3)将步骤(2)制备得到的重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，制备得到重组大肠杆菌：BL21(DE3)-BcHepI，BL21(DE3)-BeHepI，BL21(DE3)-BfHepI,BL21(DE3)-BnHepI。

实施例3：肝素酶I的表达、纯化以及活性测定

具体步骤如下：

1、肝素酶I粗酶液的制备

分别将实施例2制备得到的重组大肠杆菌接种于含卡那霉素抗性的5mL LB培养基(含50μg/L卡那霉素)37℃，220r/min培养12h，分别制备得到种子液。

分别将制备得到的种子液按1％(v/v)接种量接入50mL发酵培养基中(250mL摇瓶),在37℃，220r/min培养至OD 600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.6mM的IPTG，在28℃，200r/min条件下诱导10-12h，分别制备得到发酵液。

分别将制备得到的发酵液在4℃8000r/min离心10min收集菌体，用缓冲液(20mmol/L Tris-Hcl 200mmol/L NaCl pH 7.4)洗涤两遍，再将其悬于40mL缓冲液中，超声破碎细胞。在12000r/min、4℃条件下离心20min，收集上清，进行SDS-PAGE分析。电泳结果如图1所示。结果显示：四种酶的分泌表达，均达到了90％左右。

2、肝素酶I纯酶液的制备

(1)使用Co-NTA亲和层析进行纯化，Co柱使用10mL的平衡缓冲液(20mmol/LTrisHcl，300mmol/L NaCl pH 7.4)平衡后上样，并使用10mL结合缓冲液(20mmol/L Tris-Hcl，300mmol/L NaCl，5mmol/L咪唑)冲洗除掉非特异性结合蛋白，使用3mL洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-Hcl，300mmol/L NaCl，150mmol/L咪唑)洗脱重组目的蛋白，收集洗脱液即为纯化后的重组酶。使用PD-10预装脱盐柱对纯化后的酶进行脱盐处理。使用25mL的平衡缓冲液(20mmol/L Tris-Hcl，200mmol/L NaCl pH 7.4)平衡后上样2.5mL，3.5mL缓冲液洗脱，从上样开始收集2.5-6mL的洗脱液为脱盐后的酶液。

采用上述方法，分别制备得到含有BcHepI的纯酶液，含有BeHepI的纯酶液，含有BfHepI的纯酶液，含有BnHepI的纯酶液。

纯化后的酶经SDS-PAGE分析，结果如图2所示，可以达到胶纯的效果。

分别检测上述纯酶的酶活，结果为：BcHepI纯酶，BeHepI纯酶，BfHepI纯酶，BnHepI纯酶的酶活分别为272.23IU/mg，325.16IU/mg，303.84IU/mg，360.45IU/mg。

实施例4：肝素酶I的酶学性质和热稳定性测定

1、温度对肝素酶I活性的影响

温度既能改变酶发生催化反应速度，也能导致酶蛋白活性降低或失活。本实验将测定肝素酶I BcHepI，BeHepI，BfHepI，BnHepI的最佳反应温度。

具体实验如下：

分别向100μL反应液中添加10μL实施例3制备得到的纯酶液，得到反应体系，其中，反应液为：50mmol/L醋酸钠，5mmol/L醋酸钙，5mmol/L肝素钠，pH 7.4；

分别将反应体系置于25、30、35、40、45、50、55、60℃下反应；定时测定(反应10min)反应液A₂₃₂变化情况，将最佳温度下测定的酶活值作为100％，计算其他温度下的相对酶活。结果如表3和图3所示。

表3：不同酶在不同温度下的比酶活

实验结果表明BcHepI，BeHepI，BfHepI，BnHepI的最佳反应温度分别为35℃，30℃，35℃和40℃。

2、pH对肝素酶I活性的影响

酶反应都有其最佳的pH值范围，pH值过高或者过低对酶发生催化反应的活性都会产生影响，本实验将测定肝素酶I Bc-HepI，Be-HepI，Bf-HepI，Bn-HepI的最佳反应pH。

具体实验如下：

分别向100μL反应液中添加10μL实施例3制备得到的纯酶液，得到反应体系，其中，反应液为：50mmol/L醋酸钠，5mmol/L醋酸钙，5mmol/L肝素钠；调节反应体系中的pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，置于37℃反应；定时测定(反应10min)反应液A₂₃₂变化情况，将最适pH值下测得的酶活值作为100％，计算其他pH值下的相对酶活。结果如表4和图4所示。

表4：不同酶在不同pH条件下的酶活

实验结果表明Bc-HepI，Be-HepI，Bf-HepI，Bn-HepI的最佳反应pH分别为7.0，7.0，7.0和8.0。

3、t_1/2值是指酶在特定温度下处理一段时间后残余酶活为50％时对应的时间。

具体测定方法如下：

以未进行热处理的肝素酶I的活力作为100％，分别测定并计算出实施例3制备得到的纯酶液分别在40℃和50℃下处理不同时间后的残余酶活，并计算半衰期。

并且以及文献中公开的ChBD-SUMO-Hep I酶、BcHepI酶(以下简称BcHepI-2)作为对照，将文献当中的数据直接列于表5中，ChBD-SUMO-Hep I酶公开于“Expression andcharacterization of an enhanced recombinant heparinase I with chitin bindingdomain”论文中，BcHepI酶(以下简称BcHepI-2)公开于“A highly active heparinase Ifrom Bacteroides cellulosilyticus:Cloning,high level expression,and molecularcharacterization”，结果如表5所示：

表5不同酶在30℃的酶活及在40和50℃下的半衰期数据

其中，/代表公开的文献中没有做相应的数据，可能是在此条件下无法检测半衰期。

以处理时间为横坐标，以％残余酶活为纵坐标，绘制模拟时间-残余酶活的曲线，结果如图6所示。实验结果表明本发明的BnHepI和BfHepI的热稳定性最好。

4、底物浓度对酶促反应速率的影响

底物浓度会显著的影响酶促反应的效率，在其他条件不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。当底物浓度较低时，反应速度与底物浓度呈正比，反应为一级反应。随着底物浓度的增高，反应速度不再成正比例加速，反应为混合级反应。当底物浓度高达一定程度反应速度不在增加，达到最大速度，反应为零级反应。

具体实验如下：

分别向100μL反应液中添加10μL实施例3制备得到的纯酶液，得到反应体系，其中，反应液为：50mmol/L醋酸钠，5mmol/L醋酸钙，pH 7.4，其中肝素钠的浓度分别为0，1，2，5，10，15，20，25mg/ml；将反应体系置于30℃，反应10min，反应结束后，通过双倒数曲线分别计算出酶的催化常数Km值和最大反应速率Vmax值结果如表6和图5所示。

表6：不同酶的催化常数Km值和Vmax

Enzyme	Km(mM)	Vmax(mM/min)
			BcHepI	0.72±0.1	0.24±0.04
BeHepI	0.56±0.09	0.21±0.06
			BfHepI	0.42±0.1	0.22±0.06
BnHepI	0.25±0.07	0.24±0.05

实验结果表明，催化常数BcHepI＞BeHepI＞BfHepI＞BnHepI，Vmax四个酶之间没有显著差别。说明Bn-HpeI与底物的结合能力最强。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种来源于拟杆菌的高活性、热稳定性肝素酶I及其应用

<130> BAA210333A

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1110

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caaaatgcaa agctgattcc tttgacggaa cgtgtgaatg tacaggctga ttcagcacgt 60

atcaatcagg ttattgatgg ttgttgggta gctgttggta cagacaaacc acattccatt 120

caacgggatt ataccattcc ttttaatgga aagccctctt atcgttttga gcttaaaacg 180

gaggacaata ctttggaagg atatgctaaa ggtgagacta agggccgtgc ggagttttct 240

tattgttatg ctacatctgc tgattttaaa ggacaacctg caagtgttta tgaaaatgcg 300

cagaagacca aaaccgttta tcatcatgga aaaggtatat gtccgcaagg tgcttcacgt 360

gattatgagt tttcagttta tattccctcc gcattgaaca gagatgtatc tactatcttt 420

gctcaatggc acggaatgcc ggaccgtact ttggtttcta ctcctgatgg cgaagtgaag 480

aagcttacta cagaggagtt tttggagctg tatgaccgga tgatctttaa gaaaaatgta 540

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caaggaggct atcctccatt ggcattcgga ttctccggag gatggttcta tatcaaagca 720

aactctgacc gtagatggct gaccgacaaa gatgaccgtt gcaatgcaaa tgtagaaaaa 780

acacctgtca tgaaaccggt gacttctgaa tacaagtcat cgactatcgc ttacaaaatg 840

ccttttgccg atttcccgaa agattgttgg attacattcc gtatccatat tgattggact 900

gtctacggga aagaggctga gacaattgta aagccgggta tgcttgatgt acagatgaat 960

tatcaggata aaggtaaaaa ggttagtaaa caccttgtag acaatgagca gattctgatt 1020

ggacgtaacg acaaagatgg ctactatttt aaatttggta tttatagggt aggtaacagc 1080

accaaaccgg tgtgttacaa tttggcaggt tattcggaaa agtaa 1125

<210> 3

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actgcgcaaa ccaaaggctc tgaaacattg gttcccctga ccaaacgggt aaacgttcaa 60

gctgactcag cgcgtatcga tcaggttata gacggctgtt gggtagctgt cggcgcgaaa 120

aaggagcatg ccattcaacg ggattttaca tgtttgttca acggcaagcc gtcttatcgt 180

tttgagctgc gtgaagagga taatactttg gaagggtacg gaaagggaga gaccaaaggc 240

cgtgccgagt tctcttattg ttatgccacc tcggccgatt ttaacggatt gccggcggat 300

gcttaccgga aagcgcaaat caccaagacc gtatatcatc acggaaaagg tatttgtccg 360

caaggagcgt cacgcgacta tgagttctcc gtatatattc cgtctgcgct ggatagcaat 420

gtgtctacca tttttgccca atggcacggt atgcccgacc gtacgcttgt gcagactcct 480

gaaggtgaag tgaaaaagtt gacggttgac gagtttatag agctggataa gaccactatt 540

ttcaaaaaga acaccggaca tgaaaaagtg gcgagactgg ataagcaagg aaatccgatg 600

aaagataaaa agggaaatcc tatctataag gccggaaaga agaacggttg gttggtagag 660

caaggcggtt atccgccgtt ggctttcgga ttttccggcg gctggtttta tatcaaggcc 720

aattcggacc gccgttggct gaccgacaag actgaccgct gtaacgccaa tccggaaaaa 780

actccgataa tgaagcctgt gacttctgaa tacaagtcgt ctacaatagc ttataagatg 840

ccttttgccg atttccccaa agactgctgg gttactttcc gcattcatat cgactggact 900

acttatggca aggaagccga aaccattgtg aaaccgggca aactggacgt acaaatggag 960

tataccgaca agaagaaaac cgttaaagag catatcgtga ataatgaaga aattcagata 1020

ggccgtaatg acgatgacgg ttactatttt aaattcggca tctatcgtgt aggtaacagt 1080

acagtaccgg tatgctataa cttggccgga tataaggaag agtga 1125

<210> 4

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actgcacaag tcaagaacgc tgaaacactg gttcctttga ctaaacgggt aaacgttcaa 60

gctgatacag cacgtctcga tcagattata gatggctgtt gggtggctgt gggcacaaat 120

aagaaacatg caattcgacg ggatttcaca cgtttgtttg ccggcaaacc ttcttaccgc 180

ttcgaattgc gcaaagagga taacacgctg gaaggatacg gaaagggaga aaccaaaggg 240

cgtgccgagt tttcttattg ttacgccacc tcggccgatt ttaaggggtt gccggcagat 300

gcttatcgta aagcgcaaat cactaaaacc gtatatcatc atggcaaagg tatttgtccg 360

caaggagttt cacgcgatta tgagttttct gtgtatattc catctgcttt ggatagtaat 420

gtctccacga tttttgccca gtggcatggt atgcccgacc gcacgcttgt gcagactccc 480

gaaggtgaag taaagaaact gactgtcgat gagttcttgg aattggataa gaccactata 540

ttcaaaaaga atacagggca tgagaaggtt gcaaaactgg acaagcaggg aaatccgttg 600

aaggataaaa agggaaattc cgtatataag gccggaaaga agaacggctg gttggtagag 660

cagggtggtt atccgccgtt ggctttcggt ttctccggcg gttggttcta tatcaaggca 720

aattcggatc gccgttggct gacagacaaa acagaccgtt gcaacgcaag tcctgagaaa 780

acgccggtaa tgaaacccgt aacttccaag tacaagtcgt ctacaattgc ctataagatg 840

ccttttgccg atttccctaa agattgttgg gttacttttc gtgttcatat cgactggact 900

acatacggca aagaagctga aaacatagtg aagcccggta agctggatgt gcaaatggaa 960

tacaccgaca agaagaaaac cgttaaggag cacatcgtga ataatgaagt aatccagata 1020

gggcgtaatg atgatgacgg ttactatttt aagttcggca tatatcgtgt tggcaacagc 1080

acagtgccgg tatgctacaa cctggcaggg tacaaggaag agtga 1125

<210> 5

<211> 369

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gln Asn Ala Lys Leu Ile Pro Leu Thr Glu Arg Val Asn Val Gln Ala

1 5 10 15

Asp Ser Ala Arg Ile Asn Gln Val Ile Asp Gly Cys Trp Val Ala Val

20 25 30

Gly Thr Asp Lys Pro His Ser Ile Gln Arg Asp Tyr Thr Ile Pro Phe

35 40 45

Asn Gly Lys Pro Ser Tyr Arg Phe Glu Leu Lys Thr Glu Asp Asn Thr

50 55 60

Leu Glu Gly Tyr Ala Lys Gly Glu Thr Lys Gly Arg Ala Glu Phe Ser

65 70 75 80

Tyr Cys Tyr Ala Thr Ser Ala Asp Phe Lys Gly Gln Pro Ala Ser Val

85 90 95

Tyr Glu Asn Ala Gln Lys Thr Lys Thr Val Tyr His His Gly Lys Gly

100 105 110

Ile Cys Pro Gln Gly Ala Ser Arg Asp Tyr Glu Phe Ser Val Tyr Ile

115 120 125

Pro Ser Ala Leu Asn Arg Asp Val Ser Thr Ile Phe Ala Gln Trp His

130 135 140

Gly Met Pro Asp Arg Thr Leu Val Ser Thr Pro Asp Gly Glu Val Lys

145 150 155 160

Lys Leu Thr Thr Glu Glu Phe Leu Glu Leu Tyr Asp Arg Met Ile Phe

165 170 175

Lys Lys Asn Val Ala His Asp Lys Val Pro Val Leu Asp Lys Gln Gly

180 185 190

Asn Pro Lys Lys Asp Lys Asp Gly Asn Val Val Tyr Lys Ala Gly Lys

195 200 205

Ala Asn Gly Trp Leu Val Glu Gln Gly Gly Tyr Pro Pro Leu Ala Phe

210 215 220

Gly Phe Ser Gly Gly Tyr Phe Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Asp Arg Lys

225 230 235 240

Trp Leu Thr Asp Lys Thr Asp Arg Cys Asn Ala Ser Ala Glu Lys Ser

245 250 255

Gln Ile Met Lys Pro Val Thr Ser Lys Tyr Lys Ala Ser Thr Ile Ala

260 265 270

Tyr Lys Met Pro Phe Ala Glu Phe Pro Lys Asp Cys Trp Ile Thr Phe

275 280 285

Arg Ile His Ile Asp Trp Thr Val Tyr Gly Lys Glu Thr Glu Thr Ile

290 295 300

Val Lys Pro Gly Met Leu Asp Val Gln Met Ser Tyr Thr Glu Lys Gly

305 310 315 320

Lys Gln Ile Asn Arg His Ile Val Asp Asn Glu Glu Ile Leu Ile Gly

325 330 335

Arg Asn Asp Glu Asp Gly Tyr Tyr Phe Lys Phe Gly Ile Tyr Arg Val

340 345 350

Gly Asn Ser Thr Ile Pro Val Cys Tyr Asn Leu Ala Gly Tyr Ser Glu

355 360 365

Asn

<210> 6

<211> 374

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Asn Ala Gln Thr Lys Asn Thr Gln Thr Leu Val Pro Leu Thr Glu Arg

1 5 10 15

Val Asn Val Gln Ala Asp Ser Ala Arg Val Asn Gln Ile Ile Asp Gly

20 25 30

Cys Trp Val Ala Val Gly Ser Lys Lys Ser His Ala Ile Gln Arg Asp

35 40 45

Phe Thr Arg Met Phe Asn Gly Lys Pro Ser Tyr Arg Phe Glu Leu Lys

50 55 60

Glu Asp Asp Asn Thr Leu Ser Gly Tyr Ala Lys Gly Glu Thr Lys Gly

65 70 75 80

Arg Ala Glu Phe Ser Tyr Cys Tyr Ala Thr Ser Asp Asp Phe Lys Gly

85 90 95

Lys Pro Ala Asp Thr Tyr Lys Lys Ala Gln Ile Met Lys Thr Val Tyr

100 105 110

His His Gly Lys Gly Ala Cys Pro Gln Gly Ser Ser Arg Asp Tyr Glu

115 120 125

Phe Ser Val Tyr Ile Pro Ser Thr Leu Gly Ser Asp Val Ser Thr Ile

130 135 140

Phe Ala Gln Trp His Gly Met Pro Asp Arg Thr Leu Val Gln Thr Pro

145 150 155 160

Gln Gly Glu Val Lys Thr Leu Thr Val Asp Glu Phe Ile Glu Leu Glu

165 170 175

Lys Thr Thr Ile Phe Lys Lys Asn Val Gly His Glu Lys Lys Ala Lys

180 185 190

Leu Asp Lys Gln Gly Asn Pro Val Lys Asp Lys His Gly Asn Pro Val

195 200 205

Tyr Thr Ala Gly Lys Ala Asn Gly Trp Leu Val Glu Gln Gly Gly Tyr

210 215 220

Pro Pro Leu Ala Phe Gly Phe Ser Gly Gly Trp Phe Tyr Ile Lys Ala

225 230 235 240

Asn Ser Asp Arg Arg Trp Leu Thr Asp Lys Asp Asp Arg Cys Asn Ala

245 250 255

Asn Val Glu Lys Thr Pro Val Met Lys Pro Val Thr Ser Glu Tyr Lys

260 265 270

Ser Ser Thr Ile Ala Tyr Lys Met Pro Phe Ala Asp Phe Pro Lys Asp

275 280 285

Cys Trp Ile Thr Phe Arg Ile His Ile Asp Trp Thr Val Tyr Gly Lys

290 295 300

Glu Ala Glu Thr Ile Val Lys Pro Gly Met Leu Asp Val Gln Met Asn

305 310 315 320

Tyr Gln Asp Lys Gly Lys Lys Val Ser Lys His Leu Val Asp Asn Glu

325 330 335

Gln Ile Leu Ile Gly Arg Asn Asp Lys Asp Gly Tyr Tyr Phe Lys Phe

340 345 350

Gly Ile Tyr Arg Val Gly Asn Ser Thr Lys Pro Val Cys Tyr Asn Leu

355 360 365

Ala Gly Tyr Ser Glu Lys

370

Claims

1.一种编码肝素酶I的基因，其特征在于，所述肝素酶I的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.携带权利要求1所述的肝素酶I的基因的重组载体。

3.携带权利要求1所述的肝素酶I的基因或权利要求2所述的重组载体的重组细胞。

4.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达了权利要求1所述的编码肝素酶I的基因。

5.如权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pET-SUMO 或pUC19为表达载体。

6.如权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21或大肠杆菌BL21Rosetta为表达宿主。

7.一种低分子肝素的制备方法，其特征在于，将权利要求3所述的重组细胞，或权利要求4或5所述的重组大肠杆菌添加至含有肝素的反应体系中进行反应。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，反应温度为30~40℃。

9.权利要求1所述的肝素酶I的基因，或权利要求3所述的重组细胞，或权利要求4或5所述的重组大肠杆菌在制备含有低分子肝素的产品中的应用。