CN113181235A - 板栗花粉提取物的制备方法及应用 - Google Patents

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CN113181235A CN202110498320.4A CN202110498320A CN113181235A CN 113181235 A CN113181235 A CN 113181235A CN 202110498320 A CN202110498320 A CN 202110498320A CN 113181235 A CN113181235 A CN 113181235A
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杨越冬
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Abstract

本发明涉及花粉提取技术领域，公开了板栗花粉提取物的制备方法及应用。板栗花粉提取物在制备免疫力调节，提取物在制备促进巨噬细胞吞噬活性，与Con A协同促进脾淋巴细胞增殖，或激活加强NK细胞杀伤活性的药物或食品中的应用，板栗花粉提取物中含有黄酮和活性肽。板栗花粉提取物的制备方法，以水为溶剂，进行黄酮提取；然后以水为溶剂，酶解提取滤渣中的活性肽；合并两次提取的产物。本申请提供的制备方法，采用分开提取的方式分别提取板栗花粉中的黄酮和活性肽，可充分提取花粉中的黄酮和活性肽等活性物质，应用于免疫力调节以及促进免疫细胞活性时效果更好，大大降低了板栗花粉的有效剂量。

Description

板栗花粉提取物的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及花粉提取技术领域，具体而言，涉及板栗花粉提取物的制备方法及应用。
背景技术
板栗，又名栗、栗子和风腊，原产于中国，约有两千多年的栽培历史。目前全国栽植面积2700多万亩，产量260多万吨(占世界的84％)，面积和产量均居世界第一位。栗树为雌雄同株，异花授粉，雌雄花数量比可达1:2349，研究表明，只有少量的雄花即可满足授粉需要，大量的雄花都是多余的，白白消耗了树体营养。因此，为提高板栗产量，需人工疏除90％左右雄性花序，这些板栗雄花大多被作为废物丢弃，导致了资源的巨大浪费。
据《本草纲目》记载，栗花性味甘、平，无毒。栗花可以通过食用治疗喉炎肿毒、瘰病和赤白痢疾等症状，也可以外用，捣碎取汁外用可治疗漆疮症。现代药理研究表明板栗花雄花序具有增强血管张力，降低血管脆性，改善血管通透性，降低血脂及胆固醇；减少红血球和血小板聚集，减少血栓的形成；护肝解毒，提高机体免疫力；抗菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗真菌、抑制肿瘤等活性。国内外的研究表明，板栗花在食品、药品、保健品等诸多领域具有开发应用的价值。
花粉是植物有性繁殖的雄性配子体，是植物繁衍后代的“***”，存在于雄性花囊内，含有多种维生素、酶、微量元素、生物活性物质等多种人体所必需的营养成分，具有低脂肪、高蛋白的特点，被人们誉为“微型营养库”。近代科学研究和临床应用证明了花粉的医疗保健作用。花粉内含有许多的生物活性物质如酚类、类黄酮、脂类、蛋白质、维生素、微量元素等，为人体消耗提供潜在能量来源和功能性物质来源，被人们认为是天然的健康食品，因此有“浓缩的营养库”之称。其中，板栗花粉中的黄酮物质是所有花粉中含量最高的，凝聚了天然、绿色、营养、保健等特点，逐渐受到国内外的广泛关注。此外，板栗花粉含丰富的活性钙、磷、维生素E、***、黄酮、蛋白质等生物活性物质。但是目前对于板栗花粉研究的专利寥寥无几。申请号为201310071627.1的说明书中公开了一种板栗花粉加工方法，通过采集、晾晒、烘干、筛粉、包装工序进行加工，得到真空包装的板栗花粉，并未对板栗花粉的营养成分及功效进行研究。申请号为CN201210351320.2的说明书中公开了一种从板栗花中提取黄酮混合物的方法，提取过程需要醇类溶液、碱液、和亚硫酸钠或亚硫酸钾的混合溶液，提取物存在有机溶剂和无机盐的残留的问题，不利于后续的实际应用。目前现有对其他植物花粉的研究都是以花粉中某种单一物质为目标产物。虽然提取得到的组分具有较好的活性，但是却在提取过程中损失了花粉中其他的活性成分，使花粉仅仅成为某种成分的原料，而无法体现花粉“全能营养库”的特点。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供板栗花粉提取物在制备免疫力调节的药物或食品中的应用和板栗花粉提取物的制备方法。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供板栗花粉提取物在制备免疫力调节的药物或食品中的应用，板栗花粉提取物中含有黄酮和活性肽。
第二方面，本发明提供板栗花粉提取物在制备促进巨噬细胞吞噬活性，与Con A协同促进脾淋巴细胞增殖，或激活加强NK细胞杀伤活性的药物或食品中的应用，所述板栗花粉提取物中含有黄酮和活性肽。
在可选的实施方式中，药物的剂型包括：粉剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、糖浆剂、酊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、水性药物、乳剂、混悬剂、凝胶、乳膏、软膏或乳液。
第三方面，本发明提供板栗花粉提取物的制备方法，包括：
板栗花粉提取物的制备方法，包括：
以水为溶剂，将板栗花粉与水混合，采用回流提取法、超声提取法或微波提取法进行黄酮提取得到第一提取液和第一滤渣；
以水为溶剂，将第一滤渣与水混合，依次采用纤维素酶和蛋白酶提取第一滤渣中的活性多肽得到第二提取液和第二滤渣；
合并第一提取液和第二提取液；
在可选的实施方式中，合并所述第一提取液和所述第二提取液后得到板栗花粉提取液，将所述板栗花粉提取液干燥得到板栗花粉提取物。
在可选的实施方式中，黄酮提取是：将板栗花粉与水混合，在30-60℃下进行提取，提取结束后进行固液分离得到第一提取液和第一滤渣，提取方法包括回流提取法、超声提取法或微波提取法；
在可选的实施方式中，活性肽提取是：将第一滤渣再次与水混合得到混合浆液，调节混合浆液pH为4.0-7.0，向混合浆液中加入纤维素酶，于30-60℃下进行一次酶解；
一次酶解结束后调节混合浆液pH为4.0-7.0，向混合浆液中加入蛋白酶，于30-60℃下进行二次酶解；
二次酶解后对混合浆液进行灭酶；
灭酶后进行固液分离得到第二提取液和第二滤渣；
在可选的实施方式中，活性肽提取步骤重复提取至少一次，合并每次获得的提取液得到第二提取液。
在可选的实施方式中，采用回流提取法进行黄酮提取，提取时间为2-6h；
优选地，重复提取1-2次，合并每次提取获得的提取液得到第一提取液。
在可选的实施方式中，采用超声提取法进行黄酮提取，超声频率为10-50KHz，提取时间为20-120min；
优选地，重复提取1-2次，合并每次提取获得的提取液得到第一提取液。
在可选的实施方式中，采用微波提取法进行黄酮提取，微波功率为350-600W，提取时间为20-120min；
优选地，重复提取1-2次，合并每次提取获得的提取液得到第一提取液。
在可选的实施方式中，一次酶解的酶解时间为1-6h；
优选地，纤维素酶的加入量为板栗花粉质量的0.1～2％。
在可选的实施方式中，二次酶解的酶解时间为1-6h；
优选地，蛋白酶的加入量为板栗花粉质量的0.1～2％。
在可选的实施方式中，蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶中至少一种。
在可选的实施方式中，灭酶是在将反应体系温度升高至85～95℃，保持8～12min。
在可选的实施方式中，板栗花粉与水以料液比1:5～50混合；
优选地，第一滤渣再次与水以料液比1:2～10混合。
本发明具有以下有益效果：
含有黄酮和活性肽的板栗花粉提取物可促进巨噬细胞吞噬活性，与Con A协同促进脾淋巴细胞增殖，激活加强NK细胞杀伤活性，因此其可应用于制备调节或激发上述细胞活性的药物和食品中；含有黄酮和活性肽的板栗花粉提取物对免疫力调节有显著的作用，可应用于制备免疫力调节的药物或食品中。特别是本申请提供的制备方法，该方法最大程度地保留了板栗花粉的生物活性，采用分开提取的方式分别提取板栗花粉中的黄酮和活性肽，可确保将花粉中的黄酮和活性肽以及一些其他的活性物质充分提取出来，应用于调节或激发上述细胞活性或免疫力调节时效果更好，大大降低了板栗花粉的有效剂量。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明提供的板栗花粉提取物的制备方法及应用进行具体描述。
板栗花粉提取物在制备免疫力调节的药物或食品中的应用，板栗花粉提取物中含有黄酮和活性肽。
根据现有资料公开的内容表明，通常认为花粉中对于免疫起到调节作用的物质为黄酮。发明人付出大量的创造性劳动发现，从板栗花粉提取物中提取得到的含有黄酮和活性肽的混合物对于免疫调节有显著作用，当提取物用量相等的情况下，同时含有黄酮和活性肽时，对于免疫调节作用相较于仅含有黄酮时更好。
板栗花粉提取物在制备促进巨噬细胞吞噬活性，与Con A协同促进脾淋巴细胞增殖，或激活加强NK细胞杀伤活性的药物或食品中的应用，所述板栗花粉提取物中含有黄酮和活性肽。
发明人付出大量的创造性劳动发现，从板栗花粉提取物中提取得到的含有黄酮和活性肽的混合物对于促进巨噬细胞吞噬活性，与Con A协同促进脾淋巴细胞增殖，或激活加强NK细胞杀伤活性有显著作用。
优选地，应用于药物制备时，药物的剂型包括：粉剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、糖浆剂、酊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、水性药物、乳剂、混悬剂、凝胶、乳膏、软膏或乳液。
板栗花粉提取物的制备方法，包括：
S1、黄酮提取
将板栗花粉与水按照料液比1:5～50(例如：1:5、1:10、1:20、1:40或1:50)混合，在30-60℃(例如：30℃、40℃、50℃或60℃)下进行提取，提取结束后进行固液分离得到第一提取液和第一滤渣，提取方法包括回流提取法、超声提取法或微波提取法。
优选地，采用回流(搅拌)提取法进行黄酮提取时，提取时间为2-6h(例如：2h、4h或6h)以确保充分提取。
更优选地，为进一步保证提取充分可进行多次提取，首次提取完后重复提取1-2次，合并每次提取获得的提取液得到第一提取液。
优选地，采用超声提取法进行黄酮提取时，超声频率为10-50KHz(例如：10KHz、20KHz、30KHz或50KHz)，提取时间为20-120min(例如20min、40min、60min、80min、100min或120min)以确保充分提取。
更优选地，为进一步保证提取充分可进行多次提取，首次提取完后重复提取1-2次，合并每次提取获得的提取液得到第一提取液。
优选地，采用微波提取法进行黄酮提取时，微波功率为350-600W(例如350W、450W、500W或600W)，提取时间为20-60min例如20min、30min、40min、50min或60min)以确保充分提取。
更优选地，为进一步保证提取充分可进行多次提取，首次提取完后重复提取1-2次，合并每次提取获得的提取液得到第一提取液。
优选地，固液分离的方式为常用的过滤或离心。
经过本步骤提取，板栗花粉中的黄酮被充分提取至第一提取液中。需要说明的是，提取至第一提取液中的活性物质除了黄酮以外还有其他一些有益于健康的物质。
S2、活性肽提取
(1)一次酶解
将第一滤渣再次与水以料液比1:2～10(例如：1:2、1:4、1:6、1:8或1:10)混合得到混合浆液，调节混合浆液pH为4.0-7.0，然后向混合浆液中加入纤维素酶，于30-60℃(例如：30℃、40℃、50℃或60℃)下进行一次酶解。
优选地，为保证酶解充分，纤维素酶的加入量为板栗花粉质量的0.1～2％(例如：0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％)。更优选地，一次酶解的酶解时间为1-6h(例如:1h、2h、4h或6h)。
(2)二次酶解
一次酶解结束后调节混合浆液pH为4.0-7.0，向混合浆液中加入蛋白酶，于30-60℃(例如：30℃、40℃、50℃或60℃)下进行二次酶解。
优选地，为保证酶解充分，蛋白酶的加入量为板栗花粉质量的0.1～2％(例如：0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％)；更优选地，二次酶解的酶解时间为1-6h(例如:1h、2h、4h或6h)。
具体的，蛋白酶可以选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶中至少一种。
(3)灭酶
将反应体系温度升高至85～95℃(例如：85℃、90℃或95℃)，保持8～12min(例如：8min、10min或12min)进行灭酶。
(4)固液分离
采用过滤或离心的方式进行固液分离，得到第二滤渣和第二提取液。
优选地，S3活性肽提取步骤重复提取至少一次，具体为首次提取硅油将第二滤渣看做第一滤渣再次重复上述操作进行提取，合并每次获得的提取液得到第二提取液。
通过本步骤可使得板栗花粉中的活性肽被充分提取至提取液中。
S3、合并提取液
合并S1步骤最终得到的第一提取液和S2步骤最终得到的第二提取液得到板栗花粉提取液。
S4、干燥
将板栗花粉提取液进行干燥，得到板栗花粉提取物。优选地，干燥方式采用喷雾干燥，喷雾干燥时设置入风口165℃，出风口：85℃。
第一步采用搅拌提取或微波或超声波提取，主要用以得到的黄酮类化合物提取液，第二步采用生物酶解进行板栗花粉活性肽的提取，酸性酶解分为纤维素酶酶解和蛋白酶酶解，无论是纤维素酶还是胃蛋白酶，其最佳酶解效率的环境均为酸性，充分利用纤维素酶和胃蛋白酶的特性，将板栗花粉中的活性肽提取出来。分开提取，最大程度的提取板栗花花粉中的有效成分，经应用表明，本发明板栗花花粉提取物在对小鼠免疫调节中有显著作用。
本申请提取得到的板栗花花粉提取物可以直接作为食用级的板栗花花粉提取物，即本申请不添加任何添加剂或有机溶剂萃取剂，不需要添置有机溶剂萃取剂的回收工艺，且其提取工艺均是安全高效的。
本申请提供的板栗花花粉提取物的制备方法，其工艺简单，条件温和，安全环保，易于大规模推广，对工艺参数控制要求较低，对设备重复利用率高，降低了企业的投资规模。提取全过程未使用毒性大的溶剂或试剂。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
将板栗花粉与水按照料液比1:10混合，在40℃下进行回流搅拌提取4h。提取后分离提取液和滤渣，以滤渣作为原料再重复提取1次，提取后合并两次提取获得的提取液得到第一提取液和第一滤渣。
将第一滤渣再次与水以料液比1:5混合得到混合浆液，调节混合浆液pH为5.0，然后向混合浆液中加入占板栗花粉质量1％的纤维素酶，于40℃下进行一次酶解，酶解时间为6h。
一次酶解结束后调节混合浆液pH为7.0，向混合浆液中加入占板栗花粉质量0.5％的胰蛋白酶，于40℃下进行二次酶解，酶解时间为6h。
二次酶解后升高反应体系温度为90℃灭酶10min。
过滤得到提取液和滤渣，以滤渣为原料再重复活性肽提取步骤提取1次，提取后合并两次提取获得的提取液得到第二提取液和第二滤渣。
合并第一提取液和第二提取液得到板栗花粉提取液。
将板栗花粉提取液移至喷雾干燥机进行喷雾干燥，喷雾干燥时设置入风口165℃，出风口：85℃。得到板栗花粉提取物A。
实施例2
将板栗花粉与水按照料液比1:20混合，在30℃下以超声频率20KHz进行超声提取60min。提取后分离提取液和滤渣，以滤渣作为原料再重复提取1次，提取后合并两次提取获得的提取液得到第一提取液和第一滤渣。
将第一滤渣再次与水以料液比1:10混合得到混合浆液，调节混合浆液pH为4.5，然后向混合浆液中加入占板栗花粉质量2％的纤维素酶，于30℃下进行一次酶解，酶解时间为4h。
一次酶解结束后调节混合浆液pH为6.5，向混合浆液中加入占板栗花粉质量1％的中性蛋白酶，于30℃下进行二次酶解，酶解时间为4h。
二次酶解后升高反应体系温度为90℃灭酶10min。
过滤得到提取液和滤渣，以滤渣为原料再重复活性肽提取步骤提取1次，提取后合并两次提取获得的提取液得到第二提取液和第二滤渣。
合并第一提取液和第二提取液得到板栗花粉提取液。
将板栗花粉提取液移至喷雾干燥机进行喷雾干燥，喷雾干燥时设置入风口165℃，出风口：85℃。得到板栗花粉提取物B。
实施例3
将板栗花粉与水按照料液比1:5混合，在50℃下以功率400W进行微波提取20min。提取后分离提取液和滤渣，以滤渣作为原料再重复提取1次，提取后合并两次提取获得的提取液得到第一提取液和第一滤渣。
将第一滤渣再次与水以料液比1:2混合得到混合浆液，调节混合浆液pH为5.5，然后向混合浆液中加入占板栗花粉质量0.5％的纤维素酶，于50℃下进行一次酶解，酶解时间为2h。
一次酶解结束后调节混合浆液pH为6.0，向混合浆液中加入占板栗花粉质量1％的木瓜蛋白酶，于50℃下进行二次酶解，酶解时间为2h。
二次酶解后升高反应体系温度为90℃灭酶10min。
过滤得到提取液和滤渣，以滤渣为原料再重复活性肽提取步骤提取1次，提取后合并两次提取获得的提取液得到第二提取液和第二滤渣。
合并第一提取液和第二提取液得到板栗花粉提取液。
将板栗花粉提取液移至喷雾干燥机进行喷雾干燥，喷雾干燥时设置入风口165℃，出风口：85℃。得到板栗花粉提取物C。
对比例1
本对比例与实施例1基本相同，不同之处仅在于相对于实施例1未进行活性肽提取。得到板栗花粉提取物D。
实验例
将板栗花粉提取物A、B、C、D分别采用蒸馏水溶解，得到各自的浓度为50、100、200、400、800μg/mL的提取物溶液备用。
一、板栗花粉提取物对免疫细胞活性的影响
(1)对RAW 264.7巨噬细胞免疫活性的影响：RAW264.7细胞使用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM高糖培养液培养，2d传代一次。取对数生长期的RAW 264.7巨噬细胞用含10％胎牛血清、1％双抗的DMEM高糖培养液培养，调整细胞浓度至1×105个/mL，取200μL接种于96孔培养板，适应性培养4h后，将细胞设置为不同浓度(50、100、200、400、800μg/mL)的提取物样品组，样品组加入不同浓度提取物、LPS(1μg/mL)阳性对照组和空白组(加入等体积培养液)，每组设置3个平行孔，相同培养条件培养24h。实验结束前2h轻轻移除20μL上清液，添加中性红试剂继续培养，培养结束后缓慢吸弃培养液，用预热至37℃PBS洗3次，弃洗液，加入200μL细胞裂解液裂解细胞，然后置摇床10min，酶标仪540nm测吸光值。按下式计算吞噬率。
巨噬细胞吞噬率＝(OD样品-OD空白)/OD空白×100％
将各实验组巨噬细胞吞噬率记录至下表中。
表1各实验组巨噬细胞吞噬率统计
Figure BDA0003055376550000111
注：*表示与LPS组相比差异显著(p<0.05)；**表示与LPS组相比差异极显著(p<0.01)。
巨噬细胞是人体的一种吞噬细胞，广泛分布于组织中，有传递免疫信息、协同和吞噬处理抗原功效。单核细胞随血液循环进入组织和器官后，可进一步分化发育成巨噬细胞，成为机体内吞噬能力最强的细胞。巨噬细胞的吞噬能力是其最主要作用，吞噬能力的强弱取决于细胞活性，死细胞和状态不好的细胞不能吞噬，巨噬细胞吞噬中性红的能力可以表示巨噬细胞活性，间接反映机体免疫功能的强弱。
RAW264.7巨噬细胞吞噬中性红的实验结果由表1所示。在实验浓度范围内，RAW264.7巨噬细胞吞噬率均大于0，表明提取物具有促进吞噬作用，可增强巨噬细胞吞噬中性红的能力。提取物在较低浓度范围内，促进作用具有剂量依赖性，中性红吞噬率随着提取物浓度的增加而增加，四种提取物均在200μg/mL时促进达到最大值。本申请提供的方法得到的三种提取物对巨噬细胞吞噬活性的最大促进作用均高于阳性对照物LPS，板栗花黄酮只有在100μg/mL和200μg/mL时高于阳性对照。在相同浓度下本申请提供的方法得到的板栗花粉提取物对RAW264.7巨噬细胞吞噬中性红的促进作用要强于板栗花黄酮提取物。
(2)提取物对Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响：小鼠脱颈椎致死，无菌条件下摘取脾脏，撕去脾脏被膜，用眼科剪将脾脏剪成小块。含双抗的D-Hanks液洗涤，然后放入无菌培养皿中，加入2mL D-Hanks液，缓慢转动研棒，研磨至匀浆；过200目筛，收集洗液，1000rpm离心10min，再用细胞清洗液洗3次，离心沉淀。加入少量RPMI 1640培养液，台盼蓝染色计数，要求存活率大于95％。用含1％双抗、10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度至1×106个/mL。取100μL细胞悬液加入96孔板细胞培养中，每孔加入终浓度为4.5μg/mL刀豆蛋白(Con A)，设置不同浓度(0、50、100、200、400、800μg/mL)的提取物样品组。置细胞培养箱中培养72h，实验结束前4h加入WST-1试剂，培养结束后根据试剂盒要求测定细胞增殖情况。提取物和Con A加入量为零的组为空白组，酶标仪520nm检测吸光值，按照下式计算增殖率。
脾淋巴细胞增值率＝(OD样品-OD空白)/OD空白×100％
将各实验组对小鼠脾淋巴细胞增值率记录至下表中。
表2各实验组对脾淋巴细胞增值率统计
Figure BDA0003055376550000121
注：*表示与表示与空白组相比相比差异显著(p<0.05)；**表示与空白组相比差异极显著(p<0.01)。
脾脏是人体重要的免疫器言，其状态能一定程度上反映机体免疫功能。脾脏内驻扎有大量免疫细胞，是淋巴细胞成熟、分化的场所，能通过细胞免疫和体液免疫调节机体的免疫功能。淋巴细胞是免疫的重要组成部分，脾脏拥有全身25％的T淋巴细胞，直接参与细胞免疫，是机体适应性免疫应答的关键细胞。淋巴细胞转化试验是T细胞在特异性抗原(特异性可溶性抗原、细胞表面抗原、结核菌素)或有丝***原(Con A、LPS等)的作用下转变为淋巴母细胞，从而体积更大、代谢旺盛，不同刺激物可刺激不同淋巴细胞分化增殖，从而反映不同淋巴细胞亚群的功能状态。
Con A协同提取物诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验结果由表2表示，由表中数据可看出，提取物对淋巴细胞活性的影响随着样品浓度的增加而增强，但是达到最大值后，继续加大浓度，免疫细胞活性反而减弱。四种提取物在200μg/mL时促增殖作用最强；在相同浓度下本申请提供的方法得到的板栗花粉提取物对小鼠脾淋巴细胞的增值作用要强于板栗花黄酮提取物。
(3)小鼠NK细胞杀伤活性检测：小鼠脱颈椎致死，无菌条件下摘取脾脏，撕去脾脏被膜，用眼科剪将脾脏剪成小块。含双抗的D-Hanks液洗涤，然后放入无菌培养皿中，加入2mL D-Hanks液，缓慢转动研棒，研磨至匀浆；过200目筛，收集洗液，1000rpm离心10min。收集沉淀加入2mL细胞裂解液作用30s裂解红细胞，再立即加入8mL Hanks液中止反应，1000rpm离心10min洗涤细胞，收集沉淀加入少量RPMI 1640培养液，台盼蓝染色计数，要求存活率大于95％，用含1％双抗、10％胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度至1×106个/mL。取100μLNK细胞溶液加入96孔细胞培养板，适应性培养4h后，将细胞分成自然释放组和不同浓度(50、100、200、400、800μg/mL)提取物样品组，样品组加入不同浓度提取物，自然释放孔添加等体积完全培养液，作用12h后，加入50μL YAC-1(效靶比50:1)，混合培养4h。按照乳酸脱氢酶试剂盒要求测590nm波长下吸光值，用下式计算NK细胞杀伤活性。
NK细胞杀伤活性＝(OD实验组-OD自然释放组)/(OD最大释放组-OD自然释放组)×100％
将各实验组NK细胞杀伤活性记录至下表中。
表3各实验组对NK细胞杀伤活性统计
Figure BDA0003055376550000141
注：*表示与空白组相比差异显著(p<0.05)；**表示与空白组相比差异极显著(p<0.01)。
脾脏内有大量自然杀伤细胞(NK细胞)，NK细胞是体内重要的淋巴细胞亚群，同巨噬细胞一样，也是机体内重要的免疫细胞。NK细胞是固有免疫细胞，作为第一道免疫防线，具有识别靶细胞、分泌穿孔素等功能，积极参与细胞内的免疫反应。正常情况下活细胞胞浆内的乳酸脱氢酶不能透过细胞膜，但细胞膜破损后乳酸脱氢酶会释放到细胞外，靶细胞受到NK细胞杀伤后，释放出的乳酸脱氢酶量可由乳酸脱氢酶试剂盒测量，细胞培养液中乳酸脱氢酶含量，可反映NK细胞杀伤活性。
由表3可以看出，四种提取物可激活加强NK细胞杀伤活性，提取物C的促进作用最好，200μg/mL时NK细胞杀伤活性为32.5％，远大于空白组(18.1％)，差异极显著性(p<0.01)。板栗花黄酮提取物(D)可在一定程度上增强NK细胞杀伤活性，但没有显著性。
二、提取物对小鼠免疫功能影响
1.将小鼠随机分成8组，雌雄各半，每组10只。分别为空白组、模型组、C高剂量组、C中剂量组、C低剂量组、D高剂量组、D中剂量组、D低剂量组；空白组、模型组每天以0.1mL/10g生理盐水进行灌胃，板栗花粉提取物C和D高剂量组600mg/kg、中剂量组400mg/kg、低剂量组200mg/kg按小鼠体重每10g、生理盐水0.1mL进行溶解并灌胃，连续21天。模型组，高、低剂量组于给药第18、19、20、21天以环磷酰胺80mg/kg按小鼠体重每10g、生理盐水0.1mL溶解进行腹腔注射，空白组以小鼠体重每10g、生理盐水0.1mL进行腹腔注射。
2.测定胸腺指数和脾脏指数
末次给药后禁食12h，称重，脱颈处死，取脾脏和胸腺，冷生理盐水清洗，称重，按下列公式计算小鼠脾脏指数和胸腺指数。
胸腺指数＝胸腺重量(mg)/体重(10g)
脾脏指数＝脾脏重量(mg)/体重(10g)
将各实验组胸腺指数和脾脏指数记录至下表中：
表4各实验组胸腺指数和脾脏指数统计
Figure BDA0003055376550000151
Figure BDA0003055376550000161
注：与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
脾脏和胸腺会随着免疫功能的下降而萎缩。胸腺指数和脾脏指数反映了胸腺和脾脏两大免疫器官功能的强弱。由表4可知，与空白组相比，模型组的脾脏指数和胸腺指数显著降低(P<0.001)；与模型组相比，样品C三个剂量组升高脾脏指数和胸腺指数且呈剂量依赖；高、中剂量组显著升高小鼠脾脏指数和胸腺指数(P<0.05，P<0.01)，低剂量组虽然可以升高小鼠胸腺指数，但与模型组相比没有统计学差异。结果表明本申请提供的方法制得的板栗花粉提取物可以改善环磷酰胺引起的免疫器官(脾、胸腺)萎缩。D高剂量组对小鼠的胸腺和脾脏指数均有统计学差异(P<0.05)，但是提升程度不如A组。
3.测定脾淋巴细胞增殖能力
末次给药禁食不禁水12h后，脱颈处死小鼠，浸泡在75％酒精里3min，超净台内取小鼠脾脏，冷PBS清洗，剪碎，一次性注射器活塞胶头研磨过200目筛，1500r/min离心10min，弃上清，然后加入红细胞裂解液吹打均匀，置于冰中反应15min裂解红细胞，1500r/min离心10min，弃上清，加入1640培养基以终止裂解洗去裂解液，1500r/min离心10min弃上清，用10％胎牛血清的1640培养基重悬，37℃，5％CO2培养24h后去除贴壁细胞，得原代脾细胞，台盼蓝染色，细胞计数，活细胞率为90-93％。
1×105个/孔接种脾原代细胞，各组中加入LPS(终浓度1μg/mL)诱导，然后37℃，5％CO2培养68h后每孔加入10μL CCK-8继续培养4h，450nm测定吸光度(OD)值，计算B淋巴细胞增殖率；加入Con A(终浓度5μg/mL)诱导，其他步骤同上，计算T淋巴细胞增殖率。
细胞增值率＝(OD诱导组-OD对照组)/OD诱导×100％
表5各实验组对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响
组别 T淋巴细胞(％) B淋巴细胞(％)
空白组 46.14±2.37 33.45±1.15
模型组 24.72±3.43*** 22.25±1.12***
C低剂量组 26.54±2.51*** 23.13±1.37***
C中剂量组 29.73±4.66***# 26.32±1.79***#
C高剂量组 31.26±3.89***## 28.57±2.36***##
D低剂量组 24.42±2.23*** 22.36±2.54***
D中剂量组 26.59±3.62***# 24.13±1.43***#
D高剂量组 27.88±3.67***# 25.48±2.14***##
注：与空白组相比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
淋巴细胞增殖为反映机体免疫状态的重要指标，T淋巴细胞和B淋巴细胞在抗原或有丝***原刺激时发生激活反应，LPS和Con A可以分别诱导B淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖。由表5可知，LPS和Con A分别诱导后，模型组的B淋巴细胞增殖能力和T淋巴细胞增殖能力显著低于空白组(P<0.001)；与模型组相比，本申请提供的方法得到的板栗花提取物C的高、中剂量组淋巴细胞增殖能力显著提高(P<0.05，P<0.01)，低剂量组淋巴细胞增殖能力虽有所增加，但无统计学意义差异。结果表明板栗花粉提取物有利于淋巴细胞的增殖活化，增强小鼠免疫功能。相同浓度下，板栗花黄酮组D对B淋巴细胞增殖能力和T淋巴细胞增殖能力低于本申请提供的方法得到的板栗花粉提取物C。
综上，含有黄酮和活性肽的板栗花粉提取物可促进巨噬细胞吞噬活性，与Con A协同促进脾淋巴细胞增殖，激活加强NK细胞杀伤活性，因此其可应用于制备调节或激发上述细胞活性的药物和食品中；含有黄酮和活性肽的板栗花粉提取物对免疫力调节有显著的作用，可应用于制备免疫力调节的药物或食品中。特别是本申请提供的制备方法，该方法最大程度地保留了板栗花粉的生物活性，采用分开提取的方式分别提取板栗花粉中的黄酮和活性肽，可确保将花粉中的黄酮和活性肽以及一些其他的活性物质充分提取出来，应用于调节或激发上述细胞活性或免疫力调节时效果更好，大大降低了板栗花粉的有效剂量。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.板栗花粉提取物在制备免疫力调节的药物或食品中的应用，所述板栗花粉提取物中含有黄酮和活性肽。
2.板栗花粉提取物在制备促进巨噬细胞吞噬活性，与Con A协同促进脾淋巴细胞增殖，或激活加强NK细胞杀伤活性的药物或食品中的应用，所述板栗花粉提取物中含有黄酮和活性肽。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括：粉剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、糖浆剂、酊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、水性药物、乳剂、混悬剂、凝胶、乳膏、软膏或乳液。
4.板栗花粉提取物的制备方法，其特征在于，包括：
以水为溶剂，将板栗花粉与水混合，采用回流提取法、超声提取法或微波提取法进行黄酮提取得到第一提取液和第一滤渣；
以水为溶剂，将第一滤渣与水混合，依次采用纤维素酶和蛋白酶提取所述第一滤渣中的活性多肽得到第二提取液和第二滤渣；
合并所述第一提取液和所述第二提取液；
优选地，合并所述第一提取液和所述第二提取液后得到板栗花粉提取液，将所述板栗花粉提取液干燥得到板栗花粉提取物。
5.根据权利要求4所述的板栗花粉提取物的制备方法，其特征在于，黄酮提取是：将板栗花粉与水混合，在30-60℃下进行提取，提取结束后进行固液分离得到第一提取液和第一滤渣，提取方法包括回流提取法、超声提取法或微波提取法。
6.根据权利要求4所述的板栗花粉提取物的制备方法，其特征在于，活性肽提取是：将所述第一滤渣再次与水混合得到混合浆液，调节混合浆液pH为4.0-7.0，向所述混合浆液中加入纤维素酶，于30-60℃下进行一次酶解；
一次酶解结束后调节混合浆液pH为4.0-7.0，向混合浆液中加入蛋白酶，于30-60℃下进行二次酶解；
二次酶解后对混合浆液进行灭酶；
灭酶后进行固液分离得到第二提取液和第二滤渣；
优选地，灭酶是在将反应体系温度升高至85～95℃，保持8～12min。
7.根据权利要求5所述的板栗花粉提取物的制备方法，其特征在于，活性肽提取步骤重复提取至少一次，合并每次获得的提取液得到所述第二提取液。
8.根据权利要求5所述的板栗花粉提取物的制备方法，其特征在于，采用回流提取法进行黄酮提取，提取时间为2-6h；优选地，重复提取1-2次，合并每次提取获得的提取液得到所述第一提取液；
或采用超声提取法进行黄酮提取，超声频率为10-50KHz，提取时间为20-120min；优选地，重复提取1-2次，合并每次提取获得的提取液得到所述第一提取液；
或采用微波提取法进行黄酮提取，微波功率为350-600W，提取时间为20-120min；优选地，重复提取1-2次，合并每次提取获得的提取液得到所述第一提取液。
9.根据权利要求5所述的板栗花粉提取物的制备方法，其特征在于，一次酶解的酶解时间为1-6h；
优选地，所述纤维素酶的加入量为所述板栗花粉质量的0.1～2％；
优选地，二次酶解的酶解时间为1-6h；
优选地，所述蛋白酶的加入量为所述板栗花粉质量的0.1～2％；
优选地，所述蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶中至少一种。
10.根据权利要求5所述的板栗花粉提取物的制备方法，其特征在于，所述板栗花粉与水以料液比1:5～50混合；
优选地，所述第一滤渣再次与水以料液比1:2～10混合。
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