CN113174382A - 一种适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系及其应用 - Google Patents

一种适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系，是以里氏木霉酶系为主酶系，添加木聚糖酶和***呋喃糖苷酶制得的复合纤维素酶系；或者是在上述基础上进一步添加乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶中的一种或两种制得的复合纤维素酶系；其中，所述复合纤维素酶系由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶、酶活力不低于50U/mL的乙酰木聚糖酯酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:100‑200:20‑40:0‑20:0‑10配制。与出发酶系相比，本发明产品提高了玉米纤维糖转化率及单位玉米的乙醇得率，实现了由玉米到燃料乙醇的高效转化，同时乙醇蒸馏后得到的酒糟蛋白质大大提高，利于加工成高品质饲料。

Description

一种适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系 及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系及其应用。
背景技术
燃料乙醇指以生物质为原料通过生物发酵等途径获得的可作为燃料用的乙醇。第一代燃料乙醇以糖质和淀粉质作物为原料进行生产，存在“与人争粮”的弊端，生产规模和发展受到限制。第二代燃料乙醇则是以可再生的木质纤维素生物质为原料，符合可持续发展的理念，是发展的趋势。木质纤维素生产燃料乙醇一般包括原料预处理、酶解糖化、乙醇发酵三个步骤。然而目前以农业废弃物如秸秆等为原料生产燃料乙醇，由于预处理和酶解糖化用酶的成本高，影响了规模化生产。基于此开发新的纤维原料来源，对促进燃料乙醇的发展有重要意义。
目前，我国燃料乙醇的生产中，玉米原料的占比较高，据统计，玉米淀粉乙醇约占我国总燃料乙醇产量的50％。但现有以玉米为原料生产乙醇的工艺中，主要是利用玉米中的淀粉，而玉米纤维未被有效利用，一般其作为副产物被加工成DDGS，作为饲料进行出售，造成了原料的浪费，也降低了单位玉米的乙醇产率。另一方面，在淀粉加工、柠檬酸生产等以玉米为原料的加工生产行业，每年也产生大量的玉米纤维，这部分玉米纤维目前也未获得有效利用，一般也是作为饲料出售。
玉米纤维丰富的来源使它成为一种很有前途的生物质原料。由于玉米纤维中残留淀粉、纤维素和半纤维素的含量约占总干重的70％，如能有效利用玉米纤维中的纤维素、半纤维素和淀粉，将其转化成乙醇、柠檬酸等化学品，则不仅可以实现资源的有效利用，还可以增加单位原料的终产品产量，具有重要意义。据预估，在传统玉米淀粉乙醇生产中，如果将玉米纤维酶解糖化发酵转化成乙醇，可以提高玉米乙醇总产量的10％以上。
利用玉米纤维生产乙醇、柠檬酸等燃料和化学品，关键步骤是利用酶将玉米纤维中的纤维素和半纤维素水解生成可发酵糖。由于玉米纤维中除纤维素组分以外，还富含半纤维素且半纤维素糖的组成和结构较为复杂，包含***糖、半乳糖、阿魏酸、葡萄糖醛酸等取代基，因此，若要将其彻底水解，需要一个由纤维素酶和半纤维素酶组成的复合酶系，依靠多种酶类的共同作用才能实现，且相对而言，对酶系中半纤维素酶组分的要求更高。如美国ICM公司，采用纤维分离技术，将分离的玉米纤维经过稀酸处理，再经过商品酶水解和酵母发酵转化成乙醇，使得乙醇总产量提高了5％左右；如Syngenta公司则是将α-淀粉酶、葡萄糖糖化酶、木聚糖酶和植酸酶等酶基因直接表达在玉米胚乳中，减少了商品酶制剂用量；如Edeniq公司主要采用胶体磨技术将玉米纤维打碎，再添加淀粉酶和纤维素酶进行同步糖化发酵，DDGS蛋白质含量明显提高；但这些公司都没有研发出一种专门用于玉米纤维水解的酶制剂，而是采用了普通的商品酶制剂，专一性不强，水解效率不高。如专利CN201811277689.7将含有阿魏酸酯酶的黑曲霉发酵液与里氏木霉发酵液按照一定体积比复配获得复合纤维素酶系，在同步糖化发酵中添加这种酶系可将玉米纤维中残余的纤维素和淀粉进一步水解，但其半纤维素酶种类匮乏，对于玉米纤维中半纤维素的利用率很低。如专利201911209469.5利用超声辅助盐酸水解玉米纤维，经微生物水解后通过浓缩和蒸汽处理得到玉米纤维水解液，与未预处理的玉米纤维相比水解液中总糖浓度有一定提升，但在此过程中耗能较高，同时会产生抑制物影响后续反应。
检索发现：目前市场上还缺乏可以有效水解玉米纤维用的专用酶产品，已报道的所用的纤维素酶，对玉米纤维的酶解转化产糖的效率仍然较低，鲜见对玉米纤维水解专用酶系或适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系及其应用的研究报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系及其应用。
本发明所述的适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系，其特征在于：所述纤维素酶系是以里氏木霉酶系为主酶系，添加木聚糖酶和***呋喃糖苷酶制得的复合纤维素酶系；或者是在该复合纤维素酶系基础上进一步添加乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶中的一种或两种制得的复合纤维素酶系；其中，所述复合纤维素酶系由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶、酶活力不低于50U/mL的乙酰木聚糖酯酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:100-200:20-40:0-20:0-10配制。
进一步的，所述纤维素酶系优选是以里氏木霉酶系为主酶系，添加木聚糖酶和***呋喃糖苷酶制得的复合纤维素酶系；其特征在于：所述复合纤维素酶系中，里氏木霉酶系滤纸酶活力为10-15FPU/mL，木聚糖酶活力为750-1000U/mL，***呋喃糖苷酶活力为2-4U/mL；该复合纤维素酶系由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶按照体积比1000:150-200:30-40配制。
或者，另一优选的实施方式是：所述纤维素酶系是以里氏木霉酶系为主酶系，添加木聚糖酶、***呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶以及阿魏酸酯酶制得的复合纤维素酶系；其特征在于：该复合纤维素酶系中，里氏木霉酶系滤纸酶活力为5-15FPU/mL，木聚糖酶活力为500-1000U/mL，***呋喃糖苷酶活力为1-4U/mL，乙酰木聚糖酯酶酶活力为0.25-1U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.1-0.5U/mL；该复合纤维素酶系由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶、酶活力不低于50U/mL的乙酰木聚糖酯酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:100-200:20-40:5-20:5-10配制。
其中：所述复合纤维素酶系中，里氏木霉酶系滤纸酶活力优选为10-15FPU/mL，木聚糖酶活力优选为750-1000U/mL，***呋喃糖苷酶活力优选为2-4U/mL，乙酰木聚糖酯酶酶活力优选为0.5-1U/mL，阿魏酸酯酶活力优选为0.1-0.5U/mL；该复合纤维素酶系由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶、酶活力不低于50U/mL的乙酰木聚糖酯酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:150-200:30-40:10-20:5-10配制。
其中，再进一步优选的实施方式是：所述复合纤维素酶系中，里氏木霉酶系滤纸酶活力为13-15FPU/mL，木聚糖酶活力为900-1000U/mL，***呋喃糖苷酶活力为2-3U/mL，乙酰木聚糖酯酶酶活力为0.5-0.75U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.3-0.5U/mL；该复合纤维素酶系由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶、酶活力不低于50U/mL的乙酰木聚糖酯酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:175-200:30-35:10-15:7-10配制。
上述适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系最优选的实施方式是：所述复合纤维素酶系中，里氏木霉酶系滤纸酶活力为15FPU/mL，木聚糖酶活力为1000U/mL，***呋喃糖苷酶活力为3U/mL，乙酰木聚糖酯酶酶活力为0.5U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.4U/mL。
上述适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系酶系中：所述里氏木霉酶系、木聚糖酶、***呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶以及阿魏酸酯酶均为市售产品或以公知方法自行制备获得；其中，所述里氏木霉酶系的制备是由里氏木霉(Trichodermareesei)CGMCC3.13241菌株经过液体发酵方式实现；乙酰木聚糖酯酶由毕赤酵母(Pichiapastoris)CGMCC2.5688异源表达获得。
本发明所述的纤维素酶系在有效提高玉米纤维转化率制备糖化液中的应用。
其中，所述应用方法是：
(1)将玉米纤维粉碎，然后加入水使固液体积比达到1:3-5，在105℃-125℃下，进行蒸煮处理，得到预处理物溶液；
或者，将玉米纤维粉碎，然后加入0.025-0.1M的磷酸使固液体积比达到1:3-5，在105-125℃下，进行稀酸预处理，预处理后再加入氢氧化钾中和使溶液pH值至中性，得到预处理物溶液；
(2)向步骤(1)得到的预处理物溶液中加入上述的纤维素酶系，使溶液中酶活力达到50-250FPU/L，调节pH值至5±0.2，在温度28℃-32℃，转速180-220rpm条件下反应24-72h，得到糖化液。
上述应用中，优选的应用方法是：
(1)将玉米纤维粉碎，然后加入水使固液体积比达到1:4-5，在115-125℃下，进行蒸煮处理，得到预处理物溶液；
或者，将玉米纤维粉碎，然后加入0.05-0.1M的磷酸使固液体积比达到1:4-5，在115-125℃下，进行稀酸预处理，预处理后再加入氢氧化钾中和使溶液pH值至中性，得到预处理物溶液；
(2)向步骤(1)得到的预处理物溶液中加入上述的纤维素酶系，使溶液中酶活力达到150-250FPU/L，调节pH值至5±0.2，在温度30℃-32℃，转速200-220rpm条件下反应48-72h，得到糖化液。
上述应用中，最优选的应用方法是：
(1)将玉米纤维粉碎，然后加入水使固液体积比达到1:4，在120℃下，进行蒸煮处理，得到预处理物溶液；
或者，将玉米纤维粉碎，然后加入0.05M的磷酸使固液体积比达到1:4，在120℃下，进行稀酸预处理，预处理后再加入氢氧化钾中和使溶液pH值至中性，得到预处理物溶液；
(2)向步骤(1)得到的预处理物溶液中加入上述的纤维素酶系，使溶液中酶活力达到200FPU/L，调节pH值至4.8，在温度30℃，转速200rpm条件下反应48-50h，得到糖化液。
上述技术方案中，涉及的各种酶的活力测定方法是：
(1)滤纸酶活力：将1条滤纸条(Whatman，50±1mg)，折叠放入试管底部，加入1.5mLpH 4.8的0.2M醋酸钠缓冲液和0.5mL稀释酶液混匀，50℃反应60min；DNS法测定还原糖的生成量：加入3mL DNS终止反应，混匀后沸水浴10min，再加入20mL蒸馏水终止反应；混匀后在OD540测定葡萄糖的生成量。滤纸酶活力定义：在50℃，pH 4.8，反应60min条件下，每分钟降解滤纸释放1μmol葡萄糖所需的酶量，定义为一个滤纸酶活力单位。
(2)木聚糖酶活力：加入1.5mL 1％(m/v)桦木木聚糖(使用pH4.8的0.2M醋酸钠缓冲液配制)和0.5mL稀释酶液混匀，50℃反应30min；DNS法测定还原糖的生成量：加入3mLDNS终止反应，混匀后沸水浴10min，再加入20mL蒸馏水终止反应；混匀后在OD540测定木糖的生成量。木聚糖酶活力定义：在50℃，pH 4.8，反应30min条件下，每分钟降解木聚糖释放1μmol木糖所需的酶量，定义为一个滤纸酶活力单位。
(3)***呋喃糖苷酶活力：向50μL 1mg/mL对硝基苯基-α-L-***呋喃糖苷(pNPA，sigma，pH4.8的0.2M醋酸钠缓冲液配制)中加100μL稀释酶液，50℃反应30min后，加入150μL 10％(m/v)Na2CO3终止反应，OD420处测定对硝基苯酚的生成量。***呋喃糖苷酶活力定义：在50℃，pH 4.8，反应30min条件下，每分钟降解pNPA释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量，定义为一个***呋喃糖苷酶活力单位。
(4)乙酰木聚糖酯酶活力：乙酰木聚糖酯酶的酶活测定方法:将1.398ml pH4.8的0.2M醋酸钠缓冲液于50℃水浴锅中预热,加入2μL适当稀释的乙酰木聚糖酯酶的酶液和100μL 10mol/L的4-Methylumbelliferyl-Acetate,在OD354处测2min内紫外分光光度计的吸收值的变化。乙酰木聚糖酯酶活力定义：在50℃，pH 4.8，反应30min条件下，每分钟降解4-Methylumbelliferyl-Acetate释放1μmol4-Methylumbelliferone所需的酶量，定义为一个乙酰木聚糖酯酶活力单位。
(5)阿魏酸酯酶：将500μL稀释酶液和0.05g去淀粉麦麸混合，40℃反应30min，煮沸10min使酶失活。加入2.5mL无水乙醇,4C,1000rpm离心10min，取上清于OD320处测定阿魏酸的生成量。阿魏酸酯酶活力定义：在40℃，pH 4.8，反应30min条件下，每分钟降解去淀粉麦麸释放1μmol阿魏酸所需的酶量，定义为一个阿魏酸酯酶活力单位。
本发明制备的糖化液可以用于发酵生产燃料乙醇，同时也可用于发酵制备柠檬酸、苏氨酸等产品。
本发明提供的适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系及其应用具有以下显著效果：
1.本发明通过多酶复配获得了适于高效降解玉米纤维制备糖化液的复合纤维素酶系，使其酶系具有恰当的酶种类，实现了酶系中多种酶的合理混合。
2.本发明的复合纤维素酶系，由于强化了对玉米纤维半纤维素降解的酶组分，促进了玉米纤维半纤维素侧链取代基团的“脱枝”效果，更容易得到高糖浓度的糖化液。与已有商业纤维素酶相比，这种复合纤维素酶系的酶组成更适合于半纤维素含量丰富且结构复杂的玉米纤维，且具有酶系可控、水解效率高、用酶成本低、制备过程简单、不需要对原料进行机械处理、单糖得率高等优点。
3.本发明提供的复合纤维素酶系制备糖化液具有抑制物少等特点，该方法反应条件较为温和可控，对设备要求较低，同时产生大量高浓度糖液，可进一步用于生物乙醇发酵。同时，稀酸预处理中所使用的磷酸在中和后可以作为后续微生物培养成分，不需要脱毒。
4.与出发酶系里氏木霉酶系相比，本发明复配的复合纤维素酶系更适合制备高糖浓度的玉米纤维糖化液，总游离糖浓度更高。
5.与出发酶系里氏木霉酶系制备的糖化液相比，使用所述复合纤维素酶系制备的糖化液发酵生产乙醇浓度更高，且蒸馏固液分离后得到的酒糟蛋白质含量更高，适于制备高品质饲料。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法。
下述实施例中，所使用的材料、试剂、菌株、酶制剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，实施例中所用的药品、试剂均购自于国药集团化学试剂有限公司；木聚糖酶购自于北京索莱宝科技有限公司；***呋喃糖苷酶和阿魏酸酯酶购自于爱尔兰Megazyme公司；pPIC9K表达载体购自于Invitrogen公司；里氏木霉(Trichoderma reesei)购自于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCC3.13241；乙酰木聚糖酯酶由毕赤酵母(Pichia pastoris)异源表达获得，毕赤酵母(Pichiapastoris)菌株购自于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCC2.5688。
实施例1适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系的配制
所述复合纤维素酶系是由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶按照体积比1000:185:35配制而成。
所述复合纤维素酶系中，里氏木霉酶系滤纸酶活力为15FPU/mL，木聚糖酶活力为900U/mL，***呋喃糖苷酶活力为3U/mL。
实施例2适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系的配制
所述复合纤维素酶系是由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶、酶活力不低于100U/mL的乙酰木聚糖酯酶按照体积比1000:185:35:14配制而成。
所述复合纤维素酶系中，里氏木霉酶系滤纸酶活力为15FPU/mL，木聚糖酶活力为900U/mL，***呋喃糖苷酶活力为3U/mL，乙酰木聚糖酯酶酶活力为0.75U/mL。
实施例3适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系的配制
所述复合纤维素酶系是由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:185:35:7配制而成。
所述复合纤维素酶系中，里氏木霉酶系滤纸酶活力为15FPU/mL，木聚糖酶活力为1000U/mL，***呋喃糖苷酶活力为3U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.3U/mL。
实施例4适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系的配制
所述复合纤维素酶系是由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶、酶活力不低于100U/mL的乙酰木聚糖酯酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:185:35:10:7配制而成。
所述复合纤维素酶系中，里氏木霉酶系滤纸酶活力为15FPU/mL，木聚糖酶活力为1000U/mL，***呋喃糖苷酶活力为3U/mL，乙酰木聚糖酯酶酶活力为0.5U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.4U/mL。
实施例5适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系的配制
所述复合纤维素酶系是由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶、酶活力不低于100U/mL的乙酰木聚糖酯酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:200:40:20:10配制而成。
所述复合纤维素酶系中，里氏木霉酶系滤纸酶活力为15FPU/mL，木聚糖酶活力为1000U/mL，***呋喃糖苷酶活力为4U/mL，乙酰木聚糖酯酶酶活力为1U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.5U/mL。
实施例6适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系的配制
所述复合纤维素酶系是由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶、酶活力不低于100U/mL的乙酰木聚糖酯酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:100:20:5:5配制而成。
所述复合纤维素酶系中，里氏木霉酶系滤纸酶活力为5FPU/mL，木聚糖酶活力为500U/mL，***呋喃糖苷酶活力为1U/mL，乙酰木聚糖酯酶酶活力为0.25U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.1U/mL。
实施例7里氏木霉酶系的制备
将里氏木霉(Trichoderma reesei)CGMCC 3.13241经活化后获得种子液，无菌条件下，以重量百分比计，将菌丝按照1％的比例加入发酵培养基中，在30℃，200rpm培养7天，或发酵罐培养7天；之后以10000rpm离心10min获得上清液，即得到含里氏木霉酶系的发酵液，其滤纸酶活力不低于5FPU/mL。
其中：
种子培养基配方是：20g/L葡萄糖，Vogel’s盐。
发酵培养基配方是：10g/L麸皮，10g/L微晶纤维素，3g/L KH2PO4，2.6g/L NaNO3，0.5g/LMgSO4·7H2O，0.5g/L CaCl2，1g/L peptone，7.5mg/L FeSO4·7H2O，2.5mg/L MnSO4·H2O，3.6mg/L ZnSO4·7H2O，3.7mg/L CoCl2·6H2O。
上述Vogel’s盐的配方已记载在中国专利CN201410160118.0中并公示。
实施例8乙酰木聚糖酯酶的制备
(1)根据乙酰木聚糖酯酶AxeA在NCBI数据库中公布的GenBank序列信息(Gene ID:29571052)，利用密码子偏好性对乙酰木聚糖酯酶AxeA基因在毕赤酵母细胞中密码子的偏好性进行分析，对其DNA序列进行密码子优化，依据优化结果交由青岛派森诺基因生物技术有限公司进行乙酰木聚糖酯酶AxeA基因合成；
(2)引物F：CTGAAGCTTACGTAGAATTCATGGCAATCTTGGATATGTC；引物R：GAATTAATTCGCGGCCGCAAGATTTATTGCCCACTTGT由青岛派森诺基因生物技术有限公司进行合成。以合成的乙酰木聚糖酯酶AxeA基因为模板，以F和R为引物进行PCR扩增。PCR扩增程序为：95℃3min；95℃15s，58℃15s，72℃30s，共30个循环；72℃5min，降至12℃。PCR产物回收后，利用Vazyme公司的ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit连入经EcoRI和NotI双酶切的pPIC9K载体中，获得重组质粒pPIC9K-AxeA。
(3)提取重组质粒pPIC9K-AxeA,采用SacI线性化重组质粒pPIC9K-AxeA，通过电转化法将其转入毕赤酵母GS115细胞，筛选阳性克隆进行菌落PCR鉴定，将正确的阳性重组克隆子命名为GS115-pPIC9K-AxeA。
(4)接种GS115-pPIC9K-AxeA到YPD液体培养基活化20h，按照1％的接种量接种于装有50mL BMGY培养基中，30℃200rpm培养24h，室温条件下3000g离心5min，收集菌体，用50mL BMMY(pH 6.0)重悬菌体，30℃200rpm诱导表达，每24h向培养基中添加终浓度为1％的甲醇，维持诱导条件。诱导表达6天，4℃12000g离心收集上清液，即为含乙酰木聚糖酯酶酶液，其乙酰木聚糖酯酶活力不低于50U/mL。
其中：
YPD培养基配方是：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。
BMGY培养基配方是：YNB 34g/L，硫酸铵10g/L，KH2PO411.8g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，甘油10g/L。NaOH调节pH到6.0。
BMMY培养基配方是：YNB 34g/L，硫酸铵10g/L，KH2PO411.8g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。NaOH调节pH到6.0。
实施例9蒸煮预处理制备糖化液
(1)将玉米纤维粉碎，然后加入水使固液体积比达到1:4，在120℃下，进行蒸煮处理，得到预处理物溶液；
(2)向步骤(1)得到的预处理物溶液中加入实施例4所述的纤维素酶系，使溶液中酶活力达到200FPU/L，并用0.2M、pH 4.8的NaAc-HAc缓冲液调节pH值至5±0.2，在温度30℃，转速200rpm条件下反应48h，得到糖化液。
实施例10蒸煮预处理制备糖化液
(1)将玉米纤维粉碎，然后加入水使固液体积比达到1:3，在125℃下，进行蒸煮处理，得到预处理物溶液；
(2)向步骤(1)得到的预处理物溶液中加入实施例4所述的纤维素酶系，使溶液中酶活力达到250FPU/L，并用0.2M、pH 4.8的NaAc-HAc缓冲液调节pH值至5±0.2，在温度32℃，转速220rpm条件下反应24h，得到糖化液。
实施例11蒸煮预处理制备糖化液
(1)将玉米纤维粉碎，然后加入水使固液体积比达到1:5，在105℃下，进行蒸煮处理，得到预处理物溶液；
(2)向步骤(1)得到的预处理物溶液中加入实施例4所述的纤维素酶系，使溶液中酶活力达到50FPU/L，并用0.2M、pH 4.8的NaAc-HAc缓冲液调节pH值至5±0.2，在温度28℃，转速180rpm条件下反应72h，得到糖化液。
实施例12稀酸预处理制备糖化液
(1)将玉米纤维粉碎，然后加入0.05M的磷酸使固液体积比达到1:4，在120℃下，进行稀酸预处理，预处理后再加入氢氧化钾中和使溶液pH值至中性，得到预处理物溶液；
(2)向步骤(1)得到的预处理物溶液中加入实施例4所述的纤维素酶系，使溶液中酶活力达到200FPU/L，并用0.2M、pH 4.8的NaAc-HAc缓冲液调节pH值至5±0.2，在温度30℃，转速200rpm条件下反应48h，得到糖化液。
实施例13稀酸预处理制备糖化液
(1)将玉米纤维粉碎，然后加入0.1M的磷酸使固液体积比达到1:3，在125℃下，进行稀酸预处理，预处理后再加入氢氧化钾中和使溶液pH值至中性，得到预处理物溶液；
(2)向步骤(1)得到的预处理物溶液中加入实施例4所述的纤维素酶系，使溶液中酶活力达到250FPU/L，并用0.2M、pH 4.8的NaAc-HAc缓冲液调节pH值至5±0.2，在温度32℃，转速220rpm条件下反应24h，得到糖化液。
实施例14稀酸预处理制备糖化液
(1)将玉米纤维粉碎，然后加入0.025M的磷酸使固液体积比达到1:5，在105℃下，进行稀酸预处理，预处理后再加入氢氧化钾中和使溶液pH值至中性，得到预处理物溶液；
(2)向步骤(1)得到的预处理物溶液中加入实施例4所述的纤维素酶系，使溶液中酶活力达到50FPU/L，并用0.2M、pH 4.8的NaAc-HAc缓冲液调节pH值至5±0.2，在温度28℃，转速180rpm条件下反应72h，得到糖化液。
实施例15不同糖化液的对比
按照实施例4所述条件下得到复合纤维素酶系，按照实施例8所述条件下得到里氏木霉酶系。
按照实施例9所述条件，使用复合纤维素酶系得到糖化液1，使用里氏木霉酶系得到糖化液2。
按照实施例12所述条件，使用复合纤维素酶系得到糖化液3，使用里氏木霉酶系得到糖化液4。
糖化液中游离单糖浓度对比，具体检测结果见表1。
表1：糖化液中游离单糖浓度对比
游离糖浓度(g/L) 葡萄糖 木糖 ***糖
糖化液1 28.01±0.32 15.05±0.49 10.32±0.22
糖化液2 23.63±0.17 8.82±0.28 6.93±0.19
糖化液3 30.70±0.29 17.08±0.23 11.10±0.35
糖化液4 28.22±0.27 12.32±0.32 9.83±0.09
结果显示：使用出发里氏木霉酶系制备的糖化液游离糖浓度都明显低于为使用本发明所述复合纤维素酶系制备的糖化液。
实施例16燃料乙醇的制备
将0.5g酵母接种于50ml的灭菌的蒸馏水中进行活化处理，获得种子液，将种子液按照体积百分比1％添加入实施例15中分别制备得到的糖化液1、2、3、4中，进行发酵。发酵条件为：发酵温度30℃，摇床转速200rpm，发酵时间48h。
检测乙醇产量、糖化液中剩余的总糖，具体检测结果见表2。
表2：乙醇产量、糖化液中剩余的总糖检测结果
乙醇浓度(g/L) 残糖浓度(g/L)
糖化液1 26.64±0.98 4.05±0.15
糖化液2 19.43±0.74 4.81±0.22
糖化液3 28.79±0.39 3.39±0.41
糖化液4 24.59±0.72 3.11±0.62
结果显示：使用出发里氏木霉酶系制备的糖化液发酵后得到的乙醇浓度都明显低于本发明使用复合纤维素酶系制备的糖化液发酵后得到的乙醇浓度。

Claims (10)

1.一种适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系，其特征在于：所述纤维素酶系是以里氏木霉酶系为主酶系，添加木聚糖酶和***呋喃糖苷酶制得的复合纤维素酶系；或者是在该复合纤维素酶系基础上进一步添加乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶中的一种或两种制得的复合纤维素酶系；其中，所述复合纤维素酶系由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶、酶活力不低于50U/mL的乙酰木聚糖酯酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:100-200:20-40:0-20:0-10配制。
2.按照权利要求1所述适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系，该纤维素酶系是以里氏木霉酶系为主酶系，添加木聚糖酶和***呋喃糖苷酶制得的复合纤维素酶系；其特征在于：所述复合纤维素酶系中，里氏木霉酶系滤纸酶活力为10-15FPU/mL，木聚糖酶活力为750-1000U/mL，***呋喃糖苷酶活力为2-4U/mL；该复合纤维素酶系由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶按照体积比1000:150-200:30-40配制。
3.按照权利要求1所述适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系，所述纤维素酶系是以里氏木霉酶系为主酶系，添加木聚糖酶、***呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶以及阿魏酸酯酶制得的复合纤维素酶系；其特征在于：该复合纤维素酶系中，里氏木霉酶系滤纸酶活力为5-15FPU/mL，木聚糖酶活力为500-1000U/mL，***呋喃糖苷酶活力为1-4U/mL，乙酰木聚糖酯酶酶活力为0.25-1U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.1-0.5U/mL；该复合纤维素酶系由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶、酶活力不低于50U/mL的乙酰木聚糖酯酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:100-200:20-40:5-20:5-10配制。
4.按照权利要求3所述适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系，其特征在于：所述复合纤维素酶系中，里氏木霉酶系滤纸酶活力为10-15FPU/mL，木聚糖酶活力为750-1000U/mL，***呋喃糖苷酶活力为2-4U/mL，乙酰木聚糖酯酶酶活力为0.5-1U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.1-0.5U/mL；该复合纤维素酶系由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶、酶活力不低于50U/mL的乙酰木聚糖酯酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:150-200:30-40:10-20:5-10配制。
5.按照权利要求4所述适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系，其特征在于：所述复合纤维素酶系中，里氏木霉酶系滤纸酶活力为13-15FPU/mL，木聚糖酶活力为900-1000U/mL，***呋喃糖苷酶活力为2-3U/mL，乙酰木聚糖酯酶酶活力为0.5-0.75U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.3-0.5U/mL；该复合纤维素酶系由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的里氏木霉酶、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的***呋喃糖苷酶、酶活力不低于50U/mL的乙酰木聚糖酯酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:175-200:30-35:10-15:7-10配制。
6.按照权利要求5所述适于糖化液制备中提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系，其特征在于：所述复合纤维素酶系中，里氏木霉酶系滤纸酶活力为15FPU/mL，木聚糖酶活力为1000U/mL，***呋喃糖苷酶活力为3U/mL，乙酰木聚糖酯酶酶活力为0.5U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.4U/mL。
7.权利要求1所述的纤维素酶系在有效提高玉米纤维转化率制备糖化液中的应用。
8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于，应用方法是：
(1)将玉米纤维粉碎，然后加入水使固液体积比达到1:3-5，在105℃-125℃下，进行蒸煮处理，得到预处理物溶液；
或者，将玉米纤维粉碎，然后加入0.025-0.1M的磷酸使固液体积比达到1:3-5，在105-125℃下，进行稀酸预处理，预处理后再加入氢氧化钾中和使溶液pH值至中性，得到预处理物溶液；
(2)向步骤(1)得到的预处理物溶液中加入权利要求1所述的纤维素酶系，使溶液中酶活力达到50-250FPU/L，调节pH值至5±0.2，在温度28℃-32℃，转速180-220rpm条件下反应24-72h，得到糖化液。
9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于，应用方法是：
(1)将玉米纤维粉碎，然后加入水使固液体积比达到1:4-5，在115-125℃下，进行蒸煮处理，得到预处理物溶液；
或者，将玉米纤维粉碎，然后加入0.05-0.1M的磷酸使固液体积比达到1:4-5，在115-125℃下，进行稀酸预处理，预处理后再加入氢氧化钾中和使溶液pH值至中性，得到预处理物溶液；
(2)向步骤(1)得到的预处理物溶液中加入权利要求1所述的纤维素酶系，使溶液中酶活力达到150-250FPU/L，调节pH值至5±0.2，在温度30℃-32℃，转速200-220rpm条件下反应48-72h，得到糖化液。
10.按照权利要求9所述的应用，其特征在于，应用方法是：
(1)将玉米纤维粉碎，然后加入水使固液体积比达到1:4，在120℃下，进行蒸煮处理，得到预处理物溶液；
或者，将玉米纤维粉碎，然后加入0.05M的磷酸使固液体积比达到1:4，在120℃下，进行稀酸预处理，预处理后再加入氢氧化钾中和使溶液pH值至中性，得到预处理物溶液；
(2)向步骤(1)得到的预处理物溶液中加入权利要求1所述的纤维素酶系，使溶液中酶活力达到200FPU/L，调节pH值至4.8，在温度30℃，转速200rpm条件下反应48-50h，得到糖化液。
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