CN113151381B - 一种用于制备那西肽发酵液的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供的用于制备那西肽发酵液的方法中,将培养成熟的那西肽生产菌接种至发酵培养基中,一段时间后生成第一发酵液,然后向第一发酵液中补入菌渣水解液和硫酸盐溶液,在培养一段时间后生成第二发酵液,然后向第二发酵液中补入葡萄糖溶液即得到本申请中的那西肽发酵液;其中菌渣水解液中含有丰富的多肽和氨基酸,补料菌渣水解液和硫酸盐即补料多肽、氨基酸和硫酸盐,补料的菌渣水解液和硫酸盐一方面作为营养成分可以促进那西肽生产菌自身的生长;另一方面作为原料成为可以促进那西肽的合成,进而提高那西肽中A组分的含量;同时将菌渣水解液运用到发酵液的制备过程中,工艺简单易行,达到菌渣资源化利用,绿色环保,循环经济的目的。
Description
技术领域
本申请涉及那西肽制备技术领域,尤其涉及一种用于制备那西肽发酵液的方法。
背景技术
那西肽是一种含硫多肽类抗生素,英文名Nosiheptide。那西肽最先于20世纪60年代发现,现在是多个国家允许使用的一种畜禽专用的抗生素。尽管我国于2019年颁布文件,禁止该抗生素长期添加于饲料中用于畜禽促生长,但是由于该类抗生素结构的特异性,对这类抗生素的工艺研究工作仍是方兴未艾。
那西肽是用微生物发酵方法生产的,发酵产物中有一主组分A,同时由于多肽类抗生素的合成过程中由于不同的前体物质能被少量替换加入到化学结构中,在产物合成过程中会形成一副组分B。另外,不同的培养基或培养方法也会改变产物的组成比例。为了便于描述,我们将主组分A称为A组分,副组分B称为B组分,其中A组分的生物抑菌活性高于B组分,提高A组分含量可以显著提高那西肽的抑菌活性,因此如何提高A组分含量为本领域技术人员需要解决的问题。
将那西肽生产菌接种到发酵培养基中发酵一段时间后得到发酵培养液,通过过滤、干燥、浸提等方式从发酵培养液中提取那西肽,提取后残留下的固含物成为菌渣,菌渣为危险废弃物,如何资源化利用菌渣同样成为本领域人员需要解决的问题。
因此,如何将提高A组分含量和资源化利用菌渣结合起来成为待解决的技术问题。
发明内容
本申请提供了一种用于制备那西肽发酵液的方法,以在提高A组分含量的基础上充分再利用菌渣。
本申请提供的用于制备那西肽发酵液的方法中,包括:
将那西肽生产菌接种至发酵培养基中,得到第一发酵液;
向所述第一发酵液中加入菌渣水解液和硫酸盐,得到第二发酵液;
向所述第二发酵液中加入葡萄糖溶液,得到那西肽发酵液。
可选地,所述菌渣水解液的制备包括:
将菌渣和4mol/L的硫酸按照1:6的比例进行水解得到菌渣水解液,所述水解的温度为80-90℃;
将得到的所述菌渣水解液中和至pH为6.5-7.5。
可选地,所述菌渣水解液体积占所述第一发酵液体积的1.5%-2.5%,所述硫酸盐重量占所述第一发酵液重量的1.0%-2.0%,所述葡萄糖重量占所述第二发酵液重量的13.0%-16.0%。
可选地,所述方法还包括培养那西肽生产菌,所述培养那西肽生产菌包括:
将所述那西肽生产菌接种至种子培养基中,于27℃-29℃下培养48-60h;
所述种子培养基按照重量比包括:葡萄糖2.5%-3%,玉米浆1.5%-2.5%,酵母浸出粉0.8%-1.2%,黄豆饼粉0.8%-1.2%,MgSO4·7H2O 0.03%-0.07%,(NH4)2SO4 0.3%-0.6%,轻质碳酸钙0.3%-0.6%。
可选地,所述发酵培养基包括:可溶性淀粉4.5%-5.5%,葡萄糖1.5%-2.5%,玉米浆1.5%-2.5%,酵母粉0.8%-1.2%,黄豆粉0.8%-1.2%,MgSO4·7H2O 0.04%-0.06%,(NH4)2SO4 0.4%-0.6%,KNO3 0.04%-0.06%,轻质碳酸钙0.2%-0.4%。
可选地,所述那西肽生产菌包括活跃链霉菌。
可选地,所述硫酸盐包括但不限于硫酸钠或硫酸铵。
与现有技术相比,本申请的有益效果为:
由上述方案可见,本申请提供的用于制备那西肽发酵液的方法中,将培养成熟的那西肽生产菌接种至发酵培养基中,在培养一段时间后生成第一发酵液,然后向第一发酵液中补入菌渣水解液和硫酸盐溶液,在培养一段时间后生成第二发酵液,然后向第二发酵液中加入葡萄糖溶液即得到本申请中的那西肽发酵液,该那西肽发酵液为目标发酵液;其中菌渣水解液中含有丰富的多肽和氨基酸,补料菌渣水解液和硫酸盐即补料多肽、氨基酸和硫酸盐,补料的菌渣水解液和硫酸盐一方面作为营养成分可以促进那西肽生产菌自身的生长;另一方面作为原料成为可以促进那西肽的合成,进而提高那西肽中A组分的含量;同时将菌渣水解液运用到发酵液的制备过程中,工艺简单易行,达到菌渣资源化利用,绿色环保,循环经济的目的。
应当理解的是,以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的,并不能限制本申请。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,对于本领域普通技术人员而言,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的用于制备那西肽发酵液的方法流程示意图;
图2为本申请实施例提供的对比试验之一的测试结果示意图;
图3为本申请实施例提供的对比试验之二的测试结果示意图;
图4为本申请实施例提供的对比试验之三的测试结果示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将结合本申请实施例中的附图,对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本申请保护的范围。
那西肽是用微生物发酵方法生产的,发酵产物中有一主组分A,同时含有一副组分B,为了便于描述,我们将主组分A称为A组分,副组分B称为B组分,其中A组分的生物抑菌活性高于B组分,提高A组分含量可以显著提高那西肽的抑菌活性,因此如何提高A组分含量为本领域技术人员需要解决的问题。
将那西肽生产菌接种到发酵培养基中发酵一段时间后得到发酵培养液,通过过滤、干燥、浸提等方式从发酵培养液中提取那西肽,提取后残留下的固含物成为菌渣,菌渣为危险废弃物,如何资源化利用菌渣同样成为本领域人员需要解决的问题。
如何将提高A组分含量和资源化利用菌渣结合起来成为待解决的技术问题。
为此,本申请实施例中提供了一种用于制备那西肽发酵液的方法,如图1,方法包括:
S110:将那西肽生产菌接种至发酵培养基中,得到第一发酵液。
取菌种,接种到种子培养基中,接种量为25mm2的斜面,振幅5cm的摇床转速为220-250rpm,在27.0-29.0℃下培养48-60h;
所述菌种为活跃链霉菌,拉丁文学名为streptomyces actuosus;
种子培养基的原料按照重量比包括:葡萄糖2.5%-3%,玉米浆1.5%-2.5%,酵母浸出粉0.8%-1.2%,黄豆饼粉0.8%-1.2%,MgSO4·7H2O 0.03%-0.07%,(NH4)2SO40.3%-0.6%,轻质碳酸钙0.3%-0.6%。
上述为培养那西肽生产菌的过程。
将上述培养成熟的菌种接种至发酵培养基中,接种量占发酵培养基质量的10%-15%,发酵培养基的pH值为7.00-7.40,初始通气量为1.0vvm,初始转速为300rpm,溶氧控制15%以上,在发酵48-60h后得到第一发酵液。其中通气量为1.0vvm指的是:发酵液与空气的体积比为1:1.0。
其中,所用发酵培养基以原料总重量的百分含量计,由以下原料组成:
可溶性淀粉4.5%-5.5%,葡萄糖1.5%-2.5%,玉米浆1.5%-2.5%,酵母粉0.8%-1.2%,黄豆粉0.8%-1.2%,MgSO4·7H2O 0.04%-0.06%,(NH4)2SO4 0.4%-0.6%,KNO3 0.04%-0.06%,轻质碳酸钙0.2%-0.4%。
S120:向所述第一发酵液中加入菌渣水解液和硫酸盐溶液,得到第二发酵液。
向上述得到的第一发酵液中补加一定量地菌渣水解液和硫酸钠溶液,得到第二发酵液,具体包括如下:
补料菌渣水解液的制备方法为:将菌渣和4mol/L的硫酸按照1:6的比例进行水解,水解条件为80-90℃,水解24h,中和pH至6.5-7.5,121℃灭菌30min,制成菌渣水解液,菌渣水解液体积占所述第一发酵液体积的1.5%-2.5%,补加方式采用流加的方式,具体地:在发酵50-200h期间持续流加菌渣水解液。
需要说明的是,菌渣和4mol/L的硫酸按照除1:6之外的比例均属于本申请的保护范围。
补料硫酸盐重量占所述第一发酵液重量的1.0%-2.0%,补加方式采用流加溶液的方式。具体地:在发酵50-200h期间持续流加硫酸盐,且硫酸盐浓度为10%。
硫酸盐为可溶性盐,本申请实施例中不对具体的硫酸盐种类做限制,硫酸钠、硫酸铵等可溶性硫酸盐均在本申请实施例的保护范围内。
那西肽是一种含硫多肽类抗生素,多肽、氨基酸及硫元素的补料可以作为那西肽骨架的组成部分,促进那西肽的合成,且多肽、氨基酸及硫元素等可以作为营养成分为那西肽生产菌自身的生长提供营养物质。
基于此,菌渣水解液中含有丰富的多肽和氨基酸,补料菌渣水解液和硫酸盐即补料多肽、氨基酸和硫酸盐,补料的多肽、氨基酸和硫酸盐一方面作为营养成分可以促进那西肽生产菌自身的生长;另一方面作为原料成分可以促进那西肽骨架的合成,进而提高那西肽中A组分的含量;同时将菌渣水解液运用到发酵液的制备过程中,工艺简单易行,达到菌渣资源化利用,绿色环保,循环经济的目的。
需要说明的是,本申请的硫酸盐作为硫元素的供源,除硫酸盐之外的其他形式的硫源也属于本申请实施例的保护范围。
S130:向所述第二发酵液中加入葡萄糖溶液,得到那西肽发酵液。
在发酵70h开始流加葡萄糖溶液,27.0-28.0℃培养220-260h,即得那西肽发酵液。
其中流加的葡萄糖溶液浓度为50%,补料的葡萄糖体积占所述第二发酵液体积的13%-16%。
综上所述,本申请实施例中补料的菌渣水解液和硫酸盐一方面作为营养成分可以促进那西肽生产菌自身的生长;另一方面作为原料成为可以促进那西肽的合成,进而提高那西肽中A组分的含量;同时将菌渣水解液运用到发酵液的制备过程中,工艺简单易行,达到菌渣资源化利用,绿色环保,循环经济的目的。
为了使那西肽生产菌更好的生物代谢,第一发酵液、所述第二发酵液和所述那西肽发酵液的pH环境为弱酸性,进一步地,为了避免添加的菌渣水解液影响生物代谢过程,本申请实施例中的菌渣水解液的pH为6.5-7.5范围内。
进一步地,本申请实施例中为了测试在发酵过程中补料菌渣水解液和硫酸盐的作用,设置了对比试验,试验一为发酵过程中未补料菌渣水解液和硫酸盐,试验二为在发酵过程中补加菌渣水解液,试验三为在发酵过程中补加菌渣水解液和硫酸盐。试验一的结果如图2所示,试验二的结果如图3所示,试验三的结果如图4所示。如图2所示,试验一经过高效液相检测得到最终的A组分峰面积为2254.0,占比88.9%,对应的,如图3所示,经过检测得到最终的A组分峰面积为3577.4,占比96.6%。对应的,如图4所示,经过检测得到最终的A组分峰面积为6062.7,占比97.9%。本申请实施例中峰面积大小可代表组分含量大小,试验一中A组分含量为88.9%,试验二中A组分含量为96.6%,试验三种A组分含量为97.9%。因此可以看出,本申请中通过在发酵过程中补料菌渣水解液和硫酸盐来提高A组分含量是可行的。
基于上述内容在本申请中提供如下实施例:
实施例1:
制备种子培养基,种子培养基以原料总重量的百分含量计,由以下原料组成:葡萄糖2.5%,玉米浆1.5%,酵母浸出粉0.8%,黄豆饼粉0.8%,MgSO4·7H2O 0.03%,(NH4)2SO40.3%,轻质碳酸钙0.3%。
取活跃链霉菌菌种,接种到种子培养基中,接种量为25mm2的斜面,振幅5cm的摇床转速为230rpm,在27.0℃下培养48h;
将上述培养成熟的菌种接种至发酵培养基中,接种量占发酵培养基质量的10%,发酵培养基的基础pH值为7.00,初始通气量为1.0vvm,初始转速为300rpm,过程中溶氧控制15%以上,在发酵48h后得到初始发酵液;其中发酵培养基以原料总重量的百分含量计,由以下原料组成:可溶性淀粉4.5%,葡萄糖1.5%,玉米浆1.5%,酵母粉0.8%,黄豆粉0.8%,MgSO4·7H2O 0.04%,(NH4)2SO4 0.4%,KNO3 0.04%,轻质碳酸钙0.2%;
在发酵70h开始流加葡萄糖溶液,28.0℃培养200h,即得那西肽发酵液,其中流加的葡萄糖溶液浓度为50%,补料的葡萄糖体积占初始发酵液体积的13%。
实施例1中相应地各含量与工艺参数具体在表1中示出。
表1
实施例2:
制备种子培养基,种子培养基以原料总重量的百分含量计,由以下原料组成:葡萄糖2.5%,玉米浆1.5%,酵母浸出粉0.8%,黄豆饼粉0.8%,MgSO4·7H2O 0.03%,(NH4)2SO40.3%,轻质碳酸钙0.3%。
取活跃链霉菌菌种,接种到种子培养基中,接种量为25mm2的斜面,振幅5cm的摇床转速为230rpm,在27.0℃下培养48h;
将上述培养成熟的菌种接种至发酵培养基中,接种量占发酵培养基质量的10%,发酵培养基的基础pH值为7.00,初始通气量为1.0vvm,初始转速为300rpm,过程中溶氧控制15%以上,在发酵48h后得到第一发酵液;其中发酵培养基以原料总重量的百分含量计,由以下原料组成:可溶性淀粉4.5%,葡萄糖1.5%,玉米浆1.5%,酵母粉0.8%,黄豆粉0.8%,MgSO4·7H2O 0.04%,(NH4)2SO4 0.4%,KNO3 0.04%,轻质碳酸钙0.2%;
向第一发酵液中补料菌渣水解液,其中补料菌渣水解液的制备方法为:将菌渣和4mol/L的硫酸按照1:6的比例进行水解,水解条件为80℃,水解24h,中和pH至6.5,121℃灭菌30min,制成菌渣水解液;菌渣水解液体积占所述第一发酵液体积的1.5%,补加方式采用流加的方式。
在发酵70h开始流加葡萄糖溶液,28.0℃培养200h,即得那西肽发酵液,其中流加的葡萄糖溶液浓度为50%,补料的葡萄糖体积占初始发酵液体积的13%。
实施例2中相应地各含量与工艺参数具体在表2中示出。
表2
实施例3:
制备种子培养基,种子培养基以原料总重量的百分含量计,由以下原料组成:葡萄糖2.5%,玉米浆1.5%,酵母浸出粉0.8%,黄豆饼粉0.8%,MgSO4·7H2O 0.03%,(NH4)2SO40.3%,轻质碳酸钙0.3%。
取活跃链霉菌菌种,接种到种子培养基中,接种量为25mm2的斜面,振幅5cm的摇床转速为230rpm,在27.0℃下培养48h;
将上述培养成熟的菌种接种至发酵培养基中,接种量占发酵培养基质量的10%,发酵培养基的基础pH值为7.00,初始通气量为1.0vvm,初始转速为300rpm,过程中溶氧控制15%以上,在发酵48h后得到第一发酵液;其中发酵培养基以原料总重量的百分含量计,由以下原料组成:可溶性淀粉4.5%,葡萄糖1.5%,玉米浆1.5%,酵母粉0.8%,黄豆粉0.8%,MgSO4·7H2O 0.04%,(NH4)2SO4 0.4%,KNO3 0.04%,轻质碳酸钙0.2%;
向第一发酵液中补料菌渣水解液和硫酸盐,其中补料菌渣水解液的制备方法为:其中补料菌渣水解液的制备方法为:将菌渣和4mol/L的硫酸按照1:6的比例进行水解,水解条件为80℃,水解24h,中和pH至6.5,121℃灭菌30min,制成菌渣水解液;菌渣水解液体积占所述第一发酵液体积的1.5%,补加方式采用流加的方式,补料硫酸盐重量占所述第一发酵液重量的1.0%,补加方式采用流加10%浓度溶液的方式。
在发酵70h开始流加葡萄糖溶液,28.0℃培养240h,即得那西肽发酵液,其中流加的葡萄糖溶液浓度为50%,补料的葡萄糖体积占初始发酵液体积的13%。
实施例3中相应地各含量与工艺参数具体在表3中示出。
表3
综述,本申请提供的用于制备那西肽发酵液的方法中,将培养成熟的那西肽生产菌接种至发酵培养基中,在培养一段时间后生成第一发酵液,然后向第一发酵液中补料菌渣水解液和硫酸盐,在培养一端时间后生成第二发酵液,然后向第二发酵液中加入葡萄糖溶液即得到本申请中的那西肽发酵液,该那西肽发酵液为目标发酵液;其中菌渣水解液中含有丰富的多肽和氨基酸,补料菌渣水解液和硫酸盐即补料多肽、氨基酸和硫酸盐,补料的多肽、氨基酸和硫酸盐一方面作为营养成分可以促进那西肽生产菌自身的生长,提高那西肽生产菌自身的发酵能力;另一方面作为原料成为可以促进那西肽的合成,进而提高那西肽中A组分的含量;同时将菌渣水解液运用到发酵液的制备过程中,可以再利用菌渣水解液,提高菌渣水解液的利用率。
由于以上实施方式均是在其他方式之上引用结合进行说明,不同实施例之间均具有相同的部分,本说明书中各个实施例之间相同、相似的部分互相参见即可。在此不再详细阐述。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后,将容易想到本申请的其他实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化,这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的,本申请的真正范围和精神由权利要求的内容指出。
以上所述的本申请实施方式并不构成对本申请保护范围的限定。
Claims (5)
1.一种用于提高那西肽发酵液中A组分含量的方法,其特征在于,所述方法包括:
将那西肽生产菌接种至发酵培养基中,得到第一发酵液,所述那西肽生产菌为活跃链霉菌;
向所述第一发酵液中加入菌渣水解液和硫酸盐,得到第二发酵液,其中所述菌渣水解液和硫酸盐用于提高那西肽发酵液中A组分含量,所述A组分为所述那西肽发酵液的主组分;
其中,所述菌渣水解液的制备包括:
将菌渣和4mol/L的硫酸按照1:6的比例进行水解得到菌渣水解液,所述水解的温度为80-90℃;
将得到的所述菌渣水解液中和至pH为6.5-7.5;
向所述第二发酵液中加入葡萄糖溶液,得到那西肽发酵液。
2.根据权利要求1所述的用于提高那西肽发酵液中A组分含量的方法,其特征在于,所述菌渣水解液体积占所述第一发酵液体积的1.5%-2.5%,所述硫酸盐重量占所述第一发酵液重量的1.0%-2.0%,所述葡萄糖重量占所述第二发酵液重量的13.0%-16.0%。
3.根据权利要求1所述的用于提高那西肽发酵液中A组分含量的方法,其特征在于,所述方法还包括培养那西肽生产菌,所述培养那西肽生产菌包括:
将所述那西肽生产菌接种至种子培养基中,于27℃-29℃下培养48-60h;
所述种子培养基按照重量比包括:葡萄糖2.5%-3.0%,玉米浆1.5%-2.5%,酵母浸出粉0.8%-1.2%,黄豆饼粉0.8%-1.2%,MgSO4·7H2O 0.03%-0.07%,(NH4)2SO4 0.3%-0.6%,轻质碳酸钙0.3%-0.6%。
4.根据权利要求1所述的用于提高那西肽发酵液中A组分含量的方法,其特征在于,所述发酵培养基包括:可溶性淀粉 4.5%-5.5%,葡萄糖1.5%-2.5%,玉米浆1.5%-2.5%,酵母粉0.8%-1.2%,黄豆粉0.8%-1.2%,MgSO4·7H2O 0.04%-0.06%,(NH4)2SO4 0.4%-0.6%,KNO30.04%-0.06%,轻质碳酸钙0.2%-0.4%。
5.根据权利要求1所述的用于提高那西肽发酵液中A组分含量的方法,其特征在于,所述硫酸盐为硫酸钠或硫酸铵。
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