CN113151357B - 一种Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的构建方法及其应用 - Google Patents

一种Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种Bmi‑1‑RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的构建方法，设计合成带有BamH I和EcoR I两个酶切位点的Bmi‑1和RING1B串联的序列，扩增后得目的片段，利用BamH I和EcoR I对穿梭质粒pshuttl‑CMV和目的片段进行双酶切，然后连接，得到重组穿梭质粒，将重组穿梭质粒扩增提纯后，与pAAV‑RC和pHelper质粒一起共转染293T细胞，培养后收获细胞，反复冻融离心，即得。该病毒靶向心脏，在心脏细胞内表达Bmi‑1‑RING1B复合蛋白，直接靶向GATA4，促进GATA4泛素化及选择性自噬降解，可作为防治病理性心肌细胞肥大的药物。

Description

一种Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的构建 方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的构建方法及其应用。
背景技术
病理性心肌细胞肥大(pathological cardiomyocytes hypertrophy,PCH)是心力衰竭的关键风险因素，其受很多因素的调控，尤其是肾素-血管紧张素-醛固酮(RAAS)***及其主要效应分子血管紧张素II(Ang II)，是多种心血管疾病(如高血压心脏病、缺血性心脏病、肥厚性心脏病、扩张性心肌病等)的共同病理过程，被认为是引起心力衰竭和死亡的重要独立危险因素，防治PCH对阻止多种心血管病症导致心衰有着重要的意义。老年个体心脏中Ang II上调，RAAS***激活是引起心脏衰老的关键机制。衰老相关的病理性心肌细胞肥大(SA-PCH)与RAAS***活化、心肌纤维化、衰老相关分泌表型(SASP)、心脏功能障碍以及发病率和死亡率增加有关，并且随着衰老成为全球公共卫生日益突出的问题，防治SA-PCH对治疗多种心血管疾病保护老年健康有着重要的意义。
多梳基因家族成员Bmi-1(B cell-specific MLV integration site-1)抑制Ink4a/Arf基因座的转录并维持线粒体功能和氧化还原平衡，以防止细胞周期停滞和衰老，Bmi-1基因缺失引起小鼠应激性早衰。我们发现与野生型(WT)同窝小鼠相比，Bmi-1基因敲除(Bmi-1-/-) 小鼠血浆中的Ang II和醛固酮(ALD)水平升高，表明RAAS***被活化；先前的研究发现，由Bmi-1和RING1B(即Rnf2)形成的PRC1复合物在组蛋白泛素化中发挥重要作用，有报道称RING1B能促进p53等非组蛋白泛素化，且Bmi-1明显促进了RING1B的 E3泛素连接酶的活性。
先前研究认为：GATA4是在胚胎和成年心肌细胞中高表达的锌指转录因子，其转录的下游基因包括心钠素(ANP)、脑钠素(BNP)和β肌球蛋白重链(β-MHC)等心肌肥大相关指标，成年个体GATA4调节的胎儿基因的再激活通常被认为是在RAAS等因素刺激下导致 PCH和心力衰竭的标志。新近报道发现：GATA4蛋白作为一种新型的衰老调节因子，能激活转录因子NF-κB来启动SASP，加速衰老进程。新近研究表明，GATA4蛋白主要通过p62介导的选择性自噬降解，其抑制作用可阻止衰老进程。我们的研究发现Bmi-1-RING1B复合物与GATA4结合后增加了GATA4泛素化水平，进而被p62介导的选择性自噬降解，抑制了SA-PCH的发展。
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)，是微小病毒科依赖病毒属，病毒颗粒大小约为20～26nm，经过病毒包装后可以形成携带有外源***基因的腺相关病毒的病毒颗粒。由于腺相关病毒的安全性能好和表达时效长的优点，目前已成为最有前景的基因治疗工具。腺相关病毒有多种血清型，不同血清型对不同组织的亲和力不同，其中腺相关病毒血清型9对心脏亲和力高，目前已经广泛应用于心脏疾病的靶向基因治疗。
传统的药物和干预措施仅可部分改善临床症状，探索新的临床治疗方法和策略从而抑制甚至逆转病理性心肌细胞肥大逐渐成为心血管领域研究的重要方向。通过构建腺相关病毒(血清型9)为载体的Bmi-1-RING1B复合物促进GATA4自噬降解，抑制PCH 和SA-PCH，具有取材方便、易通过大规模培养细胞获得，腺相关病毒不整合到宿主基因组具有安全可靠性、剂量稳定可控，是治疗心血管疾病的一种理想的基因药物。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，构建了一种Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒，其能促进肥大的心肌细胞内GATA4自噬降解，防治PCH和SA-PCH。其中所述为Bmi-1-RING1B过表达的重组腺相关病毒(血清型9)，其效应分子主要为 Bmi-1-RING1B蛋白复合体，其通过靶向GATA4，促进GATA4选择性自噬降解，防治 PCH和SA-PCH。
技术方案
一种Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的构建方法，包括如下步骤：
(1)根据Bmi-1和RING1B的mRNA序列，合成带有BamH I和EcoR I两个酶切位点序列的Bmi-1和RING1B串联的序列，即为Bmi-1-RING1B序列，进行PCR扩增，得到Bmi-1-RING1B目的片段；
(2)将穿梭质粒pshuttl-CMV和Bmi-1-RING1B目的片段各自用限制性内切酶 BamHI和EcoR I进行双酶切，然后将得到的双酶切反应产物混合，进行DNA连接反应，得到含有Bmi-1-RING1B基因的重组穿梭质粒，对其进行扩增，提纯；
(3)将含有Bmi-1-RING1B基因的重组穿梭质粒和含腺相关病毒基因组DNA的pAAV-RC和pHelper质粒共转染293T细胞，培养后收获细胞，反复冻融后离心，获得病毒上清，即为Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒，提取DNA进行测序鉴定。
进一步，步骤(1)中，Bmi-1-RING1B的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步，步骤(1)中，所述PCR扩增的上游引物和下游引物分别为F引物和R引物：
F引物的序列为：5’-GGGATCCGCCACCATGCATCGA-3’(SEQ ID NO:4)；
R引物的序列为：5’-AGGAGCACAAATGAGAATTCGAT-3’(SEQ ID NO:5)。
进一步，步骤(2)中，所述扩增方法为：将含有Bmi-1-RING1B基因的重组穿梭质粒与感受态细胞混合后，放入42℃的水浴孵育90秒，再迅速放入冰浴孵育2分钟，涂板于选择培养平板上，37℃过夜培养，第二天挑选单克隆菌落，接种于含50mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃过夜扩增培养；随后离心裂解菌液，抽提纯化质粒。
采用上述方法获得的Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒。
Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒在制备用于防治病理性心肌细胞肥大的药物中的用途。
一种用于防治病理性心肌细胞肥大的药物，其活性成分为Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒。
本发明的有益效果：本发明成功构建了一种Bmi-1-RING1B过表达的重组腺相关病毒(血清型9)，该病毒靶向心脏，通过在肥大的心肌细胞内表达Bmi-1-RING1B复合蛋白，促进GATA4泛素化修饰，进而GATA4蛋白并被p62识别，促进GATA4的选择性自噬降解，进而减少心肌肥大标志基因ANP、BNP、β-MHC的转录，并抑制NF-κB介导的SASP，从而防治病理性心肌细胞肥大和衰老相关的病理性心肌细胞肥大提供了新的临床治疗方法及策略。
附图说明
图1为含有Bmi-1-RING1B基因的重组穿梭质粒的结构图；
图2为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏超声图；
图3为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏相关指标统计图；
图4为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏重量与体重和胫骨长度之比统计图；
图5为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏组织HE染色以及室间隔厚度统计图；
图6为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏组织Masson染色以及胶原面积统计图；
图7为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏组织WGA染色以及心肌细胞横截面积统计图；
图8为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏组织心肌肥大相关蛋白检测及其表达水平统计图；
图9为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏组织Bmi-1和RING1B蛋白检测及表达水平统计图；
图10为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏组织RAAS***相关蛋白检测及表达水平统计图；
图11为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏组织GATA4表达和衰老及SASP炎症通路相关蛋白检测及其表达水平统计图；
图12为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏组织自噬通路相关蛋白检测及其表达水平统计图；
图13为Bmi-1和RING1B促进GATA4泛素化修饰图；
图14为转染Flag标签的GATA4蛋白检测印迹图；
图15为转染带HA标签的RING1B蛋白检测印迹图；
图16为转染带HIS标签的Bmi-1全长和1-95片段蛋白检测印迹图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
重组腺相关病毒的构建：
(1)设计合成模板DNA：通过检索GeneBank网站，找到Bmi-1(核苷酸序列如 SEQ IDNO:2所示)和RING1B(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)的mRNA序列，送上海汉恒生物科技有限公司合成带有BamH I和EcoR I两个酶切位点序列的 Bmi-1-RING1B串联的模板序列，进行PCR扩增，酶切以后利用琼脂糖凝胶电泳将目的片段所在区域切胶回收，得到Bmi-1-RING1B目的片段；
PCR扩增体系见表1：
表1
Figure BDA0002995002110000051
其中，F引物的序列为：5’-GGGATCCGCCACCATGCATCGA-3’(SEQ ID NO:4)；
R引物的序列为：5’-AGGAGCACAAATGAGAATTCGAT-3’(SEQ ID NO:5)。
PCR扩增程序见表2：
表2
Figure BDA0002995002110000052
(2)将BamH I和EcoR I两个限制性内切酶(限制性内切酶均购自宝日医生物技术(北京)有限公司)分别和回收的目的片段和穿梭质粒pshuttl-CMV(购自上海汉恒生物科技有限公司)混合，置于37℃水浴锅中1小时，进行酶切反应，体系见表3：
表3
Figure BDA0002995002110000061
酶切以后利用琼脂糖凝胶电泳将目的片段所在区域切胶回收，并将目的片段与载体连接：于冰水浴中配制如下反应体系，如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底，反应体系见表4：
表4
Figure BDA0002995002110000062
连接后，得到含有Bmi-1-RING1B基因的重组穿梭质粒，含有Bmi-1-RING1B基因的重组穿梭质粒的结构图如图1所示。
将重组穿梭质粒进行扩增和提纯：将DH5α感受态细胞从-80℃冰箱拿出来之后，立刻放到冰上融化，感受态分装过程操作轻柔，减轻对其机械破坏，将含有Bmi-1-RING1B 基因的重组穿梭质粒与DH5α感受态细胞混合后，放入42℃的水浴孵育90秒，再迅速放入冰浴孵育2分钟，涂板于选择培养平板上，37℃过夜培养，第二天挑选单克隆菌落，接种于含50mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基(配方：将10g胰蛋白胨(Tryptone)、5g 酵母提取物(Yeast extract)、5g NaCl先溶解于950ml去离子水中，使用1mol/LNaOH调 pH至7.4，使用去离子水定容至1L，通过高压蒸汽灭菌20min，冷却后使用)，37℃过夜扩增培养，随后离心裂解菌液，抽提纯化质粒，送上海汉恒生物科技有限公司进行测序鉴定。
(3)腺相关病毒包装：
将含有Bmi-1-RING1B基因的重组穿梭质粒和含腺相关病毒基因组DNA的pAAV-RC和pHelper质粒共转染293T细胞，培养后收获细胞，反复冻融后离心，获得病毒上清，即为Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒，提取DNA送上海汉恒生物科技公司进行测序鉴定。具体方案如下：
采用的试剂见表5：
表5
Figure BDA0002995002110000071
腺相关病毒的包装包括如下步骤：
1)第一天：将AAV-293T细胞(购自上海汉恒生物科技有限公司)传代到100mm 平皿中用于转染。操作完毕后置于37℃、5％CO2和95％相对湿度的培养箱中，培养48 小时。
2)第三天：转染
确认细胞密度达到约80～90％的汇合率即可进行转染，转染直径100mm平皿所需的转染复合物成分见表6，转染后6h更换含10％胎牛血清FBS的新鲜完全培养基。
表6
Figure BDA0002995002110000072
注：上表中pAAV-RC质粒和pHelper质粒购自上海汉恒生物科技有限公司
3)细胞收集：转染后72h，将含AAV颗粒的细胞用细胞刮轻轻刮下，收集于15mL 离心管中，150×g离心3min收集细胞，去除培养上清，用PBS洗一次，最后再用300μL PBS重悬细胞。准备37℃恒温水浴锅和液氮，将装有细胞的离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次。4℃，2000×g，5min，去除细胞碎片，收集含AAV颗粒的裂解上清，即为Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒。
Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的纯化方法：
a.全能核酸酶处理：每1mL病毒粗提物中加入0.1μL Benonase酶，37℃水浴1h，除去病毒液中的细胞基因组及残留的质粒DNA。600×g，4℃，离心10min，取上清。
b.柱纯化(根据Biomiga腺相关病毒纯化试剂盒V1469-01纯化)。将柱纯化得到的4mLAAV病毒样品液体，加入到超滤管中，1400×g离心30min，得到约1mL腺相关病毒。收集最终得到的纯化后的病毒，于-80℃保存。
实施例2
防治病理性心肌细胞肥大实验：
由南京医科大学医药实验动物中心购入8周龄C57BL/6品系野生型(WT)小鼠21只，分为3组(7只/组)。具体分组如下：第一组不予任何处理(下述图中标记为WT)；第二组不予给药处理，2周后直接以Ang II埋泵缓释诱导小鼠心肌细胞肥大，持续4周(下述图中标记为WT+Ang II)；第三组给予WT小鼠注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒(100μl/只小鼠(1×1012v.g/ml))，2周后以Ang II埋泵缓释诱导小鼠心肌细胞肥大，持续4周(下述图中标记为WT+Ang II+Bmi-1-RING1B)。
模型建立方法：腺相关病毒由尾静脉注射，100μl/只小鼠(1×1012v.g/ml)。2周后进行Ang II埋泵处理，称量每只小鼠重量，按1.3mg/kg/day计算，将对应量的Ang II注入渗透压泵中(10396-18，ALZET)，再植入小鼠皮下，持续4周后进行下述分析。
上述处理结束后，对各处理组小鼠进行心脏超声心动图检测。使用高分辨率成像***检测小鼠心脏，于长轴和短轴方向测量左室收缩末期内径(LVESD)，左室舒张末期内径(LVEDD)，室厚壁厚度(LVPWT)，室间隔厚度(IVST)，并计算左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)，评估小鼠心功能。进一步将小鼠以1％戊巴比妥钠麻醉，眼球取血后脱颈椎处死，打开胸腔，冲洗心脏干净后剪下，滤纸上去除周围组织。心脏标本称量重量后一并量取该小鼠左右侧胫骨长度取均值，取心尖部于4％的多聚甲醛中固定24h 以上，梯度乙醇脱水，二甲苯透明石蜡包埋。石蜡切片厚度为5μm，37℃烘箱内烤片24h。通过HE染色观察心室壁及室间隔厚度，通过Masson三色染色观察心肌纤维化面积，通过WGA染色观察心肌细胞肥大情况，其余心脏组织用于提取心脏蛋白，通过Western Blot 检测Bmi-1、RING1B蛋白表达水平，RAAS***Ang II、Renin蛋白表达水平，心肌肥大相关分子ANP、BNP蛋白表达水平，自噬相关分子LC3B、p62蛋白表达水平以及衰老炎症通路相关分子GATA4、NF-κB蛋白表达水平。下述统计图中呈现平均值(Mean)±标准误(SEM)，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001与WT组相比；#P<0.05,##P<0.01,###P <0.001与WT+Ang II组相比。
图2为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏超声图，图3为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏相关指标统计图，其中，图3A为左心室射血分数(LVEF)、左心室缩短分数(LVFS)和左心室重量(LVmass)统计图，图3B为左室后壁厚度(LVPW)和室间隔厚度(IVS)统计图。由图2-3可以看出，与WT组小鼠相比，Ang II诱导的心肌肥大后，小鼠的LVEF和LVFS水平明显下降，LVmass、LVPW和IVS明显升高。与Ang II处理组相比，给予Bmi-1-RING1B复合物的重组腺相关病毒处理，升高了小鼠的LVEF 和LVFS水平，且有效降低了LVmass、LVPW和IVS水平。
图4为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏重量与体重和胫骨长度之比统计图。可以看出：与WT组小鼠相比，Ang II 诱导的心肌肥大后，心脏重量与体重之比(HW/BW)和心脏重量与胫骨长度之比(HW/TL) 明显升高；与Ang II处理组相比，Bmi-1-RING1B复合物的重组腺相关病毒处理后， HW/BW和HW/TL降低。
图5为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏组织HE染色以及室间隔厚度统计图，其中图5A为各处理组小鼠心脏组织 HE染色图，图5B为小鼠室间隔厚度统计图。可以看出：与WT组小鼠相比，Ang II诱导的心肌肥大后，小鼠心脏室间隔厚度明显变厚；与Ang II处理组相比，给予 Bmi-1-RING1B复合物的重组腺相关病毒处理，室间隔厚度变小。
图6为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏组织Masson染色以及胶原面积统计图，其中图6A为小鼠心脏组织Masson 染色图,图6B为小鼠心肌组织胶原面积统计图。可以看出：与WT组小鼠相比，AngII 诱导的心肌肥大后，小鼠心肌胶原面积明显变大；与Ang II处理组相比，Bmi-1-RING1B 复合物的重组腺相关病毒处理后，心肌胶原面积减少，但仍差于WT小鼠。
图7为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏组织WGA染色以及心肌细胞横截面积统计图，其中图7A为小鼠心脏组织 WGA染色图，图7B为小鼠心肌细胞横截面积统计图。可以看出：与WT小鼠相比，AngII 诱导的心肌肥大后，小鼠心肌细胞横截面积明显变大；与Ang II处理组相比， Bmi-1-RING1B复合物的重组腺相关病毒处理后，小鼠心肌细胞横截面积变小，但仍略大于WT小鼠。
图8为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏组织心肌肥大相关蛋白检测及其表达水平统计图，其中图8A为各处理组小鼠心脏心肌肥大相关蛋白印迹图，图8B为各处理组小鼠心脏心肌肥大相关蛋白表达水平统计图。可以看出：与WT组小鼠相比，Ang II诱导的心肌肥大后，小鼠心肌肥大相关分子ANP、BNP蛋白表达水平明显升高；与Ang II处理组相比，Bmi-1-RING1B复合物的重组腺相关病毒处理后，ANP、BNP蛋白表达水平降低，但仍高于WT小鼠。
图9为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏组织Bmi-1和RING1B蛋白检测及表达水平统计图，其中图9A为各处理组小鼠心脏Bmi-1和RING1B蛋白质印迹图，图9B为Bmi-1和RING1B蛋白表达水平统计图。可以看出：与WT组小鼠相比，Ang II诱导的心肌肥大后，小鼠心肌组织Bmi-1、 RING1B表达水平降低；与WT和Ang II处理组相比，给予Bmi-1-RING1B复合物的重组腺相关病毒后，小鼠心肌组织Bmi-1和RING1B表达水平均明显升高。
图10为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏组织RAAS***相关蛋白检测及表达水平统计图，其中图10A为各处理组小鼠心脏RAAS***相关蛋白质印迹图，图10B为RAAS***相关蛋白Ang II和Renin表达水平统计图。可以看出：与WT组小鼠相比，Ang II诱导的心肌肥大后，Ang II和Renin 蛋白表达水平上升，RAAS***激活；与Ang II处理组相比，Bmi-1-RING1B复合物的重组腺相关病毒处理后，Ang II和Renin蛋白表达水平明显降低，但仍高于WT小鼠。
图11为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏组织GATA4表达和衰老及SASP炎症通路相关蛋白检测及其表达水平统计图，其中图11A为各处理组小鼠衰老及炎症通路相关蛋白印迹图，图11B为各处理组小鼠衰老及炎症通路相关蛋白表达水平统计图。可以看出：与WT小鼠相比，Ang II诱导的心肌肥大后，衰老以及SASP促炎症通路相关蛋白GATA4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、p16 水平明显均升高；与Ang II处理组相比，给予Bmi-1-RING1B复合物的重组腺相关病毒处理后，衰老以及炎症通路相关蛋白GATA4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、p16水平明显下降，但仍略高于WT小鼠。
图12为经尾静脉注射Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的心肌肥大小鼠的心脏组织自噬通路相关蛋白检测及其表达水平统计图，其中图12A为各处理组小鼠心脏自噬通路相关蛋白印迹图，图12B为各处理组小鼠心脏自噬通路相关蛋白LC3B II、p62表达水平统计图。可以看出：与WT组小鼠相比，AngII诱导的心肌肥大后，LC3B II、p62蛋白表达水平降低，心肌自噬水平下降；与Ang II处理组相比，给予Bmi-1-RING1B 复合物的重组腺相关病毒处理，小鼠心肌自噬通路相关蛋白LC3B II、p62蛋白表达水平升高。
实施例3
我们设计构建带有His标签的Bmi-1过表达质粒(His-Bmi-1-FL)、带有His标签的Bmi-11-95截断过表达质粒(His-Bmi-1-1-95)、带有HA标签的RING1B过表达质粒 (HA-RING1B)、带有Flag标签的GATA4过表达质粒(Flag-GATA4)和带有Myc标签的泛素过表达质粒(Myc-Ubiquitin)分别或共转染293T细胞，观察His-Bmi-1-FL(全长)或His-Bmi-1-1-95和HA-RING1B及Myc-Ubiquitin联合转染对GATA4泛素化修饰的影响，待48小时后收集细胞，提取总蛋白，然后用抗Flag标签抗体钓取Flag-GATA4， Western Blot检测各组GATA4的泛素化水平。结果见图13-16。
图13为Bmi-1和RING1B促进GATA4泛素化修饰图，图14为转染Flag标签的GATA4 蛋白检测印迹图，图15为转染带HA标签的RING1B蛋白检测印迹图，图16为转染带HIS 标签的Bmi-1全长和1-95片段蛋白检测印迹图。可以看出：与His-Bmi-1和HA-RING1B 单独转染组相比，His-Bmi-1、HA-RING1B共转染组促进Flag-GATA4泛素水平明显升高，且His-Bmi-1-1-95和HA-RING1B共转染组对Flag-GATA4的泛素化修饰明显不足，故 His-Bmi-1和HA-RING1B共转染组对Flag-GATA4的泛素化起重要作用。
序列表：
SEQ ID NO:1
Bmi-1-RING1B的核苷酸序列
atgcatcgaacaaccagaatcaagatcactgagctaaatccccacttaatgtgtgtcctgtgtggagggtacttcattgatgccactaccataatagaatgtctac attccttctgtaaaacatgtattgtacgttacttggagaccagcaagtattgtcctatttgtgatgtccaggttcacaaaaccagaccactcctgaacataaggtca gataaaactcttcaagatattgtatacaaattagtcccagggcttttcaaaaatgagatgaagagaagaagagatttttatgcagctcacccgtcagctgatgctg ccaatggctccaatgaagaccgaggagaagttgcagatgaggagaagaggattataactgatgatgagataataagcttgtctattgagttctttgatcagagc agattggatcggaaagtaaataaagagaagcctaaggaagaggtgaatgataaaaggtacttacgatgcccagcagcaatgactgtgatgcacttgagaaa gtttctcaggagtaaaatggacatacccaatactttccagattgacgtcatgtatgaagaggaacctttaaaggattactacacgctaatggacattgcctacattt atacctggagaagaaatggcccactacctttgaaatacagagttcggccaacttgcaaaagaatgaagatgagtcaccagagggatggactgacgaatgctg gagagctggaaagtgactctgggagtgacaaggccaacagcccagccggaggtgttccctccacctcttcctgtttgcccagtcccagcactccagtgcagt ctcctcacccacagttccctcacatttccagtaccatgaatggaaccagcaacagccccagtgctaaccaccaatcttcctttgccagtagacctcgaaaatcat cactaaatgggtcatcagcaacttcatctggtgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctatgtctcaggctgtgca gacaaatggaactcaaccattaagcaaaacatgggaactcagtttgtatgagttacaacgaacacctcaggaggcaataacagatggcttggaaattgtggttt cacctagaagtctacacagtgaattaatgtgcccaatttgtttggatatgttaaagaacaccatgactacaaaggagtgtttacatcggttttgcgcggattgtatta tcacagcccttagaagtggcaacaaagagtgtcctacctgtcggaaaaaactggtttctaaaagatcactaaggccagacccgaactttgatgcactcatcagc aagatttatcccagtcgtgatgagtatgaagcgcatcaggaaagggtcttagcaaggatcaacaaacacaacaatcagcaggctctcagccacagcatcgag gaggggctgaagatacaggccatgaacagattacagcgaggcaaaaagcagcagatagaaaatggtagtggagcagaagataatggtgacagctcccac tgtagtaacgcatccacacacagcaaccaggaagcgggcccgagtaacaaacggaccaaaacctctgatgactctgggcttgaacttgataacaacaatgc agcagtggcgattgatccagtcatggacggtgccagtgagattgagttagtcttcaggccccatccaactcttatggaaaaggacgacagcgcacagacaag atacataaagacttcaggcaatgccactgttgatcacttatccaagtatctggctgtgaggttagctttagaagaacttcgaagcaaaggagaatcaaaccagat gaacctggatacagccagtgagaagcagtacaccatttacatagccacagccagtggccagttcaccgttttaaatggctccttttctttggaattggtcagtga gaaatactggaaagtgaacaaacccatggaactttattatgcacccaccaaggagcacaaatga
SEQ ID NO:2
Bmi-1的核苷酸序列
atgcatcgaacaaccagaatcaagatcactgagctaaatccccacttaatgtgtgtcctgtgtggagggtacttcattgatgccactaccataatagaatgtctac attccttctgtaaaacatgtattgtacgttacttggagaccagcaagtattgtcctatttgtgatgtccaggttcacaaaaccagaccactcctgaacataaggtca gataaaactcttcaagatattgtatacaaattagtcccagggcttttcaaaaatgagatgaagagaagaagagatttttatgcagctcacccgtcagctgatgctg ccaatggctccaatgaagaccgaggagaagttgcagatgaggagaagaggattataactgatgatgagataataagcttgtctattgagttctttgatcagagc agattggatcggaaagtaaataaagagaagcctaaggaagaggtgaatgataaaaggtacttacgatgcccagcagcaatgactgtgatgcacttgagaaa gtttctcaggagtaaaatggacatacccaatactttccagattgacgtcatgtatgaagaggaacctttaaaggattactacacgctaatggacattgcctacattt atacctggagaagaaatggcccactacctttgaaatacagagttcggccaacttgcaaaagaatgaagatgagtcaccagagggatggactgacgaatgctg gagagctggaaagtgactctgggagtgacaaggccaacagcccagccggaggtgttccctccacctcttcctgtttgcccagtcccagcactccagtgcagt ctcctcacccacagttccctcacatttccagtaccatgaatggaaccagcaacagccccagtgctaaccaccaatcttcctttgccagtagacctcgaaaatcat cactaaatgggtcatcagcaacttcatctggttag
SEQ ID NO:3
RING1B的核苷酸序列
atgtctcaggctgtgcagacaaatggaactcaaccattaagcaaaacatgggaactcagtttgtatgagttacaacgaacacctcaggaggcaataacagatg gcttggaaattgtggtttcacctagaagtctacacagtgaattaatgtgcccaatttgtttggatatgttaaagaacaccatgactacaaaggagtgtttacatcggt tttgcgcggattgtattatcacagcccttagaagtggcaacaaagagtgtcctacctgtcggaaaaaactggtttctaaaagatcactaaggccagacccgaac tttgatgcactcatcagcaagatttatcccagtcgtgatgagtatgaagcgcatcaggaaagggtcttagcaaggatcaacaaacacaacaatcagcaggctct cagccacagcatcgaggaggggctgaagatacaggccatgaacagattacagcgaggcaaaaagcagcagatagaaaatggtagtggagcagaagata atggtgacagctcccactgtagtaacgcatccacacacagcaaccaggaagcgggcccgagtaacaaacggaccaaaacctctgatgactctgggcttgaa cttgataacaacaatgcagcagtggcgattgatccagtcatggacggtgccagtgagattgagttagtcttcaggccccatccaactcttatggaaaaggacga cagcgcacagacaagatacataaagacttcaggcaatgccactgttgatcacttatccaagtatctggctgtgaggttagctttagaagaacttcgaagcaaag gagaatcaaaccagatgaacctggatacagccagtgagaagcagtacaccatttacatagccacagccagtggccagttcaccgttttaaatggctccttttctt tggaattggtcagtgagaaatactggaaagtgaacaaacccatggaactttattatgcacccaccaaggagcacaaatga
SEQ ID NO:4
F引物的序列
gggatccgccaccatgcatcga
SEQ ID NO:5
R引物的序列为
aggagcacaaatgagaattcga。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 一种Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的构建方法及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2037
<212> DNA
<213> 肾素-血管紧张素-醛固酮(Bmi-1-RING1B)
<400> 1
atgcatcgaa caaccagaat caagatcact gagctaaatc cccacttaat gtgtgtcctg 60
tgtggagggt acttcattga tgccactacc ataatagaat gtctacattc cttctgtaaa 120
acatgtattg tacgttactt ggagaccagc aagtattgtc ctatttgtga tgtccaggtt 180
cacaaaacca gaccactcct gaacataagg tcagataaaa ctcttcaaga tattgtatac 240
aaattagtcc cagggctttt caaaaatgag atgaagagaa gaagagattt ttatgcagct 300
cacccgtcag ctgatgctgc caatggctcc aatgaagacc gaggagaagt tgcagatgag 360
gagaagagga ttataactga tgatgagata ataagcttgt ctattgagtt ctttgatcag 420
agcagattgg atcggaaagt aaataaagag aagcctaagg aagaggtgaa tgataaaagg 480
tacttacgat gcccagcagc aatgactgtg atgcacttga gaaagtttct caggagtaaa 540
atggacatac ccaatacttt ccagattgac gtcatgtatg aagaggaacc tttaaaggat 600
tactacacgc taatggacat tgcctacatt tatacctgga gaagaaatgg cccactacct 660
ttgaaataca gagttcggcc aacttgcaaa agaatgaaga tgagtcacca gagggatgga 720
ctgacgaatg ctggagagct ggaaagtgac tctgggagtg acaaggccaa cagcccagcc 780
ggaggtgttc cctccacctc ttcctgtttg cccagtccca gcactccagt gcagtctcct 840
cacccacagt tccctcacat ttccagtacc atgaatggaa ccagcaacag ccccagtgct 900
aaccaccaat cttcctttgc cagtagacct cgaaaatcat cactaaatgg gtcatcagca 960
acttcatctg gtgagggcag aggaagtctt ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc 1020
ggccctatgt ctcaggctgt gcagacaaat ggaactcaac cattaagcaa aacatgggaa 1080
ctcagtttgt atgagttaca acgaacacct caggaggcaa taacagatgg cttggaaatt 1140
gtggtttcac ctagaagtct acacagtgaa ttaatgtgcc caatttgttt ggatatgtta 1200
aagaacacca tgactacaaa ggagtgttta catcggtttt gcgcggattg tattatcaca 1260
gcccttagaa gtggcaacaa agagtgtcct acctgtcgga aaaaactggt ttctaaaaga 1320
tcactaaggc cagacccgaa ctttgatgca ctcatcagca agatttatcc cagtcgtgat 1380
gagtatgaag cgcatcagga aagggtctta gcaaggatca acaaacacaa caatcagcag 1440
gctctcagcc acagcatcga ggaggggctg aagatacagg ccatgaacag attacagcga 1500
ggcaaaaagc agcagataga aaatggtagt ggagcagaag ataatggtga cagctcccac 1560
tgtagtaacg catccacaca cagcaaccag gaagcgggcc cgagtaacaa acggaccaaa 1620
acctctgatg actctgggct tgaacttgat aacaacaatg cagcagtggc gattgatcca 1680
gtcatggacg gtgccagtga gattgagtta gtcttcaggc cccatccaac tcttatggaa 1740
aaggacgaca gcgcacagac aagatacata aagacttcag gcaatgccac tgttgatcac 1800
ttatccaagt atctggctgt gaggttagct ttagaagaac ttcgaagcaa aggagaatca 1860
aaccagatga acctggatac agccagtgag aagcagtaca ccatttacat agccacagcc 1920
agtggccagt tcaccgtttt aaatggctcc ttttctttgg aattggtcag tgagaaatac 1980
tggaaagtga acaaacccat ggaactttat tatgcaccca ccaaggagca caaatga 2037
<210> 2
<211> 975
<212> DNA
<213> 肾素-血管紧张素-醛固酮(Bmi-1-RING1B)
<400> 2
atgcatcgaa caaccagaat caagatcact gagctaaatc cccacttaat gtgtgtcctg 60
tgtggagggt acttcattga tgccactacc ataatagaat gtctacattc cttctgtaaa 120
acatgtattg tacgttactt ggagaccagc aagtattgtc ctatttgtga tgtccaggtt 180
cacaaaacca gaccactcct gaacataagg tcagataaaa ctcttcaaga tattgtatac 240
aaattagtcc cagggctttt caaaaatgag atgaagagaa gaagagattt ttatgcagct 300
cacccgtcag ctgatgctgc caatggctcc aatgaagacc gaggagaagt tgcagatgag 360
gagaagagga ttataactga tgatgagata ataagcttgt ctattgagtt ctttgatcag 420
agcagattgg atcggaaagt aaataaagag aagcctaagg aagaggtgaa tgataaaagg 480
tacttacgat gcccagcagc aatgactgtg atgcacttga gaaagtttct caggagtaaa 540
atggacatac ccaatacttt ccagattgac gtcatgtatg aagaggaacc tttaaaggat 600
tactacacgc taatggacat tgcctacatt tatacctgga gaagaaatgg cccactacct 660
ttgaaataca gagttcggcc aacttgcaaa agaatgaaga tgagtcacca gagggatgga 720
ctgacgaatg ctggagagct ggaaagtgac tctgggagtg acaaggccaa cagcccagcc 780
ggaggtgttc cctccacctc ttcctgtttg cccagtccca gcactccagt gcagtctcct 840
cacccacagt tccctcacat ttccagtacc atgaatggaa ccagcaacag ccccagtgct 900
aaccaccaat cttcctttgc cagtagacct cgaaaatcat cactaaatgg gtcatcagca 960
acttcatctg gttag 975
<210> 3
<211> 1011
<212> DNA
<213> 肾素-血管紧张素-醛固酮(Bmi-1-RING1B)
<400> 3
atgtctcagg ctgtgcagac aaatggaact caaccattaa gcaaaacatg ggaactcagt 60
ttgtatgagt tacaacgaac acctcaggag gcaataacag atggcttgga aattgtggtt 120
tcacctagaa gtctacacag tgaattaatg tgcccaattt gtttggatat gttaaagaac 180
accatgacta caaaggagtg tttacatcgg ttttgcgcgg attgtattat cacagccctt 240
agaagtggca acaaagagtg tcctacctgt cggaaaaaac tggtttctaa aagatcacta 300
aggccagacc cgaactttga tgcactcatc agcaagattt atcccagtcg tgatgagtat 360
gaagcgcatc aggaaagggt cttagcaagg atcaacaaac acaacaatca gcaggctctc 420
agccacagca tcgaggaggg gctgaagata caggccatga acagattaca gcgaggcaaa 480
aagcagcaga tagaaaatgg tagtggagca gaagataatg gtgacagctc ccactgtagt 540
aacgcatcca cacacagcaa ccaggaagcg ggcccgagta acaaacggac caaaacctct 600
gatgactctg ggcttgaact tgataacaac aatgcagcag tggcgattga tccagtcatg 660
gacggtgcca gtgagattga gttagtcttc aggccccatc caactcttat ggaaaaggac 720
gacagcgcac agacaagata cataaagact tcaggcaatg ccactgttga tcacttatcc 780
aagtatctgg ctgtgaggtt agctttagaa gaacttcgaa gcaaaggaga atcaaaccag 840
atgaacctgg atacagccag tgagaagcag tacaccattt acatagccac agccagtggc 900
cagttcaccg ttttaaatgg ctccttttct ttggaattgg tcagtgagaa atactggaaa 960
gtgaacaaac ccatggaact ttattatgca cccaccaagg agcacaaatg a 1011
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 肾素-血管紧张素-醛固酮(Bmi-1-RING1B)
<400> 4
gggatccgcc accatgcatc ga 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 肾素-血管紧张素-醛固酮(Bmi-1-RING1B)
<400> 5
aggagcacaa atgagaattc ga 22

Claims (6)

1.Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒在制备用于防治病理性心肌细胞肥大的药物中的用途，所述Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的构建方法包括如下步骤：
（1）根据Bmi-1和RING1B的mRNA序列，合成带有BamH I和EcoR I两个酶切位点序列的Bmi-1和RING1B串联的序列，即为Bmi-1-RING1B序列，进行PCR扩增，得到Bmi-1-RING1B目的片段；
（2）将穿梭质粒pshuttl-CMV和Bmi-1-RING1B目的片段各自用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行双酶切，然后将得到的双酶切反应产物混合，进行DNA连接反应，得到含有Bmi-1-RING1B基因的重组穿梭质粒，对其进行扩增，提纯；
（3）将含有Bmi-1-RING1B基因的重组穿梭质粒和含腺相关病毒基因组DNA的pAAV-RC和pHelper质粒共转染293T细胞，培养后收获细胞，反复冻融后离心，获得病毒上清，即为Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒，提取DNA进行测序鉴定；
步骤（1）中，所述Bmi-1-RING1B的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（1）中，所述PCR扩增的上游引物和下游引物分别为F引物和R引物，F引物的序列如SEQ ID NO:4所示，R引物的序列如SEQ ID NO:5所示。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（2）中，所述扩增方法为：将含有Bmi-1-RING1B基因的重组穿梭质粒与感受态细胞混合后，放入42℃的水浴孵育90秒，再迅速放入冰浴孵育2分钟，涂板于选择培养平板上，37℃过夜培养，第二天挑选单克隆菌落，接种于含50mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃过夜扩增培养；随后离心裂解菌液，抽提纯化质粒。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物还包含药学上可接受的载体。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括稀释剂和赋形剂。
6.如权利要求1或2或3或4或5所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型为针剂或冻干粉。
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